CN110129268A - 一种电转后pbmc的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种电转后PBMC的培养方法，该方法包括电转人外周血单个核细胞后，先使用含人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液培养该电转后的人外周血单个核细胞2‑10小时的步骤。本发明还包括使用所述复苏液复苏冻存的人外周血单个核细胞以及培养人外周血单个核细胞的方法。本发明也包括所述复苏液。本发明的复苏液能促进电转后外周血单个核细胞的生长，进而提高其活力；采用本发明的复苏液对冷冻人外周血单个核细胞进行复苏和电转后孵育，能够有效减少冷冻复苏细胞在电转后的死亡，促进细胞增殖。
Description
技术领域
本发明涉及电转后PBMC的培养方法。
背景技术
细胞免疫治疗已经成为一种极具潜力和疗效显著的全新抗肿瘤疗法，弥补 了传统的手术、放疗和化疗的弊端。在癌症免疫疗法中，过继行细胞免疫疗法 近年来取得了长足的进步，其中以嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor， CAR)修饰的T细胞为代表的肿瘤靶向免疫治疗的成就最为突出，在体外和临 床试验中表明出良好的靶向性、杀伤肿瘤性和持续性，展现出巨大的应用潜力 和市场。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的 抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白， 通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。患者 的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。这是一个出 现了很多年，但是近几年才被改良使用到临床上的新型细胞疗法。和其它免疫 疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，但是不 同的是，这是一种细胞疗法，而不是一种药。
在2017年8月30日，医药行业迎来一条重磅新闻，诺华的基因治疗方法 CAR-T细胞药物Kymriah(tisagenlecleucel，CTL-019)被美国FDA批准上市， 用于治疗儿童和年轻成人(2～25岁)的急性淋巴细胞白血病(ALL)。这是医 学史上首款批准的CAR-T疗法，也是在美国境内，首次获批的基因疗法。
现今，多数研究人员使用AIM-V培养基培养CAR-T细胞，在电转完T细 胞后加入CTSTM无血清细胞培养基培养。但是采用AIM-V培养基去培 养电转后的T细胞存在诸多缺点：
1、转染后的T细胞死亡较多；
2、转染后的T细胞增殖缓慢。
因此，急需一种能够有效促进电转后的T细胞增殖并能够高效表达CAR 基因的培养基和培液方法。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种培养方法。该培养基方法在培养电转后人外周 血单个核细胞(PBMC)尤其是T细胞时，能够提高细胞活率和细胞增殖倍数。
具体而言，本发明提供一种培养电转后的人外周血单个核细胞的方法，所 述方法包括电转人外周血单个核细胞后，先使用含人外周血单个核细胞培养液 的上清液的复苏液培养该电转后的人外周血单个核细胞2-10小时的步骤。
还提供的是一种人外周血单个核细胞的培养方法，所述方法包括使用含人 外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液培养该人外周血单个核细胞的步 骤。
还提供的是一种复苏冻存的人外周血单个核细胞方法，所述方法包括使用 含有人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液悬浮和培养解冻后的人外 周血单个核细胞的步骤。
还提供的是一种制备电转的人外周血单个核细胞的方法，所述方法包括所 述复苏、电转前的培养以及电转后的培养的步骤；其中，所述复苏包括使用含 有人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液悬浮和培养解冻后的人外周 血单个核细胞；所述电转前的培养包括，复苏后，使用含人外周血单个核细胞 培养液的上清液的复苏液培养该人外周血单个核细胞；所述电转后的培养包括， 电转后，先使用含人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液培养该电转后 的人外周血单个核细胞2-10小时。
在上述方法的一个或多个实施方案中，所述上清液如下制备：制备含人外 周血单个核细胞和其培养基的细胞悬液并培养8-20小时、优选14-20小时，收 集该培养液的上清，即为所述上清液。
在上述方法的一个或多个实施方案中，所述上清液的制备还包括离心收集 到的上清的步骤。
在上述方法的一个或多个实施方案中，所述含人外周血单个核细胞和其培 养基的细胞悬液中的培养基为CTSTM无血清细胞培养基。
在上述方法的一个或多个实施方案中，所述复苏液含有所述上清液和人外 周血单个核细胞的培养基。
在上述方法的一个或多个实施方案中，所述复苏液中的所述人外周血单个 核细胞的培养基是CTSTM无血清细胞培养基。
在上述方法的一个或多个实施方案中，复苏液中所述上清液与所述人外周 血单个核细胞的培养基的体积比为0.1：1-5：1。
