TW202332765A

TW202332765A - 用於ｔ細胞療法之ｔ細胞群體的單核球耗盡

Info

Publication number: TW202332765A
Application number: TW111135339A
Authority: TW
Inventors: 賈斯汀古內許; 普佳梅塔; 曼塔卡爾拉
Original assignee: 美商英麥提克斯股份有限公司
Priority date: 2021-09-20
Filing date: 2022-09-19
Publication date: 2023-08-16
Also published as: WO2023044488A1; US20230089392A1

Abstract

一種用於產生工程化T細胞群體之方法，包括獲得含有單核球與T細胞的細胞群體，使所獲得細胞群體於表面上靜息，使單核球黏附於表面，保留未貼壁細胞群體，活化未貼壁細胞群體，向經活化之未貼壁細胞群體引入核酸，以獲得經轉化之T細胞，並且擴充經轉化之T細胞以獲得工程化T細胞群體。

Description

用於T細胞療法之T細胞群體的單核球耗盡

根據 EFS 網法律架構及 37 C.F.R. §1.821-825（參見 M.P.E.P. § 2442.03(a)），處於 ASCII 合規文本文件形式之序列表（名爲『3000011-025002_Sequence_Listing_ST26.xml』，2022 年 9 月 16 日創建及大小爲 159,874 位元組）跟本申請書同時提交，並且序列表之完整内容透過引用方式併入本文。

本公開總體上涉及生產用於過繼免疫療法之T細胞的方法，包括步驟：耗盡貼壁細胞，包括但不限於單核球。此公開進一步提供遺傳方式轉導藉助本文方法分離之T細胞的方法、使用T細胞之方法及其T細胞群體。

在過繼細胞療法中，分離自患者的淋巴細胞經離體基因改造以表現實現此等細胞隨後復轉移入患者後執行新治療功能之重組蛋白。例如，T 細胞可以分離自淋巴細胞且經基因改造以表現重組嵌合抗原受體（『CART細胞』）及/或T細胞受體（『TCR 療法』）。在 CART細胞療法中，細胞識別細胞表面上表現之抗原，而 TCR 療法細胞識別細胞内部呈遞於 MHC 複合體表面上之腫瘤特異性蛋白。TCR 細胞通常經工程化以識別腫瘤特異性抗原/MHC 組合。

在經修飾之T細胞復轉移入患者之前，離體擴充經修飾之T細胞以產生足夠數目細胞來實現治療效果。當淋巴細胞經分離且返還至同一患者時，一般稱其爲『自體細胞療法』。當淋巴細胞分離自相容性供體且輸注入一位新的不同患者時，此過程一般稱作『同種異體細胞療法』。

本領域需要快速、簡化及安全的方法來分離淋巴細胞、進行基因改造並且離體擴充基改淋巴細胞。此等方法可以擴展過繼細胞療法（如嵌合抗原受體技術 (CAR-T) 與T細胞受體技術 (TCR-T)）之部署，這可以為目前需要有效治療癌症之衆多患者帶來希望。

本公開涉及用於產生細胞毒性 Τ 淋巴細胞 (CTL) 之方法，所述方法包括 (a) 獲得周邊血單核細胞 (PMBC) 群體；(b) 耗盡貼壁細胞、任選地單核球；(c) 從周邊血單核細胞 (PBMC) 分離T細胞，(b) 用抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體活化經分離之T細胞，(c) 向經活化之T細胞引入核酸，(d) 擴充經轉化之T細胞，並且 (e) 收穫經轉化之 CD8 ⁺T細胞，其中步驟 (a) 至步驟 (e) 在 6 天以内執行。在另一個態樣中，此方法耗時不超過 6 天來完成。此方法可以耗時 1、2、3、4、5、6 或 7 天或更多來天完成。此方法亦可以包括低溫凍存已收穫之T細胞。在一個實施例中，T 細胞可以為 CD8 ⁺T細胞、CD4 ⁺及/或 γδT細胞。

在一個實施例中，一種用於從周邊血單核細胞 (PMBC) 群體耗盡單核球之方法可以包括使 PMBC 在容器中靜息足夠讓單核球之部分黏附於容器之時間並且取出未貼壁細胞。

在一個實施例中，一種用於從周邊血單核細胞 (PMBC) 群體耗盡貼壁細胞之方法可以包括使 PMBC 在容器中靜息足夠讓細胞之部分黏附於容器之時間並且取出未貼壁細胞。貼壁細胞可以包括單核球。

在一個實施例中，可以從 PMBC 群體耗盡貼壁細胞。可以透過一種方法耗盡貼壁細胞，所述方法包括使 PMBC 在容器中靜息足夠讓細胞之部分黏附於容器之時間並且取出未貼壁細胞。

在一個實施例中，足夠讓細胞之部分黏附於容器之時間可以介於約 1 與 10 小時之間。此時間可以為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 小時。此時間可以介於約 1-6 小時、約 2-4 小時、約 1-4 小時、約 3-6 小時、約 4-10 小時或約 2-3 小時之間。

在一個實施例中，細胞培養容器可以為塑膠或玻璃。塑膠可以為聚苯乙烯或聚碳酸酯。此容器可以用塗料處理。

在一個實施例中，PMBC 可以在容器中按約 0.1 與 2.0 百萬個細胞/cm ²之間的細胞密度接種。細胞密度可以為約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9 或 2.0 百萬個細胞/cm ²。細胞密度可以為約 0.3、0.5、0.8 或 1.2 百萬個細胞/cm ²。細胞密度可以為約 0.1 至 2.0 百萬個細胞/cm ²、約 0.3 至 1.0 百萬個細胞/cm ²、約 0.5 至 0.8 百萬個細胞/cm ²、約 0.5 至 1.0 百萬個細胞/cm ²、約 0.3 至 1.5 百萬個細胞/cm ²、約 0.8 至 2.0 百萬個細胞/cm ²或約 1.0 至 2.0 百萬個細胞/cm ²。

在一個實施例中，細胞培養容器可以為瓶、皿、袋、細胞棧 (cellstack) 或其集合體。細胞培養容器可以包含多個瓶、皿、袋、細胞棧或其集合體。

在一個實施例中，細胞棧可以包括至少1、至少 2、至少 3、至少 4、至少 5、至少 6、至少 7、至少 8、至少 9、至少 10、至少 15、至少 20、至少 25、至少 30、至少 35、至少 40、至少 45、或至少 50 個棧層。

在另一個實施例中，細胞棧可以具有至少 400、至少 500、至少 600、至少 700、至少 800、至少 900、至少 1,000、至少 2,000、至少 3,000、至少 4,000、至少 5,000、至少 6,000、至少 7,000、至少 8,000、至少 9,000、至少 10,000、至少 20,000、至少 30,000、至少 40,000 或至少 50,000cm² 總細胞生長面積。

在另一個實施例中，1-棧層可以具有約 636 cm² 細胞生長面積，2-棧層可以具有約 1,272 cm² 細胞生長面積，5-棧層可以具有約 3,180 cm² 細胞生長面積，10-棧層可以具有約 6,360 cm² 細胞生長面積，並且 40-棧層可以具有約 25,440 cm² 細胞生長面積。

在另一個實施例中，細胞棧可以獲自 Corning®、GBO®、VWR® 或 Nunc ^TM。

在一個實施例中，貼壁細胞可以包括單核球。透過此方法耗盡之貼壁細胞可以包括髓系衍生抑制細胞 (MDSCs)，例如，MDSC1 亞群、MDSC2 亞群與 MDSC7 亞群。

在一個實施例中，周邊血單核細胞 (PBMC) 可以獲自健康供體。周邊血單核細胞 (PBMC) 可以獲自患者。

在一個實施例中，經分離之T細胞的數目可以為約 1 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 2 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 3 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 4 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 5 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 6 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 7 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 8 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 9 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 1 x 10 ⁹至約 3 x 10 ⁹、約 1 x 10 ⁹至約 2.5 x 10 ⁹、約 1 x 10 ⁹至約 2 x 10 ⁹或約 1 x 10 ⁹至約 1.5 x 10 ⁹。經分離之T細胞的數目可以為約 1 x 10 ⁸個細胞、約 2 x 10 ⁸個細胞、約 3 x 10 ⁸個細胞、約 4 x 10 ⁸個細胞、約 5 x 10 ⁸個細胞、約 6 x 10 ⁸個細胞、約 7 x 10 ⁸個細胞、約 8 x 10 ⁸個細胞、約 9 x 10 ⁸個細胞、約 1 x 10 ⁹個細胞、約 2 x 10 ⁹個細胞、約 3 x 10 ⁹個細胞、約 4 x 10 ⁹個細胞、約 5 x 10 ⁹個細胞、約 6 x 10 ⁹個細胞、約 7 x 10 ⁹個細胞、約 8 x 10 ⁹個細胞、約 9 x 10 ⁹個細胞或約 1 x 10 ¹⁰個細胞。在一個實施例中，T 細胞可以為 CD8 ⁺T細胞、CD4 ⁺及/或 γδT細胞。

在一個實施例中，製備物中經分離之T細胞的純度可以為約 60% 至約 100%、約 65% 至約 100%、約 70% 至約 100%、約 75% 至約 100%、約 80% 至約 100%、約 85% 至約 100%、約 90% 至約 100%、約 95% 至約 100%、約 96% 至約 100%、約 97% 至約 100%、約 98% 至約 100%，或約 99% 至約 100%。製備物中經分離之T細胞的純度可以為約 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。在一個實施例中，T 細胞可以為 CD8 ⁺T細胞、CD4 ⁺及/或 γδT細胞。

在一個實施例中，抗 CD3 抗體可以處於約 0.1 µg/ml 至約 10.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 8.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 6.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 4.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 2.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 1.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.8 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.6 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.25 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.3 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.4 µg/ml 或約 0.4 µg/ml 至約 0.5 µg/ml 之濃度。抗 CD3 抗體可以處於約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 µg/ml 之濃度。

在一個實施例中，抗 CD28 抗體可以處於約 0.1 µg/ml 至約 10.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 8.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 6.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 4.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 2.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 1.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.8 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.6 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.25 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.3 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.4 µg/ml 或約 0.4 µg/ml 至約 0.5 µg/ml 之濃度。抗 CD28 抗體可以處於約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 µg/ml 之濃度。

在一個實施例中，抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體可以各自處於約 0.1 µg/ml 至約 10.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 8.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 6.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 4.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 2.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 1.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.8 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.6 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.25 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.3 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.4 µg/ml 或約 0.4 µg/ml 至約 0.5 µg/ml 之濃度。抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體均可以處於約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 µg/ml 之濃度。在一個實施例中，抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體組合之濃度可以處於約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 µg/ml 之濃度。

在一個實施例中，T 細胞活化可以在約 1 小時至約 120 小時、約 1 小時至約 108 小時、約 1 小時至約 96 小時、約 1 小時至約 84 小時、約 1 小時至約 72 小時、約 1 小時至約 60 小時、約 1 小時至約 48 小時、約 1 小時至約 36 小時、約 1 小時至約 24 小時、約 2 小時至約 24 小時、約 4 小時至約 24 小時、約 6 小時至約 24 小時、約 8 小時至約 24 小時、約 10 小時至約 24 小時、約 12 小時至約 24 小時、約 12 小時至約 72 小時、約 24 小時至約 72 小時、約 6 小時至約 48 小時、約 24 小時至約 48 小時、約 6 小時至約 72 小時或約 1 小時至約 12 小時之時間以内完成。T 細胞活化可以在約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119 或 120 小時内完成。T 細胞活化可以實施約 1‒10 小時、11‒30 小時、31‒50 小時、51‒100 小時或 101‒120 小時。在一個實施例中，T 細胞可以為 CD8 ⁺T細胞、CD4 ⁺及/或 γδT細胞。

在一個實施例中，抗 CD3 抗體、抗 CD28 抗體或二者均可以固定於固相支持物上。固相支持物可以處於珠、盒、柱、圓柱、盤、皿（例如，玻璃皿、培養皿）、纖維、薄膜、濾器、微量滴定盤（例如，96 孔微量滴定盤）、多葉棒、網、丸粒、板、環、杆、輥、薄板、載玻片、棒、托盤、管或小瓶形式。固相支持物可以為單個離散體（例如，單根管、單顆珠）、任何數目之多重基材體（例如，含 10 根管之架、若干顆珠）或其組合（例如，包含多個微量滴定盤之托盤、填珠之柱、填珠之微量滴定盤）。固相支持物可以為珠、管、罐、托盤、皿、板、瓶或袋之表面。固相支持物可以為陣列。固相支持物可以為袋。

在一個實施例中，向T細胞引入核酸可以包括轉染包含此核酸之裸 DNA。向T細胞引入核酸可以包括轉導包含此核酸之病毒載體。此病毒載體可以為逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或慢病毒載體。此核酸可以編碼重組蛋白。此重組蛋白可以為嵌合抗原受體 (CAR)、T 細胞受體 (TCR)、細胞介素、抗體或雙特異性結合性分子。此核酸可以編碼T細胞受體 (TCR)。

在一個實施例中，可以在細胞介素存在下擴充T細胞。此細胞介素可以為干擾素 α (IFN-α)、白血球介素-2 (IL-2)、白血球介素-4 (IL-4)、白血球介素-7 (IL-7)、白血球介素-9 (IL-9)、白血球介素-12 (IL-12)、白血球介素-15 (IL-15)、白血球介素-21 (IL-21) 或其組合。

在一個實施例中，細胞介素可以為干擾素 α (IFN-α)、白血球介素-2 (IL-2)、白血球介素-4 (IL-4)、白血球介素-7 (IL-7)、白血球介素-9 (IL-9)、白血球介素-12 (IL-12)、白血球介素-15 (IL-15)、白血球介素-21 (IL-21) 或其組合並且細胞介素可以按約 1 ng/mL 及 500 ng/mL 之量存在。此細胞介素可以按約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490 或 500 ng/mL 之量存在。此細胞介素可以按介於約 1 ng/mL 與 100 ng/mL、約 100 ng/mL 與 200 ng/mL、約 100 ng/mL 與 500 ng/mL、約 250 ng/mL 與 400 ng/mL、約 10 ng/mL 與 100 ng/mL 或約 150 ng/mL 與 350 ng/mL 之間的量存在。

在一個實施例中，細胞介素可以包括 IL-7 與 IL-15 之組合。

在一個實施例中，IL-7 濃度可以為約 1 ng/ml 至 100 ng/ml、約 1 ng/ml 至 90 ng/ml、約 1 ng/ml 至 80 ng/ml、約 1 ng/ml 至 70 ng/ml、約 1 ng/ml 至 60 ng/ml、約 1 ng/ml 至 50 ng/ml、約 1 ng/ml 至 40 ng/ml、約 1 ng/ml 至 30 ng/ml、約 1 ng/ml 至 20 ng/ml、約 1 ng/ml 至 15 ng/ml 或約 1 ng/ml 至 10 ng/ml。

在一個實施例中，IL-7 可以按約 1 ng/mL 與 500 ng/mL 之量存在。此細胞介素可以按約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490 或 500 ng/mL 之量存在。此細胞介素可以按介於約 1 ng/mL 與 100 ng/mL、約 100 ng/mL 與 200 ng/mL、約 100 ng/mL 與 500 ng/mL、約 250 ng/mL 與 400 ng/mL、約 10 ng/mL 與 100 ng/mL 或約 150 ng/mL 與 350 ng/mL 之間的量存在。

在一個實施例中，IL-15 濃度可以為約 5 ng/ml 至 500 ng/ml、約 5 ng/ml 至 400 ng/ml、約 5 ng/ml 至 300 ng/ml、約 5 ng/ml 至 200 ng/ml、約 5 ng/ml 至 150 ng/ml、約 5 ng/ml 至 100 ng/ml、約 10 ng/ml 至 100 ng/ml、約 20 ng/ml 至 100 ng/ml、約 30 ng/ml 至 100 ng/ml、約 40 ng/ml 至 100 ng/ml 或約 50 ng/ml 至 100 ng/ml。

在一個實施例中，IL-15 可以按約 1 ng/mL 與 500 ng/mL 之量存在。此細胞介素可以按約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490 或 500 ng/mL 之量存在。此細胞介素可以按介於約 1 ng/mL 與 100 ng/mL、約 100 ng/mL 與 200 ng/mL、約 100 ng/mL 與 500 ng/mL、約 250 ng/mL 與 400 ng/mL、約 10 ng/mL 與 100 ng/mL 或約 150 ng/mL 與 350 ng/mL 之間的量存在。

