JP2023522642A

JP2023522642A - 遺伝子改変自己ｔ細胞を製造するためのプロセス

Info

Publication number: JP2023522642A
Application number: JP2022562462A
Authority: JP
Inventors: リウ，イージュン; ヘンケルス，キャスリン・エイ; アルベラエス，カルロス
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 2020-04-15
Filing date: 2020-04-15
Publication date: 2023-05-31
Also published as: MX2022012990A; AU2020442490A1; CA3180143A1; EP4135724A1; WO2021211104A1

Abstract

本発明は、細胞療法用途に使用するための自己遺伝子改変Ｔ細胞の製造に関する。

Description

養子Ｔ細胞療法は、遺伝子改変Ｔ細胞を利用するものであり、特定の血液学的適応症において有効且つ強力な治療的処置であることが示されている。自己Ｔ細胞は、標的細胞の表面に関連する目的のタンパク質を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの１つ又は複数の細胞表面受容体を発現する一方、標的細胞を認識し死滅させる能力を保持及び／又は増強するように遺伝子改変されている。標的細胞を認識して破壊する遺伝子改変Ｔ細胞の能力に加えて、養子Ｔ細胞療法の成功は、患者に存続し、標的抗原に応答して大きく増大するＴ細胞の能力から利益を得る。遺伝子改変自己Ｔ細胞は、広範囲の癌の治療に大きな成功を示している。

自己Ｔ細胞治療法では、生成物は特定の患者由来の生細胞であり、それはその患者に戻される。したがって、自己細胞の製造は、１つのロットが１人の患者のために製造されるので、従来のバイオ医薬プロセスよりも困難である。製造は患者の試料を受け取ったときにのみ開始することができ、且つ細胞が有効な治療ではなくリスクとなるような大きな改変なしに患者に戻されるように注意しなければならない。十分な量及び質で細胞を製造するために、製造はより実践的で且つ労働集約的であり、小規模で複数回実施される。製造される新しいロット毎に出発物質が異なるので、ドナー間の変動は複雑さを増加させる。

自己製剤の評価基準も、一般的な組換えタンパク質製剤とは異なる。自己Ｔ細胞治療法の場合、生成物純度、細胞表現型、改変Ｔ細胞の割合、効力及び特異性が、試験されるパラメーターである。複雑な自動化システムを使用する統合クローズドプロセスプラットフォームが開発されているが、多額の設備投資が必要である。効率的で、スケーラブルで、信頼性があり、且つ費用対効果の高いプロセスを開発することは、大部分が高度な手作業のプロセスである自己細胞の治療法としての使用を進めるうえで依然として主要な課題の１つである。

汚染のリスク、コスト、設備のフットプリント、並びに現在の製造プロセスの非効率性及び複雑性を低減する、Ｔ細胞治療薬、特に自己Ｔ細胞治療薬を生成するための製造プロセスが要望されている。自己Ｔ細胞療法は、病院関連費用を含まず、患者１人当たり＄３５０，０００～＄４７５，０００の範囲であると予測される。遺伝子改変自己Ｔ細胞が、それらの完全な臨床的及び商業的可能性を達成しようとする場合、商業的に適切な量及び品質での臨床グレードの細胞の製造に直面する課題を克服しなければならない。本明細書に記載される本発明は、自己細胞療法のための遺伝子改変Ｔ細胞への効率的且つ効果的な製造方法を提供することによって、この要望を満たす。

本発明は、少なくとも１つの目的タンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞を製造する方法であって、培養培地を含有するクローズドシングルユースバイオリアクターバッグに、アフェレーシスドナー細胞及び１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターを播種する工程（ここで、バイオリアクターバッグは、ロッキング式バイオリアクタープラットフォームの一部である）、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中で細胞を培養する工程、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの可溶性ウイルスベクターでクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞に形質導入する工程、並びに約２ＲＰＭのロッキング速度でクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞を増殖させるとともに、培養物を収穫まで維持するために必要に応じて培養物容量及びロッキング速度を増加させる工程を含む方法を提供する。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、末梢血由来の細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、有核細胞及び無核細胞を含む。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、白血球及び赤血球を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞はまた、顆粒球及び／又は血小板を含む。一実施形態では、アフェレーシスは、白血球アフェレーシスである。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞を洗浄し、培養培地に再懸濁する。一実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターは、抗ＣＤ３抗体又はその結合フラグメントである。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はその結合フラグメントを含む。一実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、少なくとも抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及び抗ＣＤ２抗体、又はその結合フラグメントを含む。別の実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、少なくとも抗ヒトＣＤ３単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異性四量体抗体複合体、及び抗ヒトＣＤ２単一特異性四量体抗体複合体を含む。別の実施形態では、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．００１μｇ／ｍｌ～少なくとも１０μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ～少なくとも５μｇ／ｍｌである。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターは、播種時に少なくとも１つのドナー細胞に結合する。別の実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、バイオリアクターバッグに播種される前に、１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターと共にインキュベートされる。関連する実施形態では、インキュベーションは、播種前に１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターのアフェレーシスドナー細胞への結合を十分に飽和させることができるだけの時間である。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞及び１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターは、トランスファーバッグ中でインキュベートされる。関連する実施形態では、トランスファーバッグ内の培養培地の容量は約５ｍｌ～約５０ｍｌである。関連する実施形態では、トランスファーバッグ内の培養培地の容量は約５ｍｌ～約１０ｍｌである。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、１つ以上のＴ細胞アクチベーターと共に少なくとも３０分間以上インキュベートされる。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、１つ以上のＴ細胞アクチベーターとともに少なくとも１時間インキュベートされる。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞内の有核細胞の数は、約１．０Ｅ９～約１．３Ｅ９である。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞内の有核細胞の数は、約１．２Ｅ９である。一実施形態では、バイオリアクターバッグに、約１Ｅ６～約５Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度で、アフェレーシスドナー細胞を播種される。関連する実施形態では、バイオリアクターバッグに、約２Ｅ６の細胞密度で、アフェレーシスドナー細胞を播種される。一実施形態では、バイオリアクターバッグは、播種時に少なくとも３００ｍｌ～少なくとも４００ｍｌの培養培地を含有する。関連する実施形態では、バイオリアクターバッグは、播種時に少なくとも３００ｍｌの培養培地を含有する。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、バイオリアクターバッグ内で約１２～２４時間培養される。一実施形態では、培養培地は、少なくとも１つの可溶性サイトカインを含む。関連する実施形態では、可溶性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１から選択される。関連する実施形態では、少なくとも１つの可溶性サイトカインは、ＩＬ－２である。関連する実施形態では、ＩＬ－２は、約２５０ＩＵ／ｍｌ～約３５０ＩＵ／ｍｌの濃度である。関連する実施形態では、ＩＬ－２は、約３００ＩＵ／ｍｌの濃度である。関連する実施形態では、可溶性サイトカインは、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１と組み合わせたＩＬ－７である。関連する実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌ～少なくとも３０ｎｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌ～少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、培養培地はまた、ＷＮＴ経路アクチベーターを含む。関連する実施形態では、ＷＮＴ経路アクチベーターは、ＴＷＳ１１７である。関連する実施形態では、培養培地は、可溶性ＴＷＳ１１７、ＩＬ－７及びＩＬ－２１の混合物を含む。一実施形態では、培養培地はまた、可溶性解糖阻害剤を含む。関連する実施形態では、可溶性解糖阻害剤は、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）である。一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．２５～１０のＭＯＩで添加される。関連する実施形態では、レンチウイルスベクターは、１のＭＯＩで添加される。一実施形態では、細胞は、約２０～２４時間、形質導入される。一実施形態では、形質導入後、培養培地の半分をバイオリアクターバッグから取り出し、等量の新鮮な培養培地と交換する。関連する実施形態では、培養物を約１２～２４時間インキュベートする。一実施形態では、増殖中、新鮮な培養培地を、フェドバッチ／潅流供給によって、及び／又は潅流によってバイオリアクターに添加される。一実施形態では、増殖中、培養物は、１日当たり１バイオリアクターバッグ容量の速度で潅流される。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、バイオリアクター中の培養培地の容量を、増殖中に１リットルまで徐々に増加させる。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、培養培地の容量を、少なくとも２Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度を維持するように徐々に増加させる。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、バイオリアクター中の培養培地の容量を、少なくとも４Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度を維持するように、増殖中に１リットルまで徐々に増加させる。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、ロッキング速度を６ＲＰＭまで徐々に増加させる。一実施形態では、増殖の開始時、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の培養培地の容量は３００ｍｌであり、２°の角度で２ｒｐｍの速度でロッキングする。一実施形態では、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の培養物は、約８０～１００％のＯ_２に維持される。一実施形態では、細胞を７～１４日間増殖させる。一実施形態では、培養、形質導入、及び／又は増殖工程は、３４～３７℃で実施される。一実施形態では、目的タンパク質は、細胞表面受容体である。関連する実施形態では、細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体である。関連する実施形態では、細胞表面受容体は、標的細胞に関連する抗原標的を認識する。関連する実施形態では、標的細胞は、癌細胞である。一実施形態では、遺伝子改変自己Ｔ細胞は、それを必要とする患者の症状を治療するために使用される。

本発明は、上記の方法を用いて作製された遺伝子改変自己Ｔ細胞を含む医薬組成物を提供する。

本発明は、その治療を必要とする患者の症状を治療する方法であって、その患者に上記の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。

本発明は、目的のタンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞における導入遺伝子発現を増加させる方法であって、培養培地を含有するクローズドシングルユースバイオリアクターバッグに、アフェレーシスドナー細胞及び１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターを播種する工程（ここで、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターは、播種時に少なくとも１つのドナー細胞に結合しており、且つバイオリアクターバッグは、ロッキング式バイオリアクタープラットフォームの一部である）、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中で細胞を培養する工程、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの可溶性ウイルスベクターでクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞に形質導入する工程、並びに約２ＲＰＭのロッキング速度でクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞を増殖させるとともに、培養物を収穫まで維持するために必要に応じて培養容量及びロッキング速度を増加させる工程を含み、導入遺伝子の発現は、同じアフェレーシスドナー細胞からのＴ細胞の濃縮集団に由来し、同じ目的タンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞の導入遺伝子の発現より大きい、方法を提供する。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、末梢血由来の細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、有核細胞及び無核細胞を含む。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、白血球及び赤血球を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞はまた、顆粒球及び／又は血小板を含む。一実施形態では、アフェレーシスは、白血球アフェレーシスである。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞を洗浄し、培養培地に再懸濁する。一実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターは、抗ＣＤ３抗体又はその結合フラグメントである。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はそれらの結合フラグメントを含む。一実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、少なくとも抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ＣＤ２抗体、又はその結合フラグメントを含む。別の実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、少なくとも抗ヒトＣＤ３単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異性四量体抗体複合体、及び抗ヒトＣＤ２単一特異性四量体抗体複合体を含む。別の実施形態では、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．００１μｇ／ｍｌ～少なくとも１０μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ～少なくとも５μｇ／ｍｌである。別の実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、バイオリアクターバッグに播種する前に、１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターと共にインキュベートされる。関連する実施形態では、インキュベーションは、播種前に１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターのアフェレーシスドナー細胞への結合を十分に飽和させることができるだけの時間である。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞及び１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターは、トランスファーバッグにおいてインキュベートされる。関連する実施形態では、トランスファーバッグ内の培養培地の容量は約５ｍｌ～約５０ｍｌである。関連する実施形態では、トランスファーバッグ内の培養培地の容量は約５ｍｌ～約１０ｍｌである。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、１つ以上のＴ細胞アクチベーターとともに少なくとも３０分間以上インキュベートされる。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、１つ以上のＴ細胞アクチベーターとともに少なくとも１時間インキュベートされる。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞内の有核細胞の数は、約１．０Ｅ９～約１．３Ｅ９である。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞内の有核細胞の数は、約１．２Ｅ９である。一実施形態では、バイオリアクターバッグに、約１Ｅ６～約５Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度で、アフェレーシスドナー細胞を播種される。関連する実施形態では、バイオリアクターバッグに、約２Ｅ６の細胞密度で、アフェレーシスドナー細胞を播種される。一実施形態では、バイオリアクターバッグは、播種時に少なくとも３００ｍｌ～少なくとも４００ｍｌの培養培地を含有する。関連する実施形態では、バイオリアクターバッグは、播種時に少なくとも３００ｍｌの培養培地を含有する。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、バイオリアクターバッグ内で約１２～２４時間培養される。一実施形態では、培養培地は、少なくとも１つの可溶性サイトカインを含む。関連する実施形態では、可溶性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１から選択される。関連する実施形態では、少なくとも１つの可溶性サイトカインは、ＩＬ－２である。関連する実施形態では、ＩＬ－２は、約２５０ＩＵ／ｍｌ～約３５０ＩＵ／ｍｌの濃度である。関連する実施形態では、ＩＬ－２は、約３００ＩＵ／ｍｌの濃度である。関連する実施形態では、可溶性サイトカインは、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１と組み合わせたＩＬ－７である。関連する実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌ～少なくとも３０ｎｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌ～少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、培養培地はまた、ＷＮＴ経路アクチベーターを含む。関連する実施形態では、ＷＮＴ経路アクチベーターは、ＴＷＳ１１７である。関連する実施形態では、培養培地は、可溶性ＴＷＳ１１７、ＩＬ－７及びＩＬ－２１の混合物を含む。一実施形態では、培養培地はまた、可溶性解糖阻害剤を含む。関連する実施形態では、可溶性解糖阻害剤は、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）である。一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．２５～１０のＭＯＩで添加される。関連する実施形態では、レンチウイルスベクターは、１のＭＯＩで添加される。一実施形態では、細胞は、約２０～２４時間、形質導入される。一実施形態では、形質導入後、培養培地の半分をバイオリアクターバッグから取り出し、等量の新鮮な培養培地と交換する。関連する実施形態では、培養物を約１２～２４時間インキュベートする。一実施形態では、増殖中、新鮮な培養培地を、フェドバッチ／潅流供給及び／又は潅流によってバイオリアクターに添加される。一実施形態では、増殖中、培養物は、１日当たり１バイオリアクターバッグ容量の速度で潅流される。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、バイオリアクター中の培養培地の容量を、増殖中に１リットルまで徐々に増加させる。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、培養培地の容量を、少なくとも２Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度を維持するように徐々に増加させる。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、バイオリアクター中の培養培地の容量を、少なくとも４Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度を維持するように、増殖中に１リットルまで徐々に増加させる。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、ロッキング速度を６ＲＰＭまで徐々に増加させる。一実施形態では、増殖の開始時、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の培養培地の容量は３００ｍｌであり、２°の角度で２ｒｐｍの速度でロッキングする。一実施形態では、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の培養物は、約８０～１００％のＯ_２に維持される。一実施形態では、細胞を７～１４日間増殖させる。一実施形態では、培養、形質導入、及び／又は増殖工程は、３４～３７℃で実施される。一実施形態では、目的タンパク質は細胞表面受容体である。関連する実施形態では、細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体である。関連する実施形態では、細胞表面受容体は、標的細胞に関連する抗原標的を認識する。関連する実施形態では、標的細胞は、癌細胞である。一実施形態では、遺伝子改変自己Ｔ細胞は、それを必要とする患者の症状を治療するために使用される。

本発明は、目的のタンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞で患者を治療する方法であって、患者由来のアフェレーシス細胞を、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はその結合フラグメントからなる群から選択される１つ以上のＴ細胞アクチベーターと共にインキュベートして、抗体結合を飽和させる工程、培養培地を含有するクローズドシングルユースバイオリアクターバッグに、アフェレーシス細胞を播種する工程（ここで、バイオリアクターバッグは、ロッキング式バイオリアクタープラットフォームの一部である）、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中で細胞を培養する工程、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの可溶性ウイルスベクターでクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞に形質導入する工程、約２ＲＰＭのロッキング速度でクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞を増殖させるとともに、培養物を収穫まで所望の細胞密度に維持するために必要に応じて培養物容量及びロッキング速度を増加させる工程、凍結保存のために、細胞を収穫し製剤化するする工程、細胞を凍結し、患者に投与するために必要とされるまで保存する工程、細胞を解凍し、注入に好適な培地に再懸濁する工程、並びに目的のタンパク質を発現する薬学的に有効な量の遺伝子改変自己Ｔ細胞を患者に再導入する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、末梢血由来の細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、有核細胞及び無核細胞を含む。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、白血球及び赤血球を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞はまた、顆粒球及び／又は血小板を含む。一実施形態では、アフェレーシスは、白血球アフェレーシスである。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞を洗浄し、培養培地に再懸濁する。一実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターは、抗ＣＤ３抗体又はその結合フラグメントである。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はその結合フラグメントを含む。一実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、少なくとも抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ＣＤ２抗体、又はその結合フラグメントを含む。別の実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、少なくとも抗ヒトＣＤ３単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異性四量体抗体複合体、及び抗ヒトＣＤ２単一特異性四量体抗体複合体を含む。別の実施形態では、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．００１μｇ／ｍｌ～少なくとも１０μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ～少なくとも５μｇ／ｍｌである。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターは、播種時に少なくとも１つのドナー細胞に結合する。関連する実施形態では、インキュベーションは、播種前に１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターのアフェレーシスドナー細胞への結合を十分に飽和させることができるだけの時間である。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞及び１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターは、トランスファーバッグ中でインキュベートされる。関連する実施形態では、トランスファーバッグ内の培養培地の容量は約５ｍｌ～約５０ｍｌである。関連する実施形態では、トランスファーバッグ内の培養培地の容量は約５ｍｌ～約１０ｍｌである。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、１つ以上のＴ細胞アクチベーターとともに少なくとも３０分間以上インキュベートされる。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、１つ以上のＴ細胞アクチベーターとともに少なくとも１時間インキュベートされる。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞内の有核細胞の数は、約１．０Ｅ９～約１．３Ｅ９である。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞内の有核細胞の数は、約１．２Ｅ９である。一実施形態では、バイオリアクターバッグに、約１Ｅ６～約５Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度で、アフェレーシスドナー細胞を播種される。関連する実施形態では、バイオリアクターバッグに、約２Ｅ６の細胞密度で、アフェレーシスドナー細胞を播種される。一実施形態では、バイオリアクターバッグは、播種時に少なくとも３００ｍｌ～少なくとも４００ｍｌの培養培地を含有する。関連する実施形態では、バイオリアクターバッグは、播種時に少なくとも３００ｍｌの培養培地を含有する。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、バイオリアクターバッグ内で約１２～２４時間培養される。一実施形態では、培養培地は、少なくとも１つの可溶性サイトカインを含む。関連する実施形態では、可溶性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１から選択される。関連する実施形態では、少なくとも１つの可溶性サイトカインは、ＩＬ－２である。関連する実施形態では、ＩＬ－２は、約２５０ＩＵ／ｍｌ～約３５０ＩＵ／ｍｌの濃度である。関連する実施形態では、ＩＬ－２は、約３００ＩＵ／ｍｌの濃度である。関連する実施形態では、可溶性サイトカインは、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１と組み合わせたＩＬ－７である。関連する実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌ～少なくとも３０ｎｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌ～少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、培養培地はまた、ＷＮＴ経路アクチベーターを含む。関連する実施形態では、ＷＮＴ経路アクチベーターは、ＴＷＳ１１７である。関連する実施形態では、培養培地は、可溶性ＴＷＳ１１７、ＩＬ－７及びＩＬ－２１の混合物を含む。一実施形態では、培養培地はまた、可溶性解糖阻害剤を含む。関連する実施形態では、可溶性解糖阻害剤は、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）である。一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．２５～１０のＭＯＩで添加される。関連する実施形態では、レンチウイルスベクターは、１のＭＯＩで添加される。一実施形態では、細胞は、約２０～２４時間、形質導入される。一実施形態では、形質導入後、培養培地の半分をバイオリアクターバッグから取り出し、等量の新鮮な培養培地と交換する。関連する実施形態では、培養物を約１２～２４時間インキュベートする。一実施形態では、増殖中、新鮮な培養培地を、フェドバッチ／潅流供給及び／又は潅流によってバイオリアクターに添加される。一実施形態では、増殖中、培養物は、１日当たり１バイオリアクターバッグ容量の速度で潅流される。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、バイオリアクター中の培養培地の容量を、増殖中に１リットルまで徐々に増加させる。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、培養培地の容量を、少なくとも２Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度を維持するように徐々に増加させる。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、バイオリアクター中の培養培地の容量を、少なくとも４Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度を維持するように、増殖中に１リットルまで徐々に増加させる。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、ロッキング速度を６ＲＰＭまで徐々に増加させる。一実施形態では、増殖の開始時、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の培養培地の容量は３００ｍｌであり、２°の角度で２ｒｐｍの速度でロッキングする。一実施形態では、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の培養物は、約８０～１００％のＯ_２に維持される。一実施形態では、細胞を７～１４日間増殖させる。一実施形態では、培養、形質導入、及び／又は増殖工程は、３４～３７℃で実施される。一実施形態では、目的タンパク質は細胞表面受容体である。関連する実施形態では、細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体である。関連する実施形態では、細胞表面受容体は、標的細胞に関連する抗原標的を認識する。関連する実施形態では、標的細胞は、癌細胞である。一実施形態では、遺伝子改変自己Ｔ細胞は、それを必要とする患者の症状を治療するために使用される。

