JP2024517968A - 幹細胞からの操作されたｔ細胞の産生 - Google Patents

Abstract

本開示は、ｅｘ ｖｉｖｏ 製造時間が短縮されたＴ細胞を産生するための方法を提供する。特に、本開示は、造血幹細胞からのＴ細胞の産生を含むが、ただし、このプロセスは、Ｔ細胞の活性化および／または拡大のその後のｉｎ ｖｉｔｒｏ工程を含まないことを条件とする。本開示は、短縮されたｅｘ ｖｉｖｏ製造プロセスを用いて多数のＴ細胞を迅速かつ効率的に産生するための費用効果の高いシステムおよび方法を提供する。特に、本開示は、ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞活性化工程を行うことなく、幹細胞（例えば、造血幹細胞）からＴ細胞を産生するための方法を提供する。この工程を省略することにより、細胞培養工程の期間が大幅に短縮される。

Description

関連出願
本出願は、２０２１年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１８８，８６８号に基づく利益および優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本開示は、幹細胞からのＴ細胞の産生に関する。

背景
同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、癌処置を一変させる可能性を有する。ドナー由来の予め作製されたＣＡＲ Ｔ細胞の使用は、癌処置を患者に直ちに利用可能にし、複数の標的に対するＣＡＲ Ｔ細胞の再投与または併用の機会を提供する。このように、救命処置は、疾患進行の初期段階で利用可能であり、寛解の可能性を向上させる。

その可能性にもかかわらず、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の商業的生存率については、いくつかの重要な課題が残っている。現在、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の製造は、費用がかかり、高い生成物変動性を受けやすい長時間のｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養手順を伴う。さらに、長期間のｅｘ ｖｉｖｏ培養は、あまり特徴付けられておらず、治療有効性に有害である可能性がある表現型変化に関連する。安全で効果的なＴ細胞を確実かつ経済的に産生する製造プロセスが開発されない限り、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞療法の可能性は臨床応用に決して変換されない。

要旨
本開示は、短縮されたｅｘ ｖｉｖｏ製造プロセスを用いて多数のＴ細胞を迅速かつ効率的に産生するための費用効果の高いシステムおよび方法を提供する。特に、本開示は、ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞活性化工程（複数可）を行うことなく、幹細胞（例えば、造血幹細胞）からＴ細胞を産生するための方法を提供する。この工程を省略することにより、細胞培養工程の期間が大幅に短縮される。したがって、本発明の製造プロセスは、培養中のＴ細胞の維持に一般的に必要とされる消耗品を含む、より費用がかからない消耗品を使用してＴ細胞を産生する。さらに、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養の期間を短縮することによって、本発明の方法は、Ｔ細胞産生中に表現型変化が起こる機会を最小限にする。したがって、本発明の本開示のシステムおよび方法は、バッチ間変動性を低減し、本発明に従って産生されたＴ細胞の治療有効性を改善する。したがって、本発明の方法は、表現型的に優れ、したがって、既存の方法を使用して産生されたものと比較して臨床用途においてより効果的なＴ細胞を産生するための迅速かつ対費用効果の高いアプローチを提供する。

本発明の方法は、既製のＣＡＲ－Ｔ細胞産物の経済的産生に有用である。従来のＴ細胞製造方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞活性化を含む。Ｔ細胞活性化は、少なくとも２つの刺激シグナル：ＴＣＲ複合体の活性化のための第１のシグナル（例えば、抗ＣＤ３）、ならびに細胞増殖、分化および生存のための第２のシグナル（例えば、抗ＣＤ２８）の導入を必要とする。ｅｘ ｖｉｖｏ活性化後、細胞は増殖し、細胞維持のために数週間の高価な試薬を必要とする。本発明の洞察は、ｅｘ ｖｉｖｏ活性化および／または拡大を、同種移植後に標的細胞によって供給されるｉｎ ｖｉｖｏ活性化および／または拡大と置き換えることができることである。有利には、ｅｘ ｖｉｖｏ活性化および／または拡大を省略することによって、Ｔ細胞は、有意に少ない培養時間に供され、これにより、製造に関連するコストが削減され、他の方法よりも速い速度でより高品質の細胞産物が産生される。

さらに、これらの方法は、長期の細胞傷害効果を有するＴ細胞を産生することができる。長期の細胞培養は、特定の細胞型の転写および表現型の変化に関連している。培養中のＴ細胞の転写および表現型変化はあまり特徴付けられていないが、本開示は、長期培養中の細胞の意図しない変化が治療有効性および製品バッチ変動性の観察された減少の原因となり得ることを認識している。例えば、Ｔ細胞の長期の細胞培養は、エフェクター機能の喪失を反映する高レベルの疲弊マーカーを生じ得る。ｅｘ ｖｉｖｏ製造を短縮することによって、本発明の方法は、治療上有効なＴ細胞の一貫した産生に有用である。

一態様では、本開示は、Ｔ細胞を産生する方法を提供する。この方法は、造血幹細胞（ＨＳＣ）のＴ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および成熟を含むプロセスを行うことを含むが、ただし、このプロセスは、Ｔ細胞の活性化および／または拡大のその後のｉｎ ｖｉｔｒｏ工程を含まないことを条件とする。むしろ、Ｔ細胞の活性化および／または拡大は、好ましくは、対象への導入後にｉｎ ｖｉｖｏで起こる。

有利には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化および／またはＴ細胞拡大を省略することにより、従来のＴ細胞製造プロセスから数週間（例えば、少なくとも２週間）が節約され、これは増強された細胞傷害効果を有するＴ細胞を産生するのに有用であり得る。

幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は、細胞老化に耐性である顕著な自己再生能力および多能性能力を示す。本発明の方法は、幹細胞の能力を活用して、最適な治療表現型を有するＴ細胞を産生する。好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＨＳＣに少なくとも１つのＴＣＲおよび／または１つのＣＡＲを発現させることを含むｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスを含む。少なくとも１つのＴＣＲおよび／またはＣＡＲの発現は、細胞に一定の有利な治療能力を付与する。幹細胞は、好ましくは、前駆細胞に由来し得るＨＳＣである。例えば、前駆細胞は、多能性幹細胞であり得る。場合によっては、体液（羊水または臍帯液等）から得られるＨＳＣ。

本発明の方法において幹細胞（例えば、ＨＳＣ）を使用する利点としては、再生および拡大に対するそれらの能力が挙げられる。同種細胞療法は、単回用量の処置のために数十億個の細胞を必要とすることが多い。幹細胞の拡大能力には限りがない可能性があるため、本発明の方法は、大規模に高品質の細胞産物を産生し、それらの産物を処置に迅速に利用可能にするのによく適している。さらに、幹細胞の特徴は、様々な細胞型に分化する能力である。本開示の文脈において、分化能は、広範囲のＴ細胞サブタイプを産生し得る細胞製造プラットフォームを提供する。

本発明の方法は、幹細胞をダブルネガティブ前駆Ｔ細胞に分化させることを含み得る。ダブルネガティブ前駆Ｔ細胞は、一般に共受容体ＣＤ４およびＣＤ８の発現を欠く細胞を含む。方法は、ＣＤ４およびポジティブＣＤ８ポジティブＴ細胞を産生するために、ダブルネガティブ前駆細胞をサイトカインおよび／またはケモカインのカクテルで処置することを更に含み得る。

従来の培養実務は複雑であることが多く、ヒューマンエラーに敏感な多くの取り扱い工程を伴い、Ｔ細胞療法の全体的な再現性および有効性を損なう。ｅｘ ｖｉｖｏではなくｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞活性化を実施すると、取り扱い工程の数が大幅に減少し、製造時間が短縮され、ヒューマンエラーの機会が最小限に抑えられる。例えば、いくつかの従来の製造方法は６週間またはそれを超えて必要とするが、本発明の方法は、臨床使用のために５週間未満、例えば３週間または４週間以内にＴ細胞を産生する。したがって、本発明の方法は、現在必要とされているおよそ半分の時間で既製の治療用のための細胞産物を産生し得る。時間の短縮は、実質的なコスト削減の利益を提供し、検討されるように、バッチ間のセル間のばらつきを少なくし得る。

場合によっては、養子Ｔ細胞療法の投与は、数十億のＴ細胞を必要とする。したがって、本開示の特定の方法によるＴ細胞の大規模産生は、Ｔ細胞を拡大させることを含み得る。Ｔ細胞の拡大は、Ｔ細胞を１またはそれを超えるサイトカイン、例えば、１またはそれを超えるＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１もしくはＩＬ－１８、またはそれらの任意の組み合わせで処置することを含み得る。例えば、培地はＩＬ－７／１５の組み合わせを含有し得る。いくつかの実施形態では、培地はＩＬ－１５のみを含有する。

本発明の方法は、安全で有効な同種異系療法を製造するのに有用である。場合によっては、方法は、製品品質を確保するために、製造中の１またはそれを超える時点で細胞産物を特性評価することを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞を分析して、Ｔ細胞によって発現される１またはそれを超えるタンパク質を同定することを含む。１またはそれを超えるタンパク質は、１またはそれを超えるＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、またはＣＤ４５ＲＡを含み得る。タンパク質は、ナイーブ幹細胞に関連するマーカーを含み得る。Ｔ細胞を分析することは、好ましくは、細胞表面タンパク質を分析するハイスループット法、例えば、ＦＡＣＳ等のバルク中の個々の細胞の蛍光シグナルに基づく方法を含む。

オンデマンドで処置が利用可能であることは、同種細胞療法の１つの利点である。方法は、臨床適用前の細胞の製造を含み得るため、いくつかの好ましい方法は、Ｔ細胞を凍結保存することを含み得る。Ｔ細胞を凍結保存することは、患者が必要とするまで細胞を安全かつ効果的に保存するのに有用である。凍結保存はまた、患者に投与することができる臨床施設への細胞産物の輸送にも有用である。

本開示は、幹細胞からの治療用Ｔ細胞の経済的産生に有用なプラットフォームを提供する。プラットフォームは、任意のタイプのＴ細胞を産生するために使用され得る。しかしながら、好ましくは、Ｔ細胞は、インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であり、これは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の症例の減少に関連する。ｉＮＫＴ細胞は、アルファ／ベータｉＮＫＴ細胞またはガンマ／デルタＮＫＴ細胞を含み得る。場合によっては、細胞は、ＴＣＲおよび／またはＣＡＲに加えて１またはそれを超える導入遺伝子を含むようにプログラムされる。１またはそれを超える追加の導入遺伝子は、少なくとも１つのサイトカイン、チェックポイント阻害剤、トランスフォーミング増殖因子ベータシグナル伝達の阻害剤、サイトカイン放出症候群の阻害剤、または神経毒性の阻害剤を含み得る。サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８またはＩＬ－２１のうちの１つを含み得る。

別の態様では、本開示は、単一の活性化工程を使用してＴ細胞産物を産生する方法を提供する。本方法は、１つ以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化工程を用いて、Ｔ細胞へのＨＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および成熟を含むプロセスを行うことと、処置または研究用途で使用するためにＴ細胞を提供することと、を含む。Ｔ細胞製造の従来の方法は、少なくとも２つの別個のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化工程を必要とし、これは最大２～４週間のｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養時間を要し得る。有利には、単一の活性化工程を使用してＴ細胞産物を産生することにより、細胞培養の時間が短縮され、細胞疲弊に関連するマーカーがより少ないＴ細胞が得られる。

したがって、いくつかの実施形態は、単一の活性化工程でＴ細胞を製造することを含み得る。単一の活性化工程は、活性化培地、例えば抗体等のＴ細胞活性化試薬を含む培地中でＴ細胞を培養することによって実施することができる。好ましくは、単一の活性化工程は、活性化プロセス中に活性化試薬の種類を変更することを含まない。Ｔ細胞活性化工程は、７日間またはそれ未満継続する場合がある。

場合によっては、単一の活性化工程は、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）ベースのＴ細胞活性化を含む。したがって、活性化工程は、アルファ－ガラクトシルセラミド（ａＧＣ）担持ＰＢＭＣ、可溶性抗ＣＤ３／２８ポジティブＰＢＭＣ、および可溶性抗ＣＤ２／３／２８ポジティブＰＢＭＣの細胞培養を含み得る。場合によっては、活性化工程は、抗原提示細胞（ａＡＰＣ）ベースのＴ細胞活性化工程を含む。したがって、活性化工程はａＡＰＣを含むことができる。ａＡＰＣは好ましくは照射される。ａＡＰＣは、ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－ＣＡＲ抗原を発現する操作されたＫ５６２細胞であり得る。ａＡＰＣは、ａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄおよび／またはａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄ＋／－ａＧＣであり得る。他の例では、活性化工程はフィーダーフリーベースのＴ細胞活性化工程を含む。フィーダーフリーベースのＴ細胞活性化工程は、可溶性活性化抗体、例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２／３／２８、ＣＤ３／２８を導入することを含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、１またはそれを超えるＩＬ－７／１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２＋２１、ＩＬ－１２またはＩＬ－１８を含む培養培地を含む。
図面の簡単な説明