在上述方法的一个或多个实施方案中，复苏液中所述上清液与所述培养基 的体积比为1：2-2：1。
在上述方法的一个或多个实施方案中，复苏液中所述上清液与所述人外周 血单个核细胞的培养基的体积比为1：1.5-1：3。
在上述方法的一个或多个实施方案中，所述复苏液由所述上清液与所述人 外周血单个核细胞的培养基组成；以体积百分比计，所述上清液的体积百分比 为5-70％、优选10-40％、更优选30-40％，所述人外周血单个核细胞的培养基 的体积百分比为30-95％、优选60-80％、更优选60-70％。
在上述方法的一个或多个实施方案中，在使用所述复苏液培养电转的人外 周血单个核细胞后，所述方法还包括将所培养的人外周血单个核细胞转入人外 周血单个核细胞培养基中进行培养的步骤。
在上述方法的一个或多个实施方案中，所述人外周血单个核细胞的培养基 为CTSTM无血清细胞培养基。
在所述复苏方法的一个或多个实施方案中，所述解冻包括将容纳所述冻存 的人外周血单个核细胞的容器置于37℃的温度下迅速解冻。
在所述复苏方法的一个或多个实施方案中，所述方法包括，待容器内的固 体完全融化成液体后，往所述容器中加入1-3倍所述液体体积的所述复苏液， 混匀后再加入3-5倍所述液体体积的复苏液，离心，弃上清，之后加入所述复 苏液，制成细胞悬液。
在所述复苏方法的一个或多个实施方案中，所述方法还包括将制成的悬液 置于37℃、5％CO2的条件下培养的步骤。
本发明也提供一种复苏液，所述复苏液含有人外周血单个核细胞的培养液 的上清液。
在一个或多个实施方案中，所述上清液如下制备：混合人外周血单个核细 胞与其培养基，制成细胞悬液，培养8-20小时、优选14-20小时后，收集培养 液上清，获得所述上清液。
在一个或多个实施方案中，所述细胞悬液中细胞浓度为1×105-1×108个 细胞/mL，优选为1×106-1×107个细胞/mL，更优选为1×106-4×106个细胞/mL。
在一个或多个实施方案中，所述上清液的制备还包括；离心该培养液上清， 收集上清，即为所述上清液。
在一个或多个实施方案中，用于与人外周血单个核细胞培养以制备所述上 清液的培养基是CTSTM无血清细胞培养基。
在一个或多个实施方案中，所述复苏液含有所述上清液和所述人外周血单 个核细胞的培养基。
在一个或多个实施方案中，所述人外周血单个核细胞的培养基是 CTSTM无血清细胞培养基。
在一个或多个实施方案中，所述上清液与所述人外周血单个核细胞的培养 基的体积比为0.1：1-5：1。
在一个或多个实施方案中，所述上清液与所述人外周血单个核细胞的培养 基的体积比为1：1.5-1：3。
在一个或多个实施方案中，所述上清液与所述培养基的体积比为1：2-2： 1。
在一个或多个实施方案中，所述复苏液由所述上清液与人外周血单个核细 胞的培养基组成；以体积百分比计，所述上清液的体积百分比为5-70％、优选 10-40％、更优选30-40％，所述人外周血单个核细胞的培养基的体积百分比为 30-95％、优选60-80％、更优选60-70％。
在一个或多个实施方案中，以体积百分比计，所述复苏液含有30-40％的 所述上清液和60-70％的所述人外周血单个核细胞培养基，或由30-40％的所述 上清液和60-70％的所述人外周血单个核细胞培养基组成。
附图说明
图1：采用实施例2方法电转人外周血单个核细胞后，采用不同培养液孵 育电转后细胞的细胞增殖数目变化。
图2：采用实施例2方法电转人外周血单个核细胞后，采用不同培养液孵 育电转后细胞的细胞活率变化。
图3：采用实施例2方法电转人外周血单个核细胞后，采用不同培养液孵 育电转后细胞的细胞增殖数目变化。
图4：采用实施例2方法电转人外周血单个核细胞后，采用不同培养液孵 育电转后细胞的细胞活率变化。
图5：原培液与新鲜培养基复苏细胞并电转后孵育、培养24h后细胞数目 变化。
图6：原培液与新鲜培养基复苏细胞并电转后孵育、培养24h后细胞活率 变化。
图7：本发明复苏方法和现有复苏方法细胞复苏且培养48小时内的细胞数 量动态变化折线图。
图8：本发明复苏方法和现有复苏方法细胞复苏且培养48小时内的细胞活 力动态变化折线图。
图9：本发明复苏方法和现有复苏方法细胞复苏无血清冻存方法冻存 PBMC后，再培养4天内的细胞数量动态变化折线图。
图10：本发明复苏方法和现有复苏方法细胞复苏无血清冻存方法冻存 PBMC后，再培养4天内的细胞活力动态变化折线图。
图11：本发明复苏方法和现有复苏方法细胞复苏有血清冻存方法冻存 PBMC后，再培养2天内的细胞活力动态变化折线图。
图12：本发明复苏方法和现有复苏方法细胞复苏有血清冻存方法冻存 PBMC后，再培养2天内的细胞数量动态变化折线图。
图13：使用表1获得的复苏液A或D作为培养基培养新鲜分离的人外周 血单个核细胞的结果。
图14：使用表1获得的复苏液A或D作为培养基培养新鲜分离的人外周 血单个核细胞的结果。
图9-12中A、B、C和D与表1复苏液的命名一致。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明涉及电转后人外周血单个核细胞的培养。电转也称为电穿孔，用于 将感兴趣的DNA导入宿主细胞中。可采用本领域周知的各种电转方法和电转 试剂来实施本发明，例如，可使用LONZAI Device及其提供的 电转试剂。可先按照市售电转试剂的说明书配制电转液，加入电转质粒。电转 时，用含电转质粒的电转液重悬细胞，在电转仪器中进行电转。
