CN109456940A - 得到nk细胞或树突细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从末梢血分离可用于免疫细胞疗法的细胞，并使其增殖的方法。本发明可提供免疫细胞疗法中可利用的充分的数的免疫系统细胞。

Description

得到NK细胞或树突细胞的方法
本申请是2013年7月10日提交的名称为“得到单核细胞或NK细胞的方法”的发明专利申请201380034962.2的分案申请。
【技术领域】
本发明涉及从末梢血分离可用于免疫细胞疗法的细胞，并使其增殖的方法，更具体涉及从末梢血分离单核细胞或NK细胞，并使其增殖的方法。
【背景技术】
近年在多个医疗机关实施作为免疫细胞疗法的NK疗法及单核细胞来源的树突细胞疗法。利用获得性免疫的树突细胞疗法及利用自然免疫的NK疗法由其益处而作为组合疗法适用的情况多。
至今，上述组合疗法的情况中，树突细胞及NK细胞从独立的血液得到。之后分化为树突细胞的单核细胞由成分输血(成分采血)进行成分采集。另一方面，NK细胞从末梢血采集，并增殖。从而，在上述组合疗法中一般需要2次采血。
【现有技术文献】
【非专利文献】
非专利文献1：Castiello et al.，Cancer Immunol.Immunother.，60：457-466,2011。
非专利文献2：Zamai et al.，J.Immunol.，178：4011-4016,2007。
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
但是，由于仅一方面的采血(特别是成分输血)也给患者带来负担，如果进行两方的采血，对患者的身体的负担会再增大。从而，在免疫细胞疗法中需求对患者负担少的，用于得到单核细胞及NK细胞的其他方法。
从而，鉴于这样的课题，本发明的目的是减轻患者的负担的同时，提供免疫细胞疗法中利用可能的充分的数的免疫系细胞。
【解决课题的技术方案】
为了解决上述课题，本发明中涉及的方法是得到单核细胞或NK细胞的方法，其包括：
从末梢血，使用对于单核细胞的表面标志物特异性的抗体分离单核细胞，由此回收单核细胞样品的工序，
将分离单核细胞之后的细胞集团作为NK细胞样品回收的工序，以及
培养上述单核细胞样品或NK细胞样品，使单核细胞或NK细胞增殖的工序。
【发明效果】
由本发明可减轻患者的负担的同时，提供免疫细胞疗法中利用可能的充分的数的免疫系细胞。
【附图说明】
【图1】是显示确认单核细胞从末梢血选择性地分离的FACS解析的结果的图。
【图2】是显示确认选择性地分离单核细胞之后的样品中含NK细胞的FACS解析的结果的图。
【图3】是显示从根据本发明中涉及的培养方法及以往的培养方法增殖的单核细胞、及所述单核细胞分化的树突细胞的细胞数的经时的变化的图。
【图4】是显示根据本发明中涉及的培养方法及以往的培养方法增殖的NK细胞的细胞数的经时的变化的图。
【图5】是显示确认单核细胞增殖(第3天)的FACS解析的结果的图。
【图6】是显示确认树突细胞增殖的FACS解析的结果的图。
【图7】是显示确认NK细胞增殖的FACS解析的结果的图。
【实施方式】
本发明中涉及的方法是得到单核细胞或NK细胞的方法，其包括：使用对单核细胞的表面标志物特异性的抗体从末梢血分离单核细胞，由此回收单核细胞样品的工序，将分离单核细胞之后的细胞集团作为NK细胞样品回收的工序，以及培养上述单核细胞样品或NK细胞样品，使单核细胞或NK细胞增殖的工序。
即，本发明中涉及的方法使至少任何一方之后增殖作为前提，包括从末梢血分离单核细胞及NK细胞。从而，分离得到的单核细胞及NK细胞没必要是对于免疫细胞疗法的实施充分的量。由本发明中涉及的方法，使从少量的末梢血分离的单核细胞及NK细胞增殖，提供免疫细胞疗法中利用可能的充分的数的免疫系细胞成为可能。