図１は、Ｔ細胞の製造方法を示す。

図２は、３つの異なるプロセスによるｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞製造の段階を示す。

図３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞を産生するための２つのプロセスの比較を提供する。

図４は、Ｔ細胞を産生するための本発明の方法において使用される工程を概説するワークフローを示す。

図５Ａ～図５Ｂは、本発明の方法によるＴ細胞の産生を示す結果を提供する。

図６は、本発明の方法によるＴ細胞の産生を示す結果を提供する。

図７Ａ～図７Ｂは、本発明の方法によるＴ細胞の産生を示す結果を提供する。

詳細な説明
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の臨床試験は、Ｂ細胞悪性腫瘍等の特定の病状の処置において顕著な結果を示す。しかしながら、現在、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を伴う商業的方法は、その広範な使用が非一時的な生成に伴う物流および高いコストによって制限される自己ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、患者の処置に直ちに利用可能な予め作製された細胞ストックを提供することによって、自己細胞の限界に対処する。しかし、その可能性にもかかわらず、治療上有効な同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の一貫した産生のための方法は確立されていない。ほとんどのプロトコルは、例えば、少なくとも２つの活性化工程を有する長期間のｅｘ ｖｉｖｏ培養を必要とし、これは潜在的に過分化、Ｔ細胞疲弊および／または細胞老化をもたらし、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を損なう。参照により組み込まれる、Ｊａｆａｒｚａｄｅｈ，２０２０，Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｔ Ｃｅｌｌ ｉｎ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ Ｗａｙｓ Ｆｏｒｗａｒｄ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１（７０２）：１－１７を参照されたい。

本開示は、改善された表現型および細胞機能を有するＴ細胞を製造するための信頼できる方法を提供する。本発明は、既存の方法と比較して短縮されたｅｘ ｖｉｖｏ培養時間を使用してＴ細胞を製造するための方法を含む。本発明の特定の方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ活性化を省略することによってｅｘ ｖｉｖｏ培養を減少させ、それにより、全体的なｅｘ ｖｉｖｏ製造プロセスを最大２～３週間減少させる。本発明の代替方法は、単一の活性化工程を提供する。本発明のこれらの方法の両方の変形は、長時間の活性化および／または拡大プロセスが、対象への投与後にｉｎ ｖｉｖｏで起こり得ることを認識している。ｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養を短縮することによって、本発明の方法は、Ｔ細胞産生中に転写および／または表現型変化が起こる機会を最小限に抑え、それによって細胞間変動性を低下させ、それらの治療有効性を制限する。さらに、ｅｘ ｖｉｖｏ培養時間の短縮は、Ｔ細胞維持に必要な高価な細胞培養消耗品の量を減少させる。

本発明はまた、単一の活性化工程でＴ細胞産物を作製するための多段階方法またはワークフローを含む。驚くべきことに、これらの方法／ワークフローは、１つ以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化工程を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化およびＴ細胞へのＨＳＣの成熟を含むプロセスを行うことを含み得る。得られたＴ細胞産物は、処置または研究のために使用され得る。

Ｔ細胞製造の従来の方法は、少なくとも２つの別個のイｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化工程を必要とする。これらの複数の活性化工程は、一般に、複数の培地タイプ、すなわち異なる活性化因子を含有する異なる培地を含む。有利には、複数の活性化工程を必要とする既存の方法と比較して、単一の活性化工程を使用してＴ細胞を産生し、細胞培養の全時間を短縮し、Ｔ細胞疲弊に関連するより少ないマーカーを発現するより効果的なＴ細胞産物を産生する本発明の新規方法。

本発明の方法は、より少ないｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養（複数可）または培養時間でＴ細胞産物を産生するために使用され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養を減少させることによって、本発明の方法は、より速く、より効果的であり、より少ない疲弊／機能不全Ｔ細胞を含有するＴ細胞産物を産生する。これらのＴ細胞産物は、２またはそれを超えるＴ細胞活性化工程によって産生されたＴ細胞よりも、Ｔ細胞疲弊に関与する低レベルのタンパク質（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ）を発現し得る。Ｔ細胞産物はまた、より高レベルのＩＬ－２を発現し得る。

特定の実施形態は、Ｔ細胞を産生するための多段階プロセスを含み、工程のうち１つのみがＴ細胞活性化工程である。単一の活性化工程は、例えば、活性化培地、例えば抗体等のＴ細胞活性化試薬を含む培地中でＴ細胞を培養することによって実施され得る。

本発明の特定の方法では、活性化工程は、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）ベースの活性化を含む。ＰＭＢＣに基づく活性化は、Ｔ細胞をアルファ－ガラクトシルセラミド（ａＧＣ）担持ＰＢＭＣ、可溶性抗ＣＤ３／２８ポジティブＰＢＭＣ、および可溶性抗ＣＤ２／３／２８ポジティブＰＢＭＣに導入することを含み得る。

特定の態様では、活性化工程は、抗原提示細胞（ａＡＰＣ）ベースのＴ細胞活性化工程の使用を含む。したがって、活性化工程は、Ｔ細胞をａＡＰＣに導入することを含み得る。好ましくは、使用される場合、ａＡＰＣは照射される。好ましい態様では、ａＡＰＣは、ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－ＣＡＲ抗原を発現する操作されたＫ５６２細胞であり得る。ａＡＰＣは、ａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄおよび／またはａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄ＋／－ａＧＣであり得る。

特定の態様では、活性化工程はフィーダーフリーベースのＴ細胞活性化工程を含む。フィーダーフリーベースのＴ細胞活性化工程は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２／３／２８、ＣＤ３／２８を含む可溶性抗体をＴ細胞に導入することを含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、１またはそれを超えるＩＬ－７／１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２＋２１、ＩＬ－１２またはＩＬ－１８を含む培養培地を使用する。いくつかの実施形態では、培地はＩＬ－１５を含有する。

本発明の方法は、増強された抗腫瘍活性を有するＴ細胞を産生するために使用され得る。本開示は、ＴＣＲ、ＣＡＲ、および少なくとも１つの追加の導入遺伝子を含む複数の導入遺伝子が組み込まれた幹細胞（例えば、ＨＳＣ）からＴ細胞を産生するためのシステムおよび方法を提供する。幹細胞からの産生プロセスを開始することによって、本発明のシステムおよび方法は、「より若い」表現型および増強された抗腫瘍活性を有するＴ細胞の製造のための自己再生能力および細胞分化能力を利用する。特に、本開示は、少なくとも１つのＴＣＲ、ＣＡＲ、および少なくとも１つの追加の導入遺伝子をコードする、ＣＤ３４ポジティブ幹細胞への核酸の導入を提供する。ＴＣＲおよびＣＡＲと追加の導入遺伝子との組み合わせ発現は、癌を処置するのに有用な特定の癌細胞標的化特性をＴ細胞に提供するのに有用である。

図１は、Ｔ細胞を産生するための方法１０１を示す。特に、本発明の態様によるＴ細胞を産生するための方法の一般的概要を提供するための単純なフロー図が示される。方法１０１は、１０５個の幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞）を得ることと、幹細胞に１またはそれを超える核酸（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ、および追加の導入遺伝子をコードする）を導入する１０９ことと、Ｔ細胞を産生するために幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および成熟を行う１１１ことと、Ｔ細胞活性化工程を実施せずに（例えば、同種療法または研究のために）細胞を提供する１１３ことと、を含む。

方法１０１は、１０５個の幹細胞を得ることを含む。好ましくは、細胞はＣＤ３４＋細胞である。１つの非限定的な例において、ＣＤ３４＋幹細胞は、造血幹細胞／前駆細胞である。造血幹細胞または前駆細胞は、造血と呼ばれるプロセスにおいて他の血液細胞を生じさせる幹細胞である。

造血幹細胞／前駆細胞は、健康なドナーから得られ得る。造血幹細胞／前駆細胞は、例えば、骨髄、末梢血、羊水または臍帯血から得られ得る。造血幹細胞／前駆細胞は、臍帯の端部をクランプし、クランプされた端部の間から血液を針で吸引することによって、臍帯血から得てもよい。造血幹細胞／前駆細胞は、ポジティブ免疫磁気分離技術を用いて臍帯血から単離されてもよく、クエン酸－リン酸－デキストロース（ＣＰＤ）が抗凝固剤として臍帯血に添加され得る。臍帯血からの細胞は凍結保存され、使用するまで例えば－８０℃の温度で保存され得る。

本開示の方法を実施する際に、幹細胞を得ること１０５は、好ましくは、造血幹細胞／前駆細胞を含む凍結保存ＣＤ３４＋臍帯血細胞のバイアルを受け取ることを含む。凍結保存された臍帯血細胞のバイアルは、例えばドライアイス上の断熱容器内の細胞バンクから受け取ってもよい。

凍結保存された臍帯血細胞のバイアルは、当技術分野で公知の方法に従って解凍され得る。例えば、バイアルを３７度の水浴に約１～２分間入れることによって、細胞のバイアルを解凍してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、細胞が解凍されると、形質導入効率を高めるためにウイルスと標的細胞との共局在化を促進する試薬で予めコーティングされた組織培養皿に細胞をプレーティングする。

ＣＤ３４＋細胞は、標準的な６ウェルディッシュに、例えば、１０，０００細胞／ウェル、１５，０００細胞／ウェル、または２０，０００細胞／ウェル、または２５，０００細胞／ウェル、またはそれを超えてプレーティングされ得る。好ましくは、細胞はウェルあたり１５，０００細胞でプレーティングされる。

方法１０１は、１またはそれを超えるＴＣＲ、ＣＡＲ、および／または追加の導入遺伝子をコードする１またはそれを超える核酸をＣＤ３４＋幹細胞に導入すること１０９を更に含む。好ましくは、１またはそれを超える核酸は、ＴＣＲ、ＣＡＲ、または追加の導入遺伝子のうちの少なくとも２つをコードする。例えば、いくつかの実施形態では、幹細胞に導入１０９される１またはそれを超える核酸は、少なくともＴＣＲおよびＣＡＲをコードして、癌細胞の表面に発現される特定のタンパク質を標的とすることができるＴ細胞を産生する。他の実施形態では、幹細胞に導入１０９された１またはそれを超える核酸は、ＴＣＲ、ＣＡＲ、および追加の導入遺伝子のそれぞれをコードする。

好ましい実施形態では、核酸を介して導入されるＴＣＲはｉＮＫＴ ＴＣＲである。ｉＮＫＴ ＴＣＲは、ｉＮＫＴ細胞受容体のアルファ鎖、ｉＮＫＴ細胞受容体のベータ鎖の一方または両方を含み得る。好ましくは、ｉＮＫＴ細胞受容体は、幹細胞がアルファ－ガラクトシルセラミドを認識するように幹細胞によって発現される。さらに、好ましい実施形態は、少なくとも１つのＣＡＲをコードする核酸を導入することを含み得る。ＣＡＲは、後述するように、第１世代のＣＡＲ、第２世代のＣＡＲ、または第３世代のＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、癌に関連する抗原に特異的な受容体を細胞に提供し得る。例えば、いくつかの実施形態では、抗原はメソテリン、グリピカン３、ＣＤ１９またはＢＣＭＡのうちの１つを含む。

本発明の方法によって産生されるＴ細胞は少なくとも１つの追加の導入遺伝子を発現するように遺伝子改変され得る。導入遺伝子は、例えば、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、トランスフォーミング増殖因子ベータシグナル伝達の阻害剤、サイトカイン放出症候群の阻害剤、または神経毒性の阻害剤のうちの１つであり得る。したがって、本発明の方法は、エフェクター機能が増強されたＴ細胞を産生するのに有用であり得る。