（Ａ）ＩＬ２のみ、又はＩＬ７、ＩＬ２１及びＴＷＳ１１９のカクテルを補充したＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターにおける細胞増殖の増殖曲線。（Ｂ）ＩＬ２のみ、又はＩＬ７、ＩＬ２１及びＴＷＳ１１９カクテルを補充したＸｕｒｉＷ２５バイオリアクター中で増殖した細胞の生存率。３つの系で発現した改変Ｔ細胞からのＴ細胞導入遺伝子発現：ＸｕｒｉＷ２５バイオリアクター（「Ｘｕｒｉ」）、静的潅流バッグ及びＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターの組み合わせ（「透過性バッグ」）及びＧ－Ｒｅｘ（登録商標）プレート（「Ｇ－Ｒｅｘ」）。３つの系で発現した収穫された改変細胞における白血球サブセット：ＸｕｒｉＷ２５バイオリアクター（「Ｘｕｒｉ」）、静的潅流バッグ及びＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターの組み合わせ（「透過性バッグ」）及びＧ－Ｒｅｘプレート（「Ｇ－Ｒｅｘ」）。３つの系で発現した改変Ｔ細胞からの５日目（Ａ）及び１０日目（Ｂ）のＴ細胞サブセットの比率：ＸｕｒｉＷ２５バイオリアクター（「Ｘｕｒｉ」）、静的潅流バッグ及びＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターの組み合わせ（「透過性バッグ」）及びＧ－Ｒｅｘプレート（「Ｇ－Ｒｅｘ」）。標的細胞の溶解（Ａ）、標的細胞に応答したＩＦＮ－ガンマの放出（Ｂ）、及び標的細胞に応答したＴＮＦ－アルファの放出（Ｃ）の能力によって特徴付けられる改変Ｔ細胞の細胞傷害性機能を示す。標的細胞の溶解（Ａ）、標的細胞に応答したＩＦＮ－ガンマの放出（Ｂ）、及び標的細胞に応答したＴＮＦ－アルファの放出（Ｃ）の能力によって特徴付けられる改変Ｔ細胞の細胞傷害性機能を示す。３つの系で発現した改変Ｔ細胞の標的細胞チャレンジに対する耐性：ＸｕｒｉＷ２５バイオリアクター（「Ｘｕｒｉ」）、静的潅流バッグ及びＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターの組み合わせ（「透過性バッグ」）及びＧ－Ｒｅｘプレート（「Ｇ－Ｒｅｘ」）。アネキシンレベル（Ａ）、Ｔｉｍ３（Ｂ）。２－ＤＧを添加した培地（培地１）及び２－ＤＧを添加しない培地（培地２）で増殖させた細胞の増殖曲線（Ａ）及び生存率（Ｂ）。２－ＤＧを添加した培地（培地１）及び２－ＤＧを添加しない培地（培地２）で増殖させた細胞の導入遺伝子発現。２－ＤＧを添加した培地（培地１）及び２－ＤＧを添加しない培地（培地２）で増殖させた細胞によるＣＤ２５発現。２－ＤＧを添加した培養物（培地１）及び２－ＤＧを添加しない培養物（培地２）中のグルコース（Ａ）及び乳酸塩（Ｂ）濃度。２－ＤＧを添加した培地（培地１）及び２－ＤＧを添加しない培地（培地２）で増殖させた細胞のＴ分化表現型。２－ＤＧを添加した培地（培地１）及び２－ＤＧを添加しない培地（培地２）で増殖させた細胞の収穫したＴ細胞中の白血球サブセット。改変ＴＣＲＴ細胞の効力アッセイの結果。（Ａ）細胞傷害性。（Ｂ）ＩＦＮ－γ。（Ｃ）Ｔ細胞分化。改変ＴＣＲＴ細胞の効力アッセイの結果。（Ａ）細胞傷害性。（Ｂ）ＩＦＮ－γ。（Ｃ）Ｔ細胞分化。ＣＤ８＋細胞（Ａ）又はＣＤ４＋細胞（Ｂ）にゲートした、濃縮及び非濃縮プロセスから収穫したＴ細胞の導入遺伝子発現。ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＴＣＲのベクターコピー数。収穫終了時に測定した白血球及び白血球サブセットの割合。３人のドナー由来の濃縮細胞及び非濃縮細胞から収穫したときのＴ細胞表現型。濃縮ドナー細胞及び非濃縮ドナー細胞からのバイオリアクター中の細胞の増殖曲線（Ａ）及び生存率（Ｂ）。細胞の増殖曲線及び生存率。０日目及び１０日目の白血球サブセットの割合。バイオプロセシング中のＴ細胞分化。細胞表面レベル（Ａ）及びＤＮＡレベル（Ｂ）での、収穫したＴ細胞における導入遺伝子の発現を示す。異なるエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比での標的細胞のキリングの割合。標的細胞に応答した収穫細胞のＩＦＮ－ガンマ放出。ＣＤ６９、ＣＤ２５及び４－１ＢＢによって測定された、コーティングされた抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体及びｐａｎＴ細胞活性化の滴定の結果。ＣＤ６９、ＣＤ２５及び４－１ＢＢによって測定された、コーティングされた抗ＣＤ３に対する様々な可溶性アクチベーターによるｐａｎＴ細胞の刺激の結果。改変Ｔ細胞、ＰａｎＴ細胞（Ａ）及びアフェレーシスドナー細胞（Ｂ）の形質導入効率。様々なアクチベーターによって活性化された細胞の細胞増殖。形質導入効率に対する培養条件の影響。細胞密度及び形質導入効率。ＴＣＲ形質導入のための感染多重度。（Ａ）１～１０のＭＯＩ、（Ｂ）０．２５～２のＭＯＩ。

自己Ｔ細胞療法は個別化された療法であり、遺伝子改変Ｔ細胞は患者自身の細胞、「自己細胞」に由来し、操作され、患者に戻される。Ｔ細胞又はＴリンパ球は、身体の免疫応答に積極的に関与するリンパ球の一種（他はＢ細胞及びＮＫ細胞である）を指す。自己細胞の使用は免疫学的応答のリスクを低減するが、患者１人当たり１ロットの治療を製造することは複雑さ及びコストを加える。また、自己Ｔ細胞療法は患者中心であるため、この治療は従来の生物学的治療法とは異なり、大規模な製造及び既製の使用には適していない。

自己Ｔ細胞療法は、標的細胞に関連するタンパク質を認識する目的のタンパク質を発現するように改変された、患者自身の生きたＴ細胞を用いて患者を治療することを含む。自己Ｔ細胞製造プロセスは、一般に、セミクローズド工程及び／又はクローズド工程を含む複数の単位操作を使用し、製造過程を通して、プレート、フラスコ、容器、バッグ、又は他のタイプの容器、典型的にはガス透過性容器などの複数の容器の間で患者の細胞を移動させる。これらの移送は、シリンジ又はピペット、遠心分離機などの手段により１つの容器から別の容器へと流体を移動させることを伴い得るが、それは剪断力によって細胞に不必要な応力を加え、細胞を汚染物質や喪失に曝す可能性がある。加えて、そのような容器は、細胞分離器、バイオセーフティキャビネット及びインキュベータなどの機器内及び機器間の手動移送を必要とする。

本明細書に記載されるように、９８％を超える高純度のＴ細胞を生成し、ＣＤ８Ｔ細胞で４５％を超える高い導入遺伝子発現を示し、１０日間の完全に閉鎖された連続的なプロセスにおいて、９０％を超える生存率で１００億超の細胞収率を生じる、目的タンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞を製造する方法が開発された。アフェレーシスドナー細胞から出発して、Ｔ細胞は、収穫時の約５０％から、遺伝子操作及び活性化細胞の増殖後の９８％を超えるまで選択的に増殖される。得られたＴ細胞は分化が少なく、より幹細胞又はメモリー様の表現型を保ち、これが持続性及び全体的有効性を増大させる。得られた細胞は、標的細胞のキリング及び標的細胞チャレンジに対する耐性がより強力である。

増殖速度及び生存率は、活性化及び形質導入の前に濃縮された細胞と同等であったが、形質導入はより効率的であり、収穫されたドナー細胞から直接生成された細胞の機能及び有効性はより大きかった。

遺伝子改変自己Ｔ細胞は、全期間に亘ってロッキング運動を生じさせることができるバイオリアクターを使用して、活性化、形質導入及び増殖の工程を通して、閉鎖系連続ロッキング培養において生成された。ロッキングは、プロセス中の細胞密度の増加に伴い、バイオリアクター容積（増殖の終わりまでに１リットルに増加）及び酸素レベルの変化に合わせて調整された。これにより、静的条件下での培養培地の制限のために、低い細胞密度（≦２Ｅ６細胞／ｍｌ）で増殖されなければならない静的培養を使用する方法とは対照的に、高密度培養を支援するのに十分な酸素及び栄養素の物質移動が保証された。バイオリアクターバッグ及び一般的に使用されている静的Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）ガス透過性培養システムにおいてロッキングされた細胞はいずれも効率的な酸素輸送を有したが、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）システムは、適時に栄養素を細胞に移送する対流を欠いた。また、バイオリアクターバッグは、非常に高い細胞密度（場合によっては、５０Ｅ６細胞／ｍｌまで）を支持する新鮮な培地の潅流を利用することができる。

静的ガス透過性容器、又は静的（活性化及び形質導入操作）システム及びロッキング（増殖操作）システムの組み合わせを使用して生成された培養物中で生成された細胞と比較して、本明細書に記載される方法は、実地作業の３０％超を排除し、コストを大幅に低減した。ガス透過性容器中で静的培養物を調製し維持するために不可欠なインキュベータ及び他の支援装置は必要ではなく、これらの静的培養物が必要とする取り扱い及び操作から、製造フットプリント、並びに細胞及び装置の汚染のリスクを低減する。これらのシステムによって生成される細胞の増殖速度及び生存率は同等であったが、本明細書に記載の方法によって生成された細胞の導入遺伝子発現、機能及び有効性は、静的培養、又はハイブリッド静的／ロッキング培養においてガス透過性容器を利用する培養において生成された細胞よりも大きかった。

ドナーは、遺伝子改変自己Ｔ細胞を製造するために血液細胞の試料が必要とされる任意の対象であり得る。ドナーは、本明細書に記載の方法によって生成された細胞集団（すなわち、自己ドナー）による治療を必要とする患者であり得る。

ドナー細胞は、体外法、静脈穿刺、又は血液試料が一般に得られる他の採血法などの当該技術分野で使用される任意の好適な方法によって、循環末梢血から採取され得る。一実施形態では、ドナー細胞はアフェレーシスによって採取される。アフェレーシスは、ドナーから血液を取り出し、これを細胞成分及び可溶性成分に分離し、血液から特定の所望の成分を除去し、その後、残りの血液をドナーに戻すことを指す。Ｔ細胞が、例えば細胞療法用途のためなどの所望の細胞型である場合、白血球アフェレーシス、すなわちドナーの末梢血から白血球（ｂｌｏｏｄｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））を優先的に除去するアフェレーシスプロセスが最も頻繁に使用される。採取された白血球アフェレーシス試料は、Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）容器で提供され得る。複数の血液量を同じドナーから処理して、完全なＬｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）を生成する。

アフェレーシスは、分画遠心法などの方法を使用して、入ってくる血液を様々な血液成分に分離する。しかしながら、血液成分間の密度は近接しているため、これにより純粋な細胞集団は得られず、アフェレーシスプロセスによって収集された試料中に細胞が残存し、アフェレーシス手順中に処理される血液の量が増すにつれ、これらの残存細胞の量は増加する。白血球アフェレーシスによって集められた細胞は、単球、樹状細胞、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞）、及び顆粒球を含む白血球並びに巨核球などの有核細胞、並びに赤血球及び血小板などの核を有さない細胞を含むであろう。集められたアフェレーシス試料中のリンパ球の割合は全血と比較してより濃縮されているが、試料中にはＮＫ細胞、赤血球、血小板及び顆粒球などの他の細胞もかなりの数が存在する。

アフェレーシス細胞は、白血球及びリンパ球などの血液細胞を採取するための供給源として頻繁に使用される。しかしながら、これらの試料は血液細胞の混合物を含むので、例えば、アフェレーシス細胞を含有するＬｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）は、採取された細胞試料を目に見えて赤色にする何百億個もの赤血球を含有する可能性がある。赤血球は、例えば、エレクトロポレーションを使用した場合、トランスフェクション速度を大きく低下させるなど、試料中の細胞のさらなる処理に影響を及ぼすことが知られている。「これらの白血球アフェレーシス生成物には細胞集団に固有の変動性があるので、不要な細胞の除去又は特定の細胞集団の単離を行うためのプロセスが、遠心分離、磁気、蛍光及びに音響に基づく選択による物理的分離を含む様々な技術を用いて開発されている。細胞種は、密度勾配媒体系（例えば、Ｆｉｃｏｌｌなど）の使用の有無にかかわらず、遠心分離によりサイズに基づいて分離することができ、これにより、白血球アフェレーシス生成物から、顆粒球、血小板及び残りの赤血球混入物などの望ましくない画分を除去することができる。Ｉｙｅｒｅｔａｌ．，（２０１８）ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．５，１５０。自己Ｔ細胞及び同種異系Ｔ細胞の製造においては、細胞療法に関連する特定の方法又は適用で細胞を使用する前に、アフェレーシス試料から所望の細胞集団又は表現型をさらに単離、選択及び／又は濃縮することが一般的に行われている。このさらなる処理の目的は、Ｔ細胞の活性化又は増殖などの使用のために、ＰＢＭＣなどの高度に定義された細胞集団、又は具体的なリンパ球集団を得ることであり、例えば、Ｓｔｒｏｎｃｅｋｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１４，１２：２４１－２４９を参照されたい。

特定のＴ細胞表現型の濃縮などの所望の細胞集団を得るための手順は、自己Ｔ細胞製造プロセスにおける最も高価な単位操作の１つであり、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＰｌｕｓ磁気分離技術を使用する臨床状況において、患者１人当たり平均約１万ドルである。濃縮後でも、Ｔ細胞純度は９０～９５％にしか到達せず、Ｔ細胞の約１０％は陰性画分（フロースルー）において失われ得る。

アフェレーシス細胞などの採取された血液試料中のＰＢＭＣ及びリンパ球から赤血球及び顆粒球を分離するための標準的な手順は、密度勾配遠心法の使用による。この目的のために使用される典型的な密度勾配材料は、親水性多糖であるＦｉｃｏｌｌ（登録商標）であり、これは、全血又はアフェレーシスプロセス若しくは他の方法によって採取された血液などの血液試料中の成分を分離する。Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）密度勾配は、バフィーコート中に見出される単核細胞、樹状細胞及びリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞）を、ペレット中に見出される赤血球、血小板及び顆粒球から分離する。しかしながら、異なるＦｉｃｏｌｌ（登録商標）分離媒体、プロトコール、操作者のスキルなどは、細胞の収率、生存率及び機能に影響を及ぼし得る。加えて、いくつかのプロセスでは、細胞は高浸透圧Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）溶液中で操作された後、人工培地に再懸濁され、これは、Ｔ細胞機能に対して重大な改変効果をもたらし得る。Ｍａｌｌｏｎｅｅｔａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６３：３３－４９（２０１０）を参照されたい。また、自己赤血球に対し高い結合性を発現するリンパ球がＦｉｃｏｌｌ（登録商標）分離中にこれらのＴ－ロゼッティング細胞の喪失をもたらすことが示されている。例えば、Ｈｏｋｌａｎｄｅｔａｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１，３５３－３５６（１９８０）を参照されたい。

さらに、さらに単離され、選択され且つ／又は増強されたアフェレーシス細胞は、洗浄及び分離プロセスの一部としての遠心分離、密度勾配などのさらなる操作に供される。これは、これらのプロセスの間に繰り返し受ける剪断力に起因する細胞損傷及び損失につながり得る。加えて、手動で、又は自動化されたプロセスの一部として、細胞が取り扱われるたびに、細胞の曝露及び汚染のリスクが増大する。異なるドナーからの大量の試料が自己細胞療法用途で使用するために処理される製造施設では、処理された試料の外来ドナー細胞による汚染は、ドナー患者にとって、深刻なリスク及び危険である。

本明細書に記載される方法では、特定の細胞集団又は表現型のためにさらなる単離、分離及び／又は濃縮を行うことなく、アフェレーシス試料全体を利用する。本方法は、白血球アフェレーシスによって採取された、例えば、単球、樹状細胞、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞）及び顆粒球を含む白血球並びに巨核球などの有核細胞、並びに赤血球及び血小板などの核を有さない細胞を含む数十億もの細胞で開始される。アフェレーシス試料中の細胞の約３０～６０％のみがＴ細胞であるが、他の支援細胞は、この方法の結果に対して正の効果を有し、Ｔ細胞の健康全般にその０日目から寄与する。これらのアフェレーシス試料に由来する遺伝子改変Ｔ細胞は、アフェレーシス試料中の他の細胞と共に処理された場合、特定のＴ細胞集団についてさらに濃縮された同じアフェレーシス細胞と比較して、より速く増殖し、より高い形質導入効率を有し、且つより多くのメモリー様状態を維持した。

細胞型又は表現型によるなど、アフェレーシス細胞の任意のサブセットについてのさらなる単離、選択及び／又は濃縮は、高い純度及び生存率を有し、高い導入遺伝子発現を有する遺伝子改変Ｔ細胞を達成するために必要ではなく、この混合細胞集団から出発して、１０日プロセスで数百億を十分に超える細胞密度を生成する能力に影響を及ぼさないことがわかった。得られたＴ細胞は、分化が少なく、持続性及び全体的有効性を増大させるよりメモリー様の表現型のままであり、チャレンジ時に標的細胞を死滅させる能力がより高かった。アフェレーシス細胞からの出発は、目的の細胞を単離する磁気分離又は他の沈降といった追加の分離工程を不要とし、その結果、連続した最小限の操作で、アフェレーシスドナー細胞から遺伝子改変Ｔ細胞を収穫することが可能になった。これにより、製造施設内の患者１人当たりのフットプリント、及び採取された細胞を処理する時間は大幅に減少する。さらに、活性化前のドナー細胞の選択又は増強の必要性がなくなることにより、ドナー試料に対する操作が少なくなり、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）などの不必要な化学物質への曝露が減少し、全体的な細胞損失、全体的なコスト、及び細胞への損傷の可能性が減少し、患者試料を汚染するリスクが大幅に減少する。自己細胞試料は、深刻な疾患を有する患者に由来する。これらの患者から細胞試料を採取し、得られた遺伝子改変Ｔ細胞を患者に戻す場合、常にリスクを伴う。過剰な操作及び不必要な処理への細胞の曝露、集中的な実践的処理時の取り扱いミス、又は汚染された細胞を患者に戻すことによって、さらなる不必要なリスクに患者を曝露することは、実行可能な選択肢ではない。

本発明は、少なくとも１つの目的タンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞を製造する方法であって、培養培地を含有するクローズドシングルユースバイオリアクターバッグに、アフェレーシスドナー細胞及び１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターを播種する工程（ここで、バイオリアクターバッグは、ロッキング式バイオリアクタープラットフォームの一部である）、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中で細胞を培養する工程、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの可溶性ウイルスベクターでクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞を形質導入する工程、並びに約２ＲＰＭのロッキング速度でクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞を増殖させるとともに、培養物を収穫まで維持するために必要に応じて培養容量及びロッキング速度を増加させる工程を含む方法を提供する。

一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、末梢血由来の細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、有核細胞及び無核細胞を含む。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、白血球及び赤血球を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞はまた、顆粒球及び／又は血小板を含む。一実施形態では、アフェレーシスは、白血球アフェレーシスである。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）で提供される。

アフェレーシスドナー細胞は、アフェレーシス後、アフェレーシスドナー細胞を活性化する前に、いかなる細胞集団又は細胞種でついてもさらなる単離、選択及び／又は濃縮に供されることはない。

理解されるように、採取した細胞を洗浄して、血漿画分及びあらゆるアフェレーシス緩衝液を除去し、その後の処理のために、採取した細胞を適切な緩衝液又は培地に入れることができる。この目的のために、自動クローズドプロセスが市販されており、例えば、ＳｅｐａｘＣ－Ｐｒｏ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）、Ｃｏｂｅ２９９１セルプロセッサ（ＴｅｒｕｍｏＢＣＴ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＣＯ）、ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ））などが挙げられる。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、播種前に、洗浄され、培養培地に再懸濁される。増殖した遺伝子改変自己Ｔ細胞を製剤化及び凍結保存のために収穫するまで、さらなる洗浄工程は行われない。