本发明中，宿主细胞优选为人外周血单个核细胞，尤其是T淋巴细胞。电 转质粒可以是任何感兴趣的质粒，尤其是表达嵌合抗原受体(CAR)的质粒。 电转质粒的量可以是本领域常规的量，例如每5×106个细胞使用3-8ug的质粒 进行电转。
与现有技术电转结束后直接使用常规的人外周血单个核细胞培养基培养 电转细胞相比，本发明电转结束后先使用含有人外周血单个核细胞培养液的上 清液的复苏液培养该电转后的人外周血单个核细胞，之后再换成常规的培养基 继续培养。
可使用本领域常规的人外周血单个核细胞的培养基培养人外周血单个核 细胞，收集其培养液上清，获得所述上清液。用于制备所述上清液的人外周血 单个核细胞可以是新鲜的人外周血单个核细胞，也可以是培养过一段时间的人 外周血单个核细胞，或者是冻存并解冻后的人外周血单个核细胞。优选的是， 人外周血单个核细胞来自健康个体。用于制备该上清液的人外周血单个核细胞 还可以是任意来源(供体)的人外周血单个核细胞。
制备上清液时，可在常规的人外周血单个核细胞的培养条件下进行人外周 血单个核细胞的培养，例如可在37℃、5％CO2的条件下进行。培养时间可在 8-20小时，例如14-20小时。在某些实施方案中，培养时细胞浓度可以在1× 105-1×108个细胞/mL的范围内，例如可在1×106-1×107个细胞/mL的范围内， 或在1×106-4×106个细胞/mL的范围内。
在优选的实施方案中，本发明使用CTSTM无血清细胞培 养基培养人外周血单个核细胞，以制备所述上清液。
培养结束后，收集该细胞培养物的上清，即可制备得到本发明用作复苏液 一部分或全部的上清液。需要时，可过滤该上清，和/或离心，获得本文所述的 上清液。若需短时间内使用，该上清液可在4℃保存；于-20℃可保存6-12个 月，于-80℃可保存一年以上。
本发明的复苏液可由该上清液组成，也可含有该上清液和常用于人外周血 单个核细胞的培养基。优选的是，复苏液中的该人外周血单个核细胞的培养基 与用于培养人外周血单个核细胞以制备所述上清液的培养基相同。在某些实施 方案中，用于培养人外周血单个核细胞以制备本文所述上清液的培养基是 CTSTM无血清细胞培养基。在某些实施方案中，复苏液中所 含的培养基为CTSTM无血清细胞培养基。
在某些实施方案中，本发明的复苏液含有以CTSTM无血 清细胞培养基培养人外周血单个核细胞制备得到的上清液与 CTSTM无血清细胞培养基。
当复苏液含有本文所述的上清液与人外周血单个核细胞的培养基时，上清 液与所述人外周血单个核细胞的培养基的体积比可为0.1：1-5：1，例如1：2-2： 1。在某些实施方案中，上清液与所述人外周血单个核细胞的培养基的体积比 为1：1.5-1：3。在某些实施方案中，以体积百分比计，所述上清液的体积百 分比为5-70％、优选10-40％、更优选30-40％，所述人外周血单个核细胞的培 养基的体积百分比为30-95％、优选60-80％、更优选60-70％。
以体积百分比计，优选的复苏液含有30-70％的所述上清液和30-70％的所 述人外周血单个核细胞的培养基；更优选的复苏液含有30-40％的上清液和60-70％的人外周血单个核细胞的培养基。
电转人外周血单个核细胞后，先使用本文所述的复苏液培养该细胞2-10 小时，例如2-6小时。然后再换成常规的人外周血单个核细胞培养基如 CTSTM无血清细胞培养基继续后续的培养。两种培养都可在常规的人 外周血单个核细胞的培养条件下进行，例如可在37℃、5％CO2的条件下进行。 培养过程中，可加入合适的刺激分子，包括但不限于抗CD3抗体、抗CD28 抗体、IL-2和CD137等，这是本领域培养电转细胞常规技术，可由本领域技 术人员根据实际应用情况容易确定。
进行电转的人外周血单个核细胞可以是未经冻存的人外周血单个核细胞， 如新鲜分离得到的人外周血单个核细胞或培养过一段时间的人外周血单个核 细胞。可采用本领域常规的方法分离得到新鲜的人外周血单个核细胞。例如， 可用常规的淋巴细胞分离液分离人体外周血单个核细胞。对于这类细胞，分离 后、电转前，可加入常规的人外周血单个核细胞培养基制成细胞悬液，在常规 的培养条件下(如37℃、5％CO2)培养至电转。在某些实施方案中，使用本文 所述的复苏液培养该类人外周血单个核细胞，然后再电转。培养时，复苏液的 用量与常规培养基的用量相同或类似，可由本领域技术人员根据经验和实际培养情况加以确定。
在某些实施方案中，进行电转的人外周血单个核细胞是冷冻后复苏的人外 周血单个核细胞。可采用本领域常规的方法复苏冷冻的细胞。例如，复苏时， 先将待解冻的冻存人外周血单个核细胞在37℃下迅速解冻，期间可不断摇动装 有所述细胞的容器，使冻结的细胞迅速溶解成液体。优选的是，在2分钟内使 冻结的团块迅速融化成液体。然后立即加入少量的复苏液，可根据解冻的细胞 体积加入适量的本发明复苏液，例如，加入的复苏液的量通常可为解冻所得液 体体积的1-3倍。吹打混匀后再加入3-5倍体积的复苏液，离心，弃上清，在 细胞沉淀中再加入适量的复苏液，制成悬液，由此完成冻存人外周血单个核细 胞的复苏。此时所加入的复苏液的量应使得制成的细胞悬液中的细胞密度满足 常规的细胞培养要求。例如，加入的复苏液的量可使得所制成的细胞悬液中的 细胞密度在1×105-1×108个细胞/mL的范围内。因此，可根据实际解冻的细 胞量加入1-50mL甚至更多的复苏液。培养可在常规的培养条件下(如37℃和 5％CO2)培养，可完成冻存人外周血单个核细胞的复苏。复苏液可以是常规的 复苏液，例如CTSTM无血清细胞培养基。在优选的实施方案 中，复苏液是本文任一实施方案所述的含人外周血单个核细胞培养液的上清液 的复苏液。因此，本发明复苏人外周血单个核细胞的方法包括解冻冻存的人外 周血单个核细胞、立即混合解冻的人外周血单个核细胞与复苏液、离心获得沉 淀、加入复苏液制成细胞悬液并培养的步骤。复苏后，可采用常规的培养基如 CTSTM无血清细胞培养基培养复苏的人外周血单个核细胞， 或者优选的是如前文所述使用本发明的复苏液培养该人外周血单个核细胞，直 至电转。