例えば、場合によっては、本発明の方法は、１またはそれを超えるＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１－１５をコードする導入遺伝子の導入によって提供される、拡大および持続能力が改善されたＣＡＲ Ｔ細胞の製造に有用である。場合によっては、方法は、例えば、１またはそれを超えるＩＬ－１２、ＩＬ－１８をコードする導入遺伝子の導入によって、ＣＡＲ Ｔ細胞にＩＦＮ－ｇ産生の増加、したがってＴ細胞効力の改善をもたらし得る。場合によっては、本発明の方法は、ＩＬ－２１を含む導入遺伝子を導入することによってナイーブＴ細胞産生を増強するのに有用である。場合によっては、本明細書に記載される方法は、例えば、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦまたはサイトカイン放出症候群および神経毒性の他のメディエーターの阻害剤を導入することによって、安全性が改善されたＣＡＲ Ｔ細胞の産生を提供する。方法は、例えば、ＴＧＦ－Ｂの阻害剤、チェックポイントの阻害剤を介して、腫瘍微小環境に対抗するのに有用なペイロードを提供することによって、改善された有効性を有するＣＡＲ Ｔ細胞を提供し得る。

幹細胞への１またはそれを超える核酸の導入１０９は、ウイルス形質導入法または非ウイルストランスフェクションによって達成され得る。場合によっては、例えば、１またはそれを超える核酸を導入するための方法は、例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン／トランスポーゼシステムを使用する非ウイルス法を含む。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムは、正確に定義されたＤＮＡ配列を細胞の染色体に導入するように設計された合成ＤＮＡトランスポゾンを含む。このシステムは、トランスポザーゼが複数の不活性な魚配列から復活した、Ｔｅｌ／マリナー型システムを使用する。有利には、非ウイルス（ｎｏｎ－ｖｉａｌ）法は、費用節約の利益を提供し、特定のウイルスの使用に関連するリスクを低減し得る。しかしながら、非ウイルス法は、効率の低下に関連し得る。したがって、好ましい実施形態は、ウイルス形質導入によって、例えばレトロウイルスを介して、核酸を幹細胞に導入する。

ウイルス形質導入方法は、その汎用性がよく認識されており、レンチウイルスベクターの使用を含み、これは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に有意な量の核酸を形質導入するのに有用である。レンチウイルスベクターの使用は安全であると考えられており、しばしば長期の導入遺伝子発現を提供する。したがって、方法１０１は、好ましくは、レンチウイルス形質導入を介して３４＋幹細胞に１またはそれを超える核酸を導入する１０９。幹細胞のレンチウイルス形質導入に関する議論については、参照によって組み込まれる、Ｊａｎｇ，２０２０，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２７）：５４５－５５６を参照されたい。

本発明の方法は、核酸を幹細胞に導入するための任意の１つのプロセスまたは実験手順によって限定されない。場合によっては、単一のレンチウイルスベクターが使用される。単一のレンチウイルスベクターは、ＴＣＲ、ＣＡＲ、および追加の導入遺伝子のそれぞれをコードし得る。他の例では、少なくとも２つの異なるレンチウイルスベクターが使用され、少なくとも２つのレンチウイルスベクターのそれぞれは、少なくとも１つのＴＣＲ、ＣＡＲ、および追加の導入遺伝子をコードし、それにより、形質導入時に、ＴＣＲ、ＣＡＲ、および追加の導入遺伝子のそれぞれが幹細胞に形質導入される。さらに、複数のレンチウイルスベクターが使用される場合、方法１０１は、２つの（またはそれを超える）レンチウイルスベクターを幹細胞に導入する時間的順序によって限定されない。ベクターは、同時に、同じ形質導入で、または連続的に導入され得る。

方法１０１は更に、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）のＴ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および成熟を含むプロセスを行うこと１１１を含む。

細胞製造方法１０１の一利点は、単一の出発材料、すなわち幹細胞から広範囲のＴ細胞サブタイプを産生する能力にある。本発明の方法によって産生されるＴ細胞としては、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞、アルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞が挙げられ得る。好ましい実施形態では、方法１０１は、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞を産生することを含む。インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の産生は、それらの同種細胞療法用途にとって好ましい。特に、移植片対宿主病を誘発することなく、癌を処置するために抗原特異的Ｔ細胞応答を活性化および拡大するその能力。

したがって、方法１０１は、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）のＴ細胞（例えば、ｉＮＫＴ）へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および成熟プロセスを行うこと１１１を含む。以下に詳細に記載されるように、幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および成熟を行うこと１１１は、好ましくは、そのプロセスがＴ細胞の活性化および拡大のその後のｉｎ ｖｉｔｒｏ工程を含まないという条件で行われる。

ＣＤ３４ポジティブ細胞のＴ細胞への分化は段階的に起こり得る。第１の段階は、ＣＤ３４ポジティブ幹細胞のＣＤ４およびＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化を含み得る。ＣＤ３４ポジティブ幹細胞の分化は、一般に、ＣＤ３４ポジティブ幹細胞を培養中のサイトカインおよび／またはケモカインの組み合わせに、例えば１～２週間、導入することを含む。場合によっては、サイトカインおよび／またはケモカインは、ＳＴＥＭＣＥＬＬによってＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で販売されているサプリメント等の市販の前駆体拡大サプリメントによって提供され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスを行う実施形態１１１は、ＣＤ４およびＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞のＣＤ４およびＣＤ８ダブルポジティブ細胞への成熟を更に含む。場合によっては、ダブルネガティブ細胞を成熟させることは、市販の前駆体成熟培地、例えば、ＳＴＥＭＣＥＬＬによってＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で提供される前駆体成熟培地中で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、前駆体成熟培地中で７日間培養される。

方法１０１の特定の実施形態によれば、ＣＤ３４＋幹細胞のＴ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および成熟プロセスを行うこと１１１は、ＣＤ４ポジティブＣＤ８ポジティブＴ細胞を産生する。ＣＤ４ポジティブＣＤ８ポジティブＴ細胞はナイーブＴ細胞であり得る。ナイーブＴ細胞は、一般に、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）およびＣ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７）の表面発現を特徴とする。場合によっては、Ｔ細胞は、活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ４４またはＣＤ６９の非存在、およびメモリーＣＤ４５ＲＯイソ型の非存在を特徴とする。ナイーブＴ細胞はまた、サブユニットＩＬ－７受容体アルファ、ＣＤ１２７および共通ガンマ鎖、ＣＤ１３２からなる機能的ＩＬ－７受容体を発現し得る。ナイーブＴ細胞は、保存のために凍結保存され得るか、または同種細胞療法処置中に対象に導入され得る。対象の内部では、ナイーブＴ細胞は、最初の抗原刺激を待って末梢リンパ管を循環し得る。ナイーブ細胞のＴＣＲを介した初期刺激時に、細胞は、活性化、共刺激、および接着に関連する表面分子の発現を調節し始める。これらの分子の発現パターンは、エフェクターおよび抗原を経験したＴ細胞サブセットを更に定義するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、ＣＤ４ポジティブＣＤ８ポジティブＴ細胞は、凍結保存および／または同種細胞療法レシピエントへの投与の前にｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大される。ＣＤ４ポジティブＣＤ８ポジティブＴ細胞の拡大は、１またはそれを超えるＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２、アルファ－ガラクトシルセラミドの存在下で細胞を培養することを含み得る。

本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養工程を減らすためにｉｎ ｖｉｖｏ活性化機構を利用する。２つの活性化工程を経ることなくＴ細胞が産生され、対象の体内に導入されると、Ｔ細胞は、例えば二次リンパ器官において樹状細胞等の適切に活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）に遭遇すると完全に活性化される。ＡＰＣが主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して適切なペプチドリガンドを提示する場合、それはＴＣＲによって認識される。これは、Ｔ細胞を活性化するために重要である。ＡＰＣによって送達される２つの他の刺激シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＰＣ表面上の２つの異なるリガンド、例えばＣＤ８０およびＣＤ８６によって、Ｔ細胞上の表面分子、例えばＣＤ２８に提供され得る。活性化に重要な他の因子には、エフェクターＴ細胞の異なるサブセット、例えばＩＬ－６、ＩＬ－１２およびＴＧＦ－ｂ等のサイトカインへのＴ細胞分化の指示に関与する因子が含まれる。活性化Ｔ細胞のＣＤ２８依存性共刺激は、活性化Ｔ細胞自体によるＩＬ－２の産生をもたらし得る。ＩＬ－２の発現に続いて、ＩＣＯＳおよびＣＤ４０Ｌ等の他の調節分子に加えて、ＣＤ２５としても知られるＩＬ－２受容体の第３の成分（ａ鎖と呼ばれる）のアップレギュレーションも存在し得る。ＩＬ－２のその高親和性受容体への結合は細胞成長を促進するが、ＡＰＣ、主に樹状細胞は、環境条件に応じて、様々なサイトカインを生成するか、またはサイトカイン産生エフェクター細胞へのＣＤ４＋Ｔリンパ球の分化を誘導する表面タンパク質を発現する。

図２は、３つの異なるプロセスによるｅｘ ｖｉｖｏ Ｔ細胞製造の段階を示す。具体的には、Ｔ細胞を作製するための従来のｅｘ ｖｉｖｏプロセス２０３を、本発明の低減されたｅｘ ｖｉｖｏプロセス２０５、２０７と比較して示す。従来のプロセス２０３では、成熟Ｔ細胞は、少なくとも２回のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化工程に供され、そのうちの２回が示されている。このプロセス２０３は、完了するために少なくとも３５日間、例えば少なくとも４２日間、しばしばそれより長いｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養を必要とし得る。逆に、プロセス２０５は、Ｔ細胞活性化を省略するので、わずか２１日以内にＴ細胞を生成することができる。活性化工程を省略することにより、Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養は実質的に減少し、例えば２～３週間である。第３のプロセス２０７は、単一の活性化工程を含む。単一の活性化工程は、有効量のＴ細胞を産生するのに役立ち得る。２回ではなく１回のみの活性化工程を使用することによって、本発明の方法は、先行技術のＴ細胞製造プロセスよりも少なくとも１４日間少ない時間でＴ細胞を生成することができる。

図３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞を産生するための２つのプロセスの比較を提供する。第１のプロセス３０３は２回の活性化工程を含む。ダブルポジティブＴ細胞を、例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２およびＩＬ－１５を含む異なる活性化培地で処置することによって達成される２段階活性化プロセスは、製造プロセスを少なくとも１週間、一般にはそれ以上増加させる。第２のプロセス３０５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化を省略する。

本発明の方法は、単一の活性化工程を含み得る。単一の活性化工程は、Ｔ細胞を活性化試薬と共に７日間以下の期間培養することを含み得る。他の実施形態では、単一の活性化工程は、活性化培地中でＴ細胞を６日間または５日間または４日間または３日間または２日間または１日間以下培養することを含む。他の実施形態では、単一の活性化工程は、活性化培地中でＴ細胞を８日間、または９日間、または１０日間、または１１日間、または１２日間、または１３日間、または１４日間培養しないことを含む。単一の活性化工程は、単一のタイプの活性化培地でＴ細胞を培養することを含み得る。単一のタイプの活性化培地は、活性化試薬、例えば可溶性抗体を含み得る。単一の活性化工程は、Ｔ細胞を抗原提示細胞、例えばａＡＰＣと共培養することを含み得る。単一の活性化工程は、Ｔ細胞をＰＢＭＣと共培養することを含み得る。

本発明の方法は、造血幹細胞／前駆細胞からのＴ細胞の産生を含む。造血幹細胞／前駆細胞は、一般に、臍帯血中に見出され得るＣＤ３４＋細胞に関連する。場合によっては、細胞は前駆細胞に由来し得る。場合によっては、細胞は、胚性幹細胞等の多能性幹細胞である。

ＨＳＣから産生された同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞は、特定の病状のための治癒的治療アプローチを提供し得る。しかしながら、いくつかの制限には、同種細胞療法に関連する罹患率および死亡率の多くを担うドナーＴ細胞媒介性のアロ反応性プロセスであるＧＶＨＤが含まれる。いくつかの臨床研究は、ドナーｉＮＫＴ細胞が疾患再発のリスクを増加させることなくＧＶＨＤを予防することができることを示す。ドナーＣＡＲ ｉＮＫＴ細胞の養子移入とそれに続くｉｎ ｖｉｖｏ活性化および／または拡大は、ＧＶＨＤの症状を予防または緩和し得る。この保護効果は、アロ反応性Ｔ細胞のＴｈ２分極およびドナー制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の拡大を介して媒介され得る。同種異系ｉＮＫＴ細胞は、本発明の方法によって産生される場合、ＧＶＨＤを引き起こさないため、本明細書に記載される方法は、「既製のＣＡＲ免疫療法」のための理想的なプラットフォームを提供する。