以从少量的末梢血分离必要的免疫系细胞之后，使各细胞增殖至免疫细胞疗法中利用可能的数为例，以下说明本发明中涉及的方法中的处理的细节。再有，在本说明书中使用时，用语“单核细胞样品”是指含以单核细胞为主的细胞集团的样品。另外，在本说明书中使用时，用语“NK细胞样品”指基本上不含单核细胞，但含NK细胞的细胞集团的样品。
【从末梢血回收单核细胞样品及NK细胞样品】
如上所述，本发明中涉及的方法包括从末梢血将单核细胞样品及NK细胞样品的各自分开回收的工序。另外，如上所述，所述工序经使用对单核细胞的表面标志物特异性的抗体的单核细胞的选择性分离实施。所述抗体与磁珠等的载体结合。通过使与抗体结合的载体与含单核细胞的样品混合之后，经抗体回收与单核细胞结合的载体，得到单核细胞样品。作为代替的的方法，所述抗体可由生物素标记。用所述方法可利用链霉亲和素对标记上述抗体的生物素的相互作用而分离单核细胞。
其中，作为上述抗体的例，可举出抗CD14抗体及抗CD16抗体等。其中举的抗体是一例，本领域公知的对单核细胞的表面标志物特异性的各种抗体可用于本发明中涉及的方法。
如上所述利用抗体及载体，作为选择性地分离单核细胞的方法，可举出将StemCell Technologies公司提供的RoboSep装置和RoboSep人CD14阳性试剂盒或RoboSep阴性人单核细胞试剂盒等组合的方法。所述方法由于可大致不经人手而自动地实施从血液样品选择性分离单核细胞，从而对本发明中涉及的方法适宜。Stem CellTechnologies公司，除上述试剂盒之外，提供使用者选择使用的抗体而与试剂组合的试剂盒。从而，通过组合例举的抗体和所述试剂盒，利用RoboSep装置从血液样品分离单核细胞是可能的。
再有，通过组合RoboSep阴性人NK细胞试剂盒或RoboSep人CD56阳性试剂盒等和RoboSep装置，可从血液样品分离NK细胞。
优选在使用抗体选择性分离单核细胞之前，部分分离末梢血。优选由从末梢血分离单核细胞级分的使用Ficoll溶液的密度梯度离心分离来预先分离末梢血。由于使用Ficoll溶液的这样的密度梯度离心分离是用于得到免疫细胞疗法中使用的NK细胞的一般方法，从而不特别说明其详细。
再有，所述密度梯度离心分离是以在分离单核细胞级分之后，与适宜的抗体及细胞因子一同培养此单核细胞级分，由此得到活化的T淋巴细胞及NK细胞作为目的的一般方法。即，在如本发明中涉及的方法一样分离单核细胞，并使其增殖之前通常不进行实施所述密度梯度离心分离。
在本发明中涉及的方法中，优选确认如上所述得到的单核细胞样品中含何种程度的单核细胞。可预先知对于使得到的单核细胞样品中的单核细胞增殖至希望得到的细胞数而言必要的培养的天数、及根据需要分化为树突细胞的培养开始起的天数。单核细胞样品中所含的单核细胞的程度可由使用公知的流式细胞仪及荧光标记的抗CD14抗体的FACS解析确认。使用的抗体是对单核细胞的表面标志物特异性的抗体即可。从而，例如，用于分离单核细胞的上述的抗体在荧光标记之后可用于FACS解析。
如后述，本发明中涉及的方法培养得到的单核细胞样品及NK细胞样品，使单核细胞及NK细胞各自选择性地独立增殖。从而，得到的单核细胞样品及NK细胞样品的各自只要含相比对于免疫细胞疗法必要的数远更少的数的希望得到的细胞(单核细胞及NK细胞的各自)即可。从而，本发明中涉及的方法仅需要微少的量(例如25mL)的末梢血。即，在单核细胞的分离中不实施一般性的大量(例如数百mL～数L)的采血。因此，本发明中涉及的方法，在免疫细胞疗法中，使由采血导致的时间及身体负担大幅地减轻。
在本说明书中，少量的末梢血是指例如100mL以下，优选为75mL以下，更优选为50mL以下，最优选为25mL以下的末梢血。采集的血液越少，对个体的负担也越减轻。但是，末梢血中的单核细胞及NK细胞的数依赖于个体的身体的状态而不大同，所以根据采集的个体的状态及必要的细胞数，采集的末梢血的量可适宜变更。