因此，本发明培养电转后的人外周血单个核细胞的方法包括电转人外周血 单个核细胞后，先使用本文所述的含人外周血单个核细胞培养液的上清液的复 苏液培养该电转后的人外周血单个核细胞。通常，此培养持续2-10小时，例 如2-6小时。
本发明还包括人外周血单个核细胞的培养方法，该方法使用本文所述的含 人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液培养该人外周血单个核细胞。其 余培养条件可与现有方法相同，例如可37℃、5％CO2条件下进行培养，培养 过程中可添加合适的细胞刺激因子，如IL-2，还可以添加CD137。适用于此方 法培养的人外周血单个核细胞可以是各种来源(来自不同供体)的细胞。此外， 该人外周血单个核细胞可以是经历了各种处理的人外周血单个核细胞，如经历 了冻存和解冻处理的细胞，或者是从新鲜抽取的血液中分离得到的新鲜人外周 血单个核细胞，或者是已经培养过一段时间、但未冻存并解冻的人外周血单个 核细胞。优选的是，此培养方法为电转前的培养。
本发明还提供复苏冻存的人外周血单个核细胞方法，所述方法包括使用本 发明所述的含有人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液悬浮和培养解 冻后的人外周血单个核细胞的步骤。更具体而言，该复苏方法包括解冻完成后 立即用本发明任一实施方案所述的含有人外周血单个核细胞培养液的上清液 的复苏液制备解冻后的人外周血单个核细胞悬液并进行培养的步骤。
在某些实施方案中，本发明还提供一种制备电转的人外周血单个核细胞的 方法，所述方法包括所述复苏、电转前的培养以及电转后的培养的步骤；其中， 所述复苏包括使用本发明所述的含有人外周血单个核细胞培养液的上清液的 复苏液悬浮和培养解冻后的人外周血单个核细胞；所述电转前的培养包括，复 苏后，使用本发明所述的含人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液培养 该人外周血单个核细胞；所述电转后的培养包括，电转后，先使用本发明所述 的含人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液培养该电转后的人外周血 单个核细胞2-10小时。进一步地，使用本发明的复苏液培养该电转后的人外 周血单个核细胞2-10小时后，将细胞转入常规的培养基如 CTSTM无血清细胞培养基中进行培养。
本发明还提供一种复苏液，所述复苏液如本文任一实施方案所述。具体而 言，本发明提供的复苏液含有人外周血单个核细胞培养液的上清液。该上清液 的制备如前文任一实施方案所述。
在某些实施方案中，用于与人外周血单个核细胞培养以制备所述上清液的 培养基是CTSTM无血清细胞培养基。
在某些实施方案中，本发明的复苏液可由该上清液组成，也可含有该上清 液和常用于人外周血单个核细胞的培养基。优选的是，复苏液中的该人外周血 单个核细胞的培养基与用于培养人外周血单个核细胞以制备所述上清液的培 养基相同。在某些实施方案中，用于培养人外周血单个核细胞以制备本文所述 上清液的培养基是CTSTM无血清细胞培养基。在某些实施方案中，复苏液中所含的培养基为CTSTM无血清细胞培养基。
在某些实施方案中，本发明的复苏液含有以CTSTM无血 清细胞培养基培养人外周血单个核细胞制备得到的上清液与 CTSTM无血清细胞培养基。
本发明的复苏液中，上清液与培养基的体积比可为0.1：1-5：1，例如1： 2-2：1。在某些实施方案中，上清液与所述人外周血单个核细胞培养基的体积 比为1：1.5-1：3。在某些实施方案中，复苏液由上清液与人外周血单个核细 胞的培养基组成；以体积百分比计，上清液的体积百分比为5-70％、优选10-40 ％、更优选30-40％，人外周血单个核细胞培养基的体积百分比为30-95％、优 选60-80％、更优选60-70％。以体积百分比计，优选的复苏液含有30-70％的 所述上清液和30-70％的所述人外周血单个核细胞培养基；更优选的复苏液含 有30-40％的上清液和60-70％的人外周血单个核细胞培养基。
本发明也包括本文所述的上清液或复苏液在复苏冻存的人外周血单个核 细胞中的应用，在培养人外周血单个核细胞(尤其是复苏后的人外周血单个核 细胞)中的应用，和/或在培养电转的人外周血单个核细胞中的应用。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有(1)本发明的复苏液，(2) 任选的人外周血单个核细胞的培养基，和(3)任选的细胞刺激因子。所述复 苏液可以仅含有本文所述的上清液。此时，若试剂盒同时含有该上清液和人外 周血单个核细胞的培养基，则两者可独立包装，使用时可根据需要将两者按本 文所述体积比混合，或者也可如本文所述单独将所述上清液用作复苏液，用于 人外周血单个核细胞的复苏、电转前的培养以及电转后的培养。或者，该试剂 盒中该上清液与该培养基以组合物的形式提供，此时，两者的体积比可认为本 文任一实施方案所述。