在一個實施例中，步驟 (a) 至步驟 (e) 可以在閉式系統中執行。

在一個實施例中，透過本文所述方法產生之已收穫T細胞的數目可以為約 1 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹³、約 1 x 10 ⁹至約 5 x 10 ¹²、約 1 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹²、約 1 x 10 ⁹至約 5 x 10 ¹¹、約 1 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹¹、約 1 x 10 ⁹至約 5 x 10 ¹⁰、約 1 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 2 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 3 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 4 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 5 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 6 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 7 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 8 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰或約 9 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰個細胞。

在一個實施例中，透過本文所述方法產生之已收穫T細胞的數目可以為約 1 x 10 ⁹個細胞、2 x 10 ⁹個細胞、3 x 10 ⁹個細胞、4 x 10 ⁹個細胞、5 x 10 ⁹個細胞、6 x 10 ⁹個細胞、7 x 10 ⁹個細胞、8 x 10 ⁹個細胞、9 x 10 ⁹個細胞、1 x 10 ¹⁰個細胞、1 x 10 ¹⁰個細胞、2 x 10 ¹⁰個細胞、3 x 10 ¹⁰個細胞、4 x 10 ¹⁰個細胞、5 x 10 ¹⁰個細胞、6 x 10 ¹⁰個細胞、7 x 10 ¹⁰個細胞、8 x 10 ¹⁰個細胞、9 x 10 ¹⁰個細胞、1 x 10 ¹¹個細胞、2 x 10 ¹¹個細胞、3 x 10 ¹¹個細胞、4 x 10 ¹¹個細胞、5 x 10 ¹¹個細胞、6 x 10 ¹¹個細胞、7 x 10 ¹¹個細胞、8 x 10 ¹¹個細胞、9 x 10 ¹¹個細胞、1 x 10 ¹²個細胞、2 x 10 ¹²個細胞、3 x 10 ¹²個細胞、4 x 10 ¹²個細胞、5 x 10 ¹²個細胞、6 x 10 ¹²個細胞、7 x 10 ¹²個細胞、8 x 10 ¹²個細胞、9 x 10 ¹²個細胞、1 x 10 ¹³個細胞、2 x 10 ¹³個細胞、3 x 10 ¹³個細胞、4 x 10 ¹³個細胞、5 x 10 ¹³個細胞、6 x 10 ¹³個細胞、7 x 10 ¹³個細胞、8 x 10 ¹³個細胞、9 x 10 ¹³個細胞或 1 x 10 ¹⁴個細胞。

在一個實施例中，可以透過本文所述之方法產生基改T細胞群體。

在一個實施例中，一種治療患有癌症之患者之方法可以包括向患者投予包含本文所述之基改T細胞群體之組成物，其中基改T細胞殺傷在表面呈遞跟 MHC 分子複合的肽之癌細胞，其中肽選自 SEQ ID NO: 1-160，並且癌選自肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食管癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、Merkel 細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性髓樣白血病 (AML)、膽囊癌與膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌症 (UBC)、急性淋巴球白血病 (ALL) 與子宮癌 (UEC) 所組成之組。此 MHC 分子可以為 MHC I 類。

在一個實施例中，此組成物可以進一步包含輔藥。

在一個實施例中，輔藥可以為抗 CD40 抗體、咪喹莫特、雷西喹莫特、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、阿特珠單抗 (atezolizuma)、干擾素-α、干擾素-β、CpG 寡核苷酸及衍生物、聚 (I:C) 及衍生物、RNA、西地那非、含聚(丙交酯-共-乙交酯) (PLG) 之顆粒製劑、病毒體、白血球介素-1 (IL-1)、白血球介素-2 (IL-2)、白血球介素-4 (IL-4)、白血球介素-7 (IL-7)、白血球介素-12 (IL-12)、白血球介素-13 (IL-13)、白血球介素-15 (IL-15)、白血球介素-21 (IL-21)、白血球介素-23 (IL-23) 或其組合。

在一個實施例中，一種在患有癌症之患者中激發免疫應答之方法可以包括向患者投予包含本文所述之基改T細胞群體之組成物，其中基改T細胞殺傷在表面呈遞跟 MHC 分子複合的肽之癌細胞，其中肽選自 SEQ ID NO: 1-160，其中癌選自肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食管癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、Merkel 細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性髓樣白血病 (AML)、膽囊癌與膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌症 (UBC)、急性淋巴球白血病 (ALL) 與子宮癌 (UEC) 所組成之組。

在一個實施例中，向經活化之未貼壁細胞群體引入核酸可以在有或無血清下進行。

在一個實施例中，向經活化之未貼壁細胞群體引入核酸可以在無血清下進行。

在一個實施例中，一種用於產生工程化T細胞群體之方法可以包括獲得含有單核球與T細胞的細胞群體，使所獲得細胞群體於表面上靜息，使單核球黏附於表面，保留未貼壁細胞群體，活化未貼壁細胞群體，向經活化之未貼壁細胞群體引入核酸，以獲得經轉化之T細胞，並且擴充經轉化之T細胞以獲得工程化T細胞群體。

在一個實施例中，細胞群體可以含有周邊血單核細胞 (PMBC)。

在一個實施例中，單核球可以包括 CD14 ⁺細胞。

在一個實施例中，T 細胞可以包括 αβT細胞及/或 γδT細胞。

在一個實施例中，T 細胞可以包括 CD8 ⁺T細胞及/或 CD4 ⁺T細胞。

在一個實施例中，靜息可以進行 2-8 小時。

在一個實施例中，靜息可以按 0.1 x 10 ⁶/cm ²– 2 x 10 ⁶/cm ²之接種密度進行。

在一個實施例中，此表面可以含有塑膠或玻璃。

在一個實施例中，塑膠可以含有聚苯乙烯或聚碳酸酯。

在一個實施例中，此表面可以含有多個細胞生長區。

在一個實施例中，多個細胞生長區可以按多重棧層形式配置。

在一個實施例中，多重棧層可以含有至少 2、至少 3、至少 4、至少 5、至少 6、至少 7、至少 8、至少 9、至少 10、至少 15、至少 20、至少 25、至少 30、至少 35、至少 40、至少 45、至少 50 個棧層、至少 60 個棧層、至少 70 個棧層、至少 80 個棧層、至少 90 個棧層或至少 100 個棧層。

在一個實施例中，多個細胞生長區可以包含至少 400 cm²、至少 500 cm²、至少 600 cm²、至少 700 cm²、至少 800 cm²、至少 900 cm²、至少 1,000 cm²、至少 2,000 cm²、至少 3,000 cm²、至少 4,000 cm²、至少 5,000 cm²、至少 6,000 cm²、至少 7,000 cm²、至少 8,000 cm²、至少 9,000 cm²、至少 10,000 cm²、至少 20,000 cm²、至少 30,000 cm²、至少 40,000 cm² 或至少 50,000 cm²。

在一個實施例中，活化可以在抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體存在下進行。

在一個實施例中，此核酸可以編碼重組蛋白。

在一個實施例中，重組蛋白可以為嵌合抗原受體 (CAR)、T 細胞受體 (TCR)、細胞介素、抗體或雙特異性結合性分子。

在一個實施例中，重組蛋白可以為 TCR。

在一個實施例中，TCR 可以結合跟 MHC 分子複合的肽。

在一個實施例中，肽可以為選自 SEQ ID NOS: 1-161 中之一者。

在一個實施例中，MHC 分子可以為 MHC I 類分子。

在一個實施例中，細胞群體可以含有至少 25% 單核球。

在一個實施例中，未貼壁細胞群體可以為單核球經剝奪之細胞群體。

在一個實施例中，細胞群體可以進一步含有髓系衍生抑制細胞 (MDSC)。

在一個實施例中，MDSC 可以為 CD124 ⁺/CD14 ⁺/CD3 ^–/CD19 ^–/CD56 ^–細胞、CD124 ⁺/CD15 ⁺/CD3 ^–/CD19 ^–/CD56 ^–細胞及/或 CD14 ^–/CD15 ^–/CD33hiCD3 ^–/CD19 ^–/CD56 ^–細胞。

在一個實施例中，MDSC 可以黏附於此表面。

在一個實施例中，組成物可以含有透過本公開方法產生的工程化T細胞群體。

在一個實施例中，此核酸可以進一步編碼 CD8αβ 異二聚體或 CD8α 同型二聚體。

在一個實施例中，CD8α 可以具有選自 SEQ ID NO: 163-166 之胺基酸序列並且 CD8β 可以具有選自 SEQ ID NO: 167-173 之胺基酸序列。

在一個實施例中，此核酸可以進一步編碼土撥鼠肝炎病毒轉錄後反應元件 (WPRE)，所述反應元件包含選自 SEQ ID NO: 174-176 之核苷酸序列。

過繼 T 細胞療法

多種臨床環境下，使用基改T細胞之過繼T細胞療法是一種有吸引力的策略。Ho 等人 Cancer Cell(2003) 3: 431 437.用於產生表現重組蛋白如嵌合抗原受體 (CAR)、T 細胞受體 (TCR)、細胞介素、抗體與雙特異性結合性分子的基改T細胞產品之短時（例如，6 天）生產製程產生如相比較長時（例如，8‒10 天）製程，分化記憶表型較少之製品。雖然短時生產製程可能有益於過繼T細胞療法，但經功能轉導之T細胞的總細胞數可以受短時生產製程損害，尤其在癌症患者中優選輸注較大T細胞劑量時。爲了滿足較大劑量要求，多種策略可以用來增加功能轉導之細胞的總產率。此等策略可以包括放大整個製程、增強轉導效率或與整體 PBMC 相反，從針對 CD8 依賴性 TCR 選定的 CD8 ⁺T細胞開始。儘管可能可實現生產製程進一步放大，然而，這可能更昂貴、更冗長且可能影響生產能力。

從中可以衍生出（例如用於過繼免疫療法的）CD8 ⁺T細胞之淋巴細胞彙集物可以含有初始T細胞及經歷過抗原的長壽命記憶T細胞 (T _M)。T _M可以進一步分成在表型、歸巢屬性及功能方面不同之中央記憶 (T _CM) 細胞亞群與效應記憶 (T _EM) 細胞亞群。CD8 ⁺T _CM表現促進向淋巴結中遷移之 CD62L 與 CCR7，並且若再暴露於抗原則它們快速增殖。CD8 ⁺T _EM缺少實現移行至周邊組織之 CD62L 並且顯示出即刻效應子功能。響應于抗原刺激，CD8 ⁺T _CM與 T _EM均分化成表現高水準粒酶與穿孔素、但短壽的溶細胞性效應T細胞 (T _E)。因此，臨床免疫療法試驗中T細胞生存不良可能單純起因於它們在活體外培養期間分化成注定死亡的 T _E。

爲解決此問題，發明人使用經選定 CD8 ⁺T細胞作為起始材料以產生表現重組蛋白（例如，CAR、TCR、細胞介素、抗體與雙特異性結合性分子）的基改T細胞產品，相比使用 PBMC 作為起始材料所生產之大規模產品或 GMP 規模產品，這產生數目更大之基改T細胞產品，例如，經 CAR 轉化或經 TCR 轉化之T細胞產品，同時維持透過任一製程所生產之基改T細胞產品之可比功能性。這導致所需T細胞的產率令人驚訝地升高，同時無昂貴放大、複製成本或冗長加工時間（例如，超過 7 天）。發明人還發現，也可以使用不呈 CD8 ⁺之T細胞，而產率優異。另外，發明人還納入一個步驟，其中從細胞群體中耗盡貼壁細胞，例如，單核球。在一個實施例中，發明人還使用 (1) 閉式系統，(2) 經選定 CD8 ⁺T細胞作為起始材料，及 (3) 如上，用抗 CD3/抗 CD28 抗體活化，隨後用表現重組蛋白之病毒載體（例如，慢病毒載體）轉導，以產生表現重組蛋白的基改T細胞產品。

發明人發現，數次生產嘗試產生了產率不及預期的療法可用T細胞。作爲充分研究生產嘗試失敗之結果，發明人發現抑制性細胞（例如單核球）顯示最強烈地跟較低細胞產率相關。現有技術未提供任何關於如何確定細胞較少的基礎性原因之清晰指導。例如，美國專利申請公開第 2021/0046159 號提出單核球耗盡負面影響T細胞擴充。定義

本文使用之『活化』泛指T細胞已被充分刺激以誘導可偵測細胞增殖之狀態。活化亦可以跟經誘導之細胞介素產生及可偵測之效應子功能相關。術語『經活化之T細胞』尤其系指正在增殖之T細胞。

如本文所用之『抗體』與『免疫球蛋白』泛指任何同種型之抗體或免疫球蛋白、抗體片段，其保留與抗原之特異性結合，包括但不限於 Fab、Fab'、Fab'-SH、(Fab’) ₂Fv、scFv、二價 scFv 與 Fd 片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體以及包括抗體之抗原特異性導引區與非抗體蛋白質的融合蛋白。

如本文所用之『雙特異性結合性分子』與『雙特異性抗原結合分子』泛指能夠同時結合於兩種不同抗原之抗原結合蛋白，例如，雙特異性抗體。例如，不同於常規抗體，本公開之雙特異性抗原結合分子可以包含至少 6 個來自 TCR 之 CDR。在一個實施例中，不同於常規抗體，本公開之抗原結合蛋白可以包含來自 TCR 的至少一個 α 變異域與至少一個 β 變異域。

如本文使用之『嵌合抗原受體』或『CAR』或『CARs』泛指基改受體，所述基改受體將抗原特異性移植至細胞（例如T細胞、NK 細胞、巨噬細胞與幹細胞）上。CAR 可包含至少一個抗原特異性導引區 (ASTR)、鉸鏈或莖域、跨膜域 (TM)、一個或多個共刺激域 (CSD) 與胞內激活域 (IAD)。在某些實施例中，CSD 為可選。在另一個實施例中，CAR 為雙特異性 CAR，其對兩種不同抗原或表位具有特異性。在 ASTR 特異性結合於標靶抗原後，IAD 激活胞內信號傳導。例如，IAD 可以利用抗體之抗原結合特性，以非 MHC 限制方式將T細胞之特異性與反應性重定向至選定標靶。非 MHC 限制性抗原識別賦予表現 CAR 之T細胞以下能力：獨立於抗原加工而識別抗原，從而繞過主要的腫瘤逃逸機制。此外，在T細胞中表現時，CAR 有利地不跟內源性T細胞受體 (TCR) α 鏈與 β 鏈二聚化。

如本文所用之『細胞毒性 T 淋巴細胞』 (CTL) 泛指殺傷癌細胞、遭感染（尤其病毒感染）之細胞或以其他方式受損之細胞的 T 淋巴細胞。CTL 可以在其表面表現 CD8（例如，CD8 ⁺T細胞）。此類細胞可以優選為遭遇過抗原之『記憶』T 細胞（T _M細胞）。

如本文所用之『供體』廣義指捐獻血液的人類受試者。

如本文所用之『有效量』、『治療有效量』或『有療效量』泛指一種藥劑之量或兩種藥劑之組合量，其中投予哺乳動物或其他受試者以治療某疾病時，所述量足以影響此疾病之此種治療。『治療有效量』將根據藥劑、疾病及其嚴重程度以及待治療受試者之年齡、體重等而變化。

如本文使用之『基改』泛指向細胞引入外源核酸之方法，無論外源核酸是否整合入細胞之基因組中。

如本文使用之『基改細胞』泛指含有外源核酸之細胞，無論外源核酸是否整合入細胞之基因組中。

如本文所用之『免疫細胞』泛指從骨髓中產生之造血幹細胞 (HSC) 衍生之白血細胞（白血球 (leukocyte)）。『免疫細胞』包括但不限於淋巴細胞（T 細胞、B 細胞、自然殺手 (NK) (CD3 ^-CD56 ⁺) 細胞）與髓系衍生細胞（嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、樹狀細胞）。『T 細胞』包括所有類型表現 CD3 之免疫細胞，包括 T 輔助細胞（CD4 ⁺細胞）、細胞毒性T細胞（CD8 ⁺細胞）、T 調節細胞 (Treg) 與 γ-δT細胞以及 NKT細胞（CD3 ⁺與 CD56 ⁺）。技術人員將理解，如本公開通篇所使用之T細胞及/或 NK 細胞可以包括僅T細胞、僅 NK 細胞或T細胞與 NK 細胞兩者。在本文提供之某些說明性實施例與態樣中，T 細胞經活化及經轉導。此外，在本文提供之某些說明性組成物實施例與態樣中提供了T細胞。『細胞毒性細胞』包括 CD8 ⁺T細胞、自然殺手 (NK) 細胞、NK-T 細胞、γδT細胞與嗜中性球，所述細胞是能夠介導細胞毒性應答之細胞。