Ｔ細胞活性化は、ナイーブＴ細胞のエフェクター細胞への増殖及び分化をもたらす抗原依存性プロセスである。活性化は、一次及び共活性化シグナルによって刺激される。適切な刺激により、Ｔ細胞はインビトロで増殖する。Ｔ細胞は完全に活性化されるために２つのシグナルを必要とし、一次刺激は、Ｔ細胞受容体と抗原提示細胞上のペプチド－ＨＬＡ分子との相互作用による抗原特異的である。第２は、抗原提示細胞の膜とＴ細胞との間の相互作用による非抗原特異的共刺激シグナルである。

本明細書に記載されるように、活性化強度は、より良好な形質導入効率と相関しないようであった。結合したアクチベーターは、最高のシグナル強度を提供したにもかかわらず、高い形質導入率をもたらさなかった。可溶性アクチベーター、例えば、可溶性ＣＤ３、ＣＤ２８及び／又はＣＤ２抗体の混合物、特に可溶性ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ２抗体の組み合わせは、バッグに結合したアクチベーターとビーズに結合したアクチベーターとの中間に位置するシグナル強度を有したが、それらは最高のＧＦＰ発現と改変されたＴＣＲでＴ細胞を活性化した。

１つ又は複数の可溶性Ｔ細胞アクチベーターを使用して、活性化Ｔ細胞集団を生成することができる。そのようなＴ細胞アクチベーターとしては、Ｔ細胞刺激因子及び／又は共刺激分子を標的とする抗体又はその機能的フラグメントが挙げられる。そのようなＴ細胞アクチベーターとしては、抗ＣＤ３抗体若しくは結合フラグメント、抗ＣＤ２８抗体若しくは結合フラグメント、及び抗ＣＤ２抗体若しくは結合フラグメント、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。また、抗ヒトＣＤ３単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異性四量体抗体複合体、及び抗ヒトＣＤ２単一特異性四量体抗体複合体も挙げられる。このようなＴ細胞アクチベーターは、様々な供給源から市販されており、なかでも、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣＣＡが挙げられる。

一実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターは、抗ＣＤ３抗体又はその結合フラグメントである。一実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はこれらの結合フラグメントを含む。別の実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、少なくとも抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ＣＤ２抗体、又はこれらの結合フラグメントを含む。別の実施形態では、Ｔ細胞アクチベーターは、少なくとも抗ヒトＣＤ３単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異性四量体抗体複合体、及び抗ヒトＣＤ２単一特異性四量体抗体複合体を含む。

一実施形態では、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．００１μｇ／ｍｌ～少なくとも１０μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、濃度は、少なくとも０．０１μｇ／ｍｌ～少なくとも１０μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、濃度は、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ～少なくとも１０μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、濃度は、少なくとも１μｇ／ｍｌ～少なくとも１０μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、濃度は、少なくとも５μｇ／ｍｌ～少なくとも１０μｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．００１μｇ／ｍｌ～少なくとも１μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．０１μｇ／ｍｌ～少なくとも１μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ～少なくとも１μｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．００１μｇ／ｍｌ～少なくとも５μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．０１μｇ／ｍｌ～少なくとも５μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ～少なくとも５μｇ／ｍｌである。関連する実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも１μｇ／ｍｌ～少なくとも５μｇ／ｍｌである。一実施形態では、濃度は、少なくとも０．００１μｇ／ｍｌである。一実施形態では、濃度は、少なくとも０．０１μｇ／ｍｌである。一実施形態では、濃度は、少なくとも０．１μｇ／ｍｌである。一実施形態では、濃度は、少なくとも１μｇ／ｍｌである。一実施形態では、濃度は、少なくとも５μｇ／ｍｌである。一実施形態では、濃度は、少なくとも１０μｇ／ｍｌである。一実施形態では、濃度は１０μｇ／ｍｌ超である。

一実施形態では、培養培地は、少なくとも１つの可溶性サイトカインを含む。ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１などのサイトカインもまた、可溶性Ｔ細胞刺激剤として使用することができる。一実施形態では、可溶性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１から選択される。一実施形態では、可溶性サイトカインは、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１と組み合わせたＩＬ－７である。そのようなサイトカインは、少なくとも５ｎｇ／ｍｌ～少なくとも３０ｎｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で使用され得る。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌ～少なくとも２５ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌ～少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌ～少なくとも１５ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌ～少なくとも１０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌ～少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも１５ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも２５ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも３０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの濃度は、３０ｎｇ／ｍｌ超である。ＷＮＴ経路アクチベーターなどの、Ｔ細胞活性化又は成熟に影響を及ぼす他の分子も含まれ得る。このようなアクチベーターとしては、セリン／トレオニンキナーゼグリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（Ｇｓｋ－３β）の阻害剤である４，６－二置換ピロロピリミジンＴＷＳ１１９（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。一実施形態では、ＴＷＳ１１９の濃度は、少なくとも５μＭ～少なくとも２０μＭ又はそれ以上である。一実施形態では、ＴＷＳ１１９の濃度は、少なくとも５μＭ～少なくとも１５μＭである。一実施形態では、ＴＷＳ１１９の濃度は、少なくとも５μＭ～少なくとも１０μＭである。一実施形態では、ＴＷＳ１１９の濃度は、少なくとも１０μＭ～少なくとも２０μＭである。一実施形態では、ＴＷＳ１１９の濃度は、少なくとも５μＭである。一実施形態では、ＴＷＳ１１９の濃度は、少なくとも１０μＭである。一実施形態では、ＴＷＳ１１９の濃度は、少なくとも１５μＭである。一実施形態では、ＴＷＳ１１９の濃度は、少なくとも２０μＭである。一実施形態では、ＴＷＳ１１９の濃度は、２０μＭ超である。一実施形態では、培養培地は、可溶性ＴＷＳ１１７、ＩＬ－７及びＩＬ－２１の混合物を含む。

一実施形態では、少なくとも１つの可溶性サイトカインは、ＩＬ－２である。一実施形態では、ＩＬ－２は、約２５０ＩＵ／ｍｌ～約３５０ＩＵ／ｍｌの濃度である。一実施形態では、可溶性サイトカインは、約２５０ＩＵ／ｍｌ～３００ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ－２である。一実施形態では、可溶性サイトカインは、約３００ＩＵ／ｍｌ～３５０ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ－２である。一実施形態では、可溶性サイトカインは、約２５０ＩＵ／ｍｌ、３００ＩＵ／ｍｌ又は３５０ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ－２である。一実施形態では、可溶性サイトカインは、約２５０ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ－２である。一実施形態では、可溶性サイトカインは、約３００ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ－２である。一実施形態では、可溶性サイトカインは、約３５０ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ－２である。

抗原刺激の間、Ｔ細胞は解糖代謝に移行して、エフェクター機能を維持する。これは、細胞にアクチベーターを添加した後の最初の数日で起こる。活性化工程及び形質導入工程の間に、解糖代謝を阻害するために、活性化剤と共に解糖阻害剤を添加することができ、これは、分化の少ない表現型、増強された形質導入効率、及び／又は増強されたＴ細胞発現を示すＴ細胞の生成に寄与することができる。本明細書に記載されるように、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）阻害Ｔ細胞由来の改変Ｔ細胞は、２－ＤＧを含まない培地由来のＴ細胞と比較して、より多くのＴｓｃｍ及びＴｃｍを産生した。阻害剤は、収穫まで、又は解糖を回復させ、Ｔ細胞増殖を支援する任意の時点で除去されるまで、培養培地中に保持され得る。一実施形態では、培養培地はまた、可溶性解糖阻害剤を含む。関連する実施形態では、可溶性解糖阻害剤は、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）である。一実施形態では、２－ＤＧの濃度は、約１ｍＭ～約３ｍＭである。関連する実施形態では、２－ＤＧの濃度は、約１ｍＭ～約２ｍＭである。関連する実施形態では、２－ＤＧの濃度は、約２ｍＭ～約３ｍＭである。一実施形態では、２－ＤＧの濃度は、約１ｍＭ以下である。一実施形態では、濃度は、約２ｍＭである。一実施形態では、２－ＤＧの濃度は、約３ｍＭ以上である。

改変Ｔ細胞を生成するための手順には、特定の細胞型又は表現型のための採取したドナー試料に対する細胞単離、選択及び／又は濃縮、活性化、形質導入、増殖、収穫、製剤化並びに凍結保存など、多くの単位操作が含まれる。これらの工程の各々の間、複数の容器又はプロセスが、各操作を行うために使用され得る。例えば、所望の細胞型又は表現型を得るために、１つ又は複数の閉鎖系容器及び／又はプロセスを使用して、洗浄、磁気抗体標識、選択又は濃縮手順の実施、遠心分離／沈降、及び単離、選択又は濃縮された細胞の濃縮などの工程が実施され得る。活性化のための結合アクチベーター及び／又は形質導入を促進するための結合剤が、それらがプレートにコーティングされているか、バッグにコーティングされているか、又はビーズ若しくは他の支持体に結合されているかにかかわらず多く使用される。これらの結合したアクチベーターを用いた刺激又は形質導入が完了したなら、細胞を除去し、洗浄し、新しい容器に移す必要がある。栄養素の要求の増加及び培養量の増加に対応するために、増殖中に複数の容器を使用することができる。これらの工程に関連する異なるタイプの容器間の切り替えには、時間や費用がかかり、また細胞を損傷、喪失及び汚染にさらすおそれがある。

本明細書に記載されるように、本発明はアフェレーシスドナー細胞の播種から、増殖した遺伝子改変Ｔ細胞の収穫までの全過程の閉鎖系連続操作を提供する。活性化、形質導入及び増殖を含む全ての工程が、少なくとも２ＲＰＭの速度で絶えずロッキングされるシングルクローズドバイオリアクターシステムにおいて行われる。これは、ドナー材料の手動操作を最小限に抑え、汚染及び細胞喪失のリスクを低減するだけでなく、供給及び培養操作の自動化を可能にする。活性化及び／又は形質導入のためのインキュベータ及び個別の容器などの追加の機器は、ドナー細胞の処理に必要なくなり、汚染及び細胞喪失のリスクが大きく低減されるだけでなく、材料／試薬及びＦＴＥ時間、並びに製造施設内の患者１人当たりのフットプリントも低減する。

本明細書に記載されるように、Ｔ細胞増殖のために最適化された培養培地で可溶性成分を利用する、連続的にロッキングするバイオリアクターにおける活性化、形質導入及び増殖は、洗浄されたアフェレーシスドナー細胞からの改変自己Ｔ細胞の高密度の生成をもたらした。Ｔ細胞アクチベーター、刺激因子及び代謝経路阻害剤などの可溶性成分の使用は、自己改変Ｔ細胞の製造における様々な工程間の連続的なフローを可能にし、所望の表現型及び導入遺伝子発現の改変Ｔ細胞を生成した。このプロセス中のロッキングもまた、静的条件下での培養培地の制限のために、低い細胞密度（≦２Ｅ６細胞／ｍｌ）で増殖しなければならない静的培養とは対照的に、高密度培養を支持するのに十分な酸素及び栄養素の物質移動を保証した。ロッキングバイオリアクター及び汎用されているＧ－Ｒｅｘ（登録商標）ガス透過性培養システムはいずれも効率的な酸素輸送を有するが、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）システムは栄養素を適時に細胞に移送する送り達する対流を欠いている。また、ロッキングバイオリアクターシステムの使用は、非常に高い細胞密度、場合によっては最大５０Ｅ６細胞／ｍｌの密度を可能にする新鮮な培地の潅流を可能にする。

白血球及び赤血球を含む自己ドナーアフェレーシス細胞の活性化、形質導入及び増殖を、連続的にロッキングさせたシングルバイオリアクターバッグ内の閉鎖系連続システムで行った。Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）バイオリアクターバッグ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）などのバイオリアクターバッグは、Ｗａｖｅ又はＸｕｒｉ細胞培養システム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）などのロッキングバイオリアクタープラットフォームの一部として使用され、バイオリアクターとして動作することに加えて、Ｔ細胞に過度の剪断応力を加えることなく、酸素及び栄養素の効率的な物質移動を可能にする様々な速度及び角度でロッキングする能力も有する。このようなバイオリアクターバッグは、一般に、入ってくる培養培地を濾過するための潅流フィルター、培養培地及び他の成分を添加し、使用済み培地及び試料を取り出すためのポート及びラインを備えており、これらは全て無菌の制御された環境内にある。バッグはまた、温度、ＣＯ_２、Ｏ_２、ｐＨなどの培養パラメーター、グルコース及び乳酸などの代謝及び培地パラメーターを自動的に測定及び制御し、またガス及び培地のフローを制御するロッキングプラットフォームシステムの制御と接続するような装備がされている。バッグは、ボーラス、フェドバッチ、フェドバッチ／潅流、及び／又は半若しくは連続潅流のいずれであっても自動供給を可能にする。細胞の手動操作の量が減少することに加えて、クローズドバイオリアクターシステム中で細胞を培養することにより、改変Ｔ細胞の収率及び培養密度に対する能力の向上及び改善が可能になる。

細胞療法に適用するための改変自己Ｔ細胞の生成は、一般に、ガス透過性容器を利用し、広範な手動操作が必要であり得、培養物及び装置を汚染リスクにさらし、且つ細胞への栄養素のフローが制限される静的培養に依っている。バッグ、フラスコ及びプレートなどの静的なガス透過性容器は、遺伝子改変Ｔ細胞を生成するための形質導入工程を含む自己Ｔ細胞プロセスに広く使用されている。現在使用されているこのような静的ガス透過性細胞培養バッグの例としては、Ｐｅｒｍａｌｉｆｅ細胞培養バッグ、ＯｒｉｇｉｎＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＡｕｓｔｉｎＴｅｘａｓ、ＭＡＣＳＧＭＰ細胞分化バッグ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＲａｐｉｄＥｘｐａｎｓｉｏｎＦｌａｓｋ（Ｇ－Ｒｅｘ）バイオリアクター、他のＧ－Ｒｅｘ（登録商標）容器、Ｗｉｌｓｏｎ－ＷｏｌｆＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇが挙げられる。容器は、所望の温度を維持するためにインキュベータ又は他の環境制御チャンバを必要とし、且つ周囲インキュベータ環境からのＯ_２及び培地からのＣＯ_２の受動拡散を可能にするためにガス透過性である。容器は、培養物を維持するために必要な処理装置、インキュベータ、又はバイオセーフティキャビネットなどへの移動や、それらからの移動のために、手動操作を必要とする。さらに、容器は、培養物を維持するために、処理装置、シリンジ、ポンプ、チャンバ、並びに他の容器及びデバイスへの絶え間ない接続及び再接続を必要とする。手動処理は、培養物の汚染のリスクを増加させる。さらに、Ｐｅｒｍａｌｉｆｅ細胞培養バッグは、低密度Ｔ細胞増殖（＜２Ｅ６細胞／ｍｌ）用にのみ設計されており、Ｔ細胞療法に必要な高用量で供給するためには極めて大きな容量を必要とする。一方、Ｇ－ｒｅｘ（登録商標）は、比較的高い密度（約１０Ｅ６細胞／ｍｌ）でＴ細胞を増殖させることができるが、増殖パラメーターの操作に課題がある。これらの２つの容器はまた、より高度でデジタルの製造操作を支援するための制御システム及びデータ記録能力を備えていない。

本発明の方法は、培養培地を含有するクローズドシングルユースバイオリアクターバッグに、アフェレーシスドナー細胞及び１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターを播種すること（ここで、バイオリアクターバッグは、ロッキングバイオリアクタープラットフォームの一部である）を提供する。播種時のバイオリアクターバッグ中の培養培地の容量は、任意の所定の容量であり得る。一実施形態では、培養培地の容量は、少なくともバイオリアクターバッグの最小容量である。一実施形態では、培養培地の第２の容量は、少なくとも３００ｍｌである。一実施形態では、培養培地の容量は、４００ｍｌ以上である。一実施形態では、培養培地の容量は、約３００ｍｌ～約４００ｍｌである。一実施形態では、培養培地の容量は、約３２５ｍｌ～約４００ｍｌである。一実施形態では、培養培地の容量は、約３５０ｍｌ～約４００ｍｌである。一実施形態では、培養培地の容量は、約３７５ｍｌ～約４００ｍｌである。一実施形態では、培養培地の容量は、約３００ｍｌ、約３２５ｍｌ、約３５０ｍｌ、約３７５ｍｌ又は約４００ｍｌである。一実施形態では、培養培地の容量は、約３００ｍｌである。一実施形態では、培養培地の容量は、約３２５ｍｌである。一実施形態では、培養培地の容量は、約３５０ｍｌである。一実施形態では、培養培地の容量は、約３７５ｍｌである。一実施形態では、培養培地の容量は、約４００ｍｌである。一実施形態では、培養培地の容量は、約４００ｍｌ以上である。

Ｔ細胞は、活性化して生存するために細胞間接触を必要とする。活性化中の細胞濃度が不十分であると、活性化が不十分となるレベルまで細胞間接触を減少させる可能性がある。アフェレーシスドナー細胞は、有核細胞及び無核細胞を含む。アフェレーシスドナー試料中の有核細胞の数は、任意の知られた方法、例えば、ＮＣ－２００（商標）自動細胞計数器（ＣｈｅｍＭｅｔｅｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）などの自動システムの使用によって決定することができる。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、２ＲＰＭのロッキング速度のバイオリアクターバッグ内で十分に活性化することができるだけの数の有核細胞を含む。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、約１．０Ｅ９～１．３Ｅ９の有核細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、約１．１Ｅ９～約１．２Ｅ９の有核細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、約１．２Ｅ９～約１．３Ｅ９の有核細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、約１．２Ｅ９～約１．２５Ｅ９の有核細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、約１．０Ｅ９の有核細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、約１．１Ｅ９の有核細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、約１．２Ｅ９の有核細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、約１．２５Ｅ９の有核細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、約１．３Ｅ９の有核細胞を含む。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、約１．０Ｅ６の有核細胞、約１．１Ｅ９の有核細胞、約１．２Ｅ９の有核細胞、約１．２５のＥ９有核細胞、又は約１．３Ｅ９の有核細胞を含む。

一実施形態では、本発明は、培養培地を含有するクローズドシングルユースバイオリアクターバッグに約１Ｅ６～約５Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度でアフェレーシスドナー細胞を播種することを提供する。関連する実施形態では、細胞密度は、約２Ｅ６～約４Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３Ｅ６～約４Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３Ｅ６～約３．７５Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３Ｅ６～約３．５Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３Ｅ６～約３．３５Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２Ｅ６～約３Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２Ｅ６有核細胞／ｍｌ、約３Ｅ６有核細胞／ｍｌ、約３．２５Ｅ６有核細胞／ｍｌ、約３．７５Ｅ６有核細胞／ｍｌ、又は約４Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．２５Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．７５Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約４Ｅ６有核細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、可溶性サイトカインを含有する約３００ｍｌの培養培地中で、約３Ｅ６有核細胞／ｍｌ～４Ｅ６有核細胞／ｍｌである。

活性化中の細胞は、所定の温度で培養することができる。一実施形態では、細胞は、３４～３９℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３４～３５℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３５～３７℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３５～３６℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３６～３７℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３４℃、３５℃、３６℃又は３７℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３４℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３５℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３６℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３７℃で培養される。

活性化中の細胞は、所定時間培養することができる。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも２０時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも１８時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも１６時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも１４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも２０時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも１８時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも１６時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間～少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間～少なくとも２０時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間～少なくとも１８時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１８時間～少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１８～２０時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２０時間～少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１３時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１５時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１７時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１８時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１９時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２０時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２１時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２２時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２３時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２４時間培養される。

本発明の一実施形態では、播種時に、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターが少なくとも１つのドナー細胞に結合する。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、バイオリアクターバッグに播種される前に、１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターと共にインキュベートされる。一実施形態では、インキュベーションは、播種前に１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターのアフェレーシスドナー細胞への結合を十分に飽和させることができるだけの時間である。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、１つ以上のＴ細胞アクチベーターと共に少なくとも３０分間以上インキュベートされる。一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、１つ以上のＴ細胞アクチベーターと共に少なくとも３０分間～少なくとも２時間又はそれ以上インキュベートされる。関連する実施形態では、アフェレーシスドナー細胞は、１つ以上のＴ細胞アクチベーターと共に少なくとも１時間～少なくとも２時間インキュベートされる。一実施形態では、インキュベーションは、少なくとも３０分である。一実施形態では、インキュベーションは、約１時間である。一実施形態では、インキュベーションは、約２時間である。