在某些实施方案中，试剂盒中的复苏液含有所述上清液与人外周血单个核 细胞的培养基，或由其组成。此时，该复苏液中所述上清液与该培养基的体积 比可如本文任一实施方案所述。在该试剂盒还包括(2)所述的人外周血单个 核细胞的培养基时，该复苏液与该培养基独立包装。
试剂盒中还可含有复苏解冻的细胞所需的其它试剂和/或仪器。
本发明以培养PBMC的培养基上清作为复苏和后续培养细胞的培养基，替 代现有方法中普遍采用的新鲜配置的CTSTM无血清细胞培养 基，依靠其中包含的多种细胞在增殖中分泌的刺激因子和活性物质来促进电转 后外周血单个核细胞(尤其是T细胞)的生长，进而提高其活力。尤其在冷冻 复苏的细胞中，采用复苏液对其进行复苏和电转后孵育，能够有效减少冷冻复 苏细胞在电转后的死亡，促进细胞增殖。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述 性的，并非限制本发明的范围。
实施例中，细胞计数和细胞活力测定方法如下：用移液器吹打混匀培养的 细胞，取少量细胞悬液，加入台酚蓝混匀，转入细胞计数板内，采用Countess TMII FL全自动细胞计数仪进行细胞计数和细胞活力测定。
除非另有说明，实施例中所用到的其它方法和材料均为本领域常规的方法 和材料。
实施例1：人外周血单个核细胞的培养和培养上清的收集
用淋巴细胞分离液分离人体外周血单个核细胞后，随后加入50mL CTSTM无血清细胞培养基制成细胞悬液(1×106-4×106个细胞/mL)， 转入150cm2培养瓶内，随后放置在37℃、5％CO2细胞培养箱内培养14-20小 时。
培养上清的收集：在将PBMC培养过夜后，小心从培养瓶内收集细胞上清 液，将上清液分装于50mL离心管内，1000-1500rpm离心5-10min。小心收集 上清液。
收集到的上清液，用一次性注射器吸取后，再用0.22μm滤头过滤，收集 过滤液并放置于冰箱内冷藏。放置在4℃冰箱可短期使用，放置于-20℃冰箱可 保存6-12个月，放置于-80℃冰箱可保存一年以上。
实施例2：PBMC细胞电转
1、电转前
预先将2mL实施例1制备得到的上清液作为复苏液加入12孔板内，随后 转入细胞培养箱内孵育。
2、电转
(1)电转仪器LONZAI Device开机，选取细胞类型为T cell-humam-unstim，选取电转程序为U-014。
(2)接受在培养袋内的不同供体的PBMC细胞，超净台内取样经细胞计 数仪计数后，吸取5×106个细胞至EP管内。将吸取的细胞转入离心机内， 1000-1200rpm离心5-10min。
(3)配置电转液。按照LONZA电转试剂说明书配置电转液随后加6ug 电转质粒(电转质粒为白泽医疗公司提供的P16E09，可表达CAR基因的-质 粒，含报告基因GFP)，混匀后室温静置。
(4)离心好的细胞弃上清，随后用生理盐水清洗细胞再次离心。
(5)离心后取出细胞弃上清，用配置的质粒电转液重悬细胞，小心吸取 细胞重悬液转入LONZA电转杯内。将电转杯放入LONZA I Device电转槽内，启动电转程序。
3、电转后
(1)预先将CD28、CD3抗体按照5ug/mL加入12孔板内，培养箱放置 2-4h，即完成对EA板包板。
(2)电转完成后小心取出电转杯，用电转前预热的复苏液重悬细胞，转 入12孔板内培养4h后，将细胞轻轻吹打混匀，随后转入离心管内1000-1200rpm 离心5-10min，弃上清，用CTSTM无血清细胞培养基重悬细 胞。
(3)取出步骤(1)获得的EA板，将抗体包被液移除，使用生理盐水洗 涤2-3次，随后将步骤(2)获得的重悬的电转细胞转入该EA包被板内，加入 细胞生长刺激因子IL-2(50IU/mL)，培养箱(37℃、5％CO2)培养。
在刺激生长3-5天后，将细胞转板至6孔板继续培养。收集少量细胞用于 细胞计数仪进行计数并检测细胞活率，往后每隔2d进行细胞计数，监测细胞 增殖状况。
对照组电转过程与试验组一致，唯一区别在于步骤1电转前，预先将2mL CTSTM无血清细胞培养基加入12孔板内，随后转入细胞培养箱内(37 ℃、5％CO2)孵育，在电转完成后，将电转细胞转入含CTSTM无血清 培养基的该12孔板内培养4h，随后加入细胞生长刺激因子IL-2(50IU/mL) 转入EA包被板内继续培养。
实施例3：细胞培养以及后续观测
对实施例2中电转的细胞按照是否采用实施例1的上清液作为复苏液孵育4h电转后的细胞分为以下两组：
A：PBMC在电转后采用实施例1的上清液作为复苏液孵育4h，随后转入 CTSTM无血清细胞培养基内继续后续培养。
B：PBMC在电转后采用CTSTM无血清细胞培养基孵育4h，随后 转入CTSTM无血清细胞培养基内继续后续培养。
所有培养均在37℃、5％CO2条件下进行。
实验结果如图1和2所示。图1显示A和B两组细胞增殖数目的变化； 图2显示A和B两组细胞活率的变化。原培液的细胞增殖和细胞活力都明显 优于传统电转后细胞的培养方法。其中，原培液即实施例1的上清液，为A组； 新鲜培液即CTSTM无血清细胞培养基，为B组。
实施例4：不同供体细胞在电转后经复苏液孵育后的细胞生长状况
为了验证复苏液对不同供体细胞在电转、孵育后均具有促进细胞增殖和减 少细胞死亡的能力，本实施例使用来自另一供体的PBMC进行验证。其电转过 程和培养过程与实施例2和3一致。
实验结果如图3和4所示。图3显示两组细胞增殖数目的变化；图4显示 两组细胞活率的变化。其中，原培液为实施例1的上清液；新鲜培液为 CTSTM无血清细胞培养基。