本発明の方法は、ＴＣＲの抗原認識領域の機能的再編成を介して抗原特異性を獲得する治療活性Ｔ細胞を製造するのに有用である。ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合した抗原の認識に関与するＴ細胞（またはＴリンパ球）の表面に見られる分子である。ＴＣＲは、少なくとも２つの異なるタンパク質鎖（例えば、ヘテロ二量体）から構成され得る。ほとんどの（例えば、９５％）Ｔ細胞では、これはアルファ鎖およびベータ鎖からなるが、いくつかの（例えば、５％）Ｔ細胞では、これはガンマ鎖およびデルタ鎖からなる。そのようなＴ細胞は、細胞表面ＴＣＲ分子において抗原特異性を有し得、古典的ＣＤ３ポジティブ、アルファ－ベータＴＣＲ ＣＤ４ポジティブ、ＣＤ３ネガティブアルファ－ベータＴＣＲ ＣＤ８ポジティブ、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞等を含むがこれらに限定されない異なる表現型サブセットへとｉｎ ｖｉｖｏで分化する。さらに、Ｔ細胞は、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、ターミナルエフェクター等を含むがこれらに限定されない様々な活性化状態を更に含み得る。

好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞の製造を提供する。ＣＡＲ Ｔ細胞は、免疫療法に使用するための人工Ｔ細胞受容体を産生するように遺伝子操作されたＴ細胞である。ＣＡＲ（すなわち、キメラ抗原受容体）を使用して、例えばレトロウイルスベクターによって促進されるそれらのコード配列の移入を介して、ＴＣＲを有する幹細胞にモノクローナル抗体の特異性を移植することができる。ＣＡＲは、Ｔ細胞に特定のタンパク質を標的化する新しい能力を与えるように操作された受容体タンパク質である。受容体は、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能の両方を単一の受容体に組み合わせるため、キメラである。したがって、本発明の方法は、癌細胞をより効果的に標的化および破壊するために、癌細胞を認識する改変Ｔ細胞を産生することによる免疫療法のための産物を提供する。

本発明の方法を実施する際に、養子免疫療法で使用されるエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を操作するのに適した任意のＣＡＲを本発明で使用してもよい。本発明において使用され得るＣＡＲとしては、参照によって組み込まれる、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｈｏ，２０２０，Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＣＡＲ－Ｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１０（２）：２６３に記載されるものが挙げられる。

ＣＡＲは一般に、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、抗原結合／認識領域／ドメインを含み得る。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、特定の抗原、例えば腫瘍抗原、病原体抗原（例えば、ウイルス抗原）、ＣＤ（分化クラスター）抗原に結合するのに有用である。細胞外ドメインはまた、新生タンパク質を小胞体内に誘導するシグナルペプチドを含み得る。ＣＡＲがグリコシル化され、細胞膜に固定される場合、シグナルペプチドが必須であり得る。膜貫通ドメインは、膜にまたがる疎水性アルファヘリックスである。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性をもたらす。抗原認識後、受容体はクラスターを形成し、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用される細胞内成分は、３つのＩＴ ＡＭを含有するＣＤ３ゼータである。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＡＲはまた、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー領域を含み得る。スペーサー領域は、抗原認識を容易にするために抗原結合ドメインが異なる方向に配向することを可能にするのに十分に柔軟でなければならない。スペーサーは、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域、または免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域およびＣＤ３の一部であり得る。

現在、３世代のＣＡＲが存在する。第１世代のＣＡＲは、典型的には、Ｔ細胞受容体鎖の細胞質シグナル伝達ドメインに融合された、膜貫通ドメインに融合された抗体由来抗原認識ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む。第１世代のＣＡＲは、典型的には、内因性ＴＣＲからのシグナルの主要な伝達物質であるＣＤ３ゼータ鎖由来の細胞内ドメインを有する。第１世代のＣＡＲは、ｄｅ ｎｏｖｏ抗原認識を提供し、ＨＬＡ媒介性抗原提示とは無関係に、単一融合分子内のそれらのＣＤ３ゼータ鎖シグナル伝達ドメインを介してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化を引き起こすことができる。非限定的な一例では、Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を指示する人工ＴＣＲを発現するように遺伝子操作することができ、考察については、参照により組み込まれる、Ｅｓｈｈａｒ １９９３，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎｓ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇａｍｍａ ｏｒ ｚｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，９０，７２０－７２４を参照されたい。第２世代ＣＡＲは、第１世代ＣＡＲと類似しているが、ＣＤ２８または４－１ＢＢ等の２つの共刺激ドメインを含む。これらの細胞内シグナル伝達ドメインの関与は、Ｔ細胞増殖、サイトカイン分泌、アポトーシスに対する耐性、およびｉｎ ｖｉｖｏ持続性を改善する。第３世代ＣＡＲは、Ｔ細胞活性を更に増強するために、ＣＤ２８－４ＩＢＢまたはＣＤ２８－ＯＸ４０等の複数の共刺激ドメインを組み合わせる。

場合によっては、本発明の方法は、追加の導入遺伝子（すなわち、ＣＡＲまたはＴＣＲの１つに加えて導入遺伝子）を提供するためにＨＳＣの遺伝子改変を行うことを含む。例えば、いくつかの実施形態では、追加の導入遺伝子は１またはそれを超えるサイトカインをコードする。サイトカインは、免疫系の特定の細胞によって分泌され、他の細胞に影響を及ぼすインターフェロン、インターロイキン、および増殖因子等の物質に関する。本発明の実施形態によれば、１またはそれを超えるＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８またはＩＬ－２１をコードする導入遺伝子は、Ｔ細胞機能または腫瘍有効性を促進するために提供され得る。

ＣＡＲ Ｔ細胞への１またはそれを超える導入遺伝子の導入は、Ｔ細胞拡大および持続性（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７／１５を使用する）、ＩＦＮ－ｇ産生およびＴ細胞効力（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８による）等の特性を改善し、ナイーブサブセットを増強し（例えば、ＩＬ－２１）、安全性を改善し（例えば、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦの阻害剤またはＣＲＳおよび神経毒性の他のメディエーターを介して）、または腫瘍微小環境と戦うことによって有効性を改善し得る（ＴＧＦ－Ｂ、チェックポイント等）。

例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８は、ＣＡＲ Ｔ細胞の特定のエフェクター機能の増強において主要な役割を果たす。ＩＬ－１２は、特定のＮＫ細胞およびＴリンパ球を活性化し、Ｔｈ－１型応答を誘導し、ＩＦＮ－γ分泌を増加させることが知られている。ＩＬ－１２の誘導性発現は、リンパ腫、肝細胞癌腫、卵巣腫瘍およびＢ１６黒色腫等の特定の病態に対するＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍能力を増強し得る。ＩＬ－１８はまた、ＣＡＲ Ｔ細胞の治療可能性を改善するために使用されている。最初にＩＦＮ－γの強力な誘導物質として同定されたＩＬ－１８は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化ならびにＴｈ－１細胞の極性化に寄与し得る。例えば、Ｍｅｓｏ標的化ＣＡＲ Ｔ細胞には、ＩＦＮ－γの分泌を増強し、癌細胞を根絶するために、ＩＬ－１８をコードする導入遺伝子が提供され得る。更なる考察については、参照により組み込まれる、Ｔｉａｎ，２０２０，Ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ １３（５）を参照されたい。

ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１は、幹細胞様メモリーＴ細胞表現型の生成促進に有用である。この表現型は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞の拡大および持続性の増加をもたらし得る。場合によっては、ＩＬ－２をコードする導入遺伝子が提供され得る。ＩＬ－２を有するＴ細胞を産生することにより、例えば、栄養素の感知および取り込みに関与するタンパク質の誘導および産生を促進することによって、腫瘍環境に応答する能力が改善されたＴ細胞が提供され得る。

いくつかの実施形態では、導入遺伝子はサイトカイン放出症候群の阻害剤である。

サイトカイン放出症候群は、しばしばＣＡＲ－Ｔ細胞療法に関連する重篤で潜在的に生命を脅かす副作用に関する。サイトカイン放出症候群は、例えばＩＦＮ－γおよびＩＬ－６を含む過剰な炎症性サイトカイン放出によって引き起こされる急速な（ハイパー）免疫反応として現れる。サイトカイン放出症候群に関与する多くのサイトカインは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路を介して作用することが知られている。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖、抗腫瘍活性およびサイトカインレベルを改善するために、ＪＡＫ経路の阻害剤を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を産生することを含む。例えば、ＩＬ－６、ＪＡＫ－ＳＴＡＴまたはＢＴＫの機能を阻害する導入遺伝子が提供され得る。さらに、阻害剤は、神経毒性の阻害に更に有用であり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞関連神経毒性は、発作および昏睡等の重度の神経障害をしばしば引き起こす症候群である。

他の例では、方法は、導入遺伝子をＨＳＣに導入することを含み、導入遺伝子は、チェックポイント阻害剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイントは、免疫系の特定の態様の調節因子である。正常な生理学的条件では、チェックポイントは、免疫系が健康な組織を保存する宿主抗原に応答することを可能にする。癌では、これらの分子は腫瘍細胞の回避を促進する。場合によっては、導入遺伝子は、抗カテプシン抗体、ガレクチン－１遮断および抗ＯＸ４０アゴニスト抗体等の抗体または抗体断片をコードし得る。抗体は、細胞の表面上に分泌または発現され得る。例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体が分泌され得る。

実施形態では、トランスフォーミング増殖因子ベータの阻害剤を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を産生する。操作された細胞は、それらの有効性を制限する厳しい微小環境に直面する。環境の調節は、ＣＡＲ Ｔ細胞が癌細胞を増殖、生存および／または死滅させる能力を促進するために有用であり得る。腫瘍環境内の主な阻害機構の１つは、トランスフォーミング増殖因子ベータである。したがって、本発明のいくつかの態様は、トランスフォーミング増殖因子ベータの阻害剤をコードする導入遺伝子を導入することを含む。阻害剤は、例えば、抗体またはその断片であり得る。抗体または抗体断片は、トランスフォーミング増殖因子ベータの正常な機能を妨害するためにＣＡＲ Ｔ細胞から分泌され得る。

いくつかの実施形態では、方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞を、腫瘍微小環境のマーカーを介して固形腫瘍タイプを標的とするように作製することを含む。他の実施形態では、方法は、腫瘍特異的標的を必要とせずに腫瘍微小環境のマーカーを認識するために使用することができる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）ベースのキメラ抗原受容体を有するＣＡＲ Ｔ細胞を作製する。本発明によるＶＨＨベースのＣＡＲ Ｔ細胞は、同系の免疫適格動物モデルにおいて固形腫瘍に対して有効な免疫チェックポイント受容体を介して、または間質および細胞外マトリックスマーカーを介して腫瘍微小環境を標的化し得る。したがって、本発明の方法は、腫瘍特異的抗原発現を欠く可能性がある腫瘍を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞を作製するのに有用である。重鎖のみの抗体の可変領域（ＶＨＨまたはナノボディ）は、伝統的な短鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に匹敵する親和性を有する小さい安定なラクダ由来の単一ドメイン抗体断片である。ＶＨＨは一般にｓｃＦｖよりも免疫原性が低く、そのサイズが小さいため、ｓｃＦｖによって見られるエピトープとは異なるエピトープにアクセスすることができる。したがって、本発明によって提供されるＶＨＨは、ＣＡＲ Ｔ細胞における適切な抗原認識ドメインとして機能することができる。ｓｃＦｖとは異なり、ＶＨＨは、Ｖ領域対合に伴う追加の折り畳み工程およびアセンブリ工程を必要としない。それらは、広範なリンカーの最適化または他のタイプの再フォーマットを必要とせずに表面表示を可能にする。様々なＶＨＨベースの認識ドメインをスイッチアウトする能力は、それぞれの新しい従来の抗体をｓｃＦｖに再フォーマットする必要なくアクセス可能な高度にモジュール化されたプラットフォームをもたらす。

さらに、多くの微小環境は、ＰＤ－Ｌ１等の阻害性分子の発現を含む。認識ドメインとしてＶＨＨ、例えばＰＤ－Ｌ１特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を使用して、本発明の方法によって産生されたＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍微小環境を標的化することができる。ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍細胞上ならびに浸潤骨髄細胞およびリンパ球上に広く発現される。ＰＤ－Ｌ１を認識するＣＡＲは、免疫阻害を軽減し、同時に腫瘍微小環境におけるＣＡＲ Ｔ細胞活性化を可能にするはずである。したがって、ＰＤ－Ｌ１標的化ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍微小環境をリプログラムし、免疫抑制シグナルを減衰させ、炎症を促進し得る。例えば、Ｘｉｅ，２０１９に記載されるように、腫瘍微小環境を標的とするナノボディに基づくＣＡＲ Ｔ細胞は、免疫適格マウスにおける固形腫瘍の成長を阻害する（これは参照によって組み込まれる、ＰＮＡＳ Ａｐｒｉｌ １６，２０１９ １１６（１６）７６２４－７６３１）。