本文提及之髓系衍生抑制細胞 (MDSCS) 可以包括不均一髓樣細胞群體，所述群體通常對天然免疫細胞或適應性免疫細胞產生阻抑性或負面作用（至少在透過免疫系統控制癌症之語境下或在癌症免疫療法中，此等細胞視爲有損於正面結果）。在我們的實驗中，我們特異性檢查了 MDSC1 亞群、MDSC2 亞群與 MDSC7 亞群。

本文可互換使用之『個體』、『受試者』、『宿主』與『患者』泛指哺乳動物，包括但不限於人類、鼠類（例如，大鼠、小鼠）、兔形目動物（例如，兔）、非人靈長類、犬類、貓類與有蹄動物類（例如，馬、牛、綿羊、豬、山羊）。

如本文使用之『周邊血單核細胞』或『PBMC』泛指具有圓形胞核之任何周邊血細胞。PBMC 包括淋巴細胞，例如T細胞、B 細胞與 NK 細胞以及單核球。

如本文可互換使用之『多核苷酸』與『核酸』泛指任何長度之聚合形式之核苷酸，不論是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。因此，此術語包括但不限於單股、雙股或多股 DNA 或 RNA、基因組 DNA、cDNA、DNA-RNA 雜交體，或包含嘌呤鹼基與嘧啶鹼基或其他天然、經化學修飾或經生物化學修飾、非天然或衍生性核苷酸鹼基之聚合體。

『T 細胞』或『T 淋巴細胞』是本領域認可之術語並且包括胸腺細胞、初始 T 淋巴細胞、不成熟 T 淋巴細胞、成熟 T 淋巴細胞、靜息 T 淋巴細胞或活化型 T 淋巴細胞。適用於具體實施例之示例性T細胞群體包括但不限於輔助T細胞（HTL；CD4 ⁺T細胞）、細胞毒性T細胞（CTL；CD8 ⁺T細胞）、CD4 ⁺CD8 ⁺T細胞、CD4 ^-CD8 ⁻T細胞或任何其他T細胞亞群。適用於具體實施例之其他示例性T細胞群體包括但不限於表現以下一種或多種標誌物之T細胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197 與 HLA-DR，並且如果需要，可透過正向或負向選擇技術進一步分離。

如本文所用之『T 細胞受體 (TCR)』泛指T細胞上爲 α (α) 鏈與 β (β) 鏈之異二聚體組成的蛋白質受體，不過在一些細胞中 TCR 爲 γ 鏈與 δ 鏈 (γ/δ)組成。可能在包含 TCR 之任何細胞上修飾 TCR，所述細胞包括輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調節性T細胞、自然殺手T細胞或 γδT細胞。

TCR 一般存在於 T 淋巴細胞（或T細胞）表面上，其通常負責識別跟主要組織相容性複合體 (MHC) 分子結合之抗原。在 95% 之T細胞中，它是爲 α 鏈與 β 鏈所組成之異二聚體，而 5% 之T細胞具有爲 γ 鏈與 δ 鏈所組成之 TCR。TCR 跟抗原與 MHC 接合導致其所屬 T 淋巴細胞歷經一系列受相關酶、輔助受體與專化輔助分子介導之生化事件活化。在免疫學中，CD3 抗原（CD 代表分化簇）是哺乳動物中爲四條不同鏈（CD3-γ、CD3δ 與兩倍 CD3ε）所組成之蛋白質複合體，所述鏈跟稱為T細胞受體 (TCR) 及 ζ 鏈的分子締合以在 T 淋巴細胞中生成活化信號。TCR、ζ 鏈與 CD3 分子一起構成 TCR 複合體。CD3-γ、CD3δ 與 CD3ε 鏈是含有單一胞外免疫球蛋白域之免疫球蛋白超家族之高度相關性細胞表面蛋白。CD3 鏈之跨膜區帶負電荷，一個使此等鏈跟帶正電荷之 TCR 鏈（TCRα 與 TCRβ）締合的特徵。CD3 分子之胞內尾部含有一種稱為基於免疫受體酪氨酸之活化基序（簡稱 ITAM）之單一保守基序，所述基序對於 TCR 之信號傳導能力至關重要。

如本文使用之『治療』、『處置』等泛指獲得所需之藥理作用及/或生理作用。此作用可以就完全或部分預防疾病或其症狀而言爲預防性，及/或可以就部分或完全治癒疾病及/或歸因於此疾病之不良作用而言爲治療性。如本文使用之『治療』涵蓋對哺乳動物（例如，人類）中疾病之任何治療，並且包括：(a) 防止此疾病在可能易患此疾病但尚未確診有此疾病之受試者中發生；(b) 抑制此疾病，例如，制止其形成；(c) 緩解此疾病，例如，引起疾病消退。 周邊血單核細胞 (PMBC)

周邊血單核細胞 (PMBC) 可以獲自患者，任選地獲自健康患者。PMBC 可以冷凍供稍後使用。在獲得、任選地解凍 PMBC 群體後，可以從 PMBC 群體耗盡貼壁細胞。可以透過一種方法耗盡貼壁細胞，所述方法包括使 PMBC 在容器中靜息足夠讓細胞之部分黏附於容器之時間並且取出未貼壁細胞。貼壁細胞可以包括單核球，後者顯示跟細胞總產率强烈負相關。

足夠讓細胞之部分黏附於容器之時間可以介於約 1 與 10 小時之間。此時間可以為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 小時。此時間可以介於約 1-6 小時、約 2-4 小時、約 1-4 小時、約 3-6 小時、約 4-10 小時或約 2-3 小時之間。

細胞培養容器可以為塑膠或玻璃。塑膠可以為聚苯乙烯或聚碳酸酯。細胞培養容器可以用塗料處理。

PMBC 可以在容器中按約 0.1 與 2.0 百萬個細胞/cm ²之間的細胞密度接種。細胞密度可以為約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9 或 2.0 百萬個細胞/cm ²。細胞密度可以為約 0.3、0.5、0.8 或 1.2 百萬個細胞/cm ²。細胞密度可以介於約 0.1 至 2.0 百萬個細胞/cm ²、約 0.3 至 1.0 百萬個細胞/cm ²、約 0.5 至 0.8 百萬個細胞/cm ²、約 0.5 至 1.0 百萬個細胞/cm ²、約 0.3 至 1.5 百萬個細胞/cm ²、約 0.8 至 2.0 百萬個細胞/cm ²或約 1.0 至 2.0 百萬個細胞/cm ²之間。細胞培養容器可以為瓶、皿、袋、細胞棧或其集合體。細胞培養容器可以包含多個瓶、皿、袋、細胞棧或其集合體。

可以將 PMBC 細胞解凍（若冷凍）、靜息並且隨後如本文所述那樣活化。靜息時的條件可以包括按約 5x10 ⁶個細胞/mL 接種細胞並且靜息 4 小時、按約 5x10 ⁶個細胞/mL 接種細胞並且靜息 2 小時、按約 0.8x10 ⁶個細胞/cm ²接種細胞並且靜息 2 小時、按約 0.5x10 ⁶個細胞/cm ²接種細胞並且靜息 2 小時、按約 0.8x10 ⁶個細胞/cm ²接種細胞並且靜息 4 小時，或按約 0.5x10 ⁶個細胞/cm ²接種細胞並且靜息 4 小時。在靜息後，貼壁細胞黏附於塑膠容器。可以例如透過溫和轉動容器 4-5 次並且抽吸出含有未貼壁細胞之培養基，收穫未貼壁細胞。 單核球耗盡

如果需要或必要，可以將單核球群體（例如，CD14 ⁺細胞）在離體擴充之前透過多種方法，包括塑膠、玻璃、抗 CD14 包覆珠或柱或利用此等細胞之吞噬活性促進移除，從血液製備物中耗盡。在某些實施例中，可以從成人血液（例如，PBMC）中純化塑膠貼附性 CD14 ⁺CD1a ^-單核球。隨後可以使用如 Zhou 等人所述之塑膠貼壁法（J. Immunology 154:3821-3835, 1995；所述文獻之內容因而透過引用方式整體併入）進一步純化或移除單核球。在一個實施例中，某個尺寸之順磁粒子可能足以被吞噬性單核球吞沒。在某些實施例中，順磁粒子爲市售珠，例如，那些爲 Dynal AS 依商標 Dynabeads™ 所生產者。就此而言之示例性 Dynabeads™ 是 M-280、M-450 與 M-500。在一個態樣中，其他非特異性細胞可以透過用『無關』蛋白質（例如，血清蛋白或抗體）包被順磁粒子來移除。無關蛋白質與抗體包括非特異性靶向待擴充之T細胞的那些蛋白質及抗體或其片段。在某些實施例中，無關珠可以包括經羊抗小鼠抗體、山羊抗小鼠抗體與人血清白蛋白包覆的珠。簡言之，可以透過以下方式如此耗盡單核球：將分離自全血或單采周邊血之 PBMC 跟一個或多個種類之無關或非抗體偶聯之順磁粒子按可以允許移除單核球的任何量（大約 20:1 珠:細胞比率）在 22 至 37°C 預孵育約 30 分鐘至 2 小時，隨後磁力移除已經接合於或吞沒順磁粒子之細胞。此種分離可以使用本領域可獲得之標準方法進行。例如，可以使用任何磁性分離方法學，包括多種市售者（例如，DYNAL® 磁性粒子濃縮器 (DYNAL MPC®)）。可以在所述耗盡之前與之後，透過本領域普通技術人員已知之多種方法學（包括 CD14 陽性細胞流式細胞分析）監測必備耗盡保證。

在一個實施例中，如相比無單核球耗盡，單核球耗盡可以升高T細胞產品中 CD8 ⁺T細胞（例如，CD8 ⁺CD3 ⁺T細胞）之頻率達約 5% 至約 60%、約 5% 至約 50%、約 5% 至約 45%、約 5% 至約 40%、約 5% 至約 35%、約 5% 至約 30%、約 5% 至約 25%、約 5% 至約 20%、約 5% 至約 15%、約 5% 至約 10%、約 10% 至約 50%、約 10% 至約 40%、約 10% 至約 30%、約 10% 至約 20%、約 10% 至約 15%、約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55% 或約 60%。

在一個實施例中，如相比無單核球耗盡，單核球耗盡可以升高 CD8（例如，肽/MHC Dextramer (Dex) ⁺CD8 ⁺T細胞）中外源 TCR 轉導效率達約 5% 至約 60%、約 5% 至約 50%、約 5% 至約 45%、約 5% 至約 40%、約 5% 至約 35%、約 5% 至約 30%、約 5% 至約 25%、約 5% 至約 20%、約 5% 至約 15%、約 5% 至約 10%、約 10% 至約 50%、約 10% 至約 40%、約 10% 至約 30%、約 10% 至約 20%、約 10% 至約 15%、約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55% 或約 60%。分離 T 細胞

T 細胞可以透過正向選擇或負向選擇或二者分離自周邊血單核細胞 (PBMC) 製備物。

在耗盡非 CD8 ⁺細胞例如 CD4 ⁺T細胞、單核球、嗜中性球、嗜酸性球、B 細胞、幹細胞、樹狀細胞、NK 細胞、顆粒球、γ/δT細胞或紅血球樣細胞後，收集及任選地儲存T細胞，直至用於本文所述之方法中產生基改T細胞。分離 CD8 ⁺T 細胞

既然 CD8 ⁺T細胞如相比其他細胞（如樹狀細胞、CD4 ⁺T細胞與 NK 細胞）具有相對簡單之功能，則 CD8 ⁺T細胞不太可能在抗癌免疫療法期間造成意外副作用。通常，可以透過使用 MHC I 類/肽多聚體分離抗原特異性 CD8 ⁺T細胞，然而這可能刺激T細胞受體 (TCR)。就此點而論，此種方法可能具有一些缺點，包括在分離細胞後爲細胞凋亡所致的高細胞死亡率及爲產生足夠數量抗原特異性 CD8 ⁺T細胞所需要的長時段培養時間。

CD8 ⁺T細胞可以透過正向選擇或負向選擇或二者分離自周邊血單核細胞 (PBMC) 製備物。正向選擇可以產生經高度純化之 CD8 ⁺細胞群體。負向選擇，例如其耗盡 CD4 ⁺細胞，同時產生足夠數目 CD8 ⁺細胞，可以具有在選擇程序後續存的低水準摻雜性非 CD8 ⁺群體。可以使用例如抗 CD8 抗體自 PBMC 製備物分離 CD8 ⁺T細胞，所述抗體可以對 CD8 ⁺細胞具有高親和力，可以在選擇過程期間不活化細胞並且可以有能力從諸細胞中輕易洗脫。抗 CD8 抗體爲本領域已知且市售。

在本公開之另一個實施例中，CD8 ⁺細胞可以為 CD8 ⁺CD62L ⁺T細胞，後者可以使用一個兩步驟程序分離。在耗盡非 CD8 ⁺細胞，例如 CD4 ⁺T細胞、單核球、嗜中性球、嗜酸性球、B 細胞、幹細胞、樹狀細胞、NK 細胞、顆粒球、γ/δT細胞或紅血球樣細胞（前述細胞可以透過使用生物素綴合抗體之混合物來標記，所述混合物可以含有例如針對 CD4、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ 及/或 CD235a（血型糖蛋白 A）之抗體）後，可以使用 CD62L 微珠正向分離 CD8 ⁺CD62L ⁺T細胞。磁性標記之 CD8 ⁺CD62L ⁺T細胞可以滯留於柱（例如，MACS 柱 (Miltenyi Biotec)）內，並且從磁場取出柱後洗脫。收集及任選地儲存 CD8 ⁺T細胞，直至用於本文所述之方法中產生基改 CD8 ⁺T細胞。

在其他實施例中，產生 CD8 ⁺細胞毒性 Τ 淋巴細胞 (CTL) 之方法可以包括 (a) 從周邊血單核細胞 (PBMC) 分離 CD8 ⁺T細胞，(b) 用抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體活化經分離之 CD8 ⁺T細胞，(c) 向經活化之 CD8 ⁺T細胞引入核酸，(d) 擴充經轉化之 CD8 ⁺T細胞，並且 (e) 收穫經轉化之 CD8 ⁺T細胞，其中步驟 (a) 至步驟 (e) 在 6 天以内執行。在另一個態樣中，此方法耗時不超過 6 天來完成。在一個態樣中，此方法可以耗時 1、2、3、4、5、6、7、10 或 14 天來完成。此方法亦可以包括低溫凍存已收穫之T細胞。在另一個態樣中，完成步驟 (b)、(c)、(d) 與 (e) 之總時間可以為約 6 天至約 10 天。在另一個態樣中，活化 (b) 可以在約 15 小時至約 24 小時之時間以內實施，可以約 20 小時至約 28 小時實施轉導 (c)，並且可以約 5 天至約 6 天實施擴充 (d)。

在一個實施例中，周邊血單核細胞 (PBMC) 可以獲自健康供體。周邊血單核細胞 (PBMC) 可以獲自患者。周邊血單核細胞 (PBMC) 可以為自體或同種異體性。

在一個實施例中，經分離之 CD8 ⁺T細胞的數目可以為約 1 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 2 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 3 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 4 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 5 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 6 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 7 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 8 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 9 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 1 x 10 ⁹至約 3 x 10 ⁹、約 1 x 10 ⁹至約 2.5 x 10 ⁹、約 1 x 10 ⁹至約 2 x 10 ⁹或約 1 x 10 ⁹至約 1.5 x 10 ⁹。經分離之 CD8+T細胞的數目可以為約 1 x 10 ⁸個細胞、約 2 x 10 ⁸個細胞、約 3 x 10 ⁸個細胞、約 4 x 10 ⁸個細胞、約 5 x 10 ⁸個細胞、約 6 x 10 ⁸個細胞、約 7 x 10 ⁸個細胞、約 8 x 10 ⁸個細胞、約 9 x 10 ⁸個細胞、約 1 x 10 ⁹個細胞、約 2 x 10 ⁹個細胞、約 3 x 10 ⁹個細胞、約 4 x 10 ⁹個細胞、約 5 x 10 ⁹個細胞、約 6 x 10 ⁹個細胞、約 7 x 10 ⁹個細胞、約 8 x 10 ⁹個細胞、約 9 x 10 ⁹個細胞或約 1 x 10 ¹⁰個細胞。

