CN107083360B - 一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，分离来源丰富的人外周血CD4+T细胞，经过能符合临床药品生产质量管理规范(GMP)的简便诱导方法，在短期内将CD4+CD25‑T细胞诱导并扩增成为高纯度、高调节效率的CD4+CD25+CD127dim的抗原非特异性调节性T细胞。经过一个周期(6～7天)的诱导培养，即可获得足够治疗剂量的Treg，诱导的Treg表型和调节功能稳定，而且极大降低了由于长期体外培养可能出现的细胞活力减弱、微生物污染等事件的发生率，且质控方法特异快速，非常适合于临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法。
背景技术
细胞、组织或器官移植是治疗器官严重功能障碍或终末期功能衰竭的主要方案，在绝大多数情况下，器官捐献者(供者)与接受移植者(受者)是遗传背景不同的个体，因此，不可避免会发生急、慢性免疫排斥反应，而这正是影响移植治疗效果最主要的原因。介导免疫排斥反应的主体是受者体内的效应细胞，它们识别外来移植物抗原后活化、增殖并分泌大量效应分子，直接和/或间接地导致移植物损伤，目前，需要使用免疫抑制药物来控制效应细胞的功能，但是，长期服用免疫抑制药物会带来机会性感染、恶性肿瘤、心血管疾病、神经毒性等毒副作用，而且难以阻止慢性排斥导致的移植物功能丧失。因此，医学工作者正努力寻找新的抑制排斥反应的方法，以替代这些化学药物。大量实验研究表明，一类具有免疫负性调节功能的细胞能有效抑制效应细胞的功能，其中最重要的是调节性T细胞(Treg)。获得足够数量Treg的方法主要分两类，一类是分离出天然存在于机体内的Treg，然后在体外扩增，由于天然Treg的数量极少，需要进行多个周期的增殖培养(每6～7天为一个周期)，然而在此过程中，Treg的调节能力容易丢失；另一类方法是分离出机体内大量存在的静息T细胞(naive T细胞)，然后在体外利用抗原呈递细胞诱导培养出Treg，其只抑制能与供者抗原起作用的效应细胞，从而避免广泛的免疫抑制，尽管该类方法有众多的诱导方案，但几乎都受到诱导条件的限制，如一些抗原呈递细胞不易获取、价格昂贵、操作复杂、不符合临床标准等，而仅适合于实验研究，不利于临床开展。
发明内容
基于调节性T细胞(即Treg)的免疫细胞治疗具有良好的临床应用前景，如可能应用于治疗T细胞介导的自身免疫性疾病或应用到器官移植领域诱导免疫耐受。与抗原特异性Treg相比，抗原非特异性Treg应用适应症更广，但目前现有技术存在的最大问题是体外诱导调节性T细胞成本昂贵、耗时长、诱导效率较低、表型及调节作用不稳定等。本发明利用物极必反原理，采用文献从未报道过的全新方法，分离来源丰富的人外周血CD4+ T细胞，经过能符合临床药品生产质量管理规范(GMP)的简便诱导方法，在短期内将CD4+ CD25-T细胞诱导并扩增成为高纯度、高调节效率的CD4+CD25+CD127dim的抗原非特异性调节性T细胞。由于具有抗原非特异性，使其可能广泛应用于难治性T细胞介导的自身免疫性疾病。
本发明提供了一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，步骤包括：
S1、从人外周血中分离出外周血单个核细胞PBMC；
S2、去除非CD4+ T细胞，再去除CD25+ T细胞，从而得到CD4+CD25-CD45RA+T细胞：
S3、将CD4+CD25-CD45RA+T细胞重悬于含5～10％AB型人血清或自体血清的AIM-VCTS培养基，计数细胞总量，加入1～4倍细胞数量的抗CD3/CD28磁珠或抗CD3/CD28抗体、和终浓度为500～2000U/ml的rhIL-2，刺激培养6～12天诱导结束，培养过程中每2～3天补加一次rhIL-2；
S4、计数获得的活细胞量，取部分诱导后的T细胞进行表型和纯度的鉴定；
S5、将剩余诱导后的T细胞重悬于含5～10％人血清的AIM-V CTS培养基，加入终浓度为50～300U/ml的rhIL-2，培养1～2天以静息诱导后的T细胞；分选活细胞后，取部分细胞进行混合淋巴细胞培养，其余细胞用含人血清白蛋白的生理盐水重悬。
本发明的有益效果是：本发明的诱导来源细胞是外周血中含量丰富的T细胞，其数量远远多于nTreg，经过一个周期(6～7天)的诱导培养，即可获得足够治疗剂量的Treg，从而能及时输注体内，这对灵活应用于各种临床治疗方案非常有利。由于不需要像传统扩增nTreg的方法那样需要多个周期(5～6个周期)的培养，本发明诱导的Treg表型和调节功能稳定，而且极大降低了由于长期体外培养可能出现的细胞活力减弱、微生物污染等事件的发生率。另外，本发明成本较低、操作简单、稳定高效、重复性好、使用的所有试剂材料都能符合临床使用规范，质控方法特异快速，非常适合于临床应用。