本開示の実施形態によれば、ＣＤ３４＋幹細胞は、１またはそれを超えるＣＡＲ、ＴＣＲおよび追加の導入遺伝子（例えば、サイトカイン）を発現するように遺伝子操作される。腫瘍またはウイルス抗原特異的細胞を提供するための細胞の最初の遺伝子改変のため、レトロウイルスベクターをウイルス形質導入に使用してもよい。レトロウイルスベクターと、培養中のヒト細胞に感染する適切なパッケージングとの組み合わせは、当技術分野で公知である。好ましい実施形態では、第３世代のレンチウイルスベクターが試用され得る。ベクターは、好ましい抗原を標的とするために抗体または抗体断片の配列を含むｃＤＮＡ配列で修飾され得る。例えば、Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ，２００８，Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＤ １３７ ｄｏｍａｉｎｓ，ＰＮＡＳ，１０６（９）３３６０－３３６５；Ｌｉ，２０１７，Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３ ｗｉｔｈ ４－１ＢＢ Ｚｅｔａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｔｈｌ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２８（５）：４３７－４４８；Ａｄｕｓｕｍｉｌｌｉ，２０１４，Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｌａｓｔｉｎｇ ＣＤ４－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６１（６）：１－１４に記載されるとおりであり、これらの各々は、参照により組み込まれる。

本開示のいくつかの態様は、複数の導入遺伝子をＨＳＣに導入し、発現させることを含む。複数の遺伝子の発現を促進するために、２Ａ配列、すなわち２Ａペプチドのコードドメインを有する核酸上で導入遺伝子を分離することが有用であり得る。２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａペプチドは、タンパク質の翻訳中にリボソームスキッピングを誘導することができる１８～２２アミノ酸長のペプチドのクラスである。細胞内で、２Ａペプチドのコードドメインが２つのタンパク質の２つのコードドメインの間に挿入されると（例えば、ＴＣＲおよびＣＡＲ）、ペプチドは、リボソームスキッピングのために独立して折り畳まれる２つのタンパク質に翻訳される。

本発明の方法は、臨床適用のために操作されたＨＳＣをＴ細胞に形質転換するのに有用である。形質転換の方法には、一般に、ＨＳＣのＴ細胞への分化が含まれる。細胞分化は、細胞がある細胞型から別の細胞型に変化するプロセスである。通常、細胞は、より特殊化されたタイプに変化する。ＨＳＣのＴ細胞への分化は、多段階の分化を含み得る。第１の段階として、ＣＤ３４＋細胞がＣＤ４ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞に分化され得る。ダブルネガティブＴ細胞の生成は、造血サイトカインを含む細胞因子のカクテルの存在下でＣＤ３４＋細胞を培養することによって達成することができる。カクテルは、ＳＣＦ（例えば、ｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３Ｌ（例えば、ｈＦｌｔ３Ｌ）、および少なくとも１つのサイトカイン、ならびに造血系の特定のためのｂＦＧＦを含み得る。サイトカインは、ＩＬ－３、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－１２およびＩＬ－２１を含むがこれらに限定されないＴｈ１サイトカインであり得る。細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４１ａ、ｃｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ１、ＩＬ７Ｒａの発現についてＦＡＣＳによって免疫表現型分析され得る。

ダブルネガティブＴ細胞は、機能的な不活性化Ｔ細胞を産生するために抗原非依存性成熟プロセスを介して更に分化され得る。このプロセスは、リンパ球前駆細胞拡大培地中でダブルネガティブＴ細胞を培養することを含み得る。培地は、例えば、フィーダー細胞およびＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌおよび少なくとも１つのサイトカインを含み得る。サイトカインは、ＩＬ－３、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－１２およびＩＬ－２１を含むがこれらに限定されないＴｈ１サイトカインであり得る。いくつかの実施形態では、サイトカインは、細胞の生存および／または機能的可能性を高め得る。

活性化および／または拡大工程を経ていないＴ細胞を含むＴ細胞を含む細胞産物は、新生物、病原体感染または感染性疾患の処置のために対象に全身的にまたは直接提供することができる。一実施形態では、本発明のＴ細胞は、目的の器官（例えば、新生物によって影響を受ける器官）に直接注射され得る。あるいは、Ｔ細胞およびそれを含む組成物は、例えば循環系（例えば、腫瘍血管系）への投与によって、目的の器官に間接的に提供することができる。好ましくは、Ｔ細胞の活性化および拡大は、対象への導入後にｉｎ ｖｉｖｏで起こる。

本発明のＴ細胞およびそれを含む組成物は、任意の生理学的に許容され得るビヒクル中に、通常は血管内に投与され得るが、細胞が再生および分化のための適切な部位を見出され得る骨または他の好都合な部位（例えば、胸腺）に導入されてもよい。通常、少なくとも１００，０００個の細胞、時には１０，０００，０００，０００個またはそれを超える細胞が投与される。

本発明の方法は、同種細胞療法の投与のための医薬組成物と組み合わせてもよい細胞の組成物を提供する。本発明の治療用組成物（例えば、ＨＳＣ由来のＣＡＲ Ｔ細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、それは一般に、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化される。組成物は、治療有効濃度で提供され得る。治療有効濃度は、処置時に有益なまたは所望の臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、１またはそれを超える用量で対象に投与することができる。処置に関して、有効量は、疾患の進行を緩和、改善、安定化、逆転もしくは遅延させるか、または疾患の病理学的帰結を軽減するのに十分な量である。有効量は、一般に、症例ごとに医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定するとき、いくつかの要因が通常考慮される。これらの要因には、対象の年齢、性別および体重、処置される症状、症状の重症度ならびに投与される抗原結合断片の形態および有効濃度が含まれる。

本発明の抗原特異的Ｔ細胞を使用する養子免疫療法のために、１０，０００，０００～１０，０００，０００，０００の範囲の細胞用量が注入され得る。Ｔ細胞を対象に投与すると、Ｔ細胞は抗原依存性活性化プロセスを受け得る。

本開示は、細胞療法および／または研究のためのＴ細胞の製造方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養の時間を短縮することによってＴ細胞製造の経済的方法を提供する。いくつかの関連する態様では、本発明の方法は、増強された細胞傷害効果を有するＴ細胞の製造を提供する。長期の細胞培養は、以前は、特定の細胞型の転写および表現型の変化に関連していた。培養中のＴ細胞の転写および表現型の変化はあまり特徴付けられていないが、本開示は、長期培養中の細胞の意図しない変化が、同種異系細胞において同定された治療有効性および生成物バッチの変動性の観察された減少を説明し得ることを認識している。例えば、Ｔ細胞の長期の細胞培養は、エフェクター機能の喪失を反映する高レベルの疲弊マーカーを生じ得る。例えば、長期培養は、ＰＤ１、ＬＡＧ３の発現の増加に関連し得る。ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、更なる考察については、参照により組み込まれる、Ｗｈｅｒｒｙ，２０１６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５（８）：４８６－４９９を参照されたい。ｅｘ ｖｉｖｏ製造を短縮することによって、本発明の方法は、治療上有効なＴ細胞の一貫した産生に有用である。

したがって、一態様では、本開示は、Ｔ細胞を産生する方法を提供する。この方法は、造血幹細胞（ＨＳＣ）のＴ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および成熟を含むプロセスを行うことを含むが、ただし、このプロセスは、Ｔ細胞の活性化および／または拡大のその後のｉｎ ｖｉｔｒｏ工程を含まないことを条件とする。むしろ、Ｔ細胞の活性化および／または拡大は、好ましくは、対象への導入後にｉｎ ｖｉｖｏで起こる。有利には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化および／またはＴ細胞拡大を省略することにより、従来のＴ細胞製造プロセスから数週間（例えば、少なくとも２週間）が節約され、これは増強された細胞傷害効果を有するＴ細胞を産生するのに有用であり得る。

本発明の方法は、安全で有効な同種異系療法を製造するのに有用である。場合によっては、方法は、製品品質を確保するために、製造中の１またはそれを超える時点で細胞産物を特性評価することを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞を分析して、Ｔ細胞によって発現される１またはそれを超えるタンパク質を同定することを含む。１またはそれを超えるタンパク質は、１またはそれを超えるＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、またはＣＤ４５ＲＡを含み得る。タンパク質は、ナイーブ幹細胞に関連するマーカーを含み得る。分析することは、好ましくは、細胞表面タンパク質を分析するハイスループット法、例えば、ＦＡＣＳ等のバルク中の個々の細胞の蛍光シグナルに基づく方法を含む。

オンデマンドで処置が利用可能であることは、同種細胞療法の１つの利点である。方法は、臨床適用前の細胞の製造を含み得るため、いくつかの好ましい方法は、Ｔ細胞を凍結保存することを含み得る。Ｔ細胞を凍結保存することは、患者が必要とするまで細胞を安全かつ効果的に保存するのに有用である。凍結保存はまた、患者に投与することができる臨床施設への細胞産物の輸送にも有用である。いくつかの好ましい実施形態では、ダブルポジティブＴ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化工程を行わずに凍結保存される。

過去１０年間にわたって、免疫療法は新世代の癌医療となってきた。特に、細胞ベースの細胞療法は非常に有望であることが示されている。顕著な例はＣＡＲ操作養子Ｔ細胞療法であり、これは特定の血液癌を顕著な有効性で標的とする。しかしながら、処置のための現在のプロトコルのほとんどは、患者から収集された免疫細胞が製造され、この単一の患者を処置するために使用される自己養子細胞移入からなる。そのようなアプローチは、費用がかかり、製造労働集約的であり、必要とするすべての患者に広く送達することが困難である。同種異系免疫細胞産物は、本明細書に記載の方法によって、大規模に製造することができ、より多数の患者を処置するために容易に流通させることができるため、大きな需要がある。

いくつかの実施形態は、操作されたｉＮＫＴ細胞または操作されたｉＮＫＴ細胞の集団に関する。少なくともいくつかの場合、操作されたｉＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび／または操作されたＴ細胞受容体を含む。細胞との関連で論じられる任意の実施形態は、そのような細胞の集団に適用され得る。特定の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、以下の１、２、および／または３つを含む核酸を含む：ｉ）インバリアントアルファＴ細胞受容体コード配列の全部もしくは一部；ｉｉ）インバリアントベータＴ細胞受容体コード配列の全部もしくは一部、またはｉｉｉ）自殺遺伝子。更なる態様では、ｉ）インバリアントアルファＴ細胞受容体の全部もしくは一部；ｉｉ）インバリアントベータＴ細胞受容体の全部もしくは一部、および／またはｉｉｉ）自殺遺伝子産物をコードする配列を有する核酸を含む操作されたｉＮＫＴ細胞が存在する。

更なる態様は、ＮＫ活性化受容体のレベルの増加、ＮＫ阻害受容体のレベルの減少、および／または細胞傷害性分子のレベルの増加を有する操作されたｉＮＫＴ細胞に関する。いくつかの実施形態では、ＮＫ活性化受容体は、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＤＮＡＭ－１を含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性分子は、パーフォリンおよび／またはグランザイムＢを含む。いくつかの実施形態では、阻害剤受容体はＫＩＲを含む。増加または減少は、健康な個体から単離された遺伝子操作されていないｉＮＫＴにおける同じマーカーのレベルに対するものであり得る。更なる態様は、細胞の集団がＮＫ活性化受容体のレベルの増加、ＮＫ阻害受容体のレベルの減少、および／または細胞傷害性分子のレベルの増加を有する、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団に関する。

いくつかの実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、異種プロモーターの制御下にある核酸を含み、これはプロモーターが核酸の転写を制御するのと同じゲノムプロモーターではないことを意味する。操作されたｉＮＫＴ細胞は、１またはそれを超えるコード配列を含む外因性核酸を含み、その一部または全部が本明細書に記載される多くの実施形態では異種プロモーターの制御下にあることが企図される。