实施例5：经由复苏液复苏的PBMC电转
PBMC在复苏后会出现大量死亡，因此复苏的PBMC再经过电转后，其 存活的细胞数目会很少，本复苏液对复苏后的PBMC能够有效延缓死亡，因此， PBMC经本复苏液复苏后，在进行电转也能够减少电转后细胞的死亡。为此， 本发明方法对其进行验证。
按照实施例1收集上清液，用作复苏液，随后按照以下方法复苏细胞。
一、实验前准备：
将水浴锅预热至37℃，将培养液预热后分装到培养皿中。
二、取出冻存管：
1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
三、迅速解冻：
1、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动， 使管中的液体迅速融化，融化后的液体体积为约1mL。
2、约1-2min后冻存管内液体完全融化，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外 壁，再拿入超净台内。打开冻存管盖子，往冻存管中加入按照实施例1收集到 的复苏液1mL，吹打混匀后转入15mL离心管，随后再加入3mL该复苏液。
四、平衡离心：用架盘天平平衡后，将离心管放入离心机中1000-1500rpm 离心5-8min。
五、制备细胞悬液
1、吸弃上清液。
2、向离心管内加入3mL所述复苏液，吹打制成细胞悬液，随后加入终浓 度50IU/mL的IL-2刺激细胞生长。
六、培养细胞
将细胞转入37℃、5％CO2细胞培养箱内培养2h。
七、电转
按照实施例2所述电转由复苏液复苏的细胞。
八、培养
培养过程如实施例3所述进行。
对照组：将冻存的人外周血单个核细胞从液氮中取出，按照实例案例2中 复苏方法使用CTSTM无血清细胞培养基快速复苏细胞。随后制成细胞 悬液接种六孔板中，使用CTSTM无血清细胞培养基进行培养。放置在 在37℃、5％CO2细胞培养箱内培养2h。此外，对照组中，电转前，预先将2mL CTSTM无血清细胞培养基加入12孔板内，随后转入细胞培养箱内孵育， 电转后将电转细胞转入预先孵育的含CTSTM无血清细胞培养基12孔板 内培养。
结果如图5和6所示。图5显示两组细胞数目变化；图6显示两组细胞活 率变化。采用复苏液进行复苏细胞和后续电转后细胞的孵育能够有效减少电转 后细胞死亡和增强细胞活力。其中，原培液为实施例1的上清液；新鲜培液为 CTSTM无血清细胞培养基，对应对照组。
实施例6：复苏液的制备
按实施例1的方法收集得到上清液，按下表配制复苏液：
表1：上清液与AIM培养基体积(mL)配比
实施例7：复苏细胞活力对比
从液氮罐中取出细胞盒，迅速将冻存管投入到已经预热至37℃的水浴锅中 迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。约1-2min后冻存管内 液体完全融化，融化后液体的体积约为1mL。将冻存管取出，用酒精棉球擦拭 冻存管的外壁，再拿入超净台内。打开冻存管盖子，往冻存管中加入1mL或 3mL表1所示的复苏液A、B、C或D，吹打混匀后转入15mL离心管，随后 再加入3-5倍融化后的液体体积相应的复苏液，在180-200g离心5-8min。离 心结束后，吸弃上清液。向离心管内加入3mL相应的复苏液，吹打制成细胞 悬液，放置在37℃、5％CO2细胞培养箱内培养。
将获得的细胞悬液进行计数，按照2.4×106/mL细胞密度接种六孔板中， 使用复苏液D(补加了50IU/ml的细胞刺激因子IL-2)37℃、5％CO2细胞培养 箱内培养过夜。过夜培养后，用移液器吹打混匀培养的细胞，取少量细胞悬液， 加入台酚蓝混匀，转入细胞计数板内，采用CountessTM II FL全自动细胞计数仪 进行细胞计数和细胞活力测定。
对照组：将冻存的人外周血单个核细胞从液氮中取出，按照实施例2中复 苏方法使用CTSTM无血清细胞培养基(复苏液A)快速复苏 细胞。随后制成细胞悬液后进行计数，按照2.4×106/mL细胞密度接种六孔板 中，使用CTSTM无血清细胞培养基(补加了50IU/ml的细胞 刺激因子IL-2)在37℃、5％CO2细胞培养箱内培养过夜。过夜培养后，用移 液器吹打混匀培养的细胞，取少量细胞悬液，加入台酚蓝混匀，转入细胞计数 板内，采用CountessTM II FL全自动细胞计数仪进行细胞计数和细胞活力测定。
两者对比结果见图7和图8，由图7可以明显看出，经由本发明复苏方法 (“复苏液”)复苏后，培养48h人外周血单个核细胞的细胞数量远远超过了 对照组(“AIM-V培养基”)。图8表明，经由本发明复苏的细胞活力在48h 培养内，其细胞活力一直维持在90％以上，而对照组的细胞活力逐渐下降。这 表明，本发明的复苏方法复苏后细胞活力较高，增殖能力强。
实施例8：不同冻存方法冻存细胞经由本发明复苏方法复苏
现阶段，细胞冻存主要是采用低温液氮保存。保存方法分为有血清和无血 清冻存。本实施例采用本发明的复苏方法对以上两种冻存方法冻存的细胞进行 复苏。
1、细胞的无血清冻存和复苏
(1)细胞无血清冻存液配方：使用商品化无血清细胞冻存液如ScienCell SerumFree-Cell Freezing Medium、CELLBANKER 2或Wako 无血清细胞冻存液。
(2)冻存步骤：将配置好的细胞无血清冻存液与PBMC沉淀细胞混匀， 并调整细胞浓度在2-3×107个/mL。