附图说明
图1为体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞方法的流程图；
图2为实施例1中诱导前后，流式细胞术分析的表型变化结果；
图3为实施例1中诱导前后，在所有CD4+T细胞中，各种表型分子为阳性的细胞所占比例的比较结果；
图4为实施例1中naive CD4+T经过诱导培养后，所得Treg细胞数量增殖倍数的结果；
图5为实施例1MLR反应体系中，加入不同比例的诱导Treg，其抑制CD4+T细胞与CD8+T细胞增殖的流式细胞术分析结果；
图6为实施例1中加入不同比例的诱导Treg时，其抑制两种T细胞增殖的效率的统计结果；
图7为实施例2中诱导前后，流式细胞术分析的表型变化结果；
图8为实施例2中诱导前后，在所有CD4+T细胞中，各种表型分子为阳性的细胞所占比例的比较结果；
图9为实施例2中naive CD4+T经过诱导培养后，所得Treg细胞数量增殖倍数的结果；
图10为实施例2MLR反应体系中，加入不同比例的诱导Treg，其抑制CD4+T细胞与CD8+T细胞增殖的流式细胞术分析结果；
图11为实施例2中加入不同比例的诱导Treg时，其抑制两种T细胞增殖的效率的统计结果；
图12为实施例3中诱导前后，流式细胞术分析的表型变化结果；
图13为实施例3中诱导前后，在所有CD4+T细胞中，各种表型分子为阳性的细胞所占比例的比较结果；
图14为实施例3中naive CD4+T经过诱导培养后，所得Treg细胞数量增殖倍数的结果；
图15为实施例3MLR反应体系中，加入不同比例的诱导Treg，其抑制CD4+T细胞与CD8+T细胞增殖的流式细胞术分析结果；
具体实施方式
目前有报道的抗原非特异性Treg制备方法只有一种：抽取人外周血后，通过密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞，利用磁珠分选试剂盒或流式细胞分选术，分选出单个核细胞中的天然调节性T细胞(nTreg)，在体外培养环境中，利用包被有抗CD3/CD28抗体的磁珠和大剂量rhIL-2扩增多个周期(每6～7天为一个周期)，以获得大量调节性T细胞(Treg)。
通过天然调节性T细胞(即nTreg)体外扩增抗原非特异性Treg的方法扩增周期长，得到的Treg表型不易维持，调节作用不够强。由于健康人外周血nTreg的比例很低(占外周血单个核细胞的1～3％)，能分离得到的nTreg数量非常有限(每100ml健康人外周血仅能分选出1～4.5×106个nTreg)，而临床治疗级的抗原非特异性Treg的输注量为1×107个/kg。因此体外扩增得到能用于临床免疫治疗的、足够数量的、且能保持调节功能的Treg十分困难。此外，自身免疫性疾病的患者往往存在nTreg的数量减少或功能异常，从患者的nTreg扩增得到的抗原非特异性Treg可能治疗效果明显受限。
现有技术是在分离数量稀少的外周血nTreg的基础上体外扩增抗原非特异性Treg，而本发明是在分离外周血含量丰富的未激活CD4+ T细胞(即CD4+ T细胞)基础上进行体外诱导，实现表型从CD25-CD127high到CD25+CD127dim的转化，且数量还能得到一定倍数的增加。
本发明提供的一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，步骤包括：
S1、从人外周血中分离出外周血单个核细胞PBMC；
S2、去除非CD4+ T细胞，再去除CD25+ T细胞，从而得到CD4+CD25-CD45RA+T细胞；
S3、将CD4+CD25-CD45RA+T细胞重悬于含5～10％AB型人血清或自体血清的AIM-VCTS培养基，计数细胞总量，加入1～4倍细胞数量的抗CD3/CD28磁珠或抗CD3/CD28抗体(即方案中用于提供第一、第二信号的抗CD3/CD28磁珠可用功能性抗CD3/CD28抗体替代)，和终浓度为500～2000U/ml的rhIL-2，刺激培养6～12天诱导结束，培养过程中每2～3天补加一次rhIL-2；
S4、计数获得的活细胞量，取部分诱导后的T细胞进行表型和纯度的鉴定；
S5、将剩余诱导后的T细胞重悬于含5～10％人血清的AIM-V CTS培养基，加入终浓度为50～300U/ml的rhIL-2，培养1～2天以静息诱导后的T细胞；分选活细胞后，取部分细胞进行混合淋巴细胞培养，其余细胞用含人血清白蛋白的生理盐水重悬。
优选的，步骤S5所述混合淋巴细胞培养为：以步骤S1所述PBMC为反应细胞，以不同个体的灭活PBMC为刺激细胞或者将抗CD3/CD28抗体作为刺激源，进行混合淋巴细胞培养，在混合淋巴细胞培养体系中加入步骤S5所述分选的活细胞共同培养3～6天，通过流式细胞术检测反应细胞的增殖水平，以确定Treg的免疫调节功能、调节效率和抗原特异性。该步骤是明确Treg功能效价的重要质控步骤，对输注治疗效果的评判具有参考价值。