特定の実施形態では、少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラーＴ細胞受容体（ｉＮＫＴ ＴＣＲ）および外因性自殺遺伝子産物を発現する操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞が存在し、少なくとも１つのｉＮＫＴ ＴＣＲは、外因性核酸および／または組換え修飾プロモーター領域の転写制御下にある内因性インバリアントＴＣＲ遺伝子から発現される。ｉＮＫＴ ＴＣＲは、「ＣＤ１ｄ分子によって提示される脂質抗原を認識するＴＣＲ」を指す。それは、アルファ－ＴＣＲ、ベータ－ＴＣＲ、またはその両方を含み得る。ある場合には、利用されるＴＣＲは、ＭＡＩＴ細胞ＴＣＲ、ＧＥＭ細胞ＴＣＲ、またはガンマ／デルタＴＣＲ等のより広い群の「インバリアントＴＣＲ」に属することができ、それぞれ、ＨＳＣ操作されたＭＡＩＴ細胞、ＧＥＭ細胞、またはガンマ／デルタＴ細胞をもたらす。

特定の実施形態では、自殺遺伝子は酵素ベースであり、すなわち自殺遺伝子の遺伝子産物は酵素であり、自殺機能は酵素活性に依存する。１またはそれを超える自殺遺伝子は、単一細胞またはクローン集団において利用され得る。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９をコードする。自殺遺伝子の使用のための当該技術分野における方法は、米国特許第８６２８７６７号、米国特許出願公開第２０１４０３６９９７９号、米国特許第２０１４０２４２０３３号および米国特許第２００４００１４１９１号（これらはすべて、その全体が参照により組み込まれる）等において採用され得る。更なる実施形態では、ＴＫ遺伝子は、ウイルスＴＫ遺伝子、すなわちウイルス由来のＴＫ遺伝子である。特定の実施形態では、ＴＫ遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子産物は、基質によって活性化される。チミジンキナーゼは、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはそれらの誘導体によって活性化される自殺遺伝子産物である。特定の実施形態では、自殺遺伝子産物を活性化する基質は、検出されるために標識される。場合によっては、撮像のために標識され得る基質。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子産物は、ＴＣＲ－アルファまたはＴＣＲ－ベータの一方または両方をコードする同じまたは異なる核酸分子によってコードされ得る。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ｓｒ３９ＴＫまたは誘導性カスパーゼ９である。代替の実施形態では、細胞は、外因性自殺遺伝子を発現しない。いくつかの実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、アルファ－ガラクトシルセラミド（ａ－ＧＣ）に特異的に結合する。

追加の態様では、細胞は、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子を欠いているか、または少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現が低下している。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－Ｐ分子の表面発現の欠如は、個々のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子をコードする遺伝子を破壊することによって、またはすべてのＨＬＡ－Ｉ複合体分子の共通成分であるＢ２Ｍ（ベータ２ミクログロブリン）をコードする遺伝子を破壊することによって、またはすべてのＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現を制御する重要な転写因子であるＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体転写活性化因子）をコードする遺伝子を破壊（ｄｉｓｃｒｕｐｔｉｎｇ）することによって達成される。特定の態様では、細胞は、１またはそれを超えるＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠いているか、または５０、６０、７０、８０、９０、１００％（またはその中の誘導可能な任意の範囲）の低下したレベルのそのような分子を発現する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩは、細胞が遺伝子編集によって操作されたため、ｉＮＫＴ細胞において発現されない。

いくつかの実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、細胞に導入された組換えベクターまたは組換えベクターからの核酸配列を含む。特定の実施形態では、組換えベクターは、ウイルスベクターであるか、またはウイルスベクターであった。更なる実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスであるか、またはそれらであった。特定のウイルスベクターの核酸は、宿主ゲノム配列に組み込まれることが理解される。

「ベクター」または「コンストラクト」（遺伝子送達または遺伝子移入「ビヒクル」と呼ばれることもある）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子、分子の複合体またはウイルス粒子を指す。ポリヌクレオチドは、直鎖状または環状分子であり得る。ベクターの一般的な種類である「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子である。特定の場合において、それは環状であり、二本鎖である。

特定のタンパク質を「コードする」「遺伝子」、「導入遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コーディング領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」または「導入遺伝子」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写され、必要に応じて遺伝子産物、例えばポリペプチドにも翻訳される核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡのいずれかの形態で存在し得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、核酸分子は一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子には、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、遺伝子配列の３’側に位置する。

「細胞」という用語は、本明細書では当技術分野における最も広い意味で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、それを外部から隔離する膜構造によって取り囲まれ、自己複製能を有し、遺伝情報およびそれを発現する機構を有する生体を指す。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞等）であり得る。

ＩＮＫＴ細胞は、マウスからヒトまで高度に保存されたアルファベータＴリンパ球の小さな集団である。ｉＮＫＴ細胞は、癌、感染症、アレルギー、および自己免疫を含む多くの疾患の調節において重要な役割を果たすことが示唆されている。刺激されると、ｉＮＫＴ細胞は、細胞集団として、および単一細胞レベルで、大量のエフェクターサイトカイン、例えばＩＦＮ－γおよびＩＬ－４等を迅速に放出する。次いで、これらのサイトカインは、様々な免疫エフェクター細胞、例えば自然免疫系のナチュラルキラー細胞および樹状細胞（ＤＣ）、ならびに活性化ＤＣを介して適応免疫系のＣＤ４ヘルパーおよびＣＤ８細胞傷害性従来型アルファベータＴ細胞を活性化する。それらの固有の活性化機構のために、ｉＮＫＴ細胞は、抗原およびＭＨＣ、制限とは無関係に複数の疾患を攻撃することができ、それらを魅力的な普遍的治療剤としている。

以前、主に癌を標的とした一連のｉＮＫＴ細胞に基づく臨床試験が行われてきた。最近の試験では、頭頸部扁平上皮癌腫を有する患者における抗腫瘍免疫の促進が報告され、ｉＮＫＴ細胞に基づく免疫療法の可能性が証明された。しかしながら、今日までのほとんどの臨床試験は、内因性ｉＮＫＴ細胞の直接的な活性化またはｅｘ ｖｉｖｏ拡大に基づいており、それによって少数の患者に短期的な限定された臨床的利益しかもたらさないので、満足のいく結果をもたらしていない。ヒトにおけるｉＮＫＴ細胞の低頻度および高変動性（血中で約０．０１～１％）、ならびに活性化後のこれらの細胞の急速な枯渇は、これらの試験の成功を制限する主要な障害であると考えられる。

ｉＮＫＴ細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から操作されている。参照により組み込まれる、米国特許第８，９４５，９２２号を参照されたい。ｉＰＳ細胞は、体細胞に外因性の核リプログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ等を形質導入することによって産生される。

残念ながら、外因性核リプログラミング因子の転写レベルは、多能性状態への細胞移行と共に低下するため、安定なｉＰＳ細胞株産生の効率は低下し得る。さらに、Ｏｃｔ ４、Ｓｏｘ ２、Ｋｌｆ ４およびｃ－Ｍｙｃは腫瘍形成をもたらす癌遺伝子であるため、外因性核リプログラミング因子の転写はｉＰＳ細胞で再開し、ｉＰＳ細胞に由来する細胞から新生物発生を引き起こすことができる。

本発明の方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１７０２８３４８１号Ａ１および国際出願第２０１９２４１４００号（これらの各々は参照により組み込まれる）で検討されるｉＮＫＴ細胞の産生に使用してもよい。

一例として、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸配列がｉＮＫＴ細胞のサブセット、例えばＣＤ４／ＤＮ／ＣＤ８サブセットまたはＴｈｌ、Ｔｈ２もしくはＴｈｌ７サイトカインを産生するサブセットから得られ、ダブルネガティブｉＮＫＴ細胞を含むｉＮＫＴ細胞を産生する。いくつかの実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸配列は、黒色腫、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、リンパ腫、白血病、血液悪性腫瘍等の癌を有していたかまたは有するドナー由来のｉＮＫＴ細胞から得られる。いくつかの実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、１つのｉＮＫＴ細胞からのＴＣＲアルファ配列および異なるｉＮＫＴ細胞からのＴＣＲベータ配列を有する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲアルファ配列が得られるｉＮＫＴ細胞およびＴＣＲベータ配列が得られるｉＮＫＴ細胞は、同じドナーに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲアルファ配列が得られるｉＮＫＴ細胞のドナーは、ＴＣＲベータ配列が得られるｉＮＫＴ細胞のドナーとは異なる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲアルファ配列および／またはＴＣＲベータ配列は、発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ＴＣＲアルファ配列および／またはＴＣＲベータ配列は、非改変配列によってコードされるポリペプチドと比較して１またはそれを超えるアミノ酸置換、欠失および／または切断を有するポリペプチドをコードするように改変される。いくつかの実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、ＣＤ１ｄ上に提示されるアルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）を認識するＴ細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、発現ベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルス発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子がＭＩＧベクターのＩＲＥＳ－ＥＧＦＰセグメントを置き換えるＭＩＧベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ｐｈｉＮＫＴ－ＥＧＦＰである。

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞に任意の特異性を移植する操作された受容体を指す。これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植するために使用され、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターによって促進されるそれらのコード配列の移入を伴う。受容体は、異なる供給源由来の部分から構成されるため、キメラと呼ばれる。これらの分子の最も一般的な形態は、ＣＤ３－ゼータ膜貫通ドメインおよびエンドドメインに融合された、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合物；ＣＤ２８もしくは４ＩＢＢ細胞内ドメイン、またはそれらの組み合わせである。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してシグナルの伝達をもたらす。そのようなコンストラクトの例は、１４ｇ２ａ－ζであり、これは、ハイブリドーマ１４ｇ２ａ（ジシアロガングリオシドＧＤ２を認識する）に由来するｓｃＦｖの融合物である。Ｔ細胞がこの分子を発現する場合（例えば、神経芽細胞腫細胞）、Ｔ細胞は、ＧＤ２を発現する標的細胞を認識して死滅させる。悪性Ｂ細胞を標的とするために、研究者らは、Ｂ系統分子ＣＤ１９に特異的なキメラ免疫受容体を使用して、Ｔ細胞の特異性をリダイレクトした。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変部分は、柔軟なリンカーによって融合されてｓｃＦｖを形成する。このｓｃＦｖの前には、新生タンパク質を小胞体およびその後の表面発現（これは切断される）に導くシグナルペプチドが存在する。フレキシブルスペーサーは、抗原結合を可能にするためにｓｃＦｖが異なる方向に配向することを可能にする。膜貫通ドメインは、通常、細胞内に突出し、所望のシグナルを伝達するシグナル伝達エンドドメインの元の分子に由来する典型的な疎水性アルファヘリックスである。

好ましくは、ＣＡＲは特定の腫瘍抗原を対象とする。ＣＡＲが指向され得る腫瘍細胞抗原の例としては、例えば、少なくとも、５Ｔ４、８Ｈ９、ａｎｂｂインテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体－ａ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲｃｃ、ＧＤ２、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｈｅｒ２、ＩＬ－１３Ｒｃｘ２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、Ｋａｐｐａ、ＫＤＲ、ＭＡＧＥ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃｌ６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＰ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、癌胎児性抗原、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＡＦＰ、ＣＡ－１２５、ＥＴＡ、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ、ラミニン受容体、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＢＦＮ１Ｇ－４、カルシウム活性化塩化物チャネル２、サイクリン－Ｂ１、９Ｄ７、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、ＳＡＰ－１、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ－ＥＳＯ－１／Ｌ ＡＧＥ－１、ＰＡＭＥ、ＳＳＸ－２、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＧＰ１００／ｐｍｅｌｌ７、ＴＲＰ－１／－２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、ｂ－カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ－２、ＴＧＦ＾ＲＩＩ、またはＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ２）が挙げられる。ＣＡＲは、第１世代、第２世代、第３世代またはそれを超える世代のＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、任意の２つの非同一の抗原に対して二重特異性であり得るか、または２つを超える非同一の抗原に対して特異的であり得る。

いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書で論じられるように、ａ－ＴＣＲおよび／またはｂ－ＴＣＲをコードする核酸配列を含み得る。特定の実施形態では、１つの核酸は、ａ－ＴＣＲとｂ－ＴＣＲの両方をコードする。追加の実施形態では、核酸は、自殺遺伝子産物をコードする核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、選択されたＣＤ３４＋細胞に導入される核酸分子は、ａ－ＴＣＲ、ｂ－ＴＣＲ、および自殺遺伝子産物をコードする。他の実施形態では、方法はまた、選択されたＣＤ３４＋細胞に自殺遺伝子産物をコードする核酸を導入することを含み、この場合、異なる核酸分子が、少なくとも１つのＴＣＲ遺伝子をコードする核酸とは異なる自殺遺伝子産物をコードする。