分离单核细胞及NK细胞的末梢血可为单次采集的末梢血、或者分多次采集的末梢血的混合物。如上所述，由于必要的量少，在本发明中涉及的方法中，末梢血通常单次采集。
【单核细胞的增殖】
本发明中涉及的方法优选使回收的单核细胞样品中所含的单核细胞选择性地增殖。在本发明中涉及的方法中，单核细胞样品使用补充作为干细胞的生长因子已知的Flt-3L的单核细胞增殖用培养基进行培养。通过使用所述培养基，如后述的实施例所示，一般而言不进行的单核细胞的增殖变得可能。
上述单核细胞增殖用培养基是将单核细胞的维持中使用的公知的培养基作为基本培养基使用。上述基本培养基是，如实施例所示，由宝生物公司等市售，部分改变市售的制品的培养基，或者与市售的制品有类似的组成。上述单核细胞增殖用培养基可含单核细胞的刺激(增殖、活化及分化的促进)中使用的公知的细胞因子(例如GM-CSF)。另外，上述单核细胞增殖用培养基可补充适宜的公知的抗生物质。另外，上述单核细胞增殖用培养基可再含从回收单核细胞样品的末梢血分离的血浆(自身血浆)。对上述单核细胞增殖用培养基的适宜的其他添加物由于是用于单核细胞的维持及向树突细胞的分化的各种的添加物，所以由本领域技术人员公知。
Flt-3L以例如，500～5000IU/mL、更优选为1000～4000IU/mL、最优选为2000IU/mL的浓度含在上述单核细胞增殖用培养基中。GM-CSF以例如，500～5000IU/mL、更优选为1000～2500IU/mL、最优选为1000IU/mL的浓度含在上述单核细胞增殖用培养基中。
上述单核细胞样品使用上述单核细胞增殖用培养基培养任意的期间(至得到希望得到的量的单核细胞)。上述期间根据得到的单核细胞样品中所含的单核细胞的数而变更。以后述的实施例的情况为例，上述期间，例如，从25mL的末梢血回收单核细胞样品时是约14天。上述情况的单核细胞样品中的单核细胞由约14天的培养例如可能增殖至约1×107细胞。
如从以上的记载得知，本发明中涉及的Flt-3L是向上述单核细胞增殖用培养基加的添加剂(例如单核细胞的增殖促进剂)。另外，本发明涉及Flt-3L作为向上述单核细胞增殖用培养基加的添加剂的用途。
如后述，在本发明中涉及的方法中，在培养途中(例如培养的第3天)，可向培养物加使单核细胞分化为树突细胞的因子。即，没必要非得使仅单核细胞增殖至例如约1×107细胞。从而此时，仅将单核细胞选择性地培养的期间是约3天，培养全体的期间是约14天。免疫细胞疗法中实际上使用的是单核细胞来源的树突细胞。从而，在本发明中涉及的方法中，优选在使单核细胞增殖的同时分化为实际上使用的树突细胞。在以下的项目中，对使单核细胞增殖的同时分化为树突细胞进行说明。
【单核细胞向树突细胞的分化】
在本发明中涉及的方法中，单核细胞向树突细胞的分化使用再补充细胞因子等的上述单核细胞增殖用培养基实施。在从单核细胞向未成熟树突细胞的分化中，再补充到上述单核细胞增殖用培养基的细胞因子一般而言是IL-4及GM-CSF。可用于单核细胞向未成熟树突细胞的分化的IL-4及GM-CSF是市售的，或者通过使编码IL-4或GM-CSF的(重组)人基因表达得到。
然后，未成熟树突细胞使用含抗原的生物学材料(例如，肿瘤细胞(含其的组织片)、肿瘤标志物、特定的疾病的病巢部片及病毒感染细胞等)、或者形成抗原的生物学材料(例如，抗原肽、蛋白质(长链肽)或其片段、及抗原核酸等)进行脉冲。受脉冲之后的未成熟树突细胞通过在再加细胞因子、生理活性物质及免疫赋活剂的培养基中培养，成熟为成熟树突细胞。