更加优选的，所述反应细胞与分选的活细胞添加量之比为1∶1～1∶0.125。
优选的，步骤S1所述外周血单个核细胞PBMC的方法为：向人外周血中加入等体积生理盐水稀释并混匀后，利用人Ficoll淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞。
优选的，步骤S2所述得到CD4+CD25-CD45RA+T细胞的方法为：将步骤S1所得PBMC先后与人初始T细胞分选试剂盒中的生物素标记的抗体复合物、亲和素磁珠孵育，并经磁场纯化，以去除非CD4+ T细胞，再与包被有抗CD25抗体的磁珠孵育，并经磁场纯化，以去除CD25+T细胞，从而得到CD4+CD25-CD45RA+T细胞。
优选的，步骤S3所述刺激培养在37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中进行。
优选的，步骤S4所述表型和纯度的鉴定包括通过流式细胞术检测CD27、CD95、CD45RA、GITR、CD127、CD25、Foxp3、CTLA-4、CD62L、CXCR3、CCR7、CD69、ICOS分子的表达。该步骤是重要的质控步骤，用来检验诱导细胞的质与量能否满足输注治疗的需要。
优选的，步骤S5所述生理盐水含2％人血清白蛋白。
下面将结合具体实施例对本发明提供的一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例1
本实施例提供了体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，方法流程图如附图1所示，具体步骤包括：
1：征集自愿受试者，抽取20ml外周血，加入等体积生理盐水稀释并混匀后，利用人Ficoll淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(即PBMC)，分离得到5.6×107个PBMC；
取2.4×107个PBMC用于T细胞的分选，将PBMC先后与人初始T细胞(即T)分选试剂盒中的生物素标记的抗体复合物、亲和素磁珠孵育，并经磁场纯化，以去除非CD4+ T细胞，再与包被有抗CD25抗体的磁珠孵育，并经磁场纯化，以去除CD25+ T细胞，从而得到CD4+CD25-CD45RA+T细胞。得到3.95×106个CD4+CD25-CD45RA+T细胞。剩余PBMC冷冻保存以备后续MLR使用。
2：取3.0×106个CD4+CD25-CD45RA+T细胞重悬于4ml含8％自体血清的AIM-V CTS培养基，加入2倍数量的抗CD3/CD28磁珠和终浓度为1000U/ml的rhIL-2，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，刺激培养6天，培养过程中每2天补加一次rhIL-2，使rhIL-2终浓度为1000U/ml。剩余9.5×105个细胞用流式细胞术进行CD27、CD95、CD45RA、GITR、CD127、CD25、Foxp3、CTLA-4等分子的表达检测。
3：诱导结束后，磁场去除抗CD3/CD28的磁珠，通过台盼蓝拒染法计数，获得的活细胞总量为7.59×106个，细胞增殖2.53倍。取1×106个诱导的Treg细胞进行表型和纯度的鉴定(检测分子同步骤2)，这是重要的Treg表型质控步骤，检测结果如附图2、附图3、附图4所示。结果显示，经过一个周期的诱导，细胞增殖了2.53倍，表型分子CD127的表达比例明显下降，CD25、GITR、CD95与CTLA-4的表达比例明显升高，均符合诱导型Treg的表型特征。将剩余细胞重悬于新鲜的AIM-V CTS培养基(含8％自体血清)，加入终浓度为200U/ml的rhIL-2，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，培养1天以静息诱导后的Treg细胞。
4：MLR：将冻存的自愿受试者的PBMC复苏，作为反应细胞(其中包含CD4+与CD8+两种T细胞)，以抗CD3/CD28抗体作为刺激源，进行混合淋巴细胞培养试验，在MLR体系中加入不同比例的诱导所得Treg(1∶1～1∶0.125)，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，共同培养3天后，通过流式细胞术检测反应细胞的增殖水平，以确定Treg的免疫调节功能和调节效率。这是重要的检测诱导Treg功能的质控步骤，结果如图5、附图6所示。结果显示，在1∶1、1∶0.5、1∶0.25、1∶0.125四种比例组中，诱导的Treg均表现出免疫调节功能，当诱导Treg的比例降为0.5时，其抑制两种T细胞增殖的效率仍然大于70％，明显强于传统方法扩增的抗原非特异性Treg。