操作されたｉＮＫＴ細胞およびｉＮＫＴ細胞集団を調製、作製、製造および使用するための方法が提供される。方法は、実施形態において、以下の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれを超える工程を含む：造血細胞を得ること；造血前駆細胞を得ること；１またはそれを超える造血細胞になることができる前駆細胞を得ること；ｉＮＫＴ細胞になることができる前駆細胞を得ること；１またはそれを超える細胞表面マーカーを使用して混合細胞の集団から細胞を選択すること；細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を選択すること；細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を単離すること；ＣＤ３４＋およびＣＤ３４－細胞を互いに分離すること；ＣＤ３４以外の、またはＣＤ３４に加えて細胞表面マーカーに基づいて細胞を選択すること；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１またはそれを超える核酸を細胞に導入すること；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするウイルスベクターを細胞に感染させること；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１またはそれを超える核酸で細胞をトランスフェクトすること；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする発現コンストラクトで細胞をトランスフェクトすること；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性核酸を細胞のゲノムに組み込むこと；自殺遺伝子産物をコードする１またはそれを超える核酸を細胞に導入すること；自殺遺伝子産物をコードするウイルスベクターを細胞に感染させること；自殺遺伝子産物をコードする１またはそれを超える核酸で細胞をトランスフェクトすること；自殺遺伝子産物をコードする発現コンストラクトで細胞をトランスフェクトすること；自殺遺伝子産物をコードする外因性核酸を細胞のゲノムに組み込むこと；１またはそれを超えるポリペプチドをコードする１またはそれを超える核酸および／または遺伝子編集のための核酸分子を細胞に導入すること；遺伝子編集のための１またはそれを超えるポリペプチドおよび／または核酸分子をコードするウイルスベクターを細胞に感染させること；遺伝子編集のために１またはそれを超えるポリペプチドおよび／または核酸分子をコードする１またはそれを超える核酸で細胞をトランスフェクトすること；遺伝子編集のための１またはそれを超えるポリペプチドおよび／または核酸分子をコードする発現コンストラクトで細胞をトランスフェクトすること；遺伝子編集のために１またはそれを超えるポリペプチドおよび／または核酸分子をコードする外来性核酸を組み込むこと；細胞のゲノムを編集すること；細胞のプロモーター領域を編集すること；ｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子のプロモーター領域および／またはエンハンサー領域を編集すること；１またはそれを超える遺伝子の発現を排除すること；単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１またはそれを超えるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子の発現を排除すること；遺伝子編集のために１またはそれを超える核酸を細胞にトランスフェクトすること；単離された細胞または選択された細胞を培養すること；単離されたまたは選択された細胞を拡大させること；１またはそれを超える細胞表面マーカーについて選択された細胞を培養すること；ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養すること；単離されたＣＤ３４＋細胞を拡大すること；ｉＮＫＴ細胞を産生または増殖させる条件下で細胞を培養すること；人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生すること；無血清培地中での細胞を培養すること；Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択された集団および無血清培地を含む３Ｄ細胞凝集体を含む、ＡＴＯシステムにおいて細胞を培養すること。一実施形態では、１またはそれを超える工程を除外してもよいことが特に企図されている。

操作されたｉＮＫＴ細胞を作製するために使用され得る細胞は、造血前駆幹細胞である。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、またはそれらの組み合わせに由来し得る。本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰＣ）から操作された「ＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞」、インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞、ならびにその作製方法および使用方法を包含する。本明細書で使用される場合、「ＨＳＣ」は、ＨＳＣ、ＨＰＣ、またはＨＳＣとＨＰＣの両方を指すために使用される。「造血幹細胞および前駆細胞」または「造血前駆細胞」は、造血系統に拘束されるが、更なる造血分化が可能な細胞を指し、造血幹細胞、多能性造血幹細胞（造血芽細胞）、骨髄前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、およびリンパ球前駆細胞を含む。「造血幹細胞（ＨＳＣ）」は、骨髄（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含むすべての血球系を生じる多能性幹細胞である。本開示において、ＨＳＣは、「造血幹細胞および前駆細胞」および「造血前駆細胞」の両方を指す。造血幹細胞および造血前駆細胞は、ＣＤ３４を発現してもよく、または発現しなくてもよい。造血幹細胞は、ＣＤ１３３を共発現し、ＣＤ３８発現についてネガティブ、ＣＤ９０についてポジティブ、ＣＤ４５ ＲＡについてネガティブ、系統マーカーについてネガティブ、またはそれらの組み合わせであり得る。造血前駆細胞／前駆細胞としては、ＣＤ３４（＋）／ＣＤ３８（＋）細胞およびＣＤ３４（＋）／ＣＤ４５ＲＡ（＋）／ｌｉｎ（－）ＣＤ１０＋（共通リンパ球前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ６２Ｌ（ｈｉ）（リンパ球プライム多能性前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ１２３＋（顆粒球－単球前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ１２３＋（共通骨髄前駆細胞）またはＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ１２３－（巨核球－赤血球前駆細胞）が挙げられる。

特定の方法は、１またはそれを超える核酸を細胞に導入する前に、培地中で選択されたＣＤ３４＋細胞を培養することを含む。細胞を培養することは、選択されたＣＤ３４＋細胞を、１またはそれを超える増殖因子を含む培地とインキュベートすることを含み得る。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える増殖因子は、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む。更なる実施形態では、培地は、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、およびＴＰＯを含む。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える増殖因子の濃度は、各増殖因子またはこれらの特定の増殖因子のいずれかおよびすべての合計に対して約５ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌである。培地中の単一の増殖因子または増殖因子の組み合わせの濃度は、約、少なくとも約、または多くとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５ ３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４１０、４２０、４２５、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４７５、４８０、４９０、５００（または導出可能な任意の範囲）ｎｇ／ｍｌまたはｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度であり得る。

いくつかの実施形態では、細胞は、無細胞培地で培養される。特定の実施形態では、無血清培地は、外部添加アスコルビン酸を更に含む。特定の実施形態では、方法は、アスコルビン酸培地を添加することを含む。更なる実施形態では、無血清培地は、以下の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６種すべて（またはその中の誘導可能な範囲）の外部添加成分：ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、インターフェロン－ガンマ、インターフェロン－ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレオトロフィンまたはミドキンを更に含む。追加の実施形態では、無血清培地は、１またはそれを超えるビタミンを含む。ある場合には、無血清培地は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種の以下のビタミン（またはその中で誘導可能な任意の範囲）：ビオチン、ＤＬアルファトコフェロールアセテート、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２、またはそれらの塩を含む。特定の実施形態では、培地は、少なくともビオチン、ＤＬアルファ－トコフェロールアセテート、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、またはそれらの組み合わせもしくはそれらの塩を含む。追加の実施形態では、無血清培地は、１またはそれを超えるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、無血清培地は、１、２、３、４、５、６種またはそれを超える（またはその中で誘導可能な任意の範囲）の以下のタンパク質：アルブミンまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、またはそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、無血清培地は、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、または１１種の以下の化合物：コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ－カルニチン（Ｌ－ｃａｍｉｔｉｎｅ）、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、もしくはトリヨード－Ｉ－チロニン、またはそれらの組み合わせを含む。更なる実施形態では、無血清培地は、Ｂ－２７サプリメント、ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ Ｂ－２７サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、またはそれらの組み合わせを含む。追加の実施形態では、無血清培地は、アミノ酸、単糖類、および／または無機イオンを含むか、または更に含む。いくつかの態様では、無血清培地は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３種の以下のアミノ酸：アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシンもしくはバリン、またはそれらの組み合わせを含む。他の態様では、無血清培地は、１、２、３、４、５、または６種の以下の無機イオン：ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、もしくはリン、またはそれらの組み合わせもしくはそれらの塩を含む。追加の態様では、無血清培地は、１、２、３、４、５、６または７種の以下の元素：モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、もしくはマンガン、またはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの方法では、細胞は人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で培養される。ＡＴＯシステムは、細胞の凝集体である三次元（３Ｄ）細胞凝集体を含む。特定の実施形態では、３Ｄ細胞凝集体は、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む。いくつかの実施形態では、３Ｄ細胞凝集体は、ＣＤ３４＋形質導入細胞を物理的マトリックスまたは足場上の間質細胞の選択された集団と混合することによって作製される。更なる態様では、方法は、ＣＤ３４＋形質導入細胞および間質細胞を遠心分離して、物理的マトリックスまたは足場上に置かれる細胞ペレットを形成することを含む。特定の実施形態では、間質細胞は、インタクトな、部分的な、または改変されたＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、またはそれらの組み合わせであるＮｏｔｃｈリガンドを発現する。更なる実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ヒトＮｏｔｃｈリガンドである。他の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ヒトＤＬＬ１である。

細胞は直ちに使用されてもよく、または将来の使用のために保存されてもよい。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞を作製するために使用される細胞は凍結されるが、産生されたｉＮＫＴ細胞はいくつかの実施形態では凍結され得る。いくつかの態様では、細胞は、デキストロース、１またはそれを超える電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含む溶液中にある。他の実施形態では、細胞は、滅菌され、非発熱原性であり、等張性である溶液中にある。いくつかの実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、造血幹細胞に由来する。いくつかの実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４＋細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、癌を有していないヒト患者由来の細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＴＣＲを発現しない。

操作されたｉＮＫＴ細胞は、患者を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、方法は、以前に凍結および解凍されていてもよく、またはそうでなくてもよい１またはそれを超える追加の核酸を細胞集団に導入することを含む。この使用は、既製のｉＮＫＴセルを作製する利点の１つを提供する。特定の実施形態では、１またはそれを超える追加の核酸は、１またはそれを超える治療用遺伝子産物をコードする。治療用遺伝子産物の例としては、少なくとも以下が挙げられる：１．抗原認識分子、例えばＣＡＲ（キメラ抗原受容体）および／またはＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）；２．共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ；および／または３．サイトカイン、例えば、ＩＬ－１ｃｃ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ－ａ、ＴＧＦ－ｂ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ；４．転写因子、例えば、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ－３、ＲＯＲｙｔ、ＦＯＸＰ ３およびＢｃｌ－６。治療用抗体は、キメラ抗原受容体、一本鎖抗体、モノボディ、ヒト化抗体、抗体、二重特異性抗体、一本鎖ＦＶ抗体またはそれらの組み合わせと同様に含まれる。

いくつかの実施形態では、本発明は、操作された細胞または組成物を対象に送達するための薬物送達装置、例えばシリンジと共に包装された本発明による１またはそれを超える操作された細胞または組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、操作された細胞を培養および／または保存するための１またはそれを超える試薬と共に包装された本発明による１またはそれを超える操作された細胞または組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞を活性化する１またはそれを超える薬剤、例えばＣＡＲおよび少なくとも１つの追加の導入遺伝子を含むｉＮＫＴ細胞と共にパッケージングされた本発明による１またはそれを超える操作された細胞または組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＯＰ９－ＤＬ１間質細胞および／またはＭＳ５－ＤＬ４間質細胞と共にパッケージングされた本発明による１またはそれを超える操作された細胞または組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、抗原提示細胞またはＣＤ１ｄ発現人工抗原提示細胞と共に包装された本発明による１またはそれを超える操作された細胞または組成物を含むキットを提供する。

本発明の方法は、任意の数の症状および／または疾患を処置するための操作された細胞を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象を処置する方法であって、本発明による１またはそれを超える操作された細胞、本発明の方法に従って作製された１もしくはそれを超える操作された細胞、または本発明による１もしくはそれを超える組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、マウスまたは被験動物等の動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、癌、細菌感染症、ウイルス感染症、アレルギーまたは自己免疫疾患を有する。いくつかの実施形態では、癌は、黒色腫、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、リンパ腫、白血病、または血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、対象は、結核、ＨＩＶまたは肝炎を有する。いくつかの実施形態では、対象は、喘息または湿疹を有する。いくつかの実施形態では、対象は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、または関節炎を有する。いくつかの実施形態では、対象には、治療有効量の１またはそれを超える操作された細胞が投与される。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える操作された細胞の治療有効量は、処置される対象の体重１ｋｇ当たり約１０×１０７～約１０×１０９細胞である。いくつかの実施形態では、本方法は、ｉＮＫＴ細胞を活性化する薬剤、例えばα－ＧａｌＣｅｒまたはその塩もしくはエステル、α－ＧａｌＣｅｒ提示樹状細胞または人工ＡＰＣを、１またはそれを超える操作された細胞の投与前、投与中、および／または投与後に投与することを更に含む。