用于向成熟树突细胞的分化的细胞因子、生理活性物质及免疫赋活剂是例如IL-1β、IL-6、TNFα、PGE2及氯化毕西巴尼(OK432)等，这些均可作为市售品得到，或者通过使编码这些细胞因子的(重组)人基因表达而得到。再有，其中举对于未成熟树突细胞向成熟树突细胞的分化最适的细胞因子、生理活性物质及免疫赋活剂的组合。对于所述分化必须的组合是例如，PGE2及OK432。
IL-1β以例如，在2～100ng/mL、更优选为5～50ng/mL、最优选为10ng/mL的浓度含在用于使单核细胞分化为树突细胞的上述单核细胞增殖用培养基中。IL-6以例如，在200～6000IU/mL、更优选为500～4000IU/mL、最优选为1000IU/mL的浓度含在用于使单核细胞分化为树突细胞的上述单核细胞增殖用培养基中。TNFα以例如，在2～100ng/mL、更优选为10～50ng/mL、最优选为20ng/mL的浓度含在用于使单核细胞分化为树突细胞的上述单核细胞增殖用培养基中。PGE2以例如，在0.05～5μg/mL、更优选为0.5～2μg/mL、最优选为1μg/mL的浓度含在用于使单核细胞分化为树突细胞的上述单核细胞增殖用培养基中。氯化毕西巴尼以例如，在0.005～10KE、更优选为0.05～5KE、最优选为0.1KE的浓度含在用于使单核细胞分化为树突细胞的上述单核细胞增殖用培养基中。
在本发明中涉及的方法中，从25mL的末梢血得到单核细胞样品时，如上所述，单核细胞样品的培养经约14天实施。此时，使单核细胞分化为未成熟树突细胞的细胞因子例如在培养的第3天向培养基加。上述脉冲例如在培养的第11天实施。脉冲之后，向培养基加诱导向成熟树突细胞的分化的细胞因子及免疫赋活剂。在培养的第14天，得到希望得到的数(例如1×107细胞)的树突细胞(参照实施例2-1.)。
从以上的记载可知，本发明中涉及的Flt-3L是向用于得到树突细胞的培养基加的添加剂(例如树突细胞的增殖促进剂)。另外，本发明涉及作为向用于得到树突细胞的培养基加的添加剂而使用Flt-3L。
以从25μmL的末梢血得到单核细胞样品时作为一例，对单核细胞的增殖及分化的期间进行说明。但是，如上所述，根据得到的单核细胞样品中所含的单核细胞的数，培养的期间可延长或缩短。这样的培养的期间的设定是本领域技术人员依经验知道的事项。
细胞数，在任意的时间点，可例如使用锥虫蓝计数。另外，计数的细胞集团中所含的单核细胞及树突细胞的比例可由使用荧光标记的抗CD14抗体(单核细胞)及抗CD83抗体(树突细胞)的FACS解析确定。从而，在确定细胞数及细胞种类的各时间点，可任意地分别变更培养及分化的期间。
树突细胞将体内的异物(例如病毒及细菌以及这些的片段)摄取到细胞内。由此，树突细胞通过将抗原(上述异物或所述异物的处理物)呈递到其他免疫系统的细胞而使对所述异物特异性的免疫应答活化。从而，通常通过对树突细胞使用对不被识别为异物的疾病(例如肿瘤)特异性的疾病标志物(例如对于肿瘤的WT1)，脉冲单核细胞来源的树突细胞，可得到可处置各种疾病的树突细胞。
【NK细胞的增殖】
本发明中涉及的方法优选使回收的NK细胞样品中所含的NK细胞选择性地增殖。在本发明中涉及的方法中，NK细胞样品使用补充识别NK细胞的表面标志物的抗CD56抗体的NK细胞增殖用培养基进行培养。通过使用所述培养基，如后述的实施例所示，可使NK细胞样品(分离单核细胞的其余的细胞集团)中的NK细胞选择性地增殖。
一般而言，用于免疫细胞疗法的NK细胞通过使用含诱导NK细胞的分化、成熟、活化及增殖的细胞因子(IL-2、IL-12及IL-15)的培养基培养末梢血来源的单核细胞级分来增殖。但是，使用这样的培养基培养本发明中涉及的NK细胞样品时，NK细胞不增殖至充分的数(参照实施例的2-6.)。从而，至今已知的使NK细胞增殖的条件及方法无法适用于本发明中涉及的方法。