在一個實施例中，製備物中經分離之 CD8 ⁺T細胞的純度可以為約 60% 至約 100%、約 65% 至約 100%、約 70% 至約 100%、約 75% 至約 100%、約 80% 至約 100%、約 85% 至約 100%、約 90% 至約 100%、約 95% 至約 100%、約 96% 至約 100%、約 97% 至約 100%、約 98% 至約 100%，或約 99% 至約 100%。製備物中經分離之 CD8 ⁺T細胞的純度可以為約 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。

在一個實施例中，CD8 ⁺T細胞為 CD4 ⁺。 T 細胞活化

T 細胞可以活化，其中已經充分刺激T細胞以誘導可偵測性細胞增殖。活化亦可以跟經誘導之細胞介素產生及可偵測之效應子功能相關。僅藉助 TCR 生成之訊號不足以充分活化T細胞並且還需要一種或多種次級或共刺激信號。因此，T 細胞活化包括藉助 TCR/CD3 複合體之初級刺激訊號及一種或多種次級共刺激信號。共刺激可以為T細胞引致增殖及/或細胞介素產生所佐證，所述T細胞已經收到初級活化訊號，如藉助 CD3/TCR 複合體或藉助 CD2 刺激。

可以透過活化T細胞及用結合輔助分子之配體刺激T細胞表面上輔助分子，誘導T細胞群體增殖。可以透過使T細胞跟刺激T細胞中 TCR/CD3 複合體相關訊號的第一試劑接觸，實現T細胞群體活化。可以透過連接T細胞受體 (TCR)/CD3 複合體或 CD2 表面蛋白或透過直接刺激受體-偶聯傳信途徑，實現刺激T細胞中的 TCR/CD3 複合體相關訊號。因此，抗 CD3 抗體、抗 CD2 抗體或蛋白激酶 C 激活物聯合鈣離子載體可以用來活化T細胞群體。抗 CD3 抗體與抗 CD2 抗體均本領域已知且市售。

爲誘導增殖，可以使經活化之T細胞群體與刺激T細胞表面上輔助分子之第二試劑接觸。例如，可以用針對T細胞表面上 CD28 分子之抗 CD28 抗體刺激 CD4 ⁺T細胞群體以增殖。抗 CD28 抗體爲本領域已知且市售。

可選地，可以用針對 CD28 之天然配體（如 B7-1 與 B7-2）刺激 CD4 ⁺T細胞。天然配體可以為可溶性、於細胞膜上或偶聯於固相表面。可以透過使用跟 CD9（一種存在於活化T細胞上具有約 27 kD 分子量之輔助分子）結合之單株抗體 ES5.2D8 實現 CD8+T細胞群體增殖。可選地，可以透過刺激一種或多種因連接輔助分子（如 CD28）而產生的胞內訊號，誘導活化的T細胞群體增殖。

提供初級活化訊號之試劑及提供共刺激訊號之試劑可以按可溶性形式添加或偶聯於固相表面。在一個優選實施例中，兩種試劑可以偶聯於同一固相表面。

在激活並且刺激T細胞表面上輔助分子後，可以監測T細胞響應連續暴露於配體或其他試劑而增殖之進程，這在胞內起到模擬輔助分子介導之途徑的作用。當T細胞增殖率下降時，可以將T細胞再活化及再刺激，如用額外之抗 CD3 抗體及共刺激配體，以誘導進一步增殖。可以透過檢查細胞尺寸監測T細胞增殖率。可選地，可以透過分析響應暴露於配體或其他試劑（如 B7-1 或 B7-2）的細胞表面分子之表現，監測T細胞增殖。可以為持久之增殖反復監測及再刺激T細胞，以產生數目相對於原初T細胞群體增長約 100 倍至約 100,000 倍的T細胞群體。

抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體各自可以具有不多於約0.1 µg/ml、不多於約 0.2 µg/ml、不多於約 0.3 µg/ml、不多於約 0.4 µg/ml、不多於約 0.5 µg/ml、不多於約 0.6 µg/ml、不多於約 0.7 µg/ml、不多於約 0.8 µg/ml、不多於約 0.9 µg/ml、不多於約 1.0 µg/ml、不多於約 2.0 µg/ml、不多於約 4.0 µg/ml、不多於約 6.0 µg/ml、不多於約 8.0 µg/ml 或不多於約 10.0 µg/ml 之濃度。

抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體各自可以具有約 0.1 µg/ml 至約 1.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.8 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.6 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.25 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.3 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.4 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 10.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 8.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 6.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 4.0 µg/ml 或約 0.1 µg/ml 至約 2.0 µg/ml 之濃度。

抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體可以固定在固相支持物上。固相支持物可以處於珠、盒、柱、圓柱、盤、皿（例如，玻璃皿、培養皿）、纖維、薄膜、濾器、微量滴定盤（例如，96 孔微量滴定盤）、多葉棒、網、丸粒、板、環、杆、輥、薄板、載玻片、棒、托盤、管或小瓶形式。固相支持物可以為單個離散體（例如，單根管、單顆珠）、任何數目之多重基材體（例如，含 10 根管之架、若干顆珠）或其組合（例如，包含多個微量滴定盤之托盤、填珠之柱、填珠之微量滴定盤）。Conti 等人 (2003) Current Protocols in Cytometry John Wiley & Sons, Inc。固相支持物可以為珠、管、罐、托盤、皿、板、瓶或袋之表面。固相支持物可以為陣列。

T 細胞活化可以實施約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119 或 120 小時内完成。T 細胞活化可以實施約 1‒10 小時、11‒30 小時、15‒25 小時、31‒50 小時、51‒100 小時或 101‒120 小時。T 細胞可以為 CD8 ⁺T細胞。

T 細胞活化可以在約 0 ^oC 與約 42 ^oC 之間的溫度實施。T 細胞活化可以在約 1 ^oC、2 ^oC、3 ^oC、4 ^oC、5 ^oC、6 ^oC、7 ^oC、8 ^oC、9 ^oC、10 ^oC、11 ^oC、12 ^oC、13 ^oC、14 ^oC、15 ^oC、16 ^oC、17 ^oC、18 ^oC、19 ^oC、20 ^oC、21 ^oC、22 ^oC、23 ^oC、24 ^oC、25 ^oC、26 ^oC、27 ^oC、28 ^oC、29 ^oC、30 ^oC、31 ^oC、32 ^oC、33 ^oC、34 ^oC、35 ^oC、36 ^oC、37 ^oC、38 ^oC、39 ^oC、40 ^oC 或 41 ^oC 的溫度實施。T 細胞活化可以在約 30 ^oC 與約 40 ^oC 之間的溫度實施。T 細胞可以為 CD8 ⁺T細胞。

活化T細胞的常規方法可以涉及使用經抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體（『平板結合』）各自以濃度 1ug/mL 包覆之市售珠或非組織培養處理過之 24 孔或 6 孔平板的開式系統與費力製程。然而，開式系統法可能耗費相對長之時間（例如，約 8 小時）來完成。爲了簡化開式系統及費力製程，發明人將此系統簡化成適應於閉式系統的製程，所述閉式系統可以與市售閉式系統（例如，G-Rex ^®（細胞擴充）系統與 Xuri ^®細胞擴充系統）之容器（例如，袋）組合，產生跟使用常規方法所活化之T細胞相當的T細胞活化特徵、T 細胞轉導性與終產物功能性。另外，本公開的方法（例如，瓶結合法）可以耗費相對短之時間（例如，約 1 小時）來完成，這比常規方法快約 8 倍。

閉式系統可以為 CliniMACS Prodigy®（細胞生產用封閉與自動化平臺）、WAVE (XURI ^®) 生物反應器（細胞擴充系統）、WAVE (XURI ^®) 生物反應器（細胞擴充系統）聯合 BioSafe Sepax ^®II（細胞分離系統）、G-Rex ^®閉式系統（細胞擴充系統）、或 G-Rex® 閉式系統（細胞擴充系統）聯合 BioSafe Sepax ^®II（細胞分離系統）。 T 細胞轉化

編碼重組蛋白（例如，CAR、TCR、細胞介素、抗體、及/或雙特異性結合性分子）之核酸可以作為裸 DNA 或在合適的載體（如病毒載體）中引入T細胞。T 細胞可以為 CD8 ⁺T細胞。本領域已知使用裸 DNA 透過電穿孔或其他非病毒基因轉移（如，但不限於，聲致穿孔法）穩定轉染T細胞的方法。參見例如美國專利第 6,410,319 號； T Cell Protocols（第 2 版）De Libero（編著）2009 Humana Press; Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第 4 版）Green 與 Sambrook（編著）2012 Cold Spring Harbor Press。裸 DNA 通常系指質粒表現載體中所含之處於恰當表現方向的編碼重組蛋白之 DNA。有利地，裸 DNA 的使用減少產生表現重組蛋白之T細胞所需的時間。

病毒載體（例如，逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或慢病毒載體）可以用來向 CD8 ⁺T細胞引入編碼重組蛋白之核酸。根據本公開方法使用的合適載體在受試者之T細胞中不複製。已知基於病毒之多種載體，其中細胞内所維持之病毒的拷貝數低到足以維持細胞活力。可以在本文所述方法中使用的示意性載體包括 pFB-neo 載體 (STRATAGENE®) 以及基於γ-逆轉錄病毒、慢病毒 (LV)（例如，人免疫缺陷病毒 (HIV)）、猴空泡病毒 40 (SV40)、Epstein–Barr 病毒 (EBV)、單純皰疹病毒 (HSV) 或牛乳頭瘤病毒 (BPV) 之載體。本領域已知用病毒載體穩定轉染T細胞之方法與材料。 Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and ProtocolsMachida（編著）2003 Humana Press。參見例如 T Cell Protocols（第 2 版） De Libero（編著）2009 Humana Press; Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第 4 版）Green 與 Sambrook（編著）2012 Cold Spring Harbor Press。 慢病毒載體

本文中使用之慢病毒載體包含幾種先前經證明增強載體功能之元件，所述元件包括用於改善複製與核輸入之中央多嘌呤區 (cPPT)、來自鼠幹細胞病毒 (MSCV) 之啟動子（已經證明其在某些細胞類型削弱載體沉寂）、用於改善轉錄終止之土撥鼠肝炎病毒轉錄後反應元件 (WPRE) (SEQ ID NO: 174)，並且骨架是刪除 3'-LTR 之自滅活 (SIN) 載體設計，所述設計可能具有改良安全性、持久基因表現與抗沉寂屬性（Yang 等人. Gene Therapy (2008) 15, 1411–1423，所述文獻之内容透過引用方式完整併入）。

在一個態樣中，本文所述之載體、構築體或序列包含突變形式之 WPRE。在另一個態樣中，本文所述之序列或載體包含在 WPRE 版本 1（例如 WPREmut1 (SEQ ID NO: 175)）或 WPRE 版本 2（例如 WPREmut2 (SEQ ID NO: 176)）中的突變。在一個態樣中，WPRE 突變體包含至多一個突變、至多兩個突變、至多三個突變、至少四個突變或至多五個突變。在一個態樣中，本文所述之載體、構築體或序列不包含 WPRE。

在另一個態樣中，本文所述之載體、構築體或序列不包含 X 蛋白啟動子。

爲了在經轉導之γδT細胞或αβT細胞中獲得 TCRαβ 與 CD8αβ 的最佳共表現水準，可以產生具有各種設計之慢病毒載體。T 細胞可以經表現 TCRαβ 或 CD8αβ 之兩種獨立慢病毒載體（2 合 1）及共表現 TCRαβ 與 CD8αβ 之單一慢病毒載體（4 合 1）或以及無 CD8β 下共表現 TCRαβ 與 CD8α 之單一慢病毒載體（3 合 1）轉導。在 4 合 1 載體或 3 合 1 載體中，編碼 TCRα 鏈、TCRβ 鏈、CD8α 鏈及/或 CD8β 鏈之核苷酸可以按各種順序改組。如此產生之各種 4 合 1 載體或 3 合 1 載體可以用來轉導 γδT細胞或 αβT細胞，隨後使用本領域已知技術（例如，流式細胞術）測量經轉導之細胞的 TCR/CD8 共表現水準。

為了產生共表現 TCRαβ 與 CD8αβ 之慢病毒載體，編碼弗林蛋白酶-接頭-2A 肽之核苷酸可以位於 TCRα 鏈與 TCRβ 鏈之間、CD8α 鏈與 CD8β 鏈之間以及 TCR 鏈與 CD8 鏈之間，以實現高效基因表現。2A 肽可以選自 P2A、T2A、E2A 或 F2A。

慢病毒性病毒載體亦可以含有轉錄後調控元件 (PRE)，如土撥鼠 PRE (WPRE) (SEQ ID NO: 174)，以透過增加 mRNA 胞核水準與胞質水準來增強轉基因之表現。一種或多種調控元件，包括小鼠 RNA 轉運元件 (RTE)、猴逆轉錄病毒 1 型 (SRV-1) 之組成型轉運元件 (CTE) 與人熱休克蛋白 70 之 5′ 非翻譯區 (Hsp70 5′UTR) 亦可以使用及/或與 WPRE 之組合，以增加轉基因表現。

慢病毒載體可以經 RD114TR (SEQ ID NO: 177) 假型化，所述 RD114TR 是一種嵌合醣蛋白，其含有跟鼠白血病病毒之細胞質尾 (TR) 融合的貓內源病毒 (RD114) 胞外域與跨膜域。亦可以使用其他的病毒包膜蛋白，例如 VSV-G env、MLV 4070A env、RD114 env、嵌合包膜蛋白 RD114pro、桿狀病毒 GP64 env 或 GALV env 或其衍生物。

一旦確立經轉染或轉導之T細胞能夠將重組蛋白（例如，CARs 與 TCR）作爲具有所需調節作用之表面膜蛋白及按所需水準表現，則可以確定 CAR 與 TCR 是否在宿主細胞中有功能以提供所需之訊號誘導。隨後，可以將經轉導之T細胞再引入或投予受試者以在受試者中激活抗腫瘤應答。表 1

SEQ ID NO:	描述	序列
163	CD8α1	MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV
164	CD8α2	MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGCYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV
165	m1CD8α	MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPASVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV
166	m2CD8α	MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGCYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPASVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV
167	CD8β1	MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSVLQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQPQGEGISGTFVPQCLHGYYSNTTTSQKLLNPWILKT
168	CD8β2	MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSVLQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGLKGKVYQEPLSPNACMDTTAILQPHRSCLTHGS
169	CD8β3	LQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQFYK
170	CD8β4	LQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQLRLHPLEKCSRMDY
171	CD8β5	LQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQKFNIVCLKISGFTTCCCFQILQISREYGFGVLLQKDIGQ
172	CD8β6	LQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQKFNIVCLKISGFTTCCCFQILQISREYGFGVLLQKDIGQ
173	CD8β7	LQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQPQGEGISGTFVPQCLHGYYSNTTTSQKLLNPWILKT
174	WPRE	cagtctgacgtacgcgtaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc
175	WPREmut1	cagtctgacgtacgcgtaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc
176	WPREmut2	Gagcatcttaccgccatttatacccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacattttttgggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacttgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactttgttgctccttttacgctgtgtggatttgctgctttattgcctctgtatcttgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttttgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtc
177	RD114TR	MKLPTGMVILCSLIIVRAGFDDPRKAIALVQKQHGKPCECSGGQVSEAPPNSIQQVTCPGKTAYLMTNQKWKCRVTPKISPSGGELQNCPCNTFQDSMHSSCYTEYRQCRRINKTYYTATLLKIRSGSLNEVQILQNPNQLLQSPCRGSINQPVCWSATAPIHISDGGGPLDTKRVWTVQKRLEQIHKAMTPELQYHPLALPKVRDDLSLDARTFDILNTTFRLLQMSNFSLAQDCWLCLKLGTPTPLAIPTPSLTYSLADSLANASCQIIPPLLVQPMQFSNSSCLSSPFINDTEQIDLGAVTFTNCTSVANVSSPLCALNGSVFLCGNNMAYTYLPQNWTRLCVQASLLPDIDINPGDEPVPIPAIDHYIHRPKRAVQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSHQLISDVQVLSGTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYANKSGIVRNKIRTLQEELQKRRESLASNPLWTGLQGFLPYLLPLLGPLLTLLLILTIGPCVFNRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPL

經工程化之 CD4 ⁺CD8 ⁺T 細胞

CD8 是一種膜錨定醣蛋白，其充當T細胞受體 (TCR) 對肽/MHC I 類複合體的抗原識別過程之輔助受體，並且在胸腺内T細胞發育及周邊T細胞活化中起重要作用。功能性 CD8 系爲兩條 α 鏈 (CD8αα) 或一條 α 鏈與一條 β 鏈 (CD8αβ) 所組成之二聚體蛋白，而 β 鏈之表面表現可能需要其跟共表現之 α 鏈締合以形成 CD8αβ 異二聚體。CD8αα 與 CD8αβ 可以在多種淋巴細胞上差異性表現。CD8αβ 優勢表現於 αβTCR ^+T ^細胞與胸腺細胞的表面上，而 CD8αα 優勢表現於 αβTCR ⁺、γδTCR ⁺腸上皮內淋巴細胞、NK 細胞、樹狀細胞與一小部分 CD4 ⁺T細胞之亞群上。

在一個實施例中，T 細胞可以為表現外源 CD8αβ 異二聚體或外源 CD8α 同型二聚體或其變體（例如，如表 1 中所示）的 γδT細胞或 αβT細胞，CD8α 多肽可以為 CD8α1 (SEQ ID NO: 163)、CD8α2 (SEQ ID NO: 164)、m1CD8α (SEQ ID NO: 165) 或 m2CD8α (SEQ ID NO: 166)，並且 CD8β 多肽可以為 CD8β1 (SEQ ID NO: 167)、CD8β2 (SEQ ID NO: 168)、CD8β3 (SEQ ID NO: 169)、CD8β4 (SEQ ID NO: 170)、CD8β5 (SEQ ID NO: 171)、CD8β6 (SEQ ID NO: 172) 或 CD8β7 (SEQ ID NO: 173)。

CD8α 序列通常可以具有足以能夠結合於 MHC 之免疫球蛋白域部分。通常，CD8α 分子可以含有 CD8α 之所有或絕大部分免疫球蛋白域（例如，CD8α1 (SEQ ID NO: 163)），但在一個態樣中可以含有免疫球蛋白域之至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110 或 115 個胺基酸。本公開之 CD8α 分子可以優選為二聚體（例如，CD8αα 或 CD8αβ），不過 CD8α 單體可以納入本公開之範圍。在一態樣中，本公開之 CD8α 可以包含 CD8α1 (SEQ ID NO: 163) 與 CD8α2 (SEQ ID NO: 164)。

CD8α 亞基與 β 亞基可能具有相似之結構基序，包括一個 Ig 樣域、一個含 30–40 個胺基酸之莖區、一個跨膜區與一個含約 20 個胺基酸之短胞質域。CD8α 鏈與 β 鏈在 Ig 樣域中分別具有兩個與一個 N 聯醣基化位點，在所述 Ig 樣域中它們共有小於 20% 之胺基酸序列同一性。CD8β 莖區比 CD8α 莖短 10–13 個胺基酸，且經 O 聯醣高度醣基化。此等位於 β 莖區而非 α 莖區之醣類似乎相當不均勻，原因在於複雜唾液酸化，這可能在胸腺細胞諸發育階段期間與T細胞活化時受差異化調節。已證明聚醣加合物在醣蛋白功能及免疫應答中發揮調節作用。靠近跨膜域之聚醣可以影響毗鄰基序之取向。CD8β 鏈莖區之獨特生化特性可能使其成為調節輔助受體功能之合理候選者。

工程化T細胞可以表現本文所述之外源 CD8 多肽。例如，T 細胞可以共表現T細胞受體 (TCR) 與本文所述的外源 CD8 多肽。T 細胞亦可以表現嵌合抗原受體 (CAR)、CAR 類似物或 CAR 衍生物。

T 細胞可以為 αβT細胞、γδT細胞、自然殺手T細胞或其組合（如果在群體中）。T 細胞可以為 CD4 ⁺T細胞、CD8 ⁺T細胞或 CD4 ⁺/ CD8 ⁺T細胞。 表現外源 T 細胞受體 (TCR) 之工程化 T 細胞

T 細胞可以共表現T細胞受體 (TCR)、抗原結合蛋白或兩者，連同本文所述之外源 CD8 多肽，包括但不限於表 1 中所列的那些 (SEQ ID Nos: 163-173)）。此外，T 細胞可以表現美國專利申請公開第 2017/0267738 號、美國專利申請公開第 2017/0312350 號、美國專利申請公開第 2018/0051080 號、美國專利申請公開第 2018/0164315 號、美國專利申請公開第 2018/0161396 號、美國專利申請公開第 2018/0162922 號、美國專利申請公開第 2018/0273602 號、美國專利申請公開第 2019/0016801 號、美國專利申請公開第 2019/0002556 號、美國專利申請公開第 2019/0135914 號、美國專利 10,538,573、美國專利 10,626,160、美國專利申請公開第 2019/0321478 號、美國專利申請公開第 2019/0256572 號、美國專利 10,550,182、美國專利 10,526,407、美國專利申請公開第 2019/0284276 號、美國專利申請公開第 2019/0016802 號、美國專利申請公開第 2019/0016803 號、美國專利申請公開第 2019/0016804 號、美國專利 10,583,573、美國專利申請公開第 2020/0339652 號、美國專利 10,537,624、美國專利 10,596,242、美國專利申請公開第 2020/0188497 號、美國專利 10,800,845、美國專利申請公開第 2020/0385468 號、美國專利 10,527,623、美國專利 10,725,044、美國專利申請公開第 2020/0249233 號、美國專利 10,702,609、美國專利申請公開第 2020/0254106 號、美國專利 10,800,832、美國專利申請公開第 2020/0123221 號、美國專利 10,590,194、美國專利 10,723,796、美國專利申請公開第 2020/0140540 號、美國專利 10,618,956、美國專利申請公開第 2020/0207849 號、美國專利申請公開第 2020/0088726 號與美國專利申請公開第 2020/0384028 號中所述之 TCR 與抗原結合蛋白；其中所述此等公開之內容與序列表各自透過引用方式整體併入。T 細胞可以為 αβT細胞、γδT細胞、自然殺手T細胞。自然殺手細胞。在一個實施例中，本文所述之 TCR 為單鏈 TCR 或可溶性 TCR。 T 細胞擴充

在T細胞轉導後，可以將細胞離體增殖數天、數周或數月，如在基因轉移入細胞後約 1、2、3、4、5 天或更多天以內增殖爲一個大群體。在又一個態樣中，轉導後，選殖經轉導之細胞並且可以離體擴充顯示存在單一整合型或附加體維持型表現盒或質粒且表現重組蛋白（例如，TCR）之殖株。選定用於擴充之殖株展示出特異性識別並裂解表現肽之靶細胞的能力。可以透過用結合共同 γ-鏈的 IL-2 或其他細胞介素（例如，IFN-α、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-21 及其他）刺激，擴充基改T細胞。可以透過用人工抗原呈遞細胞刺激，擴充基改T細胞。可以在人工抗原呈遞細胞上或用使T細胞表面上 CD3 交聯之抗體（如 OKT3）擴充基改T細胞。可以在人工抗原呈遞細胞上或用結合T細胞表面上 CD52 之抗體（如 Campath）消除基改T細胞亞群。可以低溫凍存基改T細胞。

可以在T細胞活化刺激物存在下實施T細胞擴充。

T 細胞擴充可以不多於約 1 天、不多於約 2 天、不多於約 3 天、不多於約 4 天、不多於約 5 天，或不多於約 6 天之時間以内實施。T 細胞擴充可以持續約 1、2、3、4、5 或 6 天。

T 細胞擴充可以約 1 天至約 6 天、約 1 天至約 5 天、約 1 天至約 4 天、約 1 天至約 3 天、約 1 天至約 2 天或約 1 天之時間以内實施。

T 細胞擴充可以在干擾素 (IFN)-α、白血球介素 (IL)-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-21 或其組合存在下實施。在一個態樣中，擴充在 IL-7 與 IL-15 組合存在下發生。

在擴充T細胞群體到足夠數目後，經擴充之T細胞可以復轉至此個體。本公開之方法亦可以提供可再生T細胞源。因此，來自某個體的T細胞可以離體擴充，一部分經擴充之群體可以複投予此個體，並且另一個部分可以等份冷凍供長期保存及後續擴充以及投予此個體。類似地，腫瘤浸潤型淋巴細胞群體可以從罹患癌症之個體獲得並且刺激T細胞以增殖到足夠數目並且使之復轉至此個體。

本公開亦可以涉及組成物，所述組成物含有跟固相表面偶聯的向T細胞提供共刺激訊號以擴充T細胞之試劑（例如，抗 CD28 抗體、B7-1 或 B7-2 配體），所述固相表面可以另外包含跟同一固相表面偶聯的向T細胞提供初級活化訊號之試劑（例如，抗 CD3 抗體）。此等試劑可以優選地接合至珠或瓶或袋。包含跟不同固相表面偶聯的每種試劑（例如，跟第一固相表面偶聯的提供T細胞活化初級訊號之試劑及跟第二固相表面偶聯的提供共刺激訊號之試劑）之組成物也處於本公開之範圍內。 T 細胞生產過程中的無血清培養基

如本文提到，術語『無血清培養基』或『無血清培養介質』意指所用之生長培養基未補充有血清（例如，人血清或牛血清）。也就是說，血清未作為各自獨立且不同之成分添加至培養介質以支持所培養細胞之活力、活化與生長。用於T細胞生長介質的任何合適培養介質可以用於根據本文所述之方法培養細胞。例如，T 細胞生長介質可以包括但不限於無菌、低葡萄糖溶液，所述溶液包含合適量之緩衝劑、鎂、鈣、丙酮酸鈉與碳酸氫鈉。在一個實施例中，T 細胞生長介質可以包括無血清培養基，例如，OPTI-MEM®、D-MEM/F-12、4CellNutri (Sartorius)、AIM V (ThermoFisher)、Physiologix (Nucleus Biologics)，及/或病毒生產 (VP) 培養基 (Life Technologies)，但是本領域技術人員將理解如何產生類似之培養基。跟產生工程化T細胞之常見方法相反，本文所述的方法使用可以未補充有（例如，人類或牛）血清之培養介質。

人細胞中產生的 VSV-G 假型化 HIV 載體及 FIV 載體可以被人類血清補體失活（DePolo 等人, “VSV-G Pseudotyped Lentiviral Vector Particles Produced in Human Cells Are Inactivated by Human Serum（人細胞中產生的 VSV-G 假型化慢病毒載體粒子被人類血清失活）” Molecular Therapy (2000) 2:218-222；所述文獻之內容因而透過引用方式整體併入）。另外，降低培養介質中血清濃度可以導致生長動力學與產品品質等同的更持久製程（Tyagarajan 等人, “Optimizing CAR-T Cell Manufacturing Processes during Pivotal Clinical Trials (關鍵臨床試驗期間優化 CAR-T 細胞生產製程)” Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, (2020) 16:136-144；所述文獻之內容因而透過引用方式整體併入）。因此，在T細胞生產製程中納入無血清培養基可能有利。

在一個態樣中，T 細胞活化、T 細胞轉化及/或T細胞擴充可以在無血清培養基中進行。

在一個態樣中，T 細胞活化可以在無血清培養基中或在血清存在下進行。

在一個態樣中，T 細胞活化可以在無血清培養基中進行。

在一個態樣中，T 細胞轉化可以在無血清培養基中或在血清存在下進行。

在一個態樣中，T 細胞轉化可以在無血清培養基中進行。

在一個實施例中，如相比血清存在下所進行者，在血清不存在下（例如，在無血清培養基中）進行的T細胞轉化可以升高T細胞產品中 CD8 ⁺T細胞（例如，CD8 ⁺CD3 ⁺T細胞）之頻率達約 5% 至約 60%、約 5% 至約 50%、約 5% 至約 45%、約 5% 至約 40%、約 5% 至約 35%、約 5% 至約 30%、約 5% 至約 25%、約 5% 至約 20%、約 5% 至約 15%、約 5% 至約 10%、約 10% 至約 50%、約 10% 至約 40%、約 10% 至約 30%、約 10% 至約 20%、約 10% 至約 15%、約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55% 或約 60%。

在一個實施例中，如相比血清存在下所進行者，在血清不存在下（例如，在無血清培養基中）進行的T細胞轉化可以升高 CD8（例如，肽/MHC Dextramer (Dex) ⁺CD8 ⁺T細胞）中外源 TCR 之轉導頻率達約 5% 至約 60%、約 5% 至約 50%、約 5% 至約 45%、約 5% 至約 40%、約 5% 至約 35%、約 5% 至約 30%、約 5% 至約 25%、約 5% 至約 20%、約 5% 至約 15%、約 5% 至約 10%、約 10% 至約 50%、約 10% 至約 40%、約 10% 至約 30%、約 10% 至約 20%、約 10% 至約 15%、約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55% 或約 60%。

在一個態樣中，T 細胞擴充可以在無血清培養基中或在血清存在下進行。

在一個態樣中，T 細胞擴充可以在無血清培養基中進行。

在一個態樣中，低溫凍存之T細胞可以在血清存在下解凍並且靜息約 2-8 小時、2-6 小時或 2-4 小時。

在一個態樣中，低溫凍存之T細胞可以在血清存在下解凍並且靜息約 2-4 小時，在血清存在下活化，在血清不存在下轉導及在血清存在下擴充。

在一個態樣中，低溫凍存之T細胞可以在血清存在下解凍並且靜息約 2-4 小時，在血清不存在下活化，在血清不存在下轉導及在血清存在下擴充。 閉式系統中之 T 細胞生產

活化T細胞的常規方法可以包括使用經抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體（『平板結合』）各自以濃度 1ug/mL 包覆之市售珠或非組織培養處理過之 24 孔或 6 孔平板的開式系統及費力製程。然而，開式系統法可能耗費相對長之時間（例如，約 8 小時）來完成。爲了簡化開式系統及費力製程，本公開的實施例可以包括適應於閉式系統的簡潔製程，所述閉式系統可以與市售閉式系統（例如，G-Rex ^TM系統與 Xuri ^TM細胞擴充系統）之容器（例如，袋）組合，產生跟使用常規方法所活化之T細胞相當的T細胞活化特徵、T 細胞轉導性與終產物功能性。另外，本公開的方法（例如，瓶結合法）可以耗費相對短之時間（例如，約 1 小時）來完成，這比常規方法快約 8 倍。

在一些實施例中，可以在任何細胞培養閉式系統中實施本公開的T細胞生產製程，所述閉式系統包括市售系統，例如，CliniMACS Prodigy ^TM(Miltenyi)、單用或聯用 BioSafe Sepax ^TMII 之 WAVE (XURI ^TM) 生物反應器 (GE Biosciences) 及單用或聯用 BioSafe Sepax ^TMII 之 G-Rex/GatheRex ^TM閉式系統 (Wilson Wolf)。G-Rex ^TM-閉式系統是擴充容器並且 GatheRex ^TM是濃縮與收穫用泵。

CliniMACS Prodigy ^TM(Miltenyi)

帶 TCT 製程軟體與 TS520 管路套件之 CliniMACS Prodigy ^TM可以允許用於細胞富集、轉導、洗滌與擴充的閉式系統加工。例如，MACS-CD4 微珠與 CD8 微珠可以用於富集，TransACT 珠（例如，CD3/CD28 試劑）可以用於活化，表現重組 TCR 之慢病毒載體可以用於轉導，TexMACS 培養基-3%-HS-IL2 可以用於培養並且磷酸鹽緩衝液/乙二胺四乙酸緩衝液可以用於洗滌。此系統可以產生約 4-5 x 10 ⁹個細胞，含有以室最大裝量約 300 mL 生產的自動化方案，並且歷經一個 10 至 14 天製程執行選擇與激活（TransACT 珠）、轉導及擴充。

WAVE (Xuri ^TM) 生物反應器 (GE Biosciences)