一実施形態では、アフェレーシスドナー細胞及び１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターは、トランスファーバッグ中でインキュベートされる。細胞及び可溶性Ｔ細胞アクチベーターを懸濁し、有核細胞へのアクチベーターの結合を可能にするのに十分な、好ましくは細胞の総体積を保持するのに十分な最小量の培養培地が使用される。一実施形態では、トランスファーバッグ内の培養培地の容量は約５ｍｌ～約５０ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約４０ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約３０ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約２０ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約１５ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約１４ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約１３ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約１２ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約１１ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約１０ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約９ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約８ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約７ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ～約６ｍｌである。本発明の一実施形態では、可溶性サイトカイン及び１つ以上のＴ細胞アクチベーターを含む培養培地の初期容量は、約５ｍｌ、約６ｍｌ、約７ｍｌ、約８ｍｌ、約９ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌ又は約５０ｍｌである。

「形質導入」は、ウイルスベクターによって外来ＤＮＡを細胞に導入するプロセスを指す。Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，（１９９８）．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｊｏｎｅｓ＆ＢａｒｔｌｅｔｔＰｕｂｌを参照されたい。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、Ｔ細胞などの宿主細胞の形質転換に有用であり、それに作動可能に連結された１つ又は複数の異種コード領域の発現を（細胞と協働して）誘導及び／又は制御する核酸配列を含む、ウイルスベクターなどの任意の分子又は実体を意味する。発現コンストラクトは、以下に限定されないが、転写、翻訳に影響するか、又はそれを制御し、イントロンが存在するのであれば、それに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響する配列を含み得る。１つ又は複数のベクターは、その後、増幅及び／又はポリペプチド発現のために細胞に挿入される。選択された細胞への発現ベクターの形質転換は、ウイルス形質転換を介して達成され得る。ウイルス形質転換Ｔ細胞は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターで細胞を形質導入することによって得ることができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター及びワクシニアウイルスベクターが挙げられる。

本発明は、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞を、２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのウイルスベクターで形質導入することを提供する。２ＲＰＭの連続ロッキング速度は、形質転換の成功に必要な十分な細胞間接触を可能にした。一実施形態では、培養物は、２°の角度、２ＲＭＰの速度でロッキングされる。

一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターは、統合されたプロウイルスとして核内に留まり、細胞分裂で複製される。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

一実施形態では、細胞は、１つ以上の目的タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のウイルスベクターを使用して改変することができる。一実施形態では、目的タンパク質は、細胞表面受容体である。一実施形態では、細胞表面受容体は、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体である。一実施形態では、細胞表面受容体は、標的細胞表面の抗原標的を認識する。

一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．２５～１０の感染多重度（ＭＯＩ）で添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．２５～５のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．２５～２のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．２５～１のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．２５～０．５のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．５～１０のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．５～５のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．５～２のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．５～１のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、１～１０のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、１～５のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、１～２のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、２～１０のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、２～５のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、５～１０のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．２５、０．５、１、２、５又は１０のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、１０のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、５のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、２のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、１のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．５のＭＯＩで添加される。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、０．２５のＭＯＩで添加される。

細胞は、所定の温度で形質導入することができる。一実施形態では、細胞は、３４～３９℃で形質導入される。一実施形態では、細胞は、３４～３５℃で形質導入される。一実施形態では、細胞は、３５～３７℃で形質導入される。一実施形態では、細胞は、３５～３６℃で形質導入される。一実施形態では、細胞は、３６～３７℃で形質導入される。一実施形態では、細胞は、３４℃、３５℃、３６℃又は３７℃で形質導入される。一実施形態では、細胞は、３４℃で形質導入される。一実施形態では、細胞は、３５℃で形質導入される。一実施形態では、細胞は、３６℃で形質導入される。一実施形態では、細胞は、３７℃で形質導入される。

細胞は、所定の時間に亘って形質導入することができる。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２４時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも２４時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも２０時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも１８時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも１６時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも１４時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも２４時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも２０時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも１８時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも１６時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間～少なくとも２４時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間～少なくとも２０時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間～少なくとも１８時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１８時間～少なくとも２４時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１８～２０時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２０時間～少なくとも２４時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１３時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１５時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１７時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１８時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１９時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２０時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２１時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２２時間に亘って形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２３時間形質導入される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２４時間に亘って形質導入される。

本明細書に記載されるように、形質導入は、シングルユースバイオリアクターバッグを備えたロッキング式バイオリアクターを用いて、２ＲＰＭのロッキング速度、特に、２°の角度、２ＲＰＭのロッキング速度で行った。目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のウイルスベクターは、バッグがロッキングしている間に、バイオリアクターバッグ内の培養物に直接播種し得る。ロッキング式バイオリアクターで使用されるようなガス不透過性のバッグの使用は、形質導入中の使用には推奨されていない。「ロッキングモーションバイオリアクターに適合するように設計された使い捨てバイオリアクターなどの、ガス不透過性の容器は、ウイルスベクターを介した細胞の形質導入には理想的ではない。したがって、形質導入は、現在、静的細胞培養バッグ又は平面容器中で行われている」ＦａｒｉｄａｎｄＪｅｎｋｉｎｓ，ＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓｆｏｒＣｅｌｌＴｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ４４，ＢｉｏｐｈａｒｍｅｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＤｅｓｉｇｎａｎｄＩｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＰｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｅｄｓ．Ｊａｇｓｃｈｉｅｓｅｔａｌ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐａｇｅ９１４，２０１８を参照。

しかしながら、本明細書に記載されるように、静的ガス透過性容器中で形質導入された細胞と比較して、ロッキングモーションバイオリアクターの一部であるように設計された使い捨てバイオリアクターバッグ中で形質導入された細胞は、より高い形質導入効率を有し、分化が少なく、より多くのメモリー細胞様であり、静的ガス透過性バッグ又は静的Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）ガス透過性システムで形質導入された細胞よりも標的細胞を死滅させる効力はより大きかった。

一実施形態では、形質導入後、培養培地の半分をバイオリアクターバッグから取り出し、等量の新鮮な培養培地と交換し、２ＲＰＭの速度でロッキングする。一実施形態では、培養物は、２°の角度にて２ＲＭＰの速度でロッキングされる。

細胞は、所定の温度で培養することができる。一実施形態では、細胞は、３４～３９℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３４～３５℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３５～３７℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３５～３６℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３６～３７℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３４℃、３５℃、３６℃又は３７℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３４℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３５℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３６℃で培養される。一実施形態では、細胞は、３７℃で培養される。

細胞は、所定の時間にわたって培養することができる。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも２０時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも１８時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも１６時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間～少なくとも１４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも２０時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも１８時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間～少なくとも１６時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間～少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間～少なくとも２０時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間～少なくとも１８時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１８時間～少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１８～２０時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２０時間～少なくとも２４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１２時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１３時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１４時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１５時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１６時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１７時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１８時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも１９時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２０時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２１時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２２時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２３時間培養される。一実施形態では、細胞は、少なくとも２４時間培養される。

本発明は、約２ＲＰＭのロッキング速度でクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞を増殖させるとともに、培養物を収穫まで維持するために必要に応じて培養容量及びロッキング速度を増加させることを提供する。Ｔ細胞は、生存するために細胞間接触を必要とする。２Ｅ６細胞／ｍｌ未満では、細胞間接触ができず、細胞ストレスが増加し、且つ／又はバイオリアクターの撹拌を克服し、増殖する能力が減少する可能性がある。４Ｅ６細胞／ｍｌ以上まで増大させることにより、培養体積を増加させることが可能になり、これはまた供給プロセスを単純化する。培養体積を段階的に増加させることにより、培養物を適時に１リットルまで増大させることが可能になり、ロッキング速度／角度は、体積の増加に対応し、システム内の溶存酸素量を安定させて細胞の増殖を促進する。活性化の間、Ｔ細胞は大量のグルコース及び乳酸を消費し、放出する。高レベルの乳酸は、Ｔ細胞の活性化及び増殖に有害であると思われる。その結果、細胞はあまり増殖していないため、活性化及び形質導入の初期段階では、細胞培地の交換は細胞密度に対応するパラメーターではない。活性化／形質導入の間、乳酸レベルは重要な培養パラメーターであり、培地の十分な代謝回転は、Ｔ細胞の活性化及び増殖にとって重要である。半連続培地交換は、培養培地中の代謝物レベルを制御するために使用される。

Ｔ細胞は、ロッキング式バイオリアクタープラットフォームにおいて培養された場合、静的ガス透過性容器システムにおけるよりも、より高い密度に達することができる。本明細書に記載の方法の最終収量は、１Ｌバイオリアクターにおいて、１０～１４日で、１５００万～３５０億細胞であった。１人の患者を支持するのに１つのバイオリアクターで十分である。本発明の方法によって製造される１リットルで製造されるのと同じ１００億個の改変Ｔ細胞を得るためには、約２０個の透過性バッグ（２５０ｍｌ）又は４ＬのＧ－ｒｅｘ（登録商標）バイオリアクターが必要であろう。本発明の方法の細胞収率は、実際に使用されている他の一般的な方法の細胞収率よりも高い。

一実施形態では、細胞の増殖に伴い、培養培地の容量を、少なくとも２Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度を維持するように徐々に増加させる。一実施形態では、細胞の増殖に伴い、バイオリアクター中の培養培地の容量を、少なくとも４Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度を維持するように、増殖中に１リットルまで徐々に増加させる。一実施形態では、増殖中の細胞密度は、少なくとも２Ｅ６細胞／ｍｌ又はそれ以上である。一実施形態では、細胞密度は、約２Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．５０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．２５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．００Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２Ｅ６細胞／ｍｌ～約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２Ｅ６細胞／ｍｌ～約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２Ｅ６細胞／ｍｌ～約２．２５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．２５Ｅ６細胞／ｍｌ～約４．０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．２５Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．２５Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．５０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．２５Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．２５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．２５Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．２５Ｅ６細胞／ｍｌ～約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．２５Ｅ６細胞／ｍｌ～約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌ～約４．０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．５０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．２５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．００Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌ～約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌ～約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌ～約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌ～約４．０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．５０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．２５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．００Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌ～約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約２．７５Ｅ６細胞／ｍｌ～約２．５０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．０Ｅ６細胞／ｍｌ～約４．０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．０Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．０Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．５０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．０Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．２５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．２５Ｅ６細胞／ｍｌ～約４．０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．２５Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．２５Ｅ６細胞／ｍｌ～約４．０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．５０Ｅ６細胞／ｍｌ～約４．０Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．５０Ｅ６細胞／ｍｌ～約３．７５Ｅ６細胞／ｍｌである。一実施形態では、細胞密度は、約３．７５Ｅ６細胞／ｍｌ～約４．０Ｅ６細胞／ｍｌである。

一実施形態では、増殖中、新鮮な培養培地を、フェドバッチ／潅流供給の組み合わせによって、及び／又は潅流によってバイオリアクターに添加される。一実施形態では、培養物が少なくとも１リットルの体積に達するまで、新鮮な培養培地がフェドバッチ／潅流によって添加され、その後、培養物が収穫されるまで潅流に切り替えられる。一実施形態では、培養物は、収穫まで、増殖期間を通して潅流される。一実施形態では、増殖中、灌流速度は、１日当たり少なくとも１バイオリアクターバッグ容量である。一実施形態では、潅流速度は、１日当たり１バイオリアクターバッグ容量未満である。一実施形態では、潅流速度は、１日当たり１バイオリアクターバッグ容量超である。

一実施形態では、バイオリアクター中の培養培地の容量を、増殖中、約２Ｅ６～約４Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度を維持するために、１０００ｍｌまで徐々に増加させる。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも２００ｍｌから少なくとも１０００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも３００ｍｌから少なくとも１０００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも４００ｍｌから少なくとも１０００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも５００ｍｌから少なくとも１０００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも６００ｍｌから少なくとも１０００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも７００ｍｌから少なくとも１０００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも８００ｍｌから少なくとも１０００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも９００ｍｌから少なくとも１０００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも２００ｍｌから少なくとも９００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも３００ｍｌから少なくとも９００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも４００ｍｌから少なくとも９００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも５００ｍｌから少なくとも９００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも６００ｍｌから少なくとも９００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも７００ｍｌから少なくとも９００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも８００ｍｌから少なくとも９００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも２００ｍｌから少なくとも８００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも３００ｍｌから少なくとも８００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも４００ｍｌから少なくとも８００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも５００ｍｌから少なくとも８００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも７００ｍｌから少なくとも８００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも７００ｍｌから少なくとも８００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも３００ｍｌから少なくとも７００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも２００ｍｌから少なくとも８００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも４００ｍｌから少なくとも８００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも５００ｍｌから少なくとも８００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも６００ｍｌから少なくとも８００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも７００ｍｌから少なくとも８００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも２００ｍｌから少なくとも７００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも２００ｍｌから少なくとも７００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも３００ｍｌから少なくとも７００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも４００ｍｌから少なくとも７００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも５００ｍｌから少なくとも７００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも６００ｍｌから少なくとも７００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも２００ｍｌから少なくとも６００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも３００ｍｌから少なくとも６００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも４００ｍｌから少なくとも６００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも５００ｍｌから少なくとも６００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも２００ｍｌから少なくとも５００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも３００ｍｌから少なくとも５００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも４００ｍｌから少なくとも５００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも２００ｍｌから少なくとも４００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも３００ｍｌから少なくとも４００ｍｌに増加される。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、少なくとも５００ｍｌ、少なくとも５５０ｍｌ、少なくとも６００ｍｌ、少なくとも６５０ｍｌ、少なくとも７００ｍｌ、少なくとも７５０ｍｌ、少なくとも８００ｍｌ、少なくとも８５０ｍｌ、少なくとも９００ｍｌ、少なくとも９５０ｍｌ、少なくとも１０００ｍｌ、又は１０００ｍｌ超である。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも２００ｍｌである。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも３００ｍｌである。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも４００ｍｌである。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも５００ｍｌである。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも６００ｍｌである。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも７００ｍｌである。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも８００ｍｌである。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも９００ｍｌである。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、少なくとも１０００ｍｌである。一実施形態では、バイオリアクターの容量は、１０００ｍｌ超である。

一実施形態では、培養物体積及び／又は細胞密度の増加に伴い、ロッキング速度は増加する。一実施形態では、ロッキング速度は、少なくとも２ＲＭＰから少なくとも３ＲＰＭに増大する。一実施形態では、ロッキング速度は、少なくとも２ＲＭＰから少なくとも４ＲＰＭに増大する。一実施形態では、ロッキング速度は、少なくとも２ＲＭＰから少なくとも５ＲＰＭに増大する。一実施形態では、ロッキング速度は、少なくとも２ＲＭＰから少なくとも６ＲＰＭに増大する。一実施形態では、ロッキング速度は、少なくとも３ＲＭＰから少なくとも４ＲＰＭに増大する。一実施形態では、ロッキング速度は、少なくとも３ＲＭＰから少なくとも５ＲＰＭに増大する。一実施形態では、ロッキング速度は、少なくとも３ＲＭＰから少なくとも６ＲＰＭに増大する。一実施形態では、ロッキング速度は、少なくとも４ＲＭＰから少なくとも５ＲＰＭに増大する。一実施形態では、ロッキング速度は、少なくとも４ＲＭＰから少なくとも６ＲＰＭに増大する。一実施形態では、ロッキング速度は、少なくとも５ＲＭＰから少なくとも６ＲＰＭに増大する。一実施形態では、ロッキング速度は、２°の角度で少なくとも２ＲＰＭである。一実施形態では、ロッキング速度は、３°の角度で少なくとも３ＲＰＭである。一実施形態では、ロッキング速度は、４°の角度で少なくとも４ＲＰＭである。一実施形態では、ロッキング速度は、５°の角度で少なくとも５ＲＰＭである。一実施形態では、ロッキング速度は、６°の角度で少なくとも６ＲＰＭである。

一実施形態では、培養培地の容量が１０００ｍｌまで徐々に増加するにつれて、ロッキング速度は６ＲＰＭまで徐々に増大する。一実施形態では、膨張開始時のバイオリアクターバッグ内の培養培地の容量は、２°の角度、２ｒｐｍのロッキング速度で約３００ｍｌであり、１日当たり１バイオリアクターバッグ容量の潅流速度で維持される。一実施形態では、培養物の細胞密度が４Ｅ６有核細胞／ｍｌに達すると、バイオリアクターバッグ内の培養培地の容量は、４°の角度、４ｒｐｍのロッキング速度、１日当たり１バイオリアクターバッグ容量の潅流速度で、６００ｍｌに増加する。関連する実施形態では、培養物の細胞密度が４Ｅ６有核細胞／ｍｌに達すると、バイオリアクターバッグ内の培養培地の容量は、６°の角度、６ｒｐｍのロッキング速度、１日当たり１バイオリアクターバッグ容量の潅流速度で、１０００ｍｌに増加する。

一実施形態では、シングルユースバイオリアクターバッグ中の培養物は、約８０～１００％のＯ_２に維持される。

一実施形態では、細胞を７～１４日間増殖させる。一実施形態では、細胞を７～１３日間増殖させる。一実施形態では、細胞を７～１２日間増殖させる。一実施形態では、細胞を７～１１日間増殖させる。一実施形態では、細胞を７～１０日間増殖させる。一実施形態では、細胞を７～９日間増殖させる。一実施形態では、細胞を７～８日間増殖させる。一実施形態では、細胞を８～１４日間増殖させる。一実施形態では、細胞を８～１３日間増殖させる。一実施形態では、細胞を８～１２日間増殖させる。一実施形態では、細胞を８～１１日間増殖させる。一実施形態では、細胞を８～１０日間増殖させる。一実施形態では、細胞を８～９日間増殖させる。一実施形態では、細胞を９～１４日間増殖させる。一実施形態では、細胞を９～１３日間増殖させる。一実施形態では、細胞を９～１２日間増殖させる。一実施形態では、細胞を９～１１日間増殖させる。一実施形態では、細胞を９～１０日間増殖させる。一実施形態では、細胞を１０～１４日間増殖させる。一実施形態では、細胞を１０～１３日間増殖させる。一実施形態では、細胞を１０～１２日間増殖させる。一実施形態では、細胞を１０～１１日間増殖させる。一実施形態では、細胞を１１～１４日間増殖させる。一実施形態では、細胞を１１～１３日間増殖させる。一実施形態では、細胞を１１～１２日間増殖させる。一実施形態では、細胞を１２～１４日間増殖させる。一実施形態では、細胞を１２～１３日間増殖させる。一実施形態では、細胞を１３～１４日間増殖させる。一実施形態では、細胞を７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間又はそれ以上増殖させる。一実施形態では、細胞を少なくとも７日間増殖させる。一実施形態では、細胞を少なくとも８日間増殖させる。一実施形態では、細胞を少なくとも９日間増殖させる。一実施形態では、細胞を少なくとも１０日間増殖させる。一実施形態では、細胞を少なくとも１１日間増殖させる。一実施形態では、細胞を少なくとも１２日間増殖させる。一実施形態では、細胞を少なくとも１３日間増殖させる。一実施形態では、細胞を少なくとも１４日間増殖させる。

一実施形態では、細胞を３４～３９℃で増殖させる。一実施形態では、細胞を３４～３５℃で増殖させる。一実施形態では、細胞を３５～３７℃で増殖させる。一実施形態では、細胞を３５～３６℃で増殖させる。一実施形態では、細胞を３６～３７℃で増殖させる。一実施形態では、細胞を３４℃、３５℃、３６℃又は３７℃で増殖させる。一実施形態では、細胞を３４℃で増殖させる。一実施形態では、細胞を３５℃で増殖させる。一実施形態では、細胞を３６℃で増殖させる。一実施形態では、細胞を３７℃で増殖させる。

「改変Ｔ細胞」及び「遺伝子改変Ｔ細胞」は互換的に使用され、追加の遺伝物質、特に、細胞表面に発現する受容体などの目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入によって改変されたＴ細胞を指す。細胞表面受容体の例としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が挙げられる。「単離された改変Ｔ細胞」及び「単離された遺伝子改変Ｔ細胞」という用語は、特に、遺伝子改変などの改変若しくは操作された、又は天然に通常見られないＴ細胞を指す。本明細書で使用される場合、Ｔ細胞又はＴリンパ球は、身体の免疫応答に積極的に関与するリンパ球種を指す。

用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、全体を通して互換的に使用され、一本鎖及び二本鎖核酸の両方を含み、且つゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又は天然で通常見出される配列と関連しない合成起源若しくはそのいくつかの組み合わせを含む。「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離された核酸分子」という用語は、特に、合成起源又は天然で通常見出されないものの配列を指す。特定の配列を含む単離された核酸分子は、その特定の配列に加えて、最大で１０若しくは最大で２０に及ぶ数の他のタンパク質若しくはその一部をコードする配列を含むか、又は記載の核酸配列のコード領域の発現を制御する、作動可能に連結された調節配列を含むか、且つ／又はベクター配列を含み得る。核酸分子を含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドのいずれかの型の修飾形態であり得る。修飾には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’－ジデオキシリボースなどのリボース修飾、並びにホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホロアニラダート及びホスホロアミダートなどのヌクレオチド間結合の修飾が含まれる。