上述NK细胞增殖用培养基将NK细胞的增殖中使用的公知的培养基作为基本培养基使用。上述基本培养基，如实施例所示，由KohjinBio公司等市售，是部分改变市售的制品的培养基，或者与市售的制品有类似的组成。上述NK细胞增殖用培养基可含通常的NK细胞的增殖及活化中使用的IL-2、IL-12及IL-15。另外，本领域技术人员通过如上述一样的至今已知的使NK细胞增殖的条件及方法公知在至此所举的添加物以外的对上述NK细胞增殖用培养基的添加物。
抗CD56抗体以例如，1～200μg/mL、更优选为10～150μg/mL、最优选为80μg/mL的浓度含在用于使NK细胞增殖活化的上述NK增殖用培养基中。再有，以上对将抗CD56抗体直接添加到培养基进行了说明，但可使用固定于任意的支持体(例如塑料瓶及皿)的抗CD56抗体(固相化的抗CD56抗体)。固相化时，上述浓度范围表示相对于使用的培养基的量的抗CD56抗体的使用量。IL-2以例如，100～3000IU/mL、更优选为1000～2000IU/mL、最优选为1750IU/mL的浓度含在用于使NK细胞增殖活化的上述NK增殖用培养基中。IL-12以例如，100～5000IU/mL、更优选为500～3000IU/mL、最优选为2000IU/mL的浓度含在用于使NK细胞增殖活化的上述NK增殖用培养基中。IL-15以例如，100～5000IU/mL、更优选为500～3000IU/mL、最优选为2000IU/mL的浓度含在用于使NK细胞增殖活化的上述NK增殖用培养基中。
NK细胞样品可经与上述的单核细胞样品同样的期间培养。例如，本发明中涉及的NK细胞样品使用上述NK细胞增殖用培养基，经约14天培养。由经约14天的培养，例如NK细胞可增殖至1×109细胞(参照实施例的2-3.)。
从以上的记载可知，本发明中涉及的抗CD56抗体是向NK细胞增殖用培养基加的添加剂(例如NK细胞的增殖促进剂)。另外，本发明涉及抗CD56抗体作为向NK细胞增殖用培养基加的添加剂的用途。
培养物中的细胞数与单核细胞同样地在使用锥虫蓝培养之间的任意的时间点实施。此时，培养物的细胞集团中的NK细胞的比例可由使用荧光标记的抗CD56抗体的FACS解析确定。
NK细胞的通常的作用主要是攻击肿瘤细胞及感染细胞。从而，活化的NK细胞对于癌及感染症的处置有用。从而，由使用肿瘤标志物的脉冲使树突细胞成熟，与NK细胞一同使用，则预期对于癌特别优良的治疗效果。
另外，如至今说明，由本发明中涉及的方法，从少量的末梢血得到对免疫细胞疗法充分的数的NK细胞及树突细胞是可能的。从而，可大幅地减轻由对患者的采血导致的时间及身体负担。特别是，在由免疫细胞疗法的癌的治疗中，多需要达长期的多次的免疫细胞的施用。此时，大量的采血不仅对患者而言是非常的负担，随患者的状态，无法采血而变得不得不延期或中止治疗行为本身。如此，本发明中涉及的方法可容易地实现减轻患者的负担地实施继续的免疫细胞疗法。
本发明中涉及的方法是分离从个体(例如人)采集的血液中所含的有用的免疫系统细胞，并使其增殖的方法。根据本发明得到的单核细胞，通过分化是制作免疫细胞疗法中使用的树突细胞的材料。另外，根据本发明得到的NK细胞及树突细胞是在免疫细胞疗法中直接使用的细胞(药品)。
〔结论〕
本发明中涉及的方法是得到单核细胞或NK细胞的方法，其包括：
使用对单核细胞的表面标志物特异性的抗体从末梢血分离单核细胞，由此回收单核细胞样品的工序，
将分离单核细胞之后的细胞集团作为NK细胞样品回收的工序，以及
培养上述单核细胞样品或NK细胞样品，使单核细胞或NK细胞增殖的工序。
另外，在本发明中涉及的方法中，使单核细胞或NK细胞增殖的上述工序优选是将上述单核细胞样品使用含Flt-3L的第1培养基培养，从而使单核细胞增殖的工序。
另外，本发明中涉及的方法优选还包括：通过向上述第1培养基加GM-CSF及IL-4，一边使单核细胞增殖，一边使单核细胞分化为树突细胞的工序。