本实施例建立了一种全新的诱导人Treg的方法，即分选出人naive T细胞，在体外利用一种刺激因子和抗CD3/CD28磁珠的刺激，6～7天内培养出高纯度大量Treg。该方法能使T细胞增殖1.8～3.1倍，其中75％以上具有Treg表型特征，而且抑制效应细胞反应的效价较高，与效应细胞的数量比例为1∶2时，仍然能发挥50％以上的抑制效率，显著高于由nTreg扩增培养出的细胞。这种Treg是各种抗原特异性克隆的组合体，输注受者体内后，在存在供者抗原刺激的免疫微环境的影响下，其中供者抗原特异性克隆将会得到优势存活机会甚至扩增，从而逐步发挥特异性的免疫调节作用，这与免疫抑制药物的长期广泛抑制作用有着根本的不同，这也使得受者既可以输注自身的Treg，也可以在不宜抽血的情况下，接受健康人的Treg。这种诱导Treg的方法成本较低、操作简单、稳定高效、重复性好、使用的所有试剂材料都能符合临床使用规范，且naive T细胞来源丰富，易于获得治疗量的Treg，目前国内外均未见相同的报道。该方法诱导的Treg不仅可以用于实体器官移植，而且能应用于骨髓移植、自身免疫性疾病的治疗，将具有良好的临床应用前景。
实施例2
本实施例提供了体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，方法流程图如附图1所示，具体步骤与实施例1基本相同，区别在于：
步骤2中：取4.99×106个CD4+CD25-CD45RA+T细胞重悬于8ml含10％自体血清的AIM-V CTS培养基，加入3倍数量的抗CD3/CD28磁珠和终浓度为2000U/ml的rhIL-2，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，刺激培养6天，培养过程中每3天补加一次rhIL-2，使rhIL-2终浓度为2000U/ml。剩余细胞用流式细胞术进行CD27、CD95、CD45RA、GITR、CD127、CD25、Foxp3、CTLA-4等分子的表达检测。
3：诱导结束后，磁场去除抗CD3/CD28的磁珠，通过台盼蓝拒染法计数，获得的活细胞总量为9.35×106个，细胞增殖1.87倍。取1×106个诱导的Treg细胞进行表型和纯度的鉴定(检测分子同步骤2)，结果与实施例1基本一致，经过一个周期的诱导，细胞增殖了1.87倍，表型分子CD127的表达比例明显下降，CD25、GITR、CD95与CTLA-4的表达比例明显升高，均符合诱导型Treg的表型特征，结果如附图7、附图8、附图9所示。将剩余细胞重悬于新鲜的AIM-VCTS培养基(含10％自体血清)，加入终浓度为100U/ml的rhIL-2，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，培养1天以静息诱导后的Treg细胞。
4：MLR：将冻存的自愿受试者的PBMC复苏，作为反应细胞(其中包含CD4+与CD8+两种T细胞)，以抗CD3/CD28抗体作为刺激源，进行混合淋巴细胞培养试验，在MLR体系中加入不同比例的诱导所得Treg(1∶1～1∶0.125)，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，共同培养3天后，通过流式细胞术检测反应细胞的增殖水平，以确定Treg的免疫调节功能和调节效率。结果与实施例1基本一致，在1∶1、1∶0.5、1∶0.25、1∶0.125四种比例组中，诱导的Treg均表现出免疫调节功能，当诱导Treg的比例降为0.5时，其抑制两种T细胞增殖的效率仍然大于65％，明显强于传统方法扩增的抗原非特异性Treg，结果如附图10、附图11。
实施例3
本实施例提供了体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，方法流程图如附图1所示，具体步骤与实施例1基本相同，区别在于：
步骤2中：取2.9×106个CD4+CD25-CD45RA+T细胞重悬于4ml含5％自体血清的AIM-VCTS培养基，加入1倍数量的抗CD3/CD28磁珠和终浓度为500U/ml的rhIL-2，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，刺激培养12天，培养过程中每3天补加一次rhIL-2，使rhIL-2终浓度为500U/ml。剩余细胞用流式细胞术进行CD27、CD95、CD45RA、GITR、CD127、CD25、Foxp3、CTLA-4等分子的表达检测。