「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、全体を通して互換的に使用され、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。ポリペプチド及びタンパク質はまた、天然配列のアミノ酸残基からの１つ以上の欠失、挿入及び／又は置換を有する高分子、すなわち、天然に存在する非組換え細胞によって産生されるか、又は遺伝子操作された細胞若しくは組換え細胞によって産生され、天然タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基からの１つ以上の欠失、挿入、及び／若しくは置換を有する分子を含むポリペプチド若しくはタンパク質を含む。ポリペプチド及びタンパク質はまた、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸及びポリマーの化学的アナログであるアミノ酸ポリマーを含む。ポリペプチド及びタンパク質はまた、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰ－リボシル化を含むが、これらに限定されない修飾を含む。目的のポリペプチド及びタンパク質は、科学的又は商業的に興味深いもの、例えば、細胞療法の成分として有用なものであり得る。目的のタンパク質には、とりわけ、膜結合タンパク質が含まれる。

本発明は、目的タンパク質を発現する改変Ｔ細胞を生成するための方法を提供する。一実施形態では、目的タンパク質は、細胞表面受容体である。細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ又はＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＲＵＣＫ（ユニバーサルサイトカイン媒介性キリング（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｋｉｌｌｉｎｇ）用にＴ細胞をリダイレクトするキメラ抗原受容体）、及び武装した（ａｒｍｏｒｅｄ）ＣＡＲ（免疫抑制環境を調節するように設計））などの遺伝子改変受容体、並びにその標的抗原と相互作用する抗原結合分子を含む他のタンパク質である。これらの改変受容体は、Ｔ細胞の表面上に発現される。一実施形態では、細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体である。

ＴＣＲは、不変のＣＤ３鎖分子と複合体化したα鎖及びβ鎖を含む膜固定ヘテロ二量体タンパク質複合体である。ＴＣＲ α鎖及びβ鎖の可変ドメインはそれぞれ、ＭＨＣ／ＨＬＡ分子の溝によって提示される／その溝内に結合したタンパク質に由来するペプチドを認識する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、鎖を連結するためにジスルフィド結合に関与する定常ドメインとを有する。ＣＤ３ｚｅｔａはシグナル伝達によってＴリンパ球を活性化する。ＴＣＲは、癌細胞、炎症細胞、及び他の供給源由来の細胞などの多くの細胞の表面に提示される抗原を認識する可能性を有する。

ＣＡＲは、細胞外ドメインを含み、典型的には、目的の抗原に結合する抗原結合タンパク質又はドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内（細胞質）ドメインを含む、改変された膜貫通タンパク質である。

細胞外ドメインは、合成の供給源又は天然の供給源、例えば、本明細書に記載のタンパク質に由来し得る。細胞外ドメインは、「スペーサー」領域と呼ばれることもあるヒンジ部分を含むことが多い。ヒンジは、本明細書に記載のタンパク質、特に本明細書に記載の共刺激タンパク質、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）配列又は他の好適な分子から誘導され、標的細胞からの所望の特定の距離を達成し得る。

膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外又は細胞内ドメインに融合され得る。膜貫通ドメインは、合成の供給源又は天然の供給源、例えば、本明細書に記載のタンパク質、特に本明細書に記載の共刺激タンパク質に由来し得る。

細胞内（細胞質）ドメインは、膜貫通ドメインに融合し、免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を提供することができる。エフェクター機能には、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性が含まれる。細胞内ドメインは、本明細書に記載のタンパク質から、特にＣＤ３から誘導され得る。

ＣＡＲは、抗原（細胞表面抗原など）に、その標的化抗原と相互作用する抗原結合分子を組み込むことによって結合するように改変することができる。ＣＡＲは、典型的には、１つ以上の共刺激（「シグナル伝達」）ドメイン及び１つ以上の活性化ドメインと協力して抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）を取り込む。

一実施形態では、抗原結合分子は、その抗体フラグメントであり、より好ましくは１つ以上の単鎖抗体フラグメント（「ｓｃＦｖ」）である。ｓｃＦｖは、他のＣＡＲ成分と共に単鎖の一部として発現されるように改変され得るため、ＣＡＲでの使用に好適である。Ｋｒａｕｓｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８（４）：６１９－６２６，１９９８；Ｆｉｎｎｅｙｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６１：２７９１－２７９７，１９９８を参照されたい。

ＣＡＲは、その効能を高めるために、１つ以上の共刺激（シグナル伝達）ドメインを組み込む。米国特許第７，７４１，４６５号明細書及び同第６，３１９，４９４号明細書、並びにＫｒａｕｓｅ，ｅｔａｌ．及びＦｉｎｎｅｙ，ｅｔａｌ．（前述）、Ｓｏｎｇｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１１９：６９６－７０６（２０１２）；Ｋａｌｏｓｅｔａｌ．，ＳｃｉＴｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５（２０１１）；Ｐｏｒｔｅｒｅｔａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５－３３（２０１１）及びＧｒｏｓｓｅｔａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５６：５９－８３（２０１６）を参照されたい。好適な共刺激ドメインは、供給源の中でもとりわけ、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ３（アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ゼータ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤｌｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４；ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ、ＴＮＦｒ、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、ＣＤＳ、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ－ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ－ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ－ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ－ｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、４１－ＢＢ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３リガンド又はこれらの断片若しくは組み合わせから誘導され得る。共刺激ドメインは、１つ以上の細胞外部分、膜貫通部分及び細胞内部分を含み得る。

ＣＡＲにはまた、１つ以上の活性化ドメインが含まれる。ＣＤ３ｚｅｔａは、天然Ｔ細胞上のＴ細胞受容体の一エレメントであり、ＣＡＲにおいて重要な細胞内活性化エレメントであることが示されている。

細胞表面分子は、従来のＣＡＲで標的化することができる。細胞内分子は、ＭＨＣ／ＨＬＡ分子の溝によって提示されるか、又は溝内に結合されたタンパク質に由来するペプチドを認識するＴＣＲで標的とすることができる。そのような標的としては、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、ＡＦＰ、ＡＤＡＭ１７、１７－Ａ、ＡＲＴ－４、α_ｖβ_６インテグリン、ＢＡＧＥ、Ｂｃｒ－ａｂｌ、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７ｍ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ又はＴＮＦＳＦ７）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤＫ４／ｍ、カドヘリン１９（ＣＤＨ１９）、胎盤型カドヘリン（ＣＤＨ３）、ＣＥＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳＰＧ４、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＤＤＬ３、ＥＢＶ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、ＦＡＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＦＬＴ３、ＦＲα、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＧＮＴ－Ｖ、ＧＰ－１００、ＨＡＧＥ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＰＶ、ＨＳＰ７０、ＨＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＩｇＥ、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ラムダ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ルイス－Ｙ、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、メソテリン（ＭＳＬＮ）、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ミオシン／ｍ、ＮＡ８８－Ａ、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、Ｐ１５、ｐ１９０マイナーｂｃｒ－ａｂｌ、ＰＭＬ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－３、スルビビン、ＴＡＡ、ＴＡＧ７２、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＥＭｓ、ＴＰＩ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＶＥＧＦＲ２及びＷＴ１が挙げられる。Ｌｏｅｆｆｌｅｒｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８５（６）：２０９８－２１０３，１５Ｍａｒｃｈ２０００；Ｗｏｌｆｅｔａｌ．，ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｏｄａｙ１０（８）：１２３７－１２４４，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２００５；Ｂａｅｕｅｒｌｅ＆Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ６９（１２）：４９４１－４９４４，Ｊｕｎｅ１５，２００９；Ｂａｅｕｅｒｌｅｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２２－３０，２００９；Ｎａｇｏｒｓｅｎ＆Ｂａｅｕｅｌｅ，ＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ３１７：１２５５－１２６０，２０１１；Ｎａｇｏｒｓｅｎｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ１３６：３３４－３４２，２０１２；Ｈｕｅｈｌｓｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ９３：２９０－２９６，２０１５；及びＳｔｉｅｇｌｍａｉｅｒｅｔａｌ．，ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＢｉｏｌＴｈｅｒ１５（８）：１０９３－１０９９，２０１５もまた参照されたい。

本方法は、ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＴ細胞、例えば、（Ｋｙｍｒｉａｈ（商標））及び（Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標））を生成するために使用することができる。

一実施形態では、細胞表面受容体は、細胞表面分子又は分子間分子などの標的細胞に関連する抗原標的を認識する。標的細胞は、目的の遺伝子によって認識される抗原を提示する任意の細胞である。一実施形態では、標的細胞は、癌細胞である。癌細胞は、癌に関連する細胞、例えば、転移性腫瘍、固形腫瘍、血液癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脾臓癌、胃癌、甲状腺癌に関連する細胞である。

高い形質導入効率は、より少量でより有効な用量を患者に送達することを可能にする。目的の遺伝子で形質導入されたＴ細胞の生成が少ない場合、患者への投与に利用可能な遺伝子改変Ｔ細胞が少なくなり、その結果、効果の少ない用量となる。本明細書に記載の方法は、より低いレンチウイルスベクターＭＯＩで高い形質導入率（ＣＤ８Ｔ細胞で４０％を超える高い導入遺伝子の発現）を達成する。目的のタンパク質を発現するより多くのＴ細胞を作製するために必要とされるレンチウイルスベクターはより少なくてすみ、本方法はより効率的であり、費用対効果も高い。本発明は、目的のタンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞における導入遺伝子発現を増加させる方法であって、培養培地を含有するクローズドシングルユースバイオリアクターバッグに、アフェレーシスドナー細胞及び１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターを播種する工程（ここで、少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターは、播種時に少なくとも１つのドナー細胞に結合しており、且つバイオリアクターバッグは、ロッキング式バイオリアクタープラットフォームの一部である）、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中で細胞を培養する工程、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの可溶性ウイルスベクターでクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞に形質導入する工程、並びに約２ＲＰＭのロッキング速度でクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞を増殖させるとともに、培養物を収穫まで維持するために必要に応じて培養容量及びロッキング速度を増加させる工程を含み、導入遺伝子の発現は、同じアフェレーシスドナー細胞からのＴ細胞の濃縮集団に由来し、同じ目的タンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞の導入遺伝子の発現より大きい、方法を提供する。

遺伝子改変Ｔ細胞は、細胞密度が所望の若しくは所定の状態に達したとき、又は所定の若しくは所望の時点で、収穫することによって回収される。遺伝子改変Ｔ細胞は、重力又は遠心分離を使用する分離などの当該技術分野で知られた方法を使用して、バイオリアクターから回収され得る。細胞はまた、血液分離システムを含む半自動及び完全自動の細胞分離システムを使用して回収され得る。このようなシステムは市販されており、Ｓｅｐａｘ（登録商標）２及びＳｅｆｉａ（商標）Ｓ－２０００細胞プロセシングシステム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｏｂｅ２９９１細胞プロセッサ（ＴｅｒｕｍｏＢＣＴ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＣＯ、ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）などが挙げられる。回収された細胞は、一般的には、洗浄され、患者への投与及び凍結保存に適した製剤に濃縮される。

本明細書に記載の方法では、９０％を超える生存率を有する１００億を超える収量が、１０日間のプロセスで見られる。細胞増殖をさらに数日間延長した後は、２００億を超える収量が見られた。

試料は、品質管理試験のために、増殖中及び／又は収穫時に採取することができる。そのようなＱＣ試験には、フローサイトメトリーを使用して細胞表面のＴＣＲ％を決定すること、及び組み込みを測定するためにｑＰＣＲを使用してベクターコピー数を決定することなどの、遺伝子改変Ｔ細胞の形質導入効率を定量するものが含まれ得る。生存率は、患者に送達するために製品を放出する前にも試験することができる。

回収された遺伝子改変Ｔ細胞を、ヒト対象において使用するための貯蔵及び／又は調製のために凍結保存するのに、当該技術分野で知られる標準的な手順を使用することができる。一実施形態では、回収された細胞は、１％ＨＳＡを補充した生理食塩水中、２Ｅ８細胞／ｍｌで溶出され、さらに、５％ヒト血清アルブミンを補充したＨｙｃｌｏｎｅ凍結保存培地（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１：１の比率で製剤化された。

製剤化された改変Ｔ細胞の画分、及び本方法において使用されなかったアフェレーシス細胞は、患者の将来の治療に向けてそのような細胞の永続的な供給源を提供するために、当該技術分野で知られる方法によって凍結保存することができる。

治療で必要になった場合、凍結保存された遺伝子改変Ｔ細胞は解凍され、治療有効量で注入によりドナーへ投与するために、生理食塩水緩衝液又は他の好適な媒体で希釈される。好適な注入媒体は、任意の等張媒体配合物、一般的には、生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ（商標）Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）又はＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であり得るが、５％デキストロース水溶液又は乳酸リンゲル液を利用することもできる。注入媒体にヒト血清アルブミンを補充し得る。体積は一般的には可能な限り最小限に保たれ、薬学的に許容される用量は細胞の数及び生存率、治療すべき症状、及び患者に基づく。治療用量は、他の要因の中でもとりわけ、患者の状態及び必要性にも依るが、一般的には、数百万～数十億細胞である。例示的な用量は、約１００Ｅ６細胞／ｍｌで≦１００ｍｌであり得る。

本発明は、目的のタンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞で患者を治療する方法であって、患者由来のアフェレーシス細胞を、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はその結合フラグメントからなる群から選択される１つ以上のＴ細胞アクチベーターと共にインキュベートして、抗体結合を飽和させる工程、培養培地を含有するクローズドシングルユースバイオリアクターバッグに、アフェレーシス細胞を播種する工程（ここで、バイオリアクターバッグは、ロッキング式バイオリアクタープラットフォームの一部である）、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中で細胞を培養する工程、約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの可溶性ウイルスベクターでクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞に形質導入する工程、約２ＲＰＭのロッキング速度でクローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の細胞を増殖させるとともに、培養物を収穫まで所望の細胞密度に維持するために必要に応じて培養容量及びロッキング速度を増加させる工程、凍結保存のために、細胞を収穫し製剤化する工程、細胞を凍結し、患者に投与するために必要とされるまで保存する工程、細胞を解凍し、注入に好適な培地に再懸濁する工程、並びに目的のタンパク質を発現する薬学的に有効な量の遺伝子改変自己Ｔ細胞を患者に再導入する工程を含む方法を提供する。

製剤化された改変Ｔ細胞は、単独で、或いは希釈剤及び／又はＩＬ－２若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。

状態、症状、疾患、障害などを治療するために改変Ｔ細胞を使用するための方法が提供される。Ｔ細胞は、細胞表面受容体などの目的の遺伝子を発現し、病態、症状、疾患、障害などに関連する標的細胞に関連する抗原標的を認識する。このような病態、疾患又は障害には、癌、腫瘍、固形腫瘍、血液学的疾患、白血病、リンパ腫、ウイルス感染、炎症性疾患若しくは障害、及び／又は自己免疫疾患若しくは障害が含まれる。本発明の一実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞が対象における症状を治療するために使用される。本発明の一実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、癌患者を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、本発明は、目的のタンパク質を発現する改変自己Ｔ細胞の有効量をドナーに投与することを含む、ドナーにおけるＴ細胞媒介性免疫応答の作製を提供する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞媒介性免疫応答は、１個又は複数の標的細胞に向けられる。いくつかの実施形態では、改変自己Ｔ細胞は、１つ又は複数のキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体及び／又は他の目的のタンパク質を発現する遺伝子構築物を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、本発明は、症状を治療又は予防するための方法を含み、前記方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の方法によって作製された遺伝子改変自己Ｔ細胞の有効量を投与することを含む。いくつかの態様では、本発明は、炎症及び／又は自己免疫障害を治療又は予防するための方法を含む。

本願で使用する用語法は、当該技術分野内で標準的であるが、特定の用語の定義は、特許請求の範囲の意味に対して明快さ及び明確さを保証するために本明細書において提供される。単位、接頭辞及び記号は、それらのＳＩで認められた形式で示され得る。本明細書に記載の数値範囲は、範囲を定義する数を含み、定義された範囲内の各整数を含み、それを支持する。別段の記載がない限り、本明細書に記載の方法及び手法は、一般に、当該技術分野においてよく知られる従来の方法に従って実施され、こうした方法及び手法は、本明細書を通して引用され且つ論じられる様々な一般の参考文献及び特定性の高い参考文献に記載されるものである。特許、特許出願、論文、書籍及び学術論文が挙げられるが、これらに限定されない、本願で引用される全ての文献又は文献の一部は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

本発明は、本発明の個々の態様の単一の説明として意図されている本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的に同等の方法及び構成要素は、本発明の範囲内である。実際に、本明細書中に示され、記載されるものに加えて本発明の様々な変更形態は、上記及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。本発明の一態様又は実施形態に記載されているものは、本発明の他の態様及び／又は実施形態と組み合わせることができる。

実施例１３つのプロセスの比較研究
１：ＸｕｒｉＷ２５細胞培養システムにおいて活性化から増殖まで行う閉鎖系連続自己Ｔ細胞バイオプロセシング法を用いて生成された自己Ｔ細胞。「ＸｕｒｉＷ２５バイオリアクター」。
２：Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）６及び２４ウェルプレートにおいて活性化から増殖まで行うバイオプロセシングシステム。「Ｇ－Ｒｅｘ」。
３：活性化及び形質導入をガス透過性バッグで行った後、ＸｕｒｉＷ２５細胞培養システムでＴ細胞の増殖を行うハイブリッドバイオプロセシングシステム。「透過性バッグ」。

さらに、ＩＬ２（培地１）又はＴＷＳ１１９＋ＩＬ７＋ＩＬ２１（培地２）を補充した２つの異なる培養培地もまた、閉鎖系連続自己Ｔ細胞バイオプロセシングシステム及びＧ－Ｒｅｘ（登録商標）プレートを用いて比較した。

Ｔ細胞の生成を、その純度、表現型及びインビトロ特性について評価した。

０日目に、正常な末梢血から採取された３００ｍｌの新鮮な白血球アフェレーシス生成物を含有する新鮮なＬｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）（Ｈｅｍａｃａｒｅ、Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）を、ＣＤ－６００．１Ｓｅｐａｘ細胞分離キット（ＧＥ）に無菌接続し、ＣｕｌｔｕｒｅＷａｓｈ－Ｐｒｏプログラムの下で処理した。Ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）は、白血球、赤血球及び血小板を含有した。細胞を１ＬＣｌｉｎＭＡＣＳＰＢＳ／ＥＤＴＡ、５ｍｌヒト血清アルブミン（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）中で洗浄し、ＣＳ－６００．１キット（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＳｅｐａｘＣＰｒｏ細胞分離システムを製造業者の取扱説明書に従って使用して、血漿及びアフェレーシス緩衝液を除去した。Ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）に添付されたドナー情報シートに示された初期白血球（ＷＢＣ）数に基づいて、細胞を、約５０ｍｌのＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地を用いて１５０Ｅ６ＷＢＣ／ｍｌの細胞密度で溶出した。

洗浄した白血球アフェレーシス採取試料中の有核細胞を、ＮＣ－２００（商標）自動細胞計数器（ＣｈｅｍＭｅｔｅｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて計数し、続いて、洗浄した細胞の総生細胞数、生存率及び免疫表現型解析を行った。

１）ＸｕｒｉＷ２５細胞培養システムを使用する閉鎖系連続自己Ｔ細胞バイオプロセス。「ＸｕｒｉＷ２５バイオリアクター」
次いで、１．２Ｅ９有核細胞を含む洗浄したアフェレーシスドナー細胞の一部を、同じＣＤ－６００．１キットを備えたＳｅｐａｘＣ－Ｐｒｏプロセシングシステムを用いて、Ｄｉｌｕｔｅプログラムの下で、２つのトランスファーバッグ（ＣｈａｒｔｅｒＭｅｄｉｃｉｎｅ、Ｗｉｎｓｔｏｎ－Ｓａｌｅｍ、ＮＣ）に移した。１つのバッグに、約８ｍｌの培地１：（３００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ２を含むＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））を加えた。第２のバッグに、約８ｍｌの培地２：（５μＭのＴＷＳ１１９（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ）、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ７（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地）を加えた。各バッグを７．５ｍｌのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２（２５μｌ／ｍｌの細胞、ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に室温で１時間インキュベートして、抗体結合を飽和させた。添加したＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔの濃度は、以下の工程で記載するように、３００ｍｌの最終活性化培養容量で決定した。ＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地：ＯｐＴｉｍｉｚｅｒＴ細胞増殖培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、２．５％免疫細胞ＳＲサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２．６％ＣＴＳＴ細胞サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ＧｌｕｔａＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．１％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、及び３００ＩＵ／ｍｌＩＬ２。

２ＬＸｕｒｉＳＰＰｅｒｆＣｅｌｌｂａｇバイオリアクター（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＸｕｒｉ細胞培養システムＷ２５に接続し、３００ｍｌの培地１を加え、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量、及び６°の角度で６ｒｐｍのロッキング速度で平衡化させた。第２の２ＬＸｕｒｉＳＰＰｅｒｆＣｅｌｌｂａｇバイオリアクターもＸｕｒｉ細胞培養システムＷ２５に接続し、３００ｍｌ培地２を同様に平衡化した。