另外，在本发明中涉及的方法中，使单核细胞或NK细胞增殖的上述工序优选是将上述NK细胞样品使用含抗CD56抗体或IFN-γ的第2培养基培养，从而使NK细胞增殖的工序。
另外，本发明中涉及的方法优选在使单核细胞或NK细胞增殖的上述工序中，将上述NK细胞样品使用含抗CD56抗体或IFN-γ的第2培养基培养，从而使NK细胞再增殖。
另外，在本发明中涉及的方法中，上述第2培养基优选含抗CD56抗体。
另外，在本发明中涉及的方法中，上述第2培养基优选还含IL-2、IL-12及IL-15。
另外，在本发明中涉及的方法中，上述末梢血优选从个体单次采集。
【实施例】
〔1.从单次采集的末梢血分离单核细胞及NK细胞〕
【1-1.单核细胞的选择性的分离及其确认】
由使用Ficoll溶液(GE HEALTHCARE公司)的密度梯度离心分离(30分钟、900g、20℃)，从自健康者采集的25mL的末梢血分离单核细胞级分。使用RoboSep装置(Stem CellTechnologies公司)，从得到的单核细胞级分再分离单核细胞。在从此单核细胞级分的单核细胞的分离中，作为选择性地分离单核细胞的试剂，使用RoboSep人CD14阳性试剂盒(StemCell Technologies公司)。单核细胞的选择性的分离中的顺序及必要的其他试剂的全部则依据对应于上述试剂的RoboSep装置的运行程序、及随附的使用者手册。
将根据以上的操作得到的样品之一部分与荧光标记的抗CD14抗体(BioLegend公司、针对单核细胞的细胞表面标志物的抗体)混合。然后，由BD FACSCalibur(注册商标)流式细胞仪(日本BD公司)研究此混合物中所含的单核细胞的程度。此FACS解析的结果示于图1。图1是显示对CD14阳性细胞进行FACS解析的象限区的直方图的图。如图1所示，可确认，在上述样品中主要含在表面表达CD14的单核细胞。
【1-2.NK细胞的存在的确认】
将1-1.中得到的单核细胞的余下的细胞集团之一部分与荧光标记的抗CD56抗体(BioLegend公司、针对NK细胞的细胞表面标志物的抗体)混合。然后，由BD FACSCalibur(注册商标)流式细胞仪研究此混合物中所含的NK细胞的程度。此FACS解析的结果示于图2。图2是显示对CD56阳性细胞进行FACS解析的象限区的直方图的图。如图2所示，得知在以往废弃的细胞集团中含有用的NK细胞。
如上所述，得知，除了仅分离单核细胞的以往的方法之外，通过再回收至今废弃的细胞集团，可从由单次的采血得到的少量的末梢血将单核细胞及NK细胞各自分开得到。
〔2.单核细胞及NK细胞的增殖〕
【2-1.本发明中涉及的，单核细胞的增殖及向树突细胞的分化】
使1-1.中分离的单核细胞增殖，从其分化为树突细胞。至培养的0～第3天，使用向X-VIVO-15培养基(宝生物公司)补充1000IU/mL的GM-CSF(Miltenyi Biotec公司)、2000IU/mL的Flt-3L(Cellgenix公司)、50ng/mL的庆大霉素、及5％的自身血浆的培养基A1，使单核细胞选择性地增殖。在第3天，向培养基A1加1000IU/mL的IL-4(Miltenyi Biotec公司)(培养基A2)。然后，通过持续培养至第11天，使单核细胞分化为未成熟树突细胞。在第11天，将未成熟树突细胞使用MUC1肽(ThermoFisher公司)、或者封入脂质小胞的WT1等进行脉冲。然后，使用将10ng/mL的IL-1β(Miltenyi Biotec公司)、1000IU/mL的IL-6(Miltenyi Biotec公司)、1μg/mL的PGE2(CaymanChemical公司)、20ng/mL的TNF-α(Miltenyi Biotec公司)、及0.1KE的氯化毕西巴尼(中外制药)加到培养基A2而得到的培养基A3，使未成熟树突细胞分化为成熟树突细胞。以上中的全部的培养在5％CO2存在下的37℃实施。培养的第0、3、6、8、11及14天的各自中的细胞数(细胞数/mL)由锥虫蓝染色确定。确定的细胞数的经时的变化示于图3。