(3)将细胞悬液分装到2mL冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒， -80℃保存过夜。随后将细胞转入液氮中长期保存。
(4)按照实施例7所述复苏方法复苏步骤(3)冻存的细胞。
结果如图9和10所示，在无血清冻存PBMC后，经由本发明提供的复苏 方法复苏后，在4天的观测中，复苏液复苏和培养的细胞数量远远多于现有复 苏方法(A组)；尤其是B组，采用1mL复苏基础液与2mL培养基混合的配 比比例，细胞数量和细胞活率远远高于现有方法。
2、细胞的有血清冻存和复苏
(1)细胞有血清冻存液配方：按照细胞无血清培养基 CTSTM培养基、血清和DMSO(二甲基亚砜)体积比7:2:1的比例混合均匀。
(2)冻存步骤：将配置好的细胞有血清冻存液与PBMC沉淀细胞混匀， 并调整细胞浓度在2-3×107个/mL。
(3)将细胞悬液分装到2mL冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒， -80℃保存过夜。随后将细胞转入液氮中长期保存。
(4)按照实施例7所述的复苏方法复苏步骤(3)冻存的细胞。
结果如图11和12所示，在有血清冻存PBMC后，经由本发明提供的复苏 方法复苏后，在5天的观测中，复苏液复苏和培养的细胞数量和细胞活率远远 多于现有复苏方法(A组)。这表明，本发明复苏方法对于不同的冻存PBMC 方法都具有促进复苏后人外周血单个核细胞的生长，进而提高其活力的能力。
实施例9：人外周血单个核细胞的培养
本实施例使用表1获得的复苏液作为培养基培养未经冷冻、解冻的人外周 血单个核细胞。用淋巴细胞分离液分离人体外周血单个核细胞，取样进行计数， 两个供体细胞分别取5×106、3×106个细胞转入离心管中，1000-1200rpm离 心5-10min，弃上清。使用表1的复苏液A或D制成细胞悬液(补加了终浓度 为50IU/ml的细胞刺激因子IL-2)接种于6孔板内，在37℃、5％CO2细胞培 养箱内培养。
培养1-5天后，用移液器吹打混匀细胞，取少量细胞悬液，加入台酚蓝混 匀，随后转入细胞计数板内，采用CountessTM II FL全自动细胞计数仪进行细 胞计数和细胞活力测定。
两个供体实验结果如图13和14所示。结果显示，与复苏液A(“复苏液”) 相比，使用复苏液D(“AIM-V”)培养人外周血单个核细胞时能显著降低细 胞死亡、促进细胞增殖。
Claims (22)
1.一种培养电转后的人外周血单个核细胞的方法，其特征在于，所述方法包括电转人外周血单个核细胞后，先使用含人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液培养该电转后的人外周血单个核细胞2-10小时、优选2-6小时的步骤。
2.一种人外周血单个核细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括使用含人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液培养该人外周血单个核细胞的步骤。
3.一种复苏冻存的人外周血单个核细胞方法，其特征在于，所述方法包括使用含有人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液悬浮和培养解冻后的人外周血单个核细胞的步骤。
4.一种制备电转的人外周血单个核细胞的方法，其特征在于，所述方法包括所述复苏、电转前的培养以及电转后的培养的步骤；其中，所述复苏包括使用含有人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液悬浮和培养解冻后的人外周血单个核细胞；所述电转前的培养包括复苏后使用含人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液培养该人外周血单个核细胞；所述电转后的培养包括电转后先使用含人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液培养该电转后的人外周血单个核细胞2-10小时、优选2-6小时。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述上清液如下制备：制备含人外周血单个核细胞和其培养基的细胞悬液并培养8-20小时、优选14-20小时，收集该培养液的上清，即为所述上清液；
优选地，所述细胞悬液中细胞浓度为1×105-1×108个细胞/mL，优选为1×106-1×107个细胞/mL，更优选为1×106-4×106个细胞/mL。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含人外周血单个核细胞和其培养基的细胞悬液中的培养基为CTSTM无血清细胞培养基。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述复苏液由所述上清液组成，或含有所述上清液和人外周血单个核细胞的培养基，或由所述上清液与人外周血单个核细胞的培养基组成；优选地，用于制备所述上清液的培养基与所述复苏液中所含的人外周血单个核细胞培养基是相同的培养基；更优选地，用于制备所述上清液的培养基与所述复苏液中所含的人外周血单个核细胞的培养基都是CTSTM无血清细胞培养基。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，复苏液中所述上清液与所述人外周血单个核细胞培养基的体积比为0.1：1-5：1；如1：2-2：1或1：1.5-1：3；