培地１及び培地２中の細胞を含むトランスファーバッグをＸｕｒｉＣｅｌｌｂａｇフィードラインに無菌接続し、内容物を重力によってバッグ中に移送した。次いで、細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量、２°の角度で２ｒｐｍのロッキング速度で一晩培養して、Ｔ細胞を活性化した。

１日目に、各バッグ中の有核細胞を計数した。１機能性タイターのＭＯＩに対応するレンチウイルスベクター（ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む）の量を、１０ｍｌの培地１又は培地２で希釈し、トランスファーバッグに入れた。トランスファーバッグをＸｕｒｉＣｅｌｌｂａｇフィードラインに無菌接続し、レンチウイルスを重力流によってバイオリアクターのそれぞれに移送した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量、及び２°角度で２ｒｐｍのロッキング速度で２０～２４時間インキュベートした。

２日目に、各バイオリアクターバッグ中の培養培地の約半分の量を、フィードライン及び廃棄ラインによって３回の５０ｍｌバッグ洗浄を用いて交換した。細胞を毎日計数し、生細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率をＮＣ２００（商標）自動細胞計数器（ＣｈｅｍＭｅｔｅｃ）を用いて測定し、溶存酸素及び代謝産物もまた測定した。細胞表現型を、試験した全ての試料について決定した。バッグを、２°角度で２ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量で２４時間、ロッキングバイオリアクター上に維持した。

３～７日目に、ＩＬ－２（培地１）又はＴＷＳ１１９／ＩＬ１７／ＩＬ２１（培地２）を含有する追加のＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地を、２Ｅ６細胞／ｍｌを上回る細胞密度を維持するために、フェドバッチ／潅流供給によって両方の培養物に１Ｌの最終容量まで添加した。細胞密度を所望のレベルに維持するために、体積の増加に伴い、ロッキング速度及び角度を、４°の角度で４ＲＰＭまで増加した。

総生細胞密度、生存率、グルコース及び乳酸塩の測定を毎日行った。表現型解析は、３、５及び７日目に行った。

７～１０日目に、両方の培養物を、１バッグ容量／日の速度の潅流供給に切り替えた。ここで、両方のバイオリアクターバッグに培地１を供給した。細胞密度の増加に伴い、溶存Ｏ_２レベルはフィードバック制御によって８０％に維持した。

総生細胞密度、生存率、グルコース及び乳酸塩の測定を毎日行った。表現型解析は１０日目に行った。

細胞を１０日目に回収した。ＸｕｒｉＳＰＰｅｒバイオリアクターバッグを、ＦｌｅｘＣｅｌｌプログラム及びＣＴ－８００．１細胞プロセシングキット（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｓｅｌｆｉａ５２００細胞プロセシングシステムに無菌接続した。Ｔ細胞を７５ｍｌ／分の流量で約２０ｍｌに濃縮した。１ｖｏｌ％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充した０．９％の生理食塩水（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌ）を用いて、１回の洗浄サイクルを行った。洗浄は３８０×ｇで５分間行った。

細胞を、５％ＨＳＡを補充した等容量の生理食塩水＋１％ＨＳＡ＋ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）凍結保存用培地（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に再構成し、コントロールレートフリーザーＶｉａＦｒｅｅｚｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて－８０℃まで凍結させ、液体窒素中で保存することによって凍結保存した。

２．Ｇ－ｒｅｘプレート「Ｇ－ｒｅｘ」。
培地１及び培地２を用い、製造業者のプロトコールに従って、２４ウェル又は６ウェルＧ－Ｒｅｘ（登録商標）（ＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆ、ＮｅｗＢｒｉｇｈｔｏｎ、ＭＮ）プレートで細胞を培養した。１Ｅ６細胞／ウェルをＧ－Ｒｅｘ（登録商標）プレートに播種し、０日目にＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２（２５ｕｇ／ｍｌ細胞を含む培地）で活性化した。活性化の約２４時間後、細胞を１Ｅ６細胞／ウェル（濃度２Ｅ６細胞／ｍＬ）で播種し、１機能性タイターのＭＯＩに対応する量の同じレンチウイルスベクター（ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む）を各ウェルに加えた。２日目に、培地１及び培地２をウェルの全容量（合計６ｍＬ）まで加えてウイルスを希釈した。２～３日毎に培地を交換し、細胞に栄養を与えた。

細胞を毎日計数し、生細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率をＮＣ２００（商標）自動細胞計数器（ＣｈｅｍＭｅｔｅｃ）を用いて測定し、溶存酸素及び代謝産物もまた測定した。細胞表現型を、試験した全ての試料について決定した。

３．活性化及び形質導入をガス透過性バッグで行った後、ＸｕｒｉＷ２５細胞培養システムでＴ細胞の増殖を行うハイブリッドバイオプロセシングシステム。「潅流バッグ」。
５００Ｅ６有核細胞を含む洗浄済みのアフェレーシスドナー細胞を、６ｍｌのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２と共にガス透過性バッグ（ＯｒｉＧｅｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）に移し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。

有核細胞を計数した。１機能性タイターのＭＯＩに対応する量の同じレンチウイルスベクター（ａＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む）を、シリンジを使用してバッグに直接加え、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。

その後、翌日に、細胞を２つのガス透過性バッグに分け、合計１０億個の有核細胞まで、３７℃、５％ＣＯ_２でバッグ中でインキュベートした。

次いで、細胞を、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２を含有する３００ｍｌのＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地を含有するＸｕｒｉＷ２５細胞培養システム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の２ＬＸｕｒｉＳＰＰｅｒｆＣｅｌｌｂａｇバイオリアクターバッグに播種し、６°の角度で６ｒｐｍの速度でロッキングした。バイオリアクターを、播種の２４時間後に１Ｌの容量までスケールアップした。新鮮な培地を５００ｍｌ／日で１日間潅流した後、回収まで１Ｌ／日とした。

細胞を回収し、濃縮し、さらに、５％ＨＳＡを補充したＨｙＣｌｏｎｅ（商標）凍結保存用培地（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１：１の比率で製剤化し、ＶｉａＦｒｅｅｚｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて－１００℃まで凍結させ、液体窒素中で保存することによって凍結保存した。回収時の生存率及び回収率を測定した。

結果
図１は、条件１のＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターを使用する閉鎖系連続自己Ｔ細胞バイオプロセスの下で生成されたＴ細胞の、回収時の増殖曲線及びＴＣＲ発現を示す。図１Ａは、ＩＬ２のみ、又はＩＬ７、ＩＬ２１及びＴＷＳ１１９のカクテルを補充した培地を含むＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターにおける細胞増殖の増殖曲線を示す。ＩＬ２を含む培地は１０日間で１６０億個のＴ細胞を生じ、ＩＬ７、ＩＬ２１及びＴＷＳ１１９を含む培地は１０日間で１２０億個のＴ細胞を生じた。図１Ｂは、ＩＬ２のみ、又はＩＬ７、ＩＬ２１及びＴＷＳ１１９のカクテルを補充した培地を含むＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターにおいて増殖した細胞の生存率を示す。細胞生存率は、増殖を通して９０％を超え、異なる培地条件間で細胞生存率の差異は観察されなかった。

図２は、異なる条件下でのＴ細胞導入遺伝子発現を示す。活性化の１日後に、全ての細胞に同じレンチウイルスベクターをＭＯＩ＝１で形質導入した。導入遺伝子は、透過性バッグ（ハイブリッド条件３）又はＧ－Ｒｅｘシステム（条件２）で形質導入された細胞と比較して、ＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターで形質導入された細胞においてより高度に発現した。

図３は、異なる試験条件から回収したＴ細胞における白血球サブセットを示す。ヒトＢ細胞（ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、ＮＫ細胞（ＣＤ５６／１６）、ＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋Ｃｄ５６＋）及びＴ細胞（ＣＤ３＋Ｃｄ５６－）の分析は、免疫表現型解析によって行った。Ｔ細胞純度は全ての条件で９８％を超え、異なる条件間で非Ｔ細胞サブセットの割合に有意差は見られなかった。

図４は、異なる条件下での５日目（Ａ）及び１０日目（Ｂ）のＴ細胞サブセットの割合を示す。Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ及びＴｔｅサブセットを、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５及びＣＣＲ７の発現に基づく免疫表現型解析によって分析した。５日目では、ＸｕｒｉＷ２５バイオリアクター中で生成されたＴ細胞は、Ｇ－Ｒｅｘシステム又は透過性バッグ中で生成されたＴ細胞よりも、Ｔｓｃｍ及びＴｃｍの割合が高く、１０日目では、Ｔｃｍの割合が、Ｇ－Ｒｅｘシステムで生成されたＴ細胞よりも高く、表現型の分化が少ないことを示した。

図５は、標的細胞の溶解（Ａ）、標的細胞に応答したＩＦＮ－ガンマの放出（Ｂ）、及び標的細胞に応答したＴＮＦ－アルファの放出（Ｃ）の能力によって特徴付けられる改変Ｔ細胞の細胞傷害性機能を示す。簡潔に記すと、回収されたＴ細胞及びペプチドパルスＴ２細胞を、１：１の比で共培養した。Ｔ２細胞をルシフェラーゼ処理し、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて発光を測定した。発光の減少を用いて、改変Ｔ細胞の細胞傷害性の指標としてＴ２細胞の細胞死を定量した。図に示すように、２つの培地条件（ＩＬ２、又はＩＬ７、ＩＬ２１、ＴＷＳ１１９）下でＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターにおいて生成された改変Ｔ細胞はいずれも、静的透過性バッグ及び静的Ｇ－Ｒｅｘシステムで生成された改変Ｔ細胞よりも、標的細胞を死滅させる能力（Ａ）が高く、これはおそらくＩＦＮ－ガンマ（Ｂ）及びＴＮＦ－アルファ（Ｃ）の放出がより強いためであろう。

図６は、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でインビトロにおいて標的細胞と共培養した後のアネキシンのレベル（Ａ）及び疲弊マーカーＴｉｍ３の発現（Ｂ）によって特徴付けられる、改変Ｔ細胞の標的細胞チャレンジに対する耐性を示す。アポトーシス細胞におけるホスファチジルセリンの外在化を、紫色蛍光ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（商標）色素にコンジュゲートした組換えアネキシンＶを用いて検出した。エフェクター表現型を有するＴ細胞は標的細胞チャレンジによる活性化を受けやすく、活性化後にアポトーシスになるので、アネキシンのレベルが低いことはより多くのメモリーサブセットを有するＴ細胞を示すはずである。図に示されるように、ＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターで生成された改変Ｔ細胞は、標的細胞チャレンジに応答したアネキシンレベルが、Ｇ－Ｒｅｘシステム又は透過性バッグからの細胞よりも低いく、したがって、より多くのメモリー表現型様である（Ａ）。さらに、ＸｕｒｉＷ２５バイオリアクター及び透過性バッグで生成された改変Ｔ細胞は、Ｇ－Ｒｅｘシステムからの細胞と比較して、疲弊マーカーＴｉｍ３の発現が低かった（Ｂ）。

自己レンチウイルス操作Ｔ細胞を生成する能力を、閉鎖系連続自己Ｔ細胞バイオプロセシング法と、静的Ｇ－Ｒｅｘ及びハイブリッドガス透過性バッグ／Ｘｕｒｉシステムとで比較した。閉鎖系連続法は、静的Ｇ－Ｒｅｘシステム又は静的ガス透過性バッグで形質導入されたＴ細胞と比較した場合、より高い導入遺伝子発現、より高いレベルのサイトカイン分泌、及びより多くのメモリー様表現型を有するＴ細胞を生成した。

実施例２培養培地への解糖阻害剤の添加
０日目に、正常な末梢血から採取された３００ｍｌの新鮮な白血球アフェレーシス生成物を含有する新鮮なＬｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）（Ｈｅｍａｃａｒｅ、Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）を、ＣＤ－６００．１Ｓｅｐａｘ細胞分離キット（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に無菌接続し、ＣｕｌｔｕｒｅＷａｓｈ－Ｐｒｏプログラムの下で処理した。Ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）は、白血球、赤血球及び血小板を含んだ。細胞を１ＬＣｌｉｎＭＡＣＳＰＢＳ／ＥＤＴＡ、５ｍｌヒト血清アルブミン（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）中で洗浄し、ＣＳ－６００．１キット（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＳｅｐａｘＣＰｒｏ細胞分離システムを製造業者の取扱説明書に従って使用して、血漿及びアフェレーシス緩衝液を除去した。細胞を洗浄し、実施例１で上述したように計数した。

１．２Ｅ９有核細胞を含む洗浄済みのアフェレーシスドナー細胞の一部を、同じＣＳ－６００．１キット（新しいキットは使用しなかった）を有するＳｅｐａｘＣ－Ｐｒｏプロセシングシステムを使用して、Ｄｉｌｕｔｅプログラムの下で２つのトランスファーバッグに移した。１つのバッグに、約８ｍｌの培地１（３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２及び２ｍＭの２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））を加えた。第２のバッグに、約８ｍｌの培地２（３００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ２を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））を加えた。それぞれに、７．５ｍｌのＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１２（２５μｌ／ｍｌ細胞を含む培地、ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。アクチベーターの量は、以下の培養／活性化工程で使用した３００ｍｌの培養容量に基づいて決定した。バッグを室温で１時間インキュベートして、抗体結合を飽和させた。

培地１及び培地２中の細胞を含むトランスファーバッグをＸｕｒｉＣｅｌｌｂａｇフィードラインに無菌接続し、内容物を重力によってバッグ中に移送した。次いで、細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量、２°の角度で２ｒｐｍのロッキング速度で一晩インキュベートした。

１日目に、各バッグ中の有核細胞を計数し、１機能性タイターのＭＯＩに対応するレンチウイルスベクター（ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む）の量を、１０ｍｌの培地１又は培地２で希釈し、トランスファーバッグに入れた。トランスファーバッグをＸｕｒｉＣｅｌｌｂａｇフィードラインに無菌接続し、次いで、レンチウイルスを重力流によってバイオリアクターのそれぞれに移送した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量、及び２°角度で２ｒｐｍのロッキング速度で２０～２４時間インキュベートした。

２日目に、各バイオリアクターバッグ中の培養培地の約半分の量を、フィードライン及び廃棄ラインによって３回の５０ｍｌバッグ洗浄を用いて交換した。細胞数を毎日測定し、生細胞密度（ＶＣＤ）、生存率、溶存酸素、代謝産物を上記のように測定した。細胞表現型を、試験した全ての試料について決定した。バッグを、２°角度で２ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量で２４時間、ロッキングバイオリアクター上に維持した。

３～９日目に、ＩＬ－２／２－ＤＧ（培地１）及びＩＬ２（培地２）のいずれかを含有する追加のＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地を、２Ｅ６細胞／ｍｌを上回る細胞密度を維持するために、フェドバッチ／潅流供給によって１Ｌまで添加した。バイオリアクターにおいて十分な物質移動を維持するために、培養容量の増加に伴い、ロッキング速度及び角度を、４°の角度で４ＲＰＭまで増加した。培養容量が１Ｌに達したとき、２－ＤＧを含有する培地１を、ＩＬ２のみを含有するＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地（培地２）で潅流した。別の実験において、２－ＤＧを含有するＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地を、回収まで維持した。

９～１４日目に、両方の培養物を、１Ｌ／日の潅流供給に切り替え、ロッキングを６°の角度で６ＲＰＭに設定した。

総生細胞密度、生存率、グルコース及び乳酸塩の測定を毎日行った。表現型解析は９日目及び１４日目に行った。

細胞を１４日目に回収した。ＸｕｒｉＳＰＰｅｒバイオリアクターバッグを、ＦｌｅｘＣｅｌｌプログラム及びＣＴ－８００．１細胞プロセシングキット（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｓｅｌｆｉａ５２００細胞プロセシングシステムに無菌接続した。Ｔ細胞を７５ｍｌ／分の流量で約２０ｍｌに濃縮した。１ｖｏｌ％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充した０．９％の生理食塩水（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌ）を用いて、１回の洗浄サイクルを行った。洗浄は３８０×ｇで５分間行った。

生存率及び回収率を測定した。細胞を濃縮し、５％ヒト血清アルブミンを補充したＨｙｃｌｏｎｅを用いて１：１の比率でさらに製剤化し、ＶｉａＦｒｅｅｚｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて－８０℃まで凍結させ、液体窒素中で保存することによって凍結保存した

結果
抗原刺激の間、Ｔ細胞は解糖代謝に移行して、エフェクター機能を維持する。しかし、インビトロ増殖中のＴ細胞分化におけるグルコース代謝の役割は不明である。この研究では、グルコース代謝、特に解糖が、増殖時のエフェクター表現型へのＴ細胞分化を支持し、２－ＤＧによる解糖の薬理学的阻害が、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２抗原媒介性分化を弱め、メモリー表現型を促進することができるという仮説を立てた。この実験では、Ｔ細胞活性化後の解糖を阻害するために、２－ＤＧをアクチベーターと共に細胞に添加した。次いで、解糖を回復させて細胞増殖を支持するために増殖期の後半に２－ＤＧを除去するか、又は収穫まで全プロセスを通して２－ＤＧを維持した。２－ＤＧ阻害Ｔ細胞分化に由来する改変Ｔ細胞は、２－ＤＧを含まない培地に由来するＴ細胞と比較して、より多くのＴｓｃｍ及びＴｃｍを生成した。これにより、Ｔ細胞のより高い収量、より高い導入遺伝子発現、及びＴ細胞のより多くのメモリー様表現型がもたらされた。

図７は、２－ＤＧを添加した培地（培地１）及び２－ＤＧを添加しない培地（培地２）で増殖させた細胞の増殖曲線（Ａ）及び生存率（Ｂ）を示す。２－ＤＧを含有する培地は１４日間で３５０億個のＴ細胞を生じ、一方、２－ＤＧを含まない培地条件は１４日間で２５０億個のＴ細胞を生じた。全体の生存率は７０％を超え、２－ＤＧ培地由来の細胞は、４日目から１０日目まで、非２－ＤＧ培地由来の細胞よりもわずかに高い生存率を示した。４～１０日目の生存率のこの低下は、おそらく非Ｔ細胞白血球の細胞死によるものであった。Ｔ細胞集団が培養物中で９０％超に濃縮された後、回収まで、生存率は９０％超に戻った。Ｔ細胞のＴｅｍへの分化の抑制を２－ＤＧで確認すると、Ｔｅｍ集団の減少に関連する細胞傷害性サイトカイン放出の減少もまた、２－ＤＧ培地を含有する試料における高い生存率に寄与している可能性がある。

図８は、２－ＤＧを添加した培地（培地１）及び２－ＤＧを添加しない培地（培地２）で増殖させた細胞の導入遺伝子の発現を示す。２－ＤＧ培地中のＴ細胞による導入遺伝子の発現は、非２－ＤＧ培地中のＴ細胞のそれよりわずかに高く（５６％対５４％）、細胞密度が３５０億細胞／ｍｌと高い場合、高レベル（５０．４％）に維持することができた。対照的に、非２－ＤＧ培地におけるＴ細胞の導入遺伝子発現は、高細胞密度（２５０億細胞／ｍｌ）で４４．４％に減少した。

図９は、２－ＤＧを添加した培地（培地１）及び２－ＤＧを添加しない培地（培地２）で増殖させた細胞によるＣＤ２５発現を示す。非２－ＤＧ培地におけるＴ細胞によるＣＤ２５の発現は、２－ＤＧ培地におけるＴ細胞よりも高いレベルで発現する活性化に対するより強い応答を示した（４６％対３２％）。両条件のＴ細胞によるＣＤ２５の発現によっても±８０％で飽和した。２－ＤＧ培地中のＴ細胞は、７日目及び９日目で、非２－ＤＧ培地中の細胞よりもＣＤ２５をより良好に保持した。これは、２－ＤＧ培地で生成されたＴ細胞の導入遺伝子発現及びＴ細胞収量がより高いことによるものであり得る。

図１０は、異なる培地条件下でのグルコース（Ａ）及び乳酸塩（Ｂ）の濃度を示す。ＣｅｄｅｘＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、グルコース及び乳酸塩を測定した。２－ＤＧ培地条件（培地１）下での解糖の阻害は、非２－ＤＧ条件（培地２）からのものと比較して、使用済み培地中のより高いグルコース濃度（より低いグルコース消費）（Ａ）及びより高い乳酸塩濃度（Ｂ）によって証明された。さらに、２－ＤＧの効果は、グルコース（Ａ）及び乳酸塩（Ｂ）レベルの回復が、７日目から１４日目までの培地からの２－ＤＧの除去後に見られたので、可逆的であった。