如图3(添加Flt-3L)所示，在培养的14天后可确认，在第0天是7.4×105细胞的细胞增殖至1.05×107细胞。以上中，从单核细胞分化，增殖的树突细胞的数是1.05×107细胞。从而，可从单次采集的25mL的末梢血得到对于免疫细胞疗法充分的数的树突细胞。
【2-2.增殖的细胞种类的确认】
在2-1.的培养的第3及14天的各自中，由FACS解析确认增殖的细胞的种类。使用荧光标记的CD14抗体(BioLegend公司)研究第3天的培养物之一部分。使用荧光标记的抗CD11c抗体(BD公司)及荧光标记的抗CD83抗体(eBioscience公司)研究第14天的培养物之一部分。使用BD FACSCalibur(注册商标)流式细胞仪(日本BD公司)实施全部的FACS解析。这些的FACS解析的结果示于图5及6。
如图5所示，得知，在第3天的培养物中基本上仅含单核细胞。如图6所示，得知，在第14天的培养物中基本上仅含成熟树突细胞。从而确认，2-1.中的增殖及分化如所希望地进行。
【2-3.使用刺激单核细胞的公知的因子培养单核细胞】
与2-1.不同地再次进行1-1.的操作，分离单核细胞。将此单核细胞，除未将Flt-3L添加到培养基的点之外，在与2-1.相同的条件下培养。此培养的各时间点的细胞数示于图3。如图3(非添加Flt-3L)所示，用诱导单核细胞的分化的一般的此方法，在培养的第14天，细胞仅增殖至2.8×106/mL。
如上所述，本发明中涉及的方法通过使用至今未知作用于单核细胞的增殖的因子，可得到对于医疗用途充分的数的成熟树突细胞。
【2-4.NK细胞的选择的增殖】
如以下一样培养1-1.中得到的细胞集团。在培养的第0天中，使用向KBM502培养基(Kohjin Bio公司)(预先含1750IU/mL的IL-2)补充200IU/mL的IL-12(Miltenyi Biotec公司)、2000IU/mL的IL-15(Cellgenix公司)、80μg/mL的抗CD56抗体(Biolegend公司)、及5％的自身血浆的培养基，在5％CO2存在下的38℃，经24小时使淋巴细胞活化。然后，将培养条件变更为5％CO2存在下的37℃，将细胞培养至第14天。培养的第0、3、6、8、11及14天的各自中的细胞数(细胞数/mL)由锥虫蓝染色确定。确定的细胞数的经时的变化示于图4。
如图4(IL-2，抗-CD56，IL-12，IL-15)所示，培养的14天后可确认，在第0天是9.6×106细胞的细胞数增加至8.8×108细胞。在以上中，增殖的NK细胞的数是大概109细胞。从而，可从单次采集的25mL的末梢血得到对免疫细胞疗法充分的数的NK细胞。
【2-5.增殖的细胞种类的确认】
在2-4.的培养的第14天，由FACS解析确认增殖的细胞的种类。使用荧光标记的抗CD56抗体(BioLegend公司)研究各培养物之一部分。使用BD FACSCalibur(注册商标)流式细胞仪(日本BD公司)实施FACS解析。此FACS解析的结果示于图7。
如图7所示，确认最终得到基本上仅含NK细胞的培养物。
【2-6.作为生长因子仅使用IL-2的NK细胞的增殖】
与2-4.不同地再次进行1-1.的操作，得到含NK细胞的细胞集团。将此细胞集团，除作为生长因子仅使用IL-2的点之外，在与2-4.相同的条件下培养。此培养的各时间点的细胞数示于图4。如图4(IL-2)所示，用此方法，在培养的第14天，细胞数仅增加至4.6×107细胞，未得到充分的细胞。