优选地，以体积百分比计，所述复苏液中上清液的体积百分比为5-70％、优选10-40％、更优选30-40％，人外周血单个核细胞培养基的体积百分比为30-95％、优选60-80％、更优选60-70％；优选地，以体积百分比计，所述复苏液含有30-70％的所述上清液和30-70％的所述人外周血单个核细胞培养基；更优选地，以体积百分比计，所述复苏液含有30-40％的所述上清液和60-70％的所述人外周血单个核细胞培养基，或由30-40％的所述上清液和60-70％的所述人外周血单个核细胞培养基组成。
9.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，在使用所述复苏液培养电转的人外周血单个核细胞后，所述方法还包括将所培养的人外周血单个核细胞转入人外周血单个核细胞培养基中进行培养的步骤；优选地，所述人外周血单个核细胞培养基为CTSTM无血清细胞培养基。
10.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述解冻包括将容纳所述冻存的人外周血单个核细胞的容器置于37℃的温度下迅速解冻。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括，待所述容器内的固体完全融化成液体后，往所述容器中加入1-3倍所述液体体积的所述复苏液，混匀后再加入3-5倍所述液体体积的所述复苏液，离心，弃上清，之后加入所述复苏液，制成细胞悬液。
12.一种复苏液，所述复苏液含有人外周血单个核细胞培养液的上清液和任选的人外周血单个核细胞的培养基。
13.如权利要求12所述的复苏液，其特征在于，所述上清液如下制备得到：培养含人外周血单个核细胞和其培养基的细胞悬液8-20小时、优选14-20小时，收集该培养液的上清，即为所述上清液；
优选地，所述细胞悬液中细胞浓度为1×105-1×108个细胞/mL，优选为1×106-1×107个细胞/mL，更优选为1×106-4×106个细胞/mL。
14.如权利要求13所述的复苏液，其特征在于，所述含人外周血单个核细胞和其培养基的细胞悬液中的培养基为CTSTM无血清细胞培养基。
15.如权利要求12-14中任一项所述的复苏液，其特征在于，所述复苏液由所述上清液组成，或含有所述上清液和人外周血单个核细胞的培养基，或由所述上清液与人外周血单个核细胞的培养基组成；优选地，用于制备所述上清液的培养基与所述复苏液中所含的人外周血单个核细胞培养基是相同的培养基；更优选地，用于制备所述上清液的培养基与所述复苏液中所含的人外周血单个核细胞培养基都是CTSTM无血清细胞培养基。
16.如权利要求15所述的复苏液，其特征在于，复苏液中所述上清液与所述人外周血单个核细胞的培养基的体积比为0.1：1-5：1；如1：2-2：1或1：1.5-1：3；
优选地，以体积百分比计，所述复苏液中所述上清液的体积百分比为5-70％、优选10-40％、更优选30-40％，所述人外周血单个核细胞的培养基的体积百分比为30-95％、优选60-80％、更优选60-70％；优选地，以体积百分比计，所述复苏液含有30-70％的所述上清液和30-70％的所述人外周血单个核细胞培养基；更优选地，以体积百分比计，所述复苏液含有30-40％的所述上清液和60-70％的所述人外周血单个核细胞的培养基，或由30-40％的所述上清液和60-70％的所述人外周血单个核细胞培养基组成。
17.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：
(1)含人外周血单个核细胞培养液的上清液的复苏液；
(2)任选的人外周血单个核细胞的培养基；和
(3)任选的细胞刺激因子。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述复苏液如权利要求12-16中任一项所述。
19.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞刺激因子包括抗CD3抗体、抗CD28抗体和IL-2；优选地，所述细胞刺激因子还包括CD137。
20.如权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述复苏液由所述上清液组成，所述试剂盒含有所述上清液和所述人外周血单个核细胞的培养基，其中，所述上清液与所述人外周血单个核细胞的培养基独立包装，或所述上清液与所述人外周血单个核细胞的培养基为组合物形式；优选地，所述组合物中所述上清液与所述人外周血单个核细胞的培养基的体积比如权利要求16所述。
21.如权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有所述复苏液和所述人外周血单个核细胞的培养基，所述复苏液含所述上清液和人外周血单个核细胞的培养基，或由所述上清液与所述人外周血单个核细胞的培养基组成；
优选地，所述复苏液中所述上清液与所述人外周血单个核细胞的培养基的体积配比如权利要求16所述。
22.权利要求12-16中任一项所述的复苏液或权利要求17-21中任一项所述的试剂盒在复苏解冻的人外周血单个核细胞和/或培养人外周血单个核细胞中的应用，其中，所述培养人外周血单个核细胞中的应用包括电转后的人外周血单个核细胞的培养。
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