図１１は、２－ＤＧを補充した培地（培地１）及び補充しない培地（培地２）で増殖した細胞のＴ細胞分化表現型解析を示す。２－ＤＧを０日目～７日目に培地に添加し、フィード培地を７～１４日目に非２－ＤＧ培地（培地１）と交換した。２－ＤＧ培地中のＴ細胞は分化が少なく、これは５日目のＴｓｃｍサブセットがより高いこと（２６％対１４％）と、７日目のＴｃｍとＴｓｃｍの合計がより高いこと（８６％対６５％）によって示唆された。Ｔ細胞は、２－ＤＧを培養培地から潅流した後、分化をし続け、非２－ＤＧ培地（培地１）中のＴ細胞と同等の分化レベルで終了した。

図１２は、異なる培地条件下で回収されたＴ細胞における白血球サブセットを示す。ヒトＢ細胞（ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、ＮＫ細胞（ＣＤ５６／１６）、ＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋Ｃｄ５６＋）及びＴ細胞（ＣＤ３＋Ｃｄ５６－）の分析は、免疫表現型解析によって行った。ＮＫＴ細胞は５％から±１０％まで増殖したが、両方の条件におけるＣＤ３＋細胞純度は９８％を超え、２－ＤＧ培地条件と非２－ＤＧ培地条件との間で非Ｔ細胞サブセットの割合に有意差は認められなかった。

図１３は、改変ＴＣＲＴ細胞の効力アッセイの結果を示す。ルシフェラーゼを発現するＴ２細胞を、改変ＴＣＲ又はＤＭＳＯによって認識されるペプチドで４時間パルスし、細胞を洗浄した後、１：１（Ｅ：Ｔ）比で総Ｔ細胞２０，０００個との共培養アッセイを設定した。（Ａ）４８時間後、ＳｔｅａｄｙＧｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ルシフェラーゼシグナルを測定した。特異的細胞傷害性を、ＴＣＲＴ細胞と共に培養した非ペプチドＴ２細胞と比較して測定した。（Ｂ）２４時間の共培養後に、ＩＦＮ－γ発現を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＷａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて測定した。高ペプチド濃度（１μＭ）では、２‐ＤＧ培地及び非２‐ＤＧ培地のＴ細胞間のＴ２細胞溶解に有意差は認められず、低ペプチド濃度（１０ｎＭ）で、非２‐ＤＧ培地のＴ細胞にわずかに高いＴ２細胞溶解が認められた。さらに、加えて、２４時間のＩＦＮ－γの蓄積放出は、試験したペプチドの全ての濃度を横切る非２－ＤＧ培地中のＴ細胞についてより高かった。早期の時点（２４時間）の２－ＤＧ培地中のＴ細胞のＩＦＮ－γのレベルの低さは、遅延によるものであろう。さらなるデータ（本明細書には示さず）は、２－ＤＧ培地からのＴ細胞における活性化が、非２－ＤＧ培地からのＴ細胞よりも長時間の活性化を有しており、短期ＩＦＮ－γアッセイでは捕捉することができないことを示唆した。（Ｃ）は異なる培地条件下でのＴ細胞の分化を示す。２－ＤＧを含有する培養培地を全プロセス（１０日間）を通して使用した。２－ＤＧ培地からのＴ細胞は、非２－ＤＧ培地からのＴ細胞と比較して、回収されたＴｓｃｍ及びＴｃｍサブセットの割合がより高いことによって示唆されるように、分化が少なかった（５９％対４３％）。このデータは、２－ＤＧを、収穫までの全プロセスの間、培養培地中に補充することを示唆している。

実施例３
この実験は、ドナーのアフェレーシス細胞試料の細胞（非濃縮）のＣＡＲ及びＴＣＲ形質導入を、Ｔ細胞についてさらに濃縮した同じアフェレーシス細胞試料の細胞（濃縮）と比較した。

０日目に、正常な末梢血から採取された３００ｍｌの新鮮な濃縮白血球アフェレーシス生成物を含有する新鮮なＬｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）（Ｈｅｍａｃａｒｅ、Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）を、ＣＤ－６００．１Ｓｅｐａｘ細胞分離キット（ＧＥ）に無菌接続し、ＣｕｌｔｕｒｅＷａｓｈ－Ｐｒｏプログラムの下で処理した。Ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）は、白血球、赤血球及び血小板を含有した。細胞を洗浄して、実施例１で上述したように血漿及びアフェレーシス緩衝液を除去し、有核細胞をＮＣ－２００（商標）自動細胞計数器を用いて計数し、ＳｅｐａｘＣ－Ｐｒｏ細胞プロセシングシステム使用して、Ｄｉｌｕｔｅプログラムの下で２つのトランスファーバッグ（試料１、濃縮Ｔ細胞）及び（試料２、非濃縮アフェレーシスドナー細胞）に等しく分割した。

試料１「濃縮Ｔ細胞」については、Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトｐａｎＴネガティブ選択キット（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の取扱説明書に従って使用して、洗浄したアフェレーシスされた細胞から単離した。濃縮Ｔ細胞を、３００ＩＵのＩＬ２を含有する１２０ｍｌのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ完全培地中、４Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度で、ガス透過性バッグに加えた。ガス透過性バッグは、ＰＢＳ中、１．２３ｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）で予めコーティングした。活性化のために、その後、可溶性抗ＣＤ２８抗体（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を１：１００（１μ／ｍｌ）の希釈で透過性バッグに添加した。

試料２「非濃縮アフェレーシスドナー細胞」については、１２０ｍｌＯｐｔｉｍｉｚｅｒ完全培地（３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含有）中、同じ細胞密度（４Ｅ６有核細胞／ｍｌ）を、試料１のように抗ＣＤ３抗体で予めコーティングしたガス透過性バッグに加えた。活性化のために、その後、可溶性抗ＣＤ２８抗体（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を１：１００（１μ／ｍｌ）の希釈で透過性バッグに添加した。

１日目：各ガス透過性バッグ中の有核細胞を計数し、１（ＴＣＲ）機能性タイターのＭＯＩに対応するＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターの量を１つのバッグに加え、４０（ＣＡＲ）機能性タイターのＭＯＩに対応するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを第２のバッグに直接加え、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを第３のガス透過性バッグに加えた。バッグを３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。

２～６日目：２日目に、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含有する追加の１２０ｍｌのＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地を各ガス透過性バッグに添加して、レンチウイルスを希釈した。

各ガス透過性バッグからの細胞を、４日目に２つのバッグに分割し、６日目に、（実施例１に記載のように）ＸｕｒｉＷ２５バイオリアクターの平衡化ＸｕｒｉＳＰＰｅｒｆバイオリアクターバッグに播種し、総容量８００ｍｌの培養培地とした。バイオリアクターを、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量にて、６ｒｐｍの速度及び６°の角度で、全増殖期間を通してロッキングさせた。

７～１３又は１４日目：７日目に、バイオリアクター中の培養培地の容量を１Ｌまでスケールアップした。細胞を、それらが収穫される１３日目又は１４日目までバイオリアクター中に保持した。増殖中、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含有するＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地を、８日目は５００ｍｌ／日の速度で、９日目は８００ｍｌ／日の速度で、１０日目から収穫時まで１Ｌ／日の速度で潅流した。細胞数、生細胞密度、細胞生存率及び代謝産物を毎日測定した。

１３日目又は１４日目に細胞を収穫した。バイオリアクターバッグを、ＣｕｌｔｕｒｅＷａｓｈプログラム及びＣＴ－６００細胞プロセシングキット（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＳｅｐａｘＰｒｏに無菌接続した。１ｖｏｌ％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充した生理食塩水（Ｂａｘｔｅｒ）を用いて、１回の洗浄サイクルを行った。洗浄は３８０×ｇで５分間行った。

生存率及び回収率を測定した。細胞を濃縮し、さらに、５％のヒト血清アルブミンを補充したＨｙＣｌｏｎｅ（商標）凍結保存用培地（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１：１の比率で製剤化し、ＶｉａＦｒｅｅｚｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて－１００℃まで凍結させ、液体窒素中で保存することによって凍結保存した。

結果
非濃縮のアフェレーシスドナー細胞を出発材料として使用することにより、濃縮されたＴ細胞を出発材料として使用した場合と比較して、表面発現及びゲノム組み込みのレベルでわかるように、形質導入効率が改善された。さらに、アフェレーシスの非濃縮細胞は、低分化Ｔ細胞表現型を促進した。試験した３つドナーのうち２つは、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットの両方において、収穫時のＴｓｃｍ及びＴｃｍについてより高い割合を示した。Ｔ細胞純度は、出発物質として濃縮Ｔ細胞を使用した場合と非濃縮Ｔ細胞を使用した場合で同等であった。

図１４は、収穫時の濃縮細胞からのＴ細胞及び非濃縮細胞からのＴ細胞の導入遺伝子発現を示す。ＣＡＲ、ＴＣＲ又はＧＦＰを送達する３つの異なるレンチウイルスベクターを、濃縮ドナー細胞及び非濃縮ドナー細胞に形質導入した。導入遺伝子発現は、フローサイトメトリーを使用して、ＣＡＲの抗体染色、ＴＣＲのデキストラマー染色、及びＧＦＰの蛍光シグナルによって検出した。ＣＡＲ、ＴＣＲ及びＧＦＰは、濃縮プロセス由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも、非濃縮細胞由来のＣＤ８Ｔ細胞において高かった（Ａ）。デキストラマー染色はＣＤ８受容体依存性であり、したがって、ＣＤ４Ｔ細胞はＴＣＲの発現を示さなかった（Ｂ）。しかしながら、ＣＡＲ及びＧＦＰ発現は、いずれも、濃縮ドナー細胞と比較して、非濃縮ドナー細胞由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞においてより高かった（Ｂ）。

図１５は、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＴＣＲのベクターコピー数を示す。ＷＰＲＥ及びヒトアルブミンのコピーをｑＰＣＲによって測定し、ＴＣＲのベクターコピー数を、ＷＰＲＥとヒトアルブミンの比を２で割って算出した。ＴＣＲのベクターコピー数は、非濃縮ドナー細胞からのＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方で、濃縮ドナー細胞よりも高かった。導入遺伝子組み込みはまた、より高いベクターコピー数によって示されるように、濃縮Ｔ細胞よりもアフェレーシス由来のＴ細胞においてより高かったことがわかる。

図１６は、収穫終了時に測定された白血球及び白血球サブセットの割合を示す。全ての細胞を白血球（ＣＤ４５＋）について染色した。最少（＜１％）のＢ細胞（ＣＤ１９＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ５６／１６＋）及び単球（ＣＤ１４＋）が、非濃縮及び濃縮ドナー細胞の両方で検出された。全体として、ＣＤ３^＋細胞の割合（＞９９％）は、非濃縮ドナー細胞と濃縮ドナー細胞との間で同等であり、Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６－）の割合は、ＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）の増殖のために、濃縮ドナー細胞でわずかに低かった。

図１７は、濃縮ドナー細胞及び非濃縮ドナー細胞の収穫時のＴ細胞表現型を示す。この実験は、毎回異なるドナー試料を用いて３回繰り返した。試験された３つのドナー試料の中で、２つのドナーから採取されたＴ細胞は、Ｔ細胞濃縮に供された細胞と比較して、非濃縮ドナー細胞からより高い割合でメモリーステムセルマーカー（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋）及びセントラルメモリーマーカー（ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＣＲ７＋）を発現した。この差はＣＤ８^＋Ｔ細胞においてのみ有意であり、ＣＤ４^＋Ｔ細胞においては有意ではなかった。

図１８は、濃縮ドナー細胞及び非濃縮ドナー細胞からのバイオリアクターにおける細胞の増殖曲線及び生存率を示す。増殖（Ａ）及び生存率（Ｂ）は、濃縮ドナー細胞と非濃縮ドナー細胞との間で同等であった。

実施例４この実施例は、Ｔ細胞受容体を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞を生成するための閉鎖系連続法を提供する。
０日目に、正常な末梢血から採取された３００ｍｌの新鮮な濃縮白血球アフェレーシス生成物を含有する新鮮なＬｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）（Ｈｅｍａｃａｒｅ、Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）を、ＣＤ－６００．１Ｓｅｐａｘ細胞分離キット（ＧＥ）に無菌接続し、ＣｕｌｔｕｒｅＷａｓｈ－Ｐｒｏプログラムの下で処理した。Ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）は、白血球、赤血球及び血小板を含有した。細胞を１ＬＣｌｉｎＭＡＣＳＰＢＳ／ＥＤＴＡ、５ｍｌヒト血清アルブミン（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）中で洗浄し、ＣＳ－６００．１キット（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＳｅｐａｘＣＰｒｏを製造業者の取扱説明書に従って使用して、血漿及びアフェレーシス緩衝液を除去した。Ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）に添付されたドナー情報シートに示された初期白血球（ＷＢＣ）数に基づいて、細胞を、約５０ｍｌのＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地を用いて１５０Ｅ６ＷＢＣ／ｍｌの細胞密度で溶出した。

洗浄した白血球アフェレーシス採取試料中の有核細胞を、ＮＣ－２００（商標）自動細胞計数器を用いて計数し、続いて、洗浄した細胞の総生細胞数、生存率及び免疫表現型解析を行った。

次いで、１．２Ｅ９有核細胞を含む洗浄したアフェレーシスドナー細胞の試料を、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含有する約６．５ｍｌのＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地で、同じＣＤ－６００．１キットを有するＳｅｐａｘＣ－ｐｒｏプロセシングシステムを用いて、Ｄｉｌｕｔｅプログラムの下でトランスファーバッグ（ＣｈａｒｔｅｒＭｅｄｉｃｉｎｅ）に移し、７．５ｍｌのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２（２．５μｇ／ｍｌ、ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に室温で１時間インキュベートし、抗体結合を飽和させた。

２ＬＸｕｒｉＳＰＰｅｒｆＣｅｌｌｂａｇバイオリアクター（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＸｕｒｉ細胞培養システムＷ２５に接続し、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含有する３００ｍｌのＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地を加え、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量、及び６°の角度で６ｒｐｍのロッキング速度で平衡化させた。

トランスファーバッグをＸｕｒｉＣｅｌｌｂａｇフィードラインに無菌接続し、内容物を重力によってバッグに移送した。次いで、細胞を、活性化を促進するために、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量にて、２°の角度で２ｒｐｍのロッキング速度で一晩インキュベートした。

１日目に、バッグ中の有核細胞を計数した。１機能性タイターのＭＯＩに対応する量のレンチウイルスベクター（ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む）を、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２を含有する１０ｍｌのＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地で希釈し、トランスファーバッグに入れた。トランスファーバッグをＸｕｒｉＣｅｌｌｂａｇフィードラインに無菌接続し、レンチウイルスベクターを重力によりバイオリアクターに移した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量、及び２°角度で２ｒｐｍのロッキング速度で２０～２４時間インキュベートした。

２日目に、バイオリアクターバッグ中の培養培地の約半分の量を、３回の５０ｍｌ洗浄を用いて、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２を含む新鮮なＯｐＴｉｍｉｚｅｒ完全培地と交換した。細胞を毎日計数し、生細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率をＮＣ２００を用いて測定し、溶存酸素、代謝産物もまた測定した。細胞表現型を、試験した全ての試料について決定した。バッグを、２°角度で２ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量で２４時間、ロッキングバイオリアクター上に維持した。

３～１０日目に、細胞密度が４ｅ６細胞／ｍｌに達するまで、２°角度で２ｒｐｍのロッキング速度、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量で、１日当たり１バッグ容量の速度の潅流供給によって、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２を含むＯｐＴｉｍｚｅｒ完全培地３００ｍｌで培養物を維持した。

その時点で、培養培地の容量を６００ｍｌに増加させ、細胞密度が再び４ｅ６細胞／ｍｌに達するまで、４°の角度で４ｒｐｍのロッキング速度、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量で、１日当たり１バイオリアクターバッグの速度で潅流した。

その時点で、培養培地の容量を１０００ｍｌに増加させ、１０日目に採取するまで、６°の角度で６ｒｐｍのロッキング速度、３７℃、５％ＣＯ_２、０．１Ｌ／分のガス流量で、１日当たり１バイオリアクターバッグの速度で潅流した。

次いで、細胞を、１％ＨＳＡを補充した生理食塩水中、２Ｅ８細胞／ｍｌで溶出し、さらに、５％ヒト血清アルブミンを補充したＨｙｃｌｏｎｅ（商標）凍結保存培地（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１：１の比率で製剤化した。次いで、最終細胞生成物を２つの凍結バッグ及びいくつかのクライオバイアルに分割し、これらを、最終的に、温度が－８０℃に達するまで－１℃／分の冷却速度でＶＩＡＦｒｅｅｚｅ（商標）Ｑｕａｄ冷凍庫（ＧＥ）中で凍結させた。凍結後、細胞を長期保存のために液体窒素に移した。

結果
図１９は、細胞の増殖曲線及び生存率を示す。生存率の低下は、非Ｔ細胞が徐々に死滅するためであると考えられる。

図２０は、０日目及び１０日目の白血球サブセットの割合を示す。細胞を、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ５６／１６－）、ＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ５６／１６＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ３－、ＣＤ５６＋）、ＣＤ４Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋）及びＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ８＋）を標的とする抗体カクテルで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。回収時まで（１０日間）に、ＣＤ３細胞純度は９８％に達し、全Ｔ細胞は９８％に、ＮＫＴ細胞は１０％に達した。

図２１は、バイオプロセシング中のＴ細胞分化を示す。Ｔ細胞サブセットＴｓｃｍ（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ９５＋）、Ｔｃｍ（ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ９５＋）、及びＴｅｍ（ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７－、ＣＤ９５＋）を抗体カクテルで染色し、様々な時点でフローサイトメトリーによって分析した。Ｔ細胞は、実施例１及び２に示したものと同様に分化し、収穫時までにＴｅｍで約７０％、Ｔｓｃｍ＋Ｔｃｍで約３０％であった。

図２２は、細胞表面レベル（Ａ）及びＤＮＡレベル（Ｂ）での、収穫したＴ細胞における導入遺伝子の発現を示す。デキストラマー染色を実施して、形質導入されたＴ細胞及び形質導入されていないＴ細胞の導入遺伝子の表面発現を確認した。導入遺伝子発現は、形質導入されたＴ細胞（Ａ）で５０％を超えた。収穫した細胞からＤＮＡを抽出し、ＷＰＲＥ及びヒトアルブミンを標的とするｑＰＣＲ反応に２ｎｇのＤＮＡを使用した。ベクターコピー数は、ＷＰＲＥのコピー数とヒトアルブミンのコピー数の比率を２で割ったものとして計算した。導入遺伝子の検出可能なコピーは形質導入していないＴ細胞において見出されず、形質導入したＴ細胞における導入遺伝子のコピー数はＦＤＡによって実施されたベクターコピー数に関するガイドライン内の５未満であった（Ｂ）。

図２３は、種々のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比での標的細胞のキリングの割合を示す。回収されたＴ細胞（形質導入された又は形質導入されていない）を、１：１、１：５及び１：１０のＥ：Ｔ比で２４時間、標的細胞と共培養した。標的細胞のキリングの割合は、２４時間の共培養後の標的細胞の細胞死の割合から算出した。形質導入されたＴ細胞は、試験した全てのＥ：Ｔ比で標的細胞に対し強いキリング効果（＞７０％）を示した。

図２４は、収穫した細胞のＩＦＮ－ガンマ放出を示す。収穫した細胞（形質導入された又は形質導入されていない）を、種々ノ濃度のペプチドでパルスした標的細胞と２４時間共培養した。上清中のＩＦＮ－ガンマを、Ａｌｐｈａｌｉｓａアッセイにより測定した。同様のレベルのＩＦＮ－ガンマが、実施例１及び２において見られた。

閉鎖系連続自己プロセスは、２６０億個超の改変Ｔ細胞を、迅速に（１０日間）、高い導入遺伝子発現率（＞５０％）と高いＣＤ３細胞純度（９８％）で生成した。改変Ｔ細胞は、低いエフェクター対標的細胞比（１：１０）で標的細胞に対して顕著なキリング能を示し、これはおそらく標的細胞に応答してＩＦＮ－ガンマを強力に放出することによると考えられる。

実施例５種々の試薬による刺激後のＴＣＲを発現するＴ細胞の形質導入効率の評価
０日目に、正常な末梢血から採取された１５０ｍｌの白血球アフェレーシス生成物を含有する新鮮なＬｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）（Ｈｅｍａｃａｒｅ、Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）の半分を、ＣＤ－６００．１Ｓｅｐａｘ細胞分離キット（ＧＥ）に無菌接続し、ＣｕｌｔｕｒｅＷａｓｈ－Ｐｒｏプログラムの下で処理した。Ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（登録商標）は、白血球、赤血球及び血小板を含有した。細胞を１ＬＣｌｉｎＭＡＣＳＰＢＳ／ＥＤＴＡ、５ｍｌヒト血清アルブミン（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）中で洗浄し、ＣＳ－６００．１キット（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＳｅｐａｘＣ－Ｐｒｏ細胞分離システムを製造業者の取扱説明書に従って使用して、血漿及びアフェレーシス緩衝液を除去した。