从以上得知，为了使从末梢血分离的NK细胞选择性地增殖，得到希望程度的数，仅用IL-2是不充分的，至少必要IL-12、IL-15及抗CD56抗体之任何。
如从本实施例得知，可从微少25mL的单次采集的末梢血，分别得到对于免疫细胞疗法充分的量的树突细胞及NK细胞。从而，可从以检查作为目的的程度的量的末梢血大量地得到2种有用的免疫系细胞。即，本发明中涉及的方法可提高使用树突细胞及NK细胞的免疫细胞疗法的有用性(使对受采血的对象的时间及身体负担大幅地降低)。
本发明不限于上述的各实施方式及实施例，专利权利要求中所示的范围内的各种变更是可能的，适宜组合不同的实施方式及实施例中各自公开的技术的方案而得到的实施方式也包括在本发明的技术的范围内。
【工业实用性】
本发明可用于对各种疾病的免疫细胞疗法。
本说明书还包括如下内容：
1.得到单核细胞或NK细胞的方法，其包括：
使用对单核细胞的表面标志物特异性的抗体从末梢血分离单核细胞，由此回收单核细胞样品的工序，
将分离单核细胞之后的细胞集团作为NK细胞样品回收的工序，以及
培养上述单核细胞样品及NK细胞样品之中的至少一方而使单核细胞或NK细胞增殖的工序。
2.实施方式1所述的方法，其中使单核细胞或NK细胞增殖的上述工序是将上述单核细胞样品使用含Flt-3L的第1培养基培养，从而使单核细胞增殖的工序。
3.实施方式2所述的方法，其还包括通过向上述第1培养基加入单核细胞的刺激因子，一边使单核细胞增殖，一边使单核细胞分化为树突细胞的工序。
4.实施方式1所述的方法，其中使单核细胞或NK细胞增殖的上述工序是将上述NK细胞样品使用含抗CD56抗体或IFN-γ的第2培养基培养，从而使NK细胞增殖的工序。
5.实施方式2或3所述的方法，其中在使单核细胞或NK细胞增殖的上述工序中，将上述NK细胞样品使用含抗CD56抗体或IFN-γ的第2培养基培养，从而使NK细胞再增殖。
6.实施方式4或5所述的方法，其中所述第2培养基含抗CD56抗体。
7.实施方式4～6之任一项所述的方法，其中所述第2培养基还含IL-2、IL-12及IL-15。
8.实施方式1～7之任一项所述的方法，其中所述末梢血从个体单次采集。

Claims (7)

1.得到NK细胞的方法，其包括：
使用对单核细胞的表面标志物特异性的抗体从末梢血分离单核细胞，由此回收单核细胞样品的工序，
将分离单核细胞之后的细胞集团作为NK细胞样品回收的工序，以及
使用含抗CD56抗体的第1培养基培养上述NK细胞样品而使NK细胞增殖的工序。
2.权利要求1所述的方法，其还包括将上述单核细胞样品使用含Flt-3L的第2培养基培养，从而使单核细胞增殖的工序。
3.权利要求2所述的方法，其还包括通过向上述第2培养基加入单核细胞的刺激因子，一边使单核细胞增殖，一边使单核细胞分化为树突细胞的工序。
4.得到树突细胞的方法，其包括：
使用对单核细胞的表面标志物特异性的抗体从末梢血分离单核细胞，由此回收单核细胞样品的工序，
将分离单核细胞之后的细胞集团作为NK细胞样品回收的工序，
将上述单核细胞样品使用含Flt-3L和GM-CSF的第2培养基培养，从而使单核细胞增殖的工序，及
通过向上述第2培养基加入单核细胞的刺激因子，一边使单核细胞增殖，一边使单核细胞分化为树突细胞的工序。
5.权利要求4所述的方法，其还包括将上述NK细胞样品使用含抗CD56抗体或IFN-γ的第1培养基培养，从而使NK细胞增殖的工序。
6.权利要求1～3和5之任一项所述的方法，其中所述第1培养基还含IL-2、IL-12及IL-15。
7.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中所述末梢血从个体单次采集。
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