WAVE (Xuri ^TM) 生物反應器允許T細胞於培養袋（例如，Xuri Cellbag）中伴隨及/或不伴隨灌注下培養。飼養用培養基袋可以為 5 升 Hyclone Labtainer。廢棄物袋可以為 Mbag（購自 GE Healthcare）。此系統可以產生約 15-30 x 10 ⁹個細胞，使用允許進行培養物控制且監測之獨角獸軟體，含有可容納約 0.3 升至約 25 升之搖擺托盤，並且執行灌流功能以維持培養物容量，與此同時介導氣體交換並且向細胞培養物引入新鮮培養基與細胞介素。

WAVE (Xuri ^TM) 生物反應器可以包括用於擴充之 Xuri Bag、用於解凍與靜息之 Saint Gobain’s VueLife 袋及用於活化之 VueLife AC 袋。WAVE (Xuri ^TM) 生物反應器可以跟其他技術（例如，Sepax ^TM細胞分離系統 (GE Biosciences)）組合用於培養物洗滌步驟與容量縮減步驟。無菌焊機 (Terumo BCT ^TM) 可以用於連接溶液轉移用無菌袋及密封管件用熱密封。

Sepax ^TM細胞分離系統依賴於分離室，所述分離室既藉助注射器室轉動提供分離（離心），又藉助注射器柱塞位移提供組分轉移。光學感測器測量已分離組分之光吸收性並且管理其各自在正確輸出容器中之流動方向，例如，可以因此從血液樣品分離並且收集血漿、膚色血球層與紅血球。 醫藥組成物

為了便於給藥，可以將根據本公開的經轉化之T細胞以可藥用運載體或稀釋劑製成醫藥組成物或製成適於活體內給藥之植入物。本領域描述了製備此種組成物或植入物之手段。例如，參見 Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第 16 版, Mack 編著 (1980)。T 細胞可以為 CD8 ⁺T細胞。

經轉導之T細胞可以配製成半固態或液態形式之製劑，例如：膠囊劑、溶液劑、輸注劑或注射劑。本領域已知之手段可以用來防止或最大限度減少組成物到達靶組織或器官前之釋放與吸收，或確保組成物定時釋放。不過，合乎需要地使用未妨礙細胞表現 CAR 或 TCR 之可藥用形式。因此，經轉導之T細胞可以合乎需要製成包含運載體之醫藥組成物。可以用生理可接受運載體或賦形劑配製藉助本文所述方法產生之T細胞以製備醫藥組成物。運載體與組成物可為無菌。經優選之運載體例如包括平衡鹽溶液，優選地 Hanks 平衡鹽溶液或生理鹽水。製劑應適合投予模式。合適之可藥用運載體包括但不限於水、鹽溶液（例如，NaCl）、生理鹽水、緩衝鹽水及其組合。若需要，藥物製品可以與不跟T細胞發生有害反應之助劑（例如，潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓之鹽、緩衝劑）混合。

本發明之組成物可以按單位劑量形式提供，其中每個劑量單位（例如，注射劑）含有預定量之單獨或跟其他活性劑適當組合之組成物。

組成物可以包含有效量經分離之轉導T細胞並且如此引入受試者，從而實現減小腫瘤尺寸或消除腫瘤生長或再生長之長期、特異性抗腫瘤應答，此應答在此種治療不存在時原本不會產生。例如，否則相比其中不存在已轉導T細胞之相同條件時，向受試者再引入之已轉導T細胞之量造成約 10%、約 20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 95%、約 98% 或約 99% 腫瘤尺寸減小。

因此，投予之已轉導T細胞之量可以考慮投予路徑並且應當爲如此，從而引入足夠數目經轉導之T細胞，以致於實現所需之治療反應。另外，本文所述組成物中所包含之每種活性劑的量（例如，根據每個待接觸細胞之量或根據某個體重之量）可以在不同應用中變動。總體上，已轉導T細胞之濃度合乎需要地應當足以在正接受治療之受試者中提供例如有效量之已轉導T細胞，這些有效量可以為約 1×10 ⁶至約 1×10 ⁹個已轉導T細胞/m ²（或 kg）患者，甚至更合乎需要地，是約 1×10 ⁷至約 5×10 ⁸個已轉導T細胞/m ²（或 kg）患者。如爲實現治療效果需要，可以利用任何合適量，例如，大於 5×10 ⁸個細胞/m ²（或 kg）患者或更低，例如，小於 1×10 ⁷個細胞/m ²（或 kg）患者。給藥方案可以基於充分確立之細胞基療法（例如，參見美國專利第 4,690,915 號），或可以使用交替連續輸注策略。

本文所述之T細胞產品也可以低溫凍存。因此，低溫凍存之T細胞組成物可以包含基改T細胞與凍結介質。 免疫療法

治療患有癌症或需要治療癌症之患者或個體的方法可以包括向患者投予有效量之本文所述的已擴充基改T細胞。需要其之患者或個體可以為癌症患者。待用本文所述T細胞待治療之癌症可以為肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食管癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、Merkel 細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性髓樣白血病 (AML)、膽囊癌與膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌症 (UBC)、急性淋巴球白血病 (ALL)、子宮癌 (UEC) 或其組合。

T 細胞基免疫療法靶向從腫瘤相關蛋白或腫瘤特異性蛋白衍生之肽表位，所述肽表位爲主要組織相容性複合體 (MHC) 分子所呈遞。腫瘤特異性 T 淋巴細胞識別之抗原（即，其表位）可以為衍生自所有蛋白質類別之分子，如酶、受體、轉錄因子等，所述分子表現於相應腫瘤之細胞中且如相比同起源之未改變細胞通常上調。

存在兩類 MHC-分子：MHC I 類與 MHC II 類。MHC I 類分子爲 α 重鏈與 β-2-微球蛋白所組成，MHC II 類分子爲 α 鏈與 β 鏈所組成。其三維構象產生一個結合溝，後者用於跟肽非共價相互作用。MHC I 類分子可以存在於大部分有核細胞上。它們呈遞因蛋白酶剪切優勢內源性蛋白質、缺陷性核糖體產物 (DRIP) 與較大肽而產生之肽。但是，從內體區室或外源來源衍生之肽亦頻繁存在於 MHC I 類分子上。此種非經典 I 類呈遞方式稱作交叉呈遞。MHC II 類分子可以優勢存在於專職抗原呈遞細胞 (APC) 上，並且主要呈遞被 APC 取得（例如，在內吞期間）並且隨後加工的外源蛋白或跨膜蛋白之肽。

肽與 MHC I 類之複合體爲擕載適當T細胞受體 (TCR) 之 CD8 ⁺T細胞所識別，而肽與 MHC II 類分子之複合體爲擕載適當 TCR 之 CD4 陽性輔助T細胞所識別。眾所周知，TCR、肽與 MHC 因而按 1:1:1 之化學計量數量存在。

CD4 ⁺輔助T細胞在藉助 CD8 ⁺細胞毒性T細胞誘導並且維持有效應答方面發揮重要作用。鑒定衍生自腫瘤相關抗原 (TAA) 之 CD4 陽性T細胞表位對開發觸發抗腫瘤免疫應答之藥物產品非常重要。在腫瘤部位，輔助T細胞支持細胞毒性T細胞 (CTL) 友好性細胞介素環境並且吸引效應細胞，例如，CTL、自然殺手 (NK) 細胞、巨噬細胞與顆粒球。

對於觸發（激發）細胞免疫應答之 MHC I 類肽，它還必須結合於 MHC 分子。此過程依賴於 MHC 分子之等位基因及肽之胺基酸序列的特定多態性。MHC 1 類結合肽通常爲 8-12 個胺基酸殘基長度並且通常在其序列中含有兩個跟 MHC 分子之相應結合溝相互作用之保守殘基（『錨定物』）。以此種方式，每個 MHC 等位基因具有確定哪些肽可以跟結合溝特異性結合之『結合基序』。

在 MHC I 類依賴性免疫應答中，肽不僅須能跟腫瘤細胞表現之某些 MHC-I 類分子結合，而且它們後續亦須爲擕載特異性T細胞受體 (TCR) 之T細胞所識別。

對於被 T 淋巴細胞識別為腫瘤特異性或相關抗原以及療法中待用之蛋白質，必須滿足特殊前提。此抗原應主要爲腫瘤細胞所表現，而不爲正常健康組織所表現，或以相對少之量表現。如相比正常健康組織，肽應當爲腫瘤細胞過量呈遞。更適宜之情況是，相應抗原不僅出現於一種腫瘤中，而且以高濃度（例如，每個細胞之相應肽拷貝數）出現。腫瘤特異性抗原與腫瘤相關抗原往往衍生自因其功能（例如，在細胞週期控制或抑制凋亡中功能）而直接參與正常細胞向腫瘤細胞轉化之蛋白質。另外，直接導致轉化之蛋白質之下游標靶可能上調，並且因此可能間接為腫瘤相關。此等間接性腫瘤相關抗原也可能是免疫接種靶。表位存在於抗原之胺基酸序列中旨在確保此種肽（『免疫原性肽』）衍生自腫瘤相關抗原，並且導致活體外或活體內T細胞應答。

TAA 是開發T細胞基療法（包括但不限於腫瘤疫苗）之起點。用於鑒定及表徵 TAA 之方法通常以使用可以分離自患者或健康受試者之T細胞爲基礎，或此類方法以腫瘤組織與正常組織之間生成差異性轉錄譜或差異性肽表現模式爲基礎。然而，鑒定腫瘤組織或人腫瘤細胞株中過量表現或此等組織或細胞株中選擇性表現之基因未提供關於轉錄自此等基因之抗原在免疫療法中用途之確切資訊。此系因爲僅此等抗原之單獨表位亞群適於此種應用，原因在於具有相應 TCR 之T細胞不得不存在且需要針對這個具體表位之免疫耐受性不存在或最小。在本說明書的一個非常優選之實施例中，因此重要的是僅選擇那些過量呈遞或選擇性呈遞之肽，其中可以找到針對所述肽之功能性T細胞及/或正在增殖之T細胞。此種功能性T細胞定義為經特定抗原刺激時可以選殖性擴充且能夠執行效應子功能之T細胞（『效應子T細胞』）。

能夠跟本文所述方法與實施例配合使用之 TAA 肽例如包括以下美國專利申請公開號中所述之那些 TAA 肽：2016/0187351；2017/0165335；2017/0035807；2016/0280759；2016/0287687；2016/0346371；2016/0368965；2017/0022251；2017/0002055；2017/0029486；2017/0037089；2017/0136108；2017/0101473；2017/0096461；2017/0165337；2017/0189505；2017/0173132；2017/0296640；2017/0253633；2017/0260249；2018/0051080 與 2018/0164315。

本文所述之T細胞選擇性識別此等細胞，它們呈遞在上文所述多份專利與出版物之一中描述的 TAA 肽。

能夠配合本文所述方法與實施例使用之 TAA 包含 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 162 的至少一個胺基酸序列。T 細胞選擇性識別此等細胞，它們呈遞在 SEQ ID NO: 1–162 之胺基酸序列中或本文所述之任何專利或申請中描述的 TAA 肽。表 2. 腫瘤相關抗原列表 (TAA)

SEQ ID NO:	胺基酸序列	SEQ ID NO:	胺基酸序列	SEQ ID NO:	胺基酸序列
1	YLYDSETKNA	54	LLWGHPRVALA	106	VLLNEILEQV
2	HLMDQPLSV	55	VLDGKVAVV	107	SLLNQPKAV
3	GLLKKINSV	56	GLLGKVTSV	108	KMSELQTYV
4	FLVDGSSAL	57	KMISAIPTL	109	ALLEQTGDMSL
5	FLFDGSANLV	58	GLLETTGLLAT	110	VIIKGLEEITV
6	FLYKIIDEL	59	TLNTLDINL	111	KQFEGTVEI
7	FILDSAETTTL	60	VIIKGLEEI	112	KLQEEIPVL
8	SVDVSPPKV	61	YLEDGFAYV	113	GLAEFQENV
9	VADKIHSV	62	KIWEELSVLEV	114	NVAEIVIHI
10	IVDDLTINL	63	LLIPFTIFM	115	ALAGIVTNV
11	GLLEELVTV	64	ISLDEVAVSL	116	NLLIDDKGTIKL
12	TLDGAAVNQV	65	KISDFGLATV	117	VLMQDSRLYL
13	SVLEKEIYSI	66	KLIGNIHGNEV	118	KVLEHVVRV
14	LLDPKTIFL	67	ILLSVLHQL	119	LLWGNLPEI
15	YTFSGDVQL	68	LDSEALLTL	120	SLMEKNQSL
16	YLMDDFSSL	69	VLQENSSDYQSNL	121	KLLAVIHEL
17	KVWSDVTPL	70	HLLGEGAFAQV	122	ALGDKFLLRV
18	LLWGHPRVALA	71	SLVENIHVL	123	FLMKNSDLYGA
19	KIWEELSVLEV	72	YTFSGDVQL	124	KLIDHQGLYL
20	LLIPFTIFM	73	SLSEKSPEV	125	GPGIFPPPPPQP
21	FLIENLLAA	74	AMFPDTIPRV	126	ALNESLVEC
22	LLWGHPRVALA	75	FLIENLLAA	127	GLAALAVHL
23	FLLEREQLL	76	FTAEFLEKV	128	LLLEAVWHL
24	SLAETIFIV	77	ALYGNVQQV	129	SIIEYLPTL
25	TLLEGISRA	78	LFQSRIAGV	130	TLHDQVHLL
26	ILQDGQFLV	79	ILAEEPIYIRV	131	SLLMWITQC
27	VIFEGEPMYL	80	FLLEREQLL	132	FLLDKPQDLSI
28	SLFESLEYL	81	LLLPLELSLA	133	YLLDMPLWYL
29	SLLNQPKAV	82	SLAETIFIV	134	GLLDCPIFL
30	GLAEFQENV	83	AILNVDEKNQV	135	VLIEYNFSI
31	KLLAVIHEL	84	RLFEEVLGV	136	TLYNPERTITV
32	TLHDQVHLL	85	YLDEVAFML	137	AVPPPPSSV
33	TLYNPERTITV	86	KLIDEDEPLFL	138	KLQEELNKV
34	KLQEKIQEL	87	KLFEKSTGL	139	KLMDPGSLPPL
35	SVLEKEIYSI	88	SLLEVNEASSV	140	ALIVSLPYL
36	RVIDDSLVVGV	89	GVYDGREHTV	141	FLLDGSANV
37	VLFGELPAL	90	GLYPVTLVGV	142	ALDPSGNQLI
38	GLVDIMVHL	91	ALLSSVAEA	143	ILIKHLVKV
39	FLNAIETAL	92	TLLEGISRA	144	VLLDTILQL
40	ALLQALMEL	93	SLIEESEEL	145	HLIAEIHTA
41	ALSSSQAEV	94	ALYVQAPTV	146	SMNGGVFAV
42	SLITGQDLLSV	95	KLIYKDLVSV	147	MLAEKLLQA
43	QLIEKNWLL	96	ILQDGQFLV	148	YMLDIFHEV
44	LLDPKTIFL	97	SLLDYEVSI	149	ALWLPTDSATV
45	RLHDENILL	98	LLGDSSFFL	150	GLASRILDA
46	YTFSGDVQL	99	VIFEGEPMYL	151	ALSVLRLAL
47	GLPSATTTV	100	ALSYILPYL	152	SYVKVLHHL
48	GLLPSAESIKL	101	FLFVDPELV	153	VYLPKIPSW
49	KTASINQNV	102	SEWGSPHAAVP	154	NYEDHFPLL
50	SLLQHLIGL	103	ALSELERVL	155	VYIAELEKI
51	YLMDDFSSL	104	SLFESLEYL	156	VHFEDTGKTLLF
52	LMYPYIYHV	105	KVLEYVIKV	157	VLSPFILTL
53	KVWSDVTPL			158	HLLEGSVGV
				159	ALREEEEGV
				160	KEADPTGHSY
				161	TLDEKVAEL
				162	KIQEILTQV

雖然已經出於清晰理解目的透過說明與舉例方式以某種細節描述了本發明，但應當理解可以實施落於所附權利要求之範圍內的某些變化與修改。將會藉鑒前述公開來理解或腫瘤學、生理學、免疫學及/或相關領域技術人員在常規落實或實施本發明時顯而易見的本發明上述實施模式之修改意在處於以下請求項之範圍內。

本說明書中提到之所有出版物（例如，非專利文獻）、專利、專利申請公開及專利申請指示本發明所屬領域技術人員之技術水準。將所有此等出版物（例如，非專利文獻）、專利、專利申請公開與專利申請透過引用方式併入本文至相同程度，如同特別且逐一指出透過引用方式併入每份單獨之出版物、專利、專利申請公開或專利申請。實例實例 1 單核球與低 T 細胞產率之間的相關性