採取試料中の有核細胞を、ＮＣ－２００（商標）自動細胞計数器（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）を用いて計数し、続いて、洗浄した細胞の総生細胞数、生存率及び免疫表現型解析を行った。

ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトｐａｎＴネガティブ選択キット（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従って、洗浄されたドナー細胞からｐａｎＴ細胞を単離することによって、又はさらなる選択若しくは濃縮なしの洗浄されたドナー細胞（非濃縮細胞）を使用することによって、細胞の出発集団を調製した。濃縮ｐａｎＴ細胞及び非濃縮細胞を、特に明記しない限り、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地に再懸濁し、トランスファーバッグに加えた。いくつかの実験では、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及び／又はＴＷＳ１１１９（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を活性化培地及び増殖培地で使用した。

ガス透過性バッグ（ＰＬ０７、Ｐｅｒｍａｌｉｆｅ、ＯｒｉＧｅｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を、１ｕｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＣｌｏｎｅＯＫＴ３ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を含むＰＢＳで４℃にて一晩かけてコーティングすることによって調製し、ＰＢＳで洗浄した後、細胞を添加した。以下の条件を試験した。

１）１つの実験では、単離されたｐａｎＴ細胞（２×１０^６細胞／ｍＬ）を、抗ＣＤ３コーティングバッグ中の、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地に播種した。抗ＣＤ３又は出発細胞数の滴定のために、抗ＣＤ３コーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用した。プレートを、０．０００１～１０μｇ／ｍｌの滴定濃度で抗ＣＤ３でコーティングした。細胞を２０時間及び４８時間活性化した。これらの細胞は形質導入しなかった。ＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ６９、ＣＤ２５、及び４－１ＢＢのレベルを、２０時間及び４８時間でフローサイトメトリーによって測定した（１条件当たり２回の反復）。

２）種々のアクチベーターを比較するために、単離されたｐａｎＴ細胞（２×１０^６細胞／ｍＬ）を、抗ＣＤ３コーティングバッグ中の、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地に播種した。以下の可溶性アクチベーターを、それぞれ２Ｅ６細胞／ｍＬの培地１ｍＬ当たり２５ｕＬのアクチベーターで、製造業者の説明書に従って、コーティングされた抗ＣＤ３条件に対して試験した：Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、及びＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ－アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、１：１のビーズ：細胞比で、製造業者の取扱説明書に従って、コーティングされていないバッグで試験した。細胞／アクチベーターを２０時間及び４８時間インキュベートした。

３）単離されたｐａｎＴ細胞（２×１０^６細胞／ｍＬ）を、上記の抗ＣＤ３コーティング透過性バッグ中の、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地に接種した。以下のアクチベーターを試験した：上記の１ｕｇ／ｍＬのコーティングされた抗ＣＤ３ガス透過性バッグ、１ｕｇ／ｍＬ。可溶性抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、可溶性Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（培地１ｍＬ当たり２５ｕＬのアクチベーター）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）（１：１のビーズ：細胞比）、及び可溶性ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰＴＣｅｌｌＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８コンジュゲートポリマーナノマトリックス（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）（濃度（１：１７．５希釈）で）を、活性化の４８時間後に、コーティングされていないバッグ中で試験し、コーティングされた抗ＣＤ３バッグからの細胞を新しいバッグに移して、刺激を除去した。活性化後、細胞を、以下に記載するように形質導入した。細胞／アクチベーターを７日間インキュベートした。改変ＴＣＲ発現を、ＣＤ８＋Ｔ細胞にゲートしたペプチド－ＭＨＣクラスＩ複合体を認識するデキストラマーを使用するフローサイトメトリーによって評価した。

４）洗浄した白血球アフェレーシス細胞（２×１０^６細胞／ｍＬ）を、上記の抗ＣＤ３コーティング透過性バッグ中の、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地に播種した。以下のアクチベーターを試験した：１μｇ／ｍＬのコーティングされた抗ＣＤ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と１μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及び可溶性ＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（培地１ｍＬ当たり、２５μＬのアクチベーター）。活性化の４８時間後、コーティングされた抗ＣＤ３バッグから細胞を新しいバッグに移し、刺激を除去した。活性化後、細胞を、以下に記載するように形質導入した。細胞／アクチベーターを７日間インキュベートした。形質導入効率を、ＧＦＰ発現を使用し、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞にゲーティングするフローサイトメトリーによって評価した。

５）種々のサイトカインカクテルの効果。Ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｅｄ材料（ＷＬＰＣ）由来の新鮮な細胞を、次の４つの異なるサイトカインカクテルを含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地中にＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むガス透過性バッグ中、２×１０^６細胞／ｍＬで活性化した：ａ）３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２、ｂ）１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｃ）１０μＭのＴＷＳ１１９（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、又はｄ）１０ｎｇ／ｍＬＩＬ－７（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。改変ＴＣＲ発現を、ＴＣＲに特異的なデキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ）を使用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞にゲーティングするフローサイトメトリーによって評価した。

６）可溶性アクチベーターによる活性化に対する開始ＷＬＰＣ密度の効果。３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２又は１０μＭのＴＷＳ１１９（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ完全培地において、４つの異なる密度：（ａ）１×１０^６細胞／ｍＬ、ｂ）２×１０^６細胞／ｍＬ、ｃ）４×１０^６細胞／ｍＬ、又はｄ）６×１０^６細胞／ｍＬで、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により細胞を活性化した。改変ＴＣＲ発現を、ＴＣＲに特異的なデキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ）を使用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞にゲーティングするフローサイトメトリーによって評価した。

形質導入した場合、活性化の２４時間後、各バッグ（上記の実験３、４、５及び６から）中の細胞を計数した。１～２の機能性タイターのＭＯＩに対応する量のレンチウイルスベクター（ＴＣＲ及びＧＦＰをコードするポリヌクレオチドを含む）をバッグに加え、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。

２～３日毎に分割し、必要に応じてより大きなガス透過性バッグに移すことによって、細胞密度を１００万～３００万細胞／ｍＬの間に保ちながら、細胞をガス透過性バッグ中、静置培養で増殖させた。増殖は６～９日間行った。サイトカインを含む培地を２～３日毎に交換した。

細胞計数を１～３日毎に行った。

結果
図２５は、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及び４－１ＢＢによって測定された、コーティングされた抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体及びｐａｎＴ細胞活性化の滴定の結果を示す。Ｔ細胞の刺激に基づいて、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３を可溶性アクチベーターとの比較のために選択した。

図２６は、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及び４－１ＢＢによって測定された、コーティングされた抗ＣＤ３に対する、様々な可溶性アクチベーターによるパンＴ細胞の刺激の結果を示す。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８）は最も強い刺激を示し、次いで、培地中に２５μＬ／ｍＬの細胞の製造業者が推奨する濃度のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２が示した。興味深いことに、可溶性Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８アクチベーターは、コーティングされた抗ＣＤ３と同等であった。

図２７は、改変Ｔ細胞の形質導入効率が刺激シグナルに依存したことを示す。（Ａ）出発物質：ｐａｎＴ細胞。ＣＤ８＋Ｔ細胞上の改変ＴＣＲのデキストラマー染色は、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２が最高の形質導入効率を与えたことを示した。（Ｂ）出発物質：アフェレーシス細胞：形質導入されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現のためのＦＡＣＳは、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２がコーティングされた抗ＣＤ３よりも優れていることを示した。

図２８は、細胞増殖がコーティングされたアフェレーシス細胞活性化抗ＣＤ３／可溶性抗ＣＤ２８、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２、ＴｒａｎｓＡｃｔ、及びＤｙｎａｂｅａｄｓの間で９日間類似していたことを示す。

図２９は、改変Ｔ細胞の形質導入効率に培養条件が影響を及ぼしたことを示す。ＩＬ－２、ＩＬ－７／１５の組み合わせ、ＩＬ－７／２１の組み合わせを含有する培養培地中で増殖させたアフェレーシス細胞の形質導入効率は類似していた。ＩＬ－７／２１／ＴＷＳ１１９を含有するカクテルは形質導入効率を改善した。

図３０は、開始細胞密度が形質導入効率に影響を及ぼしたことを示す。全体的な増殖には影響がなかったが、培養培地がＩＬ－２又はＩＬ－７／２１／ＴＷＳ１１９のカクテルを含有する場合、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２で活性化されたアフェレーシスされた細胞の高い出発密度はより良好な形質導入効率をもたらした。

様々なＴ細胞アクチベーター及びサイトカインの本比較では、２つの異なる出発細胞集団、すなわち濃縮ｐａｎＴ細胞と白血球アフェレーシス細胞を用いる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ抗ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が最高のシグナル強度を提供したにもかかわらず高い形質導入率をもたらさなかったため、活性化強度と良好な形質導入効率とは相関しないようであった。コーティングされた抗ＣＤ３よりも高いが、Ｄｙｎａｂｅａｄｓよりも低いシグナル強度を有するＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２は、ＧＦＰ及び改変ＴＣＲの最も高い発現を有するＴ細胞を活性化した。様々なサイトカインカクテルの存在下での白血球アフェレーシス細胞のＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２による活性化は形質導入効率に影響を及ぼしたが、異なる細胞密度で比較した場合、ＩＬ－２又はＩＬ－７／２１／ＴＷＳ１１９を含有する培養培地中での活性化され増殖した細胞の形質導入は類似していた。ＩＬ－２及びＩＬ－７／２１／ＴＷＳ１１９中で培養した細胞を比較し、ＩＬ－７／２１／ＴＷＳ１１９条件が形質導入効率の上昇を促進することがわかった。これらの結果は、細胞療法用途のための多くの機能的に改変されたＴ細胞をもたらす製造プロセスにおける、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２などの可溶性アクチベーターの使用に重要な意味を有する。

実施例６ＴＣＲ形質導入の最適なＭＯＩ
以前に凍結されたアフェレーシス細胞を解凍し、上記のように、ＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２（２５μｌ／ｍｌの細胞、ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２４時間活性化した。活性化後１日目に、ＴＲＣをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを、１×１０^６細胞に、ＭＯＩが１以上の高い感染多重度（ＭＯＩ）で添加する（Ａ）、又はＭＯＩを２以下に減少させる（Ｂ）。形質導入の７日後に、細胞をＴＣＲ発現についてアッセイした。１を超えるＭＯＩでは、観察可能なＭＯＩ効果は観察されなかった。報告された値は、４人の異なるドナー由来のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＣＲ発現の平均である。図３１Ａ及び３１Ｂは、ＭＯＩ１が大規模な閉鎖系バイオプロセスにおけるレンチウイルスによる形質導入に最適であったことを示す。

Claims

少なくとも１つの目的タンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞を製造する方法であって、
培養培地を含有するクローズドシングルユースバイオリアクターバッグに、アフェレーシスドナー細胞及び１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターを播種する工程（ここで、前記バイオリアクターバッグは、ロッキング式バイオリアクタープラットフォームの一部である）、
約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、前記クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中で前記細胞を培養する工程、
約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの可溶性ウイルスベクターで前記クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の前記細胞に形質導入する工程、並びに
約２ＲＰＭのロッキング速度で前記クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の前記細胞を増殖させるとともに、前記培養物を収穫まで維持するために必要に応じて前記培養物容量及びロッキング速度を増加させる工程
を含む方法。
前記アフェレーシスドナー細胞は、末梢血由来の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
前記アフェレーシスドナー細胞は、有核細胞及び無核細胞を含む、請求項２に記載の方法。
前記アフェレーシスドナー細胞は、白血球及び赤血球を含む、請求項１に記載の方法。
前記アフェレーシスドナー細胞はまた、顆粒球及び／又は血小板を含む、請求項４に記載の方法。
前記アフェレーシスは、白血球アフェレーシスである、請求項１に記載の方法。
前記アフェレーシスドナー細胞を洗浄し、培養培地に再懸濁する、請求項１に記載の方法。
前記少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターは、抗ＣＤ３抗体又はその結合フラグメントである、請求項１に記載の方法。
前記Ｔ細胞アクチベーターは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はその結合フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
前記Ｔ細胞アクチベーターは、少なくとも抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ＣＤ２抗体、又はその結合フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
前記Ｔ細胞アクチベーターは、少なくとも抗ヒトＣＤ３単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異性四量体抗体複合体、及び抗ヒトＣＤ２単一特異性四量体抗体複合体を含む、請求項１に記載の方法。
前記少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．００１μｇ／ｍｌ～少なくとも１０μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
前記少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターの濃度は、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ～少なくとも５μｇ／ｍｌである、請求項１２に記載の方法。
前記少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターは、播種時に少なくとも１つのドナー細胞に結合する、請求項１に記載の方法。
前記アフェレーシスドナー細胞は、前記バイオリアクターバッグに播種される前に、前記１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターと共にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
前記インキュベーションは、播種前に前記１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターの前記アフェレーシスドナー細胞への結合を十分に飽和させることができるだけの時間である、請求項１５に記載の方法。
前記アフェレーシスドナー細胞及び前記１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターは、トランスファーバッグ中でインキュベートされる、請求項１６に記載の方法。
前記トランスファーバッグ内の培養培地の容量は約５ｍｌ～約５０ｍｌである、請求項１７に記載の方法。
前記トランスファーバッグ内の培養培地の容量は約５ｍｌ～約１０ｍｌである、請求項１８に記載の方法。
前記アフェレーシスドナー細胞は、前記１つ以上のＴ細胞アクチベーターと共に少なくとも３０分間以上インキュベートされる、請求項１７に記載の方法。
前記アフェレーシスドナー細胞は、前記１つ以上のＴ細胞アクチベーターと共に少なくとも１時間インキュベートされる、請求項２０に記載の方法。
前記アフェレーシスドナー細胞内の有核細胞の数は、約１．０Ｅ９～約１．３Ｅ９である、請求項１に記載の方法。
前記アフェレーシスドナー細胞内の有核細胞の数は、約１．２Ｅ９である、請求項１に記載の方法。
前記バイオリアクターバッグに、約１Ｅ６～約５Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度で、前記アフェレーシスドナー細胞を播種される、請求項１に記載の方法。
前記バイオリアクターバッグに、約２Ｅ６の細胞密度で、前記アフェレーシスドナー細胞を播種される、請求項２４に記載の方法。
前記バイオリアクターバッグは、播種時に少なくとも３００ｍｌ～少なくとも４００ｍｌの培養培地を含有する、請求項１に記載の方法。
前記バイオリアクターバッグは、播種時に少なくとも３００ｍｌの培養培地を含有する、請求項２６に記載の方法。
前記アフェレーシスドナー細胞は、前記バイオリアクターバッグ内で約１２～２４時間培養される、請求項１に記載の方法。
前記培養培地は、少なくとも１つの可溶性サイトカインを含む、請求項１に記載の方法。
前記可溶性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１から選択される、請求項２９に記載の方法。
前記少なくとも１つの可溶性サイトカインは、ＩＬ－２である、請求項２９に記載の方法。
前記ＩＬ－２は、約２５０ＩＵ／ｍｌ～約３５０ＩＵ／ｍｌの濃度である、請求項２９に記載の方法。
前記ＩＬ－２は、約３００ＩＵ／ｍｌの濃度である、請求項３２に記載の方法。
前記可溶性サイトカインは、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１と組み合わせたＩＬ－７である、請求項２９に記載の方法。
前記少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも５ｎｇ／ｍｌ～少なくとも３０ｎｇ／ｍｌである、請求項２９に記載の方法。
前記少なくとも１つのサイトカインの濃度は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌ～少なくとも２０ｎｇ／ｍｌである、請求項３５に記載の方法。
前記培養培地はまた、ＷＮＴ経路アクチベーターを含む、請求項１に記載の方法。
前記ＷＮＴ経路アクチベーターは、ＴＷＳ１１７である、請求項３７に記載の方法。
前記培養培地は、可溶性ＴＷＳ１１７、ＩＬ－７及びＩＬ－２１の混合物を含む、請求項３７に記載の方法。
前記培養培地はまた、可溶性解糖阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
前記可溶性解糖阻害剤は、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）である、請求項４０に記載の方法。
前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
前記レンチウイルスベクターは、０．２５～１０のＭＯＩで添加される、請求項４３に記載の方法。
前記レンチウイルスベクターは、１のＭＯＩで添加される、請求項４４に記載の方法。
前記細胞は、約２０～２４時間、形質導入される、請求項４４に記載の方法。
形質導入後、前記培養培地の半分を前記バイオリアクターバッグから取り出し、等量の新鮮な培養培地と交換する、請求項１に記載の方法。
前記培養物を約１２～２４時間インキュベートする、請求項４７に記載の方法。
増殖中、新鮮な培養培地を、フェドバッチ／潅流供給によって、及び／又は潅流によって前記バイオリアクターに添加される、請求項１に記載の方法。
増殖中、前記培養物は、１日当たり１バイオリアクターバッグ容量の速度で潅流される、請求項１に記載の方法。
前記細胞の増殖に伴い、前記バイオリアクター中の前記培養培地の容量を、増殖中に１リットルまで徐々に増加させる、請求項１に記載の方法。
前記細胞の増殖に伴い、前記培養培地の容量を、少なくとも２Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度を維持するように徐々に増加させる、請求項１に記載の方法。
前記細胞の増殖に伴い、前記バイオリアクター中の前記培養培地の容量を、少なくとも４Ｅ６有核細胞／ｍｌの細胞密度を維持するように、増殖中に１リットルまで徐々に増加させる、請求項１に記載の方法。
前記細胞の増殖に伴い、前記ロッキング速度を６ＲＰＭまで徐々に増加させる、請求項１に記載の方法。
前記増殖の開始時、前記クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の前記培養培地の容量は３００ｍｌであり、２°の角度で２ｒｐｍの速度でロッキングする、請求項１に記載の方法。
前記クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の前記培養物は、約８０～１００％のＯ_２に維持される、請求項１に記載の方法。
前記細胞を７～１４日間増殖させる、請求項１に記載の方法。
前記培養、形質導入、及び／又は増殖工程は、３４～３７℃で実施される、請求項１に記載の方法。
前記目的タンパク質は、細胞表面受容体である、請求項１に記載の方法。
前記細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体である、請求項５９に記載の方法。
前記細胞表面受容体は、標的細胞に関連する抗原標的を認識する、請求項６０に記載の方法。
前記標的細胞は、癌細胞である、請求項６１に記載の方法。
前記遺伝子改変自己Ｔ細胞は、それを必要とする患者の症状を治療するために使用される、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の遺伝子改変自己Ｔ細胞を含む医薬組成物。
その治療を必要とする患者の症状を治療する方法であって、前記患者に請求項６４に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
目的のタンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞における導入遺伝子発現を増加させる方法であって、
培養培地を含有するクローズドシングルユースバイオリアクターバッグに、アフェレーシスドナー細胞及び１つ以上の可溶性Ｔ細胞アクチベーターを播種する工程（ここで、前記少なくとも１つの可溶性Ｔ細胞アクチベーターは、播種時に少なくとも１つのドナー細胞に結合しており、且つ前記バイオリアクターバッグは、ロッキング式バイオリアクタープラットフォームの一部である）、
約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、前記クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中で前記細胞を培養する工程、
約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの可溶性ウイルスベクターで前記クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の前記細胞に形質導入する工程、並びに
約２ＲＰＭのロッキング速度で前記クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の前記細胞を増殖させるとともに、前記培養物を収穫まで維持するために必要に応じて前記培養物容量及びロッキング速度を増加させる工程
を含み、
前記導入遺伝子の発現は、同じアフェレーシスドナー細胞からのＴ細胞の濃縮集団に由来し、同じ目的タンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞の導入遺伝子の発現より大きい方法。
目的のタンパク質を発現する遺伝子改変自己Ｔ細胞で患者を治療する方法であって、
前記患者由来のアフェレーシス細胞を、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はその結合フラグメントからなる群から選択される１つ以上のＴ細胞アクチベーターと共にインキュベートして、抗体結合を飽和させる工程、
培養培地を含有するクローズドシングルユースバイオリアクターバッグに、前記アフェレーシス細胞を播種する工程（ここで、前記バイオリアクターバッグは、ロッキング式バイオリアクタープラットフォームの一部である）、
約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、前記クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中で前記細胞を培養する工程、
約２ＲＰＭの速度で連続的にロッキングしながら、前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの可溶性ウイルスベクターで前記クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の前記細胞に形質導入する工程、
約２ＲＰＭのロッキング速度で前記クローズドシングルユースバイオリアクターバッグ中の前記細胞を増殖させるとともに、前記培養物を収穫まで所望の細胞密度に維持するために必要に応じて前記培養物容量及びロッキング速度を増加させる工程、
凍結保存のために、前記細胞を収穫し製剤化するする工程、
前記細胞を凍結し、前記患者に投与するために必要とされるまで保存する工程、並びに
前記細胞を解凍し、注入に好適な培地に再懸濁する工程、並びに
前記目的のタンパク質を発現する薬学的に有効な量の遺伝子改変自己Ｔ細胞を患者に再導入する工程
を含む方法。