3：诱导结束后，磁场去除抗CD3/CD28的磁珠，通过台盼蓝拒染法计数，获得的活细胞总量为8.9×106个，细胞增殖3.07倍。取1×106个诱导的Treg细胞进行表型和纯度的鉴定(检测分子同步骤2)，结果与实施例1基本一致，经过两个周期的诱导，细胞增殖了3.07倍，表型分子CD127的表达比例明显下降，CD25、GITR、CD95与CTLA-4的表达比例明显升高，均符合诱导型Treg的表型特征，结果如附图12、附图13、附图14所示。将剩余细胞重悬于新鲜的AIM-V CTS培养基(含5％自体血清)，加入终浓度为50U/ml的rhIL-2，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，培养2天以静息诱导后的Treg细胞。
4：MLR：将冻存的自愿受试者的PBMC复苏，作为反应细胞(其中包含CD4+与CD8+两种T细胞)，以抗CD3/CD28抗体作为刺激源，进行混合淋巴细胞培养试验，在MLR体系中加入不同比例的诱导所得Treg(1∶1～1∶0.125)，置于37℃、含5％二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中，共同培养6天后，通过流式细胞术检测反应细胞的增殖水平，以确定Treg的免疫调节功能和调节效率。结果与实施例1基本一致，在1∶1、1∶0.5、1∶0.25、1∶0.125四种比例组中，诱导的Treg均表现出免疫调节功能，当诱导Treg的比例降为0.5时，其抑制CD4+T细胞增殖的效率约为40％，抑制CD8+T细胞增殖的效率约为70％，明显强于传统方法扩增的抗原非特异性Treg，结果如附图15所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于，步骤包括：
S1、从人外周血中分离出外周血单个核细胞PBMC；
S2、去除非CD4+ T细胞，再去除CD25+ T细胞，从而得到CD4+CD25-CD45RA+T细胞；
S3、将CD4+CD25-CD45RA+ T细胞重悬于含5～10％AB型人血清或自体血清的AIM-V CTS培养基，计数细胞总量，加入同等细胞数量的抗CD3/CD28磁珠、和终浓度为500～1000U/ml的rhIL-2，刺激培养6～7天诱导结束，培养过程中每2～3天补加一次rhIL-2；
S4、磁场去除抗CD3/CD28的磁珠，计数获得的活细胞量，取部分诱导后的T细胞进行表型和纯度的鉴定；
S5、将剩余诱导后的T细胞重悬于含5～10％人血清的AIM-V CTS培养基，加入终浓度为50～200U/ml的rhIL-2，培养1～2天以静息诱导后的T细胞，分选活细胞；
S6、取部分步骤S5获得的活细胞进行混合淋巴细胞培养，其余细胞用含人血清白蛋白的生理盐水重悬。
2.如权利要求1所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S6所述混合淋巴细胞培养为：以步骤S1所述PBMC为反应细胞，以不同个体的灭活PBMC为刺激细胞或者将抗CD3/CD28抗体作为刺激源，与步骤S5中所述分选的活细胞共同培养3～6天，通过流式细胞术检测反应细胞的增殖水平。
3.如权利要求2所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：所述反应细胞与分选的活细胞添加量之比为1∶1～1∶0.125。
4.如权利要求1所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S1所述外周血单个核细胞PBMC的分离方法为：向人外周血中加入等体积生理盐水稀释并混匀后，利用人Ficoll淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞。
5.权利要求1所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S2所述得到CD4+CD25-CD45RA+T细胞的方法为：将步骤S1所得PBMC先后与人初始T细胞分选试剂盒中的生物素标记的抗体复合物、亲和素磁珠孵育，并经磁场纯化，以去除非CD4+T细胞，再与包被有抗CD25抗体的磁珠孵育，并经磁场纯化，以去除CD25+ T细胞，从而得到CD4+CD25-CD45RA+T细胞。
6.如权利要求1所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S4所述表型和纯度的鉴定包括通过流式细胞术检测CD27、CD95、CD45RA、GITR、CD127、CD25、Foxp3、CTLA-4、CD62L、CXCR3、CCR7、CD69、ICOS分子的表达。
7.如权利要求1所述的体外诱导扩增人抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S6所述生理盐水含2％人血清白蛋白。
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