發明人使用含有經刺激之高量單核球的健康供體 PBMC 群體展示單核球對T細胞活化之抑制作用。將具有單核球（CD14 ⁺細胞）自然頻率（約 20%）之對照 PBMC 群體與透過將漸增量單核球（CD14 ⁺細胞）加回到耗盡 CD14 之 PBMC 群體所產生的模擬樣品比較。例如，產生 10% 單核球群體、30% 單核球群體、60% 單核球群體及 80% 單核球群體並且測試對 CD3 ⁺CD4 ⁺CD8a ^-細胞設門之 CD69 ⁺細胞 (%)、CD25 細胞 (%) 及 hLDL-R ⁺細胞 (%)。細胞群體中存在之單核球百分數越高，T 細胞產率越低。未觀察到 PMBC 起始群體中存在之 B 細胞、自然殺手細胞 (NK) 或自然殺手T細胞 (NKT) 之百分數（量）的顯著相關性或趨勢。

例如，包含超過 30% 單核球之起始群體跟T細胞產率降低超過 50% 相關。例如參見圖 1。發明人發現，模擬的已啟動 PMBC 群體中單核球含量 ( 30%) 升高在第 6 天收穫時負面地影響生產指標。圖 2A-圖 2C 描述 3 項中等規模研究之扼要資料，N =2-10 情況下之生產指標依賴於條件（依賴於條件，N=3-4 位健康供體，以及依賴於條件，N= 6 份患者樣品）。擴充以細胞總數爲基礎。不良生產指標主要歸因於抑制性影響活化及轉導時存在之T細胞較少。

發明人發現，依據較低靜息後回收率指示藉助塑膠貼壁法高效耗盡貼壁細胞、任選地單核球。圖 3A-圖 3C 描述了靜息前與靜息後之細胞總計數 (3A)、回收百分數 (3B) 及細胞活力百分數 (3C)，而不同單核球百分數包括 60% 單核球。用塑膠貼壁法介導單核球耗盡時，存在升高的擴充倍數及較高 TCR ⁺細胞產率。圖 4A-B. 此等結果表明，存在較高數量單核球（例如，30% 或更多單核球）對可用於免疫療法中經 TCR 轉化之T細胞的產率具備有害影響。爲解釋此點，發明人發現，降低貼壁細胞（包括單核球）數目導致每個批次中經 TCR 轉化之T細胞的產率改善。實例 2 癌症患者中使用塑膠貼壁法評價單核球耗盡

爲評價癌症患者中使用如本文所述的塑膠貼壁法對單核球耗盡之影響，測試總計 13 位患者。對四位患者使用優化之靜息條件與擴充條件並且對九位患者使用非優化條件。表 3 ：靜息條件

	優化條件	非優化條件
靜息（塑膠貼壁法）	0.5–0.8x10 ⁶個細胞/cm ²持續 2 小時	無標準接種密度持續 2–4 小時
擴充	Grex6M（高）表面積 – 10 cm ²培養基高度 – 100 mL 細胞介素 - 2.5X（總量）	Grex6 表面積 – 10 cm ²培養基高度 – 40 mL 細胞介素 - 1X（總量）
收穫日	第 7 天	第 6 天 – 第 10 天（取決於製程可變）

PBMC 分離、單核球耗盡及生產工程化T細胞產品

在患者中使用塑膠貼壁法評價單核球耗盡之研究設計包括袋包被（第 -1 天）、解凍、靜息與活化（第 0 天）[靜息時條件 (A) Grex 對照與 (B) 經優化之塑膠貼壁法單核球耗盡 (CellStack)]、在 Grex6M 中轉導（第 1 天）、飼養（第 2 天）、收穫（第 6 天–10 天，優選地第 7 天）。細胞生長面積可能根據細胞棧規格變動。例如，1-層細胞棧可能具有約 636 cm ²，2-層細胞棧可能具有 1,272 cm ²(2 x 636 cm ²) 等。Grex-10 可以具有 10 cm ²。細胞棧的表面塗層經組織培養處理，而 Grex 則否。Grex 可以在底部具有纖薄矽有機基透氣性膜。

來自健康獻血者之白血球單采術產物獲自 HemaCare。在多項研究中按不同規模從 PBMC 生產工程化T細胞產品。下文描述所執行每個步驟之簡要説明：

PBMC 分離

根據廠商之推薦，使用閉式與自動化 Sepax C-pro 系統及 NeatCell C-Pro 軟體 (GE Healthcare Life Sciences) 藉助聚蔗糖從白血球單采機中分離 PBMC。

單核球耗盡與靜息

使用瓶或細胞棧按 0.5-0.8 x10e6 個細胞/cm ²接種密度，透過塑膠貼壁法進行單核球耗盡。將細胞在此等容器中於 37°C 靜息 2-4 小時，此後透過溫和振搖容器幾次並且隨後傾析或抽吸出溶液中之細胞，收集未貼壁細胞。作為對照，使一些 PBMC 在 Grex10 中於 37°C 靜息 4 小時。隨後活化此等經靜息之細胞。爲檢查細胞棧中之殘餘細胞，將貼壁細胞用含有 10% 人 AB 血清之冷 PBS 脫離，使用抗體染色並且透過流式細胞術分析。

活化

將 750-AC 袋或 290-AC 袋 (Saint-Gobain) 用抗人 CD3 抗體 (0.5 µg/ml) 與抗人 CD28 抗體 (0.5 µg/ml) 在 4 ^oC 包被 16-24 小時。將新鮮製備之 PBMC 按完整 TexMACS 培養基（補充有 5% 人 AB 血清）中 2x10 ⁶/ml 之濃度在無細胞介素下於 37 ^oC 置於經抗 CD3/28 包被的袋中 16-20 小時。

轉導

在 16-24 小時後收穫並且計數抗 CD3/CD28 活化型 PBMC。將經活化之 PBMC 與轉導混合物在 37 ^oC 於 Grex6M 或 Grex100M 中無血清 TexMACS 培養基（2x10 ⁶個細胞/ml）内混合 24 小時，所述轉導混合物含有編碼 IMA203 或 IMA202 TCR 的慢病毒（2.5 µl/10 ⁶個細胞）、硫酸魚精蛋白 (1 µg/ml)、IL-7 (10 ng/ml) 與 IL-15 (50 ng/ml)。在 24 小時後，經轉導之細胞飼以含有血清及 IL-7 與 IL-15 的 TexMACS 培養基以獲得最終接種密度 0.5-0.8 x10 ⁶/cm ²。

收穫與低溫凍存

在第 7 天，收穫經轉導與未經轉導之細胞，計數並且低溫凍存於 CryoStor CS5 冷凍介質中。在解凍經低溫凍存之 IMA20x 製品後進行功能性分析。

使用甚至非優化條件之初始資料顯示在一些患者中有益處。

使用細胞棧透過塑膠貼壁法從患者 PBMC 高效耗盡單核球

圖 5A 與圖 5B 顯示使用 Cellstack（堆疊之細胞皿）透過塑膠貼壁法從患者 PBMC 中高效耗盡單核球。可以在癌症患者樣品中使用細胞棧高效實現耗盡單核球及髓系衍生抑制細胞 (MDSC)。進一步，如圖 6 中所顯示，藉助用於 CD8 ⁺T細胞、CD25 ⁺細胞、CD69 ⁺細胞、LDL ^-R ⁺細胞、41BB ⁺細胞、PD1 ⁺細胞、CD95 ⁺細胞與 Ki67 ⁺細胞之細胞棧，CD8 ⁺T細胞活化增加。單核球百分數降低導致 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞產率升高。例如，單核球百分數降低小於 30% 導致 CD3 ^+T ^細胞幾乎加倍。

透過塑膠貼壁法耗盡單核球所生成的製品中 CD8 ⁺T細胞擴充倍數與頻率升高

圖 9A 顯示透過使用塑膠貼壁法耗盡單核球 (CS) 所製備之T細胞產品中從轉導至收穫的擴充倍數高於使用 G-Rex 時之擴充倍數。圖 9B 顯示透過使用塑膠貼壁法耗盡單核球 (CS) 所製備之T細胞產品中 CD8 ⁺細胞% 高於使用 G-Rex 時之百分數。未轉導之T細胞 (NT) 充當對照。

耗盡單核球時 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞產率升高

表 4 顯示使用優化之靜息條件與擴充條件時四位患者之 PBMC 群體。表 4

PBMC 群體	A	B	C	D
CD3 ⁺(%)	23.2%	25.2%	49%	21.6%
單核球 (%)	46%	48.5%	14.6%	52.7%

圖 10A 顯示在如相比於 CD3 ⁺細胞%，其單核球%高的患者 A、B 與 D 中，透過使用塑膠貼壁法耗盡單核球 (CS) 所製備之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞的數目高於使用 G-Rex 時之數目（表 4）。相反，單核球耗盡未顯著升高患者 C 中 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞之數目，如相比 CD3 ⁺細胞%，此患者之單核球 % 低（表 4），這提示單核球耗盡可能在產生高數目經工程化之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞時因使用具有高單核球% 之 PBMC 而更有益。圖 10B 顯示透過 CS 所製備之從患者 A-D 獲得之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞的平均數目高於使用 G-Rex 時之平均數目。圖 10C 顯示透過 CS 所製備之從患者 A-D 獲得之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞的平均 % 高於使用 G-Rex 時之平均 %。未轉導之T細胞 (NT) 充當對照。

用單核球耗盡所生成的製品中初始T細胞之頻率較高

圖 11A 顯示透過使用塑膠貼壁法耗盡單核球 (CS) 所製備之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞含有比使用 G-Rex 所製備者更高 % 呈 CD45RA ⁺與 CD28 ⁺之細胞及更低 % 呈 CD45RO ⁺之細胞，這顯示透過使用 CS 生成之初始T細胞比使用 G-rex 時更多。一致地，圖 11B 顯示透過使用 CS 所製備之 TCR ⁺CD8 ⁺T 含有比使用 G-Rex 所製備者更高 % 之初始T細胞。

單核球耗盡不影響T細胞產品之功能

爲確定單核球耗盡對T細胞產品功能性之影響，比較透過 CS 與 G-rex 產生之T細胞產品的細胞殺傷活性。從表 4 中所列患者 (n =4) 中獲得、使用塑膠貼壁法 (CS) 與 Grex 透過單核球耗盡所製備之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞按 E:T = 3:1 經歷 IncuCyte 殺傷測定法。靶細胞 (T)，例如，UACC257（人皮膚黑素瘤）呈遞標靶肽/MHC 分子複合體於細胞表面上。T 細胞中經轉導之 TCR 可以結合標靶肽/MHC 分子複合體並且殺傷 UACC257 細胞。圖 12A 顯示透過使用 CS 所製備之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞的細胞殺傷活性跟使用 Grex 所製備者相當。透過測量圖 12A 之曲線下面積 (AUC) 進一步定量細胞殺傷活性。圖 12B 顯示透過使用 CS 及 Grex 所製備的 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞之間細胞殺傷活性無顯著差異。此等結果表明，單核球耗盡可能不影響T細胞產品之功能性。（ns = 使用單因素方差分析 (one-way ANOVA) 連同 Sidak 多重比較檢驗時，不顯著）。

進一步，發明人在生成自單核球經耗盡之 PMBC 群體的產品中發現較高頻率的初始T細胞，例如 CD45RA ⁺細胞、CD28 ⁺細胞，及減少的 CD45RO ⁺細胞。另外，免疫檢查點抑制蛋白標誌物表現亦在從單核球耗盡之 PMBC 群體產生的產物中減少。圖 7.這導致耗盡之細胞寥寥無幾及T細胞產品更好。進一步，單核球耗盡方法不影響T細胞免疫療法產品之功能性。

簡言之，如相比於 Grex 靜息條件，細胞棧 (CS) 靜息條件可以改善擴充倍數與轉導效率並且顯著改善 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞之產率。另外，經細胞棧 (CS) 靜息之細胞可以具有顯著更多的初始細胞及更少的耗盡細胞；同時未觀察到對腫瘤殺傷能力之負面影響。

患者合併資料顯示單核球耗盡後收穫時 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞之產率改善

所有患者資料（n=13 及 n =4 種優化條件）顯示收穫時 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞之產率改善。圖 8.對資料之更詳細分析顯示，13 位患者中，7 位患者顯示產率升高 (54%)，2 位患者顯示無變化 (15%) 並且 4 位患者顯示產率降低 (31%)。當考慮優化與非優化時，4 位優化試驗患者中 3 者顯示產率升高 (75%) 而 9 位非優化試驗患者中僅 4 者顯示產率升高 (45%)。此資料表明，優化之靜息條件與擴充條件組合顯示T細胞產率升高最大。發明人發現，本文所述的單核球耗盡方法可以成功地放大，同時未負面影響T細胞產率或T細胞產品之品質。

具有高單核球頻率之患者因使用優化之靜息條件與擴充條件耗盡單核球而受益最大。

爲了確定患者 PBMC 中存在之單核球% 對使用 CS 與 Grex 所製備之T細胞產品的影響，靜息前單核球 % 比照從使用 Grex 所獲得之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞倍數變化與從使用 CS 所獲得者來測量。圖 13A 顯示靜息前所有患者中存在的較高單核球 % 跟 CS 相對于 Grex 的較高倍數變化相關 (r ²= 0.35)。圖 13B 顯示靜息前僅條件經優化之患者中存在的較高單核球 % 跟 CS 相對于 Grex 的較高倍數變化相關 (r ²= 0.79)。圖 13C 顯示靜息前測量之僅條件未經優化之患者中存在的較高單核球 % 跟 CS 相對于 Grex 的較高倍數變化相關 (r ²= 0.28)。此等結果表明可能僅在條件經優化下單核球頻率高的患者中才更好地預測到 Grex 上 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞高倍數變化（圖 13B）。總體上，靜息期間耗盡貼壁細胞群體導致收穫時 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞產率改善（升高 1.44 倍，n = 13）。使用優化之靜息條件與擴充條件導致 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞產率改善更顯著（升高 1.96 倍，n =4）。圖 13D 顯示起始材料中具有高單核球頻率（＞25% 單核球）之患者似乎因使用優化之靜息條件與擴充條件耗盡單核球而受益最大。

使用優化之塑膠貼壁法時高效及可放大的單核球耗盡

貼壁群體耗盡可以從瓶貼壁群體耗盡可以從瓶放大到細胞棧用於 GMP。例如，圖 14A 顯示 2 小時靜息（3、4、5）導致比 4 小時（2、6、7、8）更高效之單核球耗盡。0.5 與 0.8 x 10 ⁶/cm ²接種密度導致耗盡效率相當（4 對 5 與 7 對 8）。另外，細胞棧 (CS) 靜息之細胞中單核球耗盡效率似乎跟瓶中者相當。如相比從藉助 CS 靜息 4 小時（單核球時爲 6 小時且T細胞時爲 6 小時）所獲得者，藉助 CS 靜息 2 小時似乎具有更好之單核球耗盡效率（單核球時爲 3）並且獲得更高之T細胞產量（T 細胞時爲 3）。圖 14B 顯示 Cellstack (CS) 靜息之細胞中 TCR ⁺CD8 ⁺細胞產率似乎跟瓶相當。使用 Grex、CS 或瓶時，TCR ⁺CD8 ⁺細胞產率似乎在接種密度 0.5 與 0.8 x 10 ⁶/cm ²之間相當。

Corning® CellSTACK® 在靜息後降低單核球之頻率方面表現好於從其他廠商所獲得者。

圖 15 顯示如相比從其他廠商（例如從 Grex (1) (n = 4)、GBO (3) (n = 3)、VWR (4) (n = 4) 與 Nunc (5) (n = 4)）獲得者，Corning® CellSTACK® (2) (n = 4) 在單核球耗盡方面表現更好（如箭頭所示）。

使用細胞棧時單核球耗盡可放大

爲測定細胞生長表面漸增下單核球耗盡之效率，使用 Grex、Corning 1-棧層 (CellStack 1)（具有 636 cm² 細胞生長面積）、2-棧層 (CellStack 2)（具有 1,272 cm² 細胞生長面積）、5-棧層 (CellStack 5)（具有 3,180 cm² 細胞生長面積）、細胞貼壁增強型 (CellBIND®) 1-棧層 (CellStack 1) 與細胞貼壁增強型 (CellBIND®) 10-棧層 (CellStack 10)（具有 6,360 cm² 細胞生長面積）進行單核球耗盡及評價。圖 16 顯示，在靜息後，單核球 % 低於靜息前，但在使用 CellStack 1、CellStack 2、CellStack 5 與 CellStack 10 透過單核球耗盡所製備的T細胞之間相當。在靜息後，T 細胞 % 高於靜息前，但在使用 CellStack 1、CellStack 2、CellStack 5 與 CellStack 10 透過單核球耗盡所製備的T細胞之間相當。此等結果表明，增加細胞生長表面，例如，從 636 cm² 細胞生長面積 (CellStack 1) 增至 6,360 cm² 細胞生長面積 (CellStack 10)，可能未顯著影響單核球耗盡效率，從而提示使用細胞棧時單核球耗盡的可放大性。

爲測定細胞生長表面增長下髓系衍生抑制細胞 (MDSCs) 耗盡之效率，使用 Grex、Corning CellStack 1、CellStack 2、CellStack 5、細胞貼壁增強型 CellStack 1 (CellBIND®) 與細胞貼壁增強型 CellStack 10 (CellBIND®) 進行單核球耗盡及評估。圖 17 顯示，在靜息後，MDSC1 (CD124 ⁺CD14 ⁺CD3 ^-CD19 ^-CD56 ^-) % 與 MDSC2 (CD124 ⁺CD15 ⁺CD3 ^-CD19 ^-CD56 ^-) % 低於靜息前。MDSC7 (CD14 ^-CD15 ^-CD33hiCD3 ^-CD19 ^-CD56 ^-) % 從靜息前至靜息後降低，但如相比 MDSC1 與 MDSC2 而言程度較小。總之，此等結果表明使用細胞棧時，單核球耗盡可放大。

單核球耗盡對T細胞產品之影響

患者T細胞生產過程中單核球耗盡改進生產指標。圖 18A 顯示如相比無單核球耗盡下之頻率，單核球耗盡升高T細胞產品中 CD8 (CD8 ⁺CD3 ⁺)T細胞之頻率。圖 18B 顯示如相比無單核球耗盡下之轉導效率，單核球耗盡升高 CD8 (Dex ⁺CD8 ⁺)T細胞中外源 TCR 之轉導效率。圖 18C 顯示有或無單核球耗盡可能對T細胞產品擴充倍數有微小影響。

無血清轉導對T細胞產品之影響

在患者T細胞 GMP 規模生產班次中，從轉導步驟取消血清增强了載體整合及轉基因表現。圖 19A 顯示如相比血清存在下之轉導，無血清轉導升高T細胞產品中 CD8 (CD8 ⁺CD3 ⁺)T細胞之頻率。圖 18B 顯示如相比血清存在下之轉導，無血清轉導升高 CD8 (Dex ⁺CD8 ⁺)T細胞中外源 TCR 之轉導效率。圖 18C 顯示轉導時有或無血清可能對T細胞產品擴充倍數有微小影響。

應當理解，上述要素各自或者兩個或更多個要素一起也可以在異於上述類型之其他類型方法中找到有用之應用。在不作進一步分析下，前述內容將如此充分地揭示本公開之要點，從而其他人可以透過應用當前知識，便利地改編此要點用於各種應用，同時不遺漏以下特徵，所述特徵從現有技術觀點看，實際上構成所附請求項中所述之本公開之通用或具體態樣之必要特徵。前述實例僅透過舉例方式呈現；本公開內容之範圍僅受以下申請專利範圍限制。

圖 1描述單核球 (%) 與活化標誌物之相關性。N= 16 位患者。

圖 2A- 圖 2C描述了充當對照之 Grex PBMC NT（未轉導；指在 Grex 中靜息且未經 TCR 轉導之 PBMC）、Grex PMBC TCR（指在 Grex 中靜息且經 TCR 轉導之 PBMC）對比單核球富集 10%、30%、60% 或 80% 之 PBMC 群體的分組擴充倍數 (2A)（基於細胞總數擴充）、分組 TCR+ 頻率 (%) (2B) 及分組 TCR+ 細胞絕對數目 (2C)。

圖 3A-圖 3C 描述了靜息前與靜息後之細胞總計數 (3A)、回收百分數 (3B) 及細胞活力百分數 (3C)，而不同單核球百分數包括 60% 單核球。簡而言之，健康供體材料 (PBMCS) 在 Grex 或細胞棧 (CS)/瓶中分別靜息 4 小時或 2 小時。列爲『Grex 60% 單核球或 CS/瓶 60% 單核球』之條件指以增加之單核球如此人工接種之起始材料 (PBMC)，從而彼始材料中單核球頻率爲 60%。做到此點以模擬單核球含量高（一般高於 20%）的起始材料。靜息前指靜息前取得之細胞總計數（藉助細胞計數器進行）並且靜息後是靜息後取得之計數。

圖 4A- 圖 4B描述 NT、Grex、CS/瓶、Grex 60% 單核球及 CS/瓶 60% 單核球之擴充倍數 (4A) 與 TCR+ 細胞絕對計數 (4B)。簡而言之，健康供體材料 (PBMCS) 於 Grex 或細胞棧 (CS)/瓶中分別靜息 4 小時或 2 小時，隨後經歷生產製程（活化/轉導/擴充）並且在第 7 天收穫。圖 4A 描述從轉導至收穫時間之總細胞擴充倍數。每種條件（每位供體）8 x 10 ⁶個細胞經轉導並且 [收穫計數]/8 x 10 ⁶將產生總擴充倍數。圖 4B 顯示 TCR ⁺細胞絕對計數，其指呈四聚體陽性之 CD3 ⁺CD8 ⁺細胞總數。

經分組之資料，n=4，3 種供體細胞於 CS 中靜息並且 1 種供體細胞於瓶中靜息；收穫日指標。

圖 5A- 圖 5B描述靜息前後之殘餘群體。測量了陽性細胞、B 細胞、γδT細胞、單核球、自然殺手細胞與T細胞之百分數（對活細胞設門）(5A) 及 MDSC1 (CD124 ⁺/CD14 ⁺/CD3 ^–/CD19 ^–/CD56 ^–)、MDSC2 (CD124 ⁺/CD15 ⁺/CD3 ^–/CD19 ^–/CD56 ^–) 與 MDSC3 (CD14 ^–/CD15 ^–/CD33hiCD3 ^–/CD19 ^–/CD56 ^–) (5B)。

圖 6描述用細胞棧靜息的 CD8 ⁺T細胞之活化增長。將細胞對活 CD8 ⁺T細胞設門。CS = 使用塑膠貼壁法耗盡單核球並且 G-Rex = 對照。

圖 7説明用本文所述的單核球耗盡方法生成之產品中免疫檢查點抑制蛋白標誌物表現減少 (7A)。另外，CD39 ⁺/CD69 ⁺細胞減少及 CD39 ^–/CD69 ^–細胞增加 (7B)。

圖 8描述患者資料（n=13 及 n =4 位優化條件 #10-#13）顯示收穫時 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞之產率改善。Grex = 對照並且 CS/瓶 = 單核球被耗盡。

圖 9A顯示透過使用塑膠貼壁法耗盡單核球 (CS) 所製備之T細胞產品中從轉導至收穫的擴充倍數高於使用 G-Rex 時之擴充倍數。

圖 9B顯示透過使用塑膠貼壁法耗盡單核球 (CS) 所製備之T細胞產品中 CD8 ⁺細胞% 高於使用 G-Rex 時之百分數。

圖 10A顯示患者 A、B 與 D（其單核球% 高於 CD3 ⁺細胞%）中透過使用塑膠貼壁法耗盡單核球 (CS) 所製備之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞的數目高於使用 G-Rex 時之數目。

圖 10B顯示患者 A-D 中，透過 CS 所製備之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞的平均數目高於使用 G-Rex 時之平均數目。

圖 10C顯示患者 A-D 中，透過 CS 所製備之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞的平均 % 高於使用 G-Rex 時之平均 %。

圖 11A顯示透過使用塑膠貼壁法耗盡單核球 (CS) 所製備之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞含有比使用 G-Rex 所製備者更高 % 之 CD45RA ⁺細胞與 CD28 ⁺細胞及更低 % 之 CD45RO ⁺細胞。

圖 11B顯示透過 CS 所製備之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞含有比使用 G-Rex 所製備者更高 % 之初始T細胞。

圖 12A顯示透過 CS 所製備之 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞的腫瘤殺傷活性跟使用 Grex 所製備者相當。

圖 12B顯示透過 CS 及 Grex 所製備的 TCR ⁺CD8 ⁺T細胞之間細胞殺傷作用無顯著差異。

圖 13A顯示靜息前所有患者中存在的較高單核球 % 跟 CS 相對于 Grex 的較高倍數變化相關。

圖 13B顯示靜息前僅條件經優化之患者中存在的較高單核球 % 跟 CS 相對于 Grex 的較高倍數變化相關。

圖 13C靜息前測量之僅條件未經優化之患者中存在的較高單核球 % 跟 CS 相對于 Grex 的較高倍數變化相關。

圖 13D顯示具有高單核球頻率（＞25% 單核球）之患者似乎因使用優化之靜息條件與擴充條件耗盡此等單核球而受益最多。

圖 14A顯示 2 小時靜息導致比 4 小時靜息更高的單核球耗盡效率並且 0.5 與 0.8 x 10 ⁶/cm ²接種密度導致可比之耗盡效率。

圖 14B顯示細胞棧 (CS) 靜息之細胞中 TCR ⁺CD8 ⁺細胞產率似乎跟瓶可比。0.5 與 0.8 x 10 ⁶/cm ²接種密度似乎在轉導之細胞產率方面相當。

圖 15顯示如相比從其他廠商所獲得的單核球耗盡，Corning® CellSTACK® 表現更好。

圖 16顯示，在靜息後，單核球% 在使用細胞生長面積增長之細胞棧透過單核球耗盡所製備的T細胞之間相當。

圖 17顯示，在靜息後，MDSC% 在使用細胞生長面積增長之細胞棧透過單核球耗盡所製備的T細胞之間相當。

圖 18A顯示根據本公開之一個實施例，單核球耗盡對 CD8 ⁺T細胞頻率的影響。

圖 18B顯示根據本公開之一個實施例，單核球耗盡對轉導效率的影響。

圖 18C顯示根據本公開之一個實施例，單核球耗盡對擴充倍數的影響。

圖 19A顯示根據本公開之一個實施例，無血清轉導對 CD8 ⁺T細胞頻率的影響。

圖 19B顯示根據本公開之一個實施例，無血清轉導對轉導效率的影響。

圖 19C顯示根據本公開之一個實施例，無血清轉導對擴充倍數的影響。

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Claims

一種用於產生工程化T細胞群體之方法，包括：獲得包含單核球與T細胞之細胞群體，使所獲得細胞群體於表面上靜息，使單核球黏附於表面，保留未貼壁細胞群體，活化未貼壁細胞群體，向經活化之未貼壁細胞群體引入核酸，以獲得經轉化之T細胞，並且擴充經轉化之T細胞以獲得工程化T細胞群體。
如請求項 1 之方法，其中細胞群體包含周邊血單核細胞 (PMBC)。
如請求項 1 或 2 之方法，其中單核球包括 CD14 ⁺細胞。
如請求項 1-3 中任一項之方法，其中T細胞包括 αβT細胞及/或 γδT細胞。
如請求項 1-4 中任一項之方法，其中T細胞包括 CD8 ⁺T細胞及/或 CD4 ⁺T細胞。
如請求項 1-5 中任一項之方法，其中靜息進行 2-8 小時。
如請求項 1-6 中任一項之方法，其中靜息按 0.1 x 10 ⁶/cm ²– 2 x 10 ⁶/cm ²之接種密度進行。
如請求項 1-7 中任一項之方法，其中表面包括塑膠或玻璃。
如請求項 8 之方法，其中塑膠包括聚苯乙烯或聚碳酸酯。
如請求項 1-9 中任一項之方法，其中表面包括多個細胞生長區。
如請求項 10 之方法，其中多個細胞生長區按多重棧層形式配置。
如請求項 11 之方法，其中多重棧層包括至少 2、至少 3、至少 4、至少 5、至少 6、至少 7、至少 8、至少 9、至少 10、至少 15、至少 20、至少 25、至少 30、至少 35、至少 40、至少 45、至少 50 個棧層、至少 60 個棧層、至少 70 個棧層、至少 80 個棧層、至少 90 個棧層或至少 100 個棧層。
如請求項 10-12 中任一項之方法，其中多個細胞生長區包括至少 400 cm²、至少 500 cm²、至少 600 cm²、至少 700 cm²、至少 800 cm²、至少 900 cm²、至少 1,000 cm²、至少 2,000 cm²、至少 3,000 cm²、至少 4,000 cm²、至少 5,000 cm²、至少 6,000 cm²、至少 7,000 cm²、至少 8,000 cm²、至少 9,000 cm²、至少 10,000 cm²、至少 20,000 cm²、至少 30,000 cm²、至少 40,000 cm² 或至少 50,000 cm²。
如請求項 1-13 中任一項之方法，其中活化在抗 CD3 抗體與抗 CD28 抗體存在下進行。
如請求項 1-14 中任一項之方法，其中核酸編碼重組蛋白。
如請求項 15 之方法，其中重組蛋白是嵌合抗原受體 (CAR)、T 細胞受體 (TCR)、細胞介素、抗體或雙特異性結合性分子。
如請求項 16 之方法，其中重組蛋白是 TCR。
如請求項 17 之方法，其中 TCR 結合跟 MHC 分子複合的肽。
如請求項 18 之方法，其中肽爲選自 SEQ ID NOS: 1-161 中之一者。
如請求項 18 或 19 之方法，其中 MHC 分子是 MHC I 類分子。
如請求項 1-20 中任一項之方法，其中細胞群體包含至少 25% 單核球。
如請求項 1-21 中任一項之方法，其中未貼壁細胞群體是單核球經剝奪之細胞群體。
如請求項 1-22 中任一項之方法，其中細胞群體亦包含髓系衍生抑制細胞 (MDSC)。
如請求項 23 之方法，其中 MDSC 是 CD124 ⁺/CD14 ⁺/CD3 ^–/CD19 ^–/CD56 ^–細胞、CD124 ⁺/CD15 ⁺/CD3 ^–/CD19 ^–/CD56 ^–細胞及/或 CD14 ^–/CD15 ^–/CD33hiCD3 ^–/CD19–/CD56 ^–細胞。
如請求項 23 或 24 之方法，其中 MDSC 黏附於表面。
組成物，包含透過請求項 1-25、29 與 30 中任一項之方法產生的工程化T細胞群體。
在患有癌症之患者中激發免疫應答之方法，包括向患者投予請求項 26 之組成物，其中癌症是肝細胞癌、結直腸癌、膠質母細胞瘤、胃癌、食管癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、腎細胞癌、良性攝護腺增生、攝護腺癌、卵巢癌、黑素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病、Merkel 細胞癌、小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性髓樣白血病、膽囊癌與膽管癌、膀胱癌、急性淋巴球白血病或子宮癌。
治療患有癌症之患者的方法，包括向患者投予請求項 26 之組成物、其中癌症是肝細胞癌、結直腸癌、膠質母細胞瘤、胃癌、食管癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、腎細胞癌、良性攝護腺增生、攝護腺癌、卵巢癌、黑素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病、Merkel 細胞癌、小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性髓樣白血病、膽囊癌與膽管癌、膀胱癌、急性淋巴球白血病或子宮癌。
如請求項 1-25 中任一項之方法，其中在有或無血清下向經活化之未貼壁細胞群體引入核酸。
如請求項 29 之方法，其中在有血清下向經活化之未貼壁細胞群體引入核酸。
如請求項 1-25、29 與 30 中任一項之方法，其中核酸進一步編碼 CD8αβ 異二聚體或 CD8α 同型二聚體。
如請求項 31 之方法，其中 CD8α 包含選自 SEQ ID NO: 163-166 之胺基酸序列並且 CD8β 包含選自 SEQ ID NO: 167-173 之胺基酸序列。
如請求項 1-25 與 29-32 中任一項之方法，其中核酸進一步編碼土撥鼠肝炎病毒轉錄後反應元件 (WPRE)，所述反應元件包含選自 SEQ ID NO: 174-176 之核苷酸序列。