特定の態様では、本開示は、増強された抗腫瘍表現型を有するＴ細胞を産生するためのシステムおよび方法を提供する。特に、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、および少なくとも１つの追加の導入遺伝子を含む複数の導入遺伝子で操作された幹細胞（例えば、ＨＳＣ）からＴ細胞を作製する方法を提供する。ＨＳＣから出発することによって、本発明のシステムおよび方法は、改善された抗腫瘍表現型を有するＴ細胞の製造のための幹細胞の自己再生および細胞分化能を利用する。特に、本開示は、ＴＣＲ、ＣＡＲ、および少なくとも１つの追加の導入遺伝子をコードするＣＤ３４＋幹細胞への核酸の導入を提供する。ＴＣＲおよびＣＡＲの組み合わせ発現は、Ｔ細胞に特異的な癌細胞標的化特性を提供するのに有用である。さらに、少なくとも１つの追加の導入遺伝子を備え、本発明の方法によって産生されたＴ細胞は、標的癌細胞と接触したときに癌を処置するのに有用なカーゴ（例えば、サイトカイン）で武装している。

例えば、好ましい実施形態では、本発明の方法は、レンチウイルス形質導入を介して核酸をＨＳＣに導入することを含む。１またはそれを超える核酸の導入は、少なくとも１つのＴＣＲ、ＣＡＲ、および追加の導入遺伝子を発現するＨＳＣを提供する。追加の導入遺伝子の組み込みは、改善された機能的特性、例えば、改善された細胞の拡大、持続性、安全性および／または抗腫瘍活性を有する治療用Ｔ細胞を提供するために有用である。

１またはそれを超える追加の導入遺伝子は、１またはそれを超えるサイトカイン、チェックポイント阻害剤、トランスフォーミング増殖因子ベータシグナル伝達の阻害剤、サイトカイン放出症候群の阻害剤、または神経毒性の阻害剤を含み得る。例えば、１またはそれを超えるＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８またはＩＬ－２１をコードする導入遺伝子が提供され得る。

したがって、場合によっては、本発明の方法は、例えば、１またはそれを超えるＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１－１５をコードする核酸を導入することによって、拡大および持続能力が改善されたＣＡＲ Ｔ細胞の製造を提供する。場合によっては、方法は、例えば、１またはそれを超えるＩＬ－１２、ＩＬ－１８をコードする導入遺伝子の導入によって、ＣＡＲ Ｔ細胞にＩＦＮ－ｇ産生の増加、したがってＴ細胞効力の改善をもたらし得る。他の例では、本発明の方法は、ＩＬ－２１を含む導入遺伝子を導入することによってナイーブＴ細胞産生を増強するのに有用である。場合によっては、本明細書に記載される方法は、例えば、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦまたはサイトカイン放出症候群および神経毒性の他のメディエーターの阻害剤を導入することによって、安全性が改善されたＣＡＲ Ｔ細胞の産生を提供する。方法は、例えば、ＴＧＦ－Ｂの阻害剤、チェックポイントの阻害剤を介して、腫瘍微小環境に対抗するのに有用なペイロードを提供することによって、改善された有効性を有するＣＡＲ Ｔ細胞を提供し得る。

本発明の特定の方法は、単一のｉｎ ｖｉｔｒｏ性化工程を含む。場合によっては、Ｔ細胞は、例えば１～３日間、試薬で短時間活性化され、その後、活性化試薬は、細胞を連続的に刺激せず、したがって細胞を疲弊させないように培地から除去されることが多い。活性化後、活性化されたＴ細胞集団は、急速に拡大し、例えば、２４時間毎に数が倍になり得る。いくつかの試薬を添加して、拡大を促進してもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、培養培地に１またはそれを超えるＩＬ－７／１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２＋２１、ＩＬ－１２またはＩＬ－１８を補充し得る培養培地を含む。

場合によっては、単一の活性化工程は、ＰＭＢＣに基づくＴ細胞活性化を含む。したがって、活性化工程は、ａＧＣ担持ＰＢＭＣ、可溶性抗ＣＤ３／２８ポジティブＰＢＭＣ、および可溶性抗ＣＤ２／３／２８ポジティブＰＢＭＣをＴ細胞に導入することを含み得る。場合によっては、活性化工程は、抗原提示細胞（ａＡＰＣ）ベースのＴ細胞活性化工程を含む。したがって、活性化工程は、Ｔ細胞をａＡＰＣに導入することを含み得る。ａＡＰＣは、ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－ＣＡＲ抗原を発現する操作されたＫ５６２細胞であり得る。ａＡＰＣは、ａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄおよび／またはａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄ＋／－ａＧＣであり得る。他の例では、活性化工程はフィーダーフリーベースのＴ細胞活性化工程を含む。フィーダーフリーベースのＴ細胞活性化工程は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２／３／２８、ＣＤ３／２８を含む可溶性抗体をＴ細胞に導入することを含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化工程は、活性化拡大培養培地ＩＬ－７／１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２＋２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８に添加された異なるサイトカインの存在下でＴ細胞を培養することを含む。

以下の実施例は、本発明の方法によって提供されるＣＤ３４＋細胞からＴ細胞（例えば、ｉＮＫＴ）を製造するための有用な例示的プロトコルを提供する。更なる例および議論については、参照により組み込まれる国際公開第２０１９２４１４００号ＡＩを参照されたい。

実施例
以下の実施例は、本発明の方法によって提供されるように、単一の活性化工程を使用して幹細胞からＴ細胞を製造するための有用な例示的プロトコルを提供する。更なる例および議論については、参照により組み込まれる国際公開第２０１９２４１４００号Ａ１を参照されたい。

実施例１：ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ細胞培養およびレンチウイルス形質導入
－２日目：予備刺激

１．ＰＢＳで希釈した０．５ｍＬ／ウェルの２０ｕｇ／ｍｌレトロネクチン（ＲＮ）で２４ウェル非組織培養処置プレートの適切なウェル数（約１５×１０^３細胞／ウェルを播種するか、０．１×１０^６アリコートの場合は６ウェルを播種することが推奨される）をコーティングする。１ｍｇ／ｍＬのＲＮストックアリコートを、６０マイクロリットルのアリコートで－２０℃で保存してもよい。

２．室温（ＲＴ）で２時間（ｈ）インキュベートする。

３．ＲＮを吸引し、ＰＢＳで希釈した０．５ｍｌ／ウェルの２パーセントＢＳＡと交換する。３０パーセントＢＳＡアリコートを－２０℃で保存する。

４．室温で３０分間インキュベートする。

５．吸引し、０．５ｍｌ／ウェルのＰＢＳで置き換える。

６．標準的な手順に従ってＣＤ３４＋細胞の０．１×１０^６アリコートを幹細胞培地中に解凍し、３００ｇで１０分間回転させる。

７．上清を吸引し、幹細胞培地に再懸濁し、血球計を用いて計数し、細胞数を記録する。場合によっては、本出願人は、０．１×１０^６アリコートの細胞数が低すぎて信頼性がないことを見出した。

８．ＣＤ３４＋細胞を幹細胞培地で０．０５×１０^６細胞／ｍｌに希釈する。

９．ＰＢＳをＲＮコーティングウェルから吸引し、３００ｕｌ細胞／ウェルを播種する（約１５×１０^３細胞／ウェル）。

１０．３７℃、５パーセントＣＯ２で１２～１８時間インキュベートする。

－１日目：形質導入

１．濃縮レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を解凍し、穏やかにピペット操作して混合する（ボルテックスせず、再凍結しない）。

２．形質導入チューブを準備する。
ａ．１００～２００のＭＯＩに十分な体積を計算することによって、適切な体積のＬＶＶを１．５ｍｌチューブに移す。
ｂ．適切な体積のＰＧＥ２を同じチューブに添加して、総培養体積の１０ｎＭの最終濃度を達成する。
ｃ．適切な体積のポロキサマーを同じチューブに添加して、総培養体積のｌｕｇ／ｕｌの最終濃度を達成する。

３．形質導入チューブの内容物を適切な培養ウェルおよび揺動プレートに静かに添加して混合する

４．細胞を３７℃、５パーセントＣＯ２で２４時間インキュベートする。

０日目の採取

１．細胞を静かにピペッティングしてプレートから取り出し、コニカルチューブに移すことによって細胞を収集する。

２．ウェルを等量の冷Ｘ－ＶＩＶＯ－１５で洗浄して、まだプレートに付着している細胞を除去し、コニカルチューブに移す。

３．顕微鏡下で確認し、必要に応じて冷Ｘ－ＶＩＶＯ－１５で追加の洗浄を実施し、プレートからすべての細胞を収集する。

４．３００ｇで１０分間回転させ、上清を吸引する。

５．段階２（すなわち、実施例２）に進む。

実施例２：ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の生成；分化
０～１４日目：分化（期間：２週間）

１．１２ウェル非組織培養処置プレートの適切なウェル数（１，０００～２，０００細胞／ウェルまたは１２ウェル／１５，０００細胞を播種するために推奨される）を、リンパ球分化コーティング材料（ＬＤＣＭ）、例えば、ＳＴＥＭＣＥＬＬによりＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で提供され、ＰＢＳで１：２００希釈されたリンパ球分化材料で１ｍｌ／ウェルでコーティングする。４℃で１２～１８時間インキュベートする。

２．ＬＤＣＭを吸引し、２ｍｌ／ウェルのＰＢＳを添加する

３．段階１（すなわち、実施例１）で収集された形質導入ＣＤ３４＋細胞を、リンパ球前駆細胞拡大培地（ＬＰＥＭ）、例えば、ＳＴＥＭＣＥＬＬによってＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で販売されているリンパ球前駆細胞拡大培地に再懸濁する。

４．ＬＰＥＭで細胞密度を１～２×１０^３細胞／ｍｌに調整する

５．ＬＤＣＭ被覆プレートからＰＢＳを吸引する

６．０．７５ｍｌ細胞／ウェルをＬＣＤＭ被覆プレートに播種する

７．細胞を３７℃、５パーセントＣＯ２でインキュベートする

８．３日目に、０．２５ｍｌ／ウェルの新鮮なＬＰＥＭを添加し、培養を継続する

９．７および１１日目に、細胞を乱さずに０．５ｍｌ／ウェル未満を慎重に除去し、０．５ｍｌ／ウェルの新鮮なＬＰＥＭを補充する

１０．１４日目まで培養を継続

１１．段階３に進む（すなわち、実施例３）

実施例３：ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の生成；成熟
１４～２１日目＋：成熟（期間：１～２週間）

１．ＰＢＳで１：２００に希釈した２ｍｌ／ウェルのＬＤＣＭで６ウェル非組織培養処置プレートの適切なウェル数（５０～１００×１０^３／ウェルを播種することが推奨される）をコーティングする。播種の前日に調製する場合は４℃で１２～１８時間、播種の当日に調製する場合は３７℃で２時間インキュベートする。

２．ＬＤＣＭを吸引し、４ｍＬ／ウェルのＰＢＳを添加する

３．１４日目に、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒによってＶｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲの商品名で提供される細胞生存率カウンター等の細胞生存率カウンターを使用して細胞を採取し、計数する。
ａ．細胞を静かにピペッティングしてプレートから取り出し、コニカルチューブに移すことによって細胞を収集する。
ｂ．冷ＳＦＥＭ ＩＩの１ｍｌ／４ウェルでウェルを洗浄して、まだプレートに付着している細胞を除去し、コニカルチューブに移す
ｃ．顕微鏡下で確認し、必要に応じて冷ＳＦＥＭ ＩＩで追加の洗浄を実施し、プレートから細胞を収集する。

４．０．２×１０^６細胞のアリコートを取り出し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。

５．適切な体積の細胞を取り出して段階３のために播種し、３００ｇで１０分間ペレット化する。

６．上清を吸引する。

７．Ｔ細胞前駆体成熟培地（ＴＰＭＭ）、例えば、ＳＴＥＭＣＥＬＬによりＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で提供されるＴ細胞前駆体成熟培地中に２．５～５×１０^４細胞／ｍｌで細胞を再懸濁する。

８．ＬＤＣＭ被覆プレートからＰＢＳを吸引する。

９．２ｍｌ細胞／ウェルをＬＤＣＭコーティングプレートに播種した。

１０．細胞を３７℃、５パーセントＣＯ２でインキュベートする

１１．残存細胞を３００ｇで１０分間ペレット化する。

１２．２～５×１０^６細胞／ｍＬを達成するため、残存細胞を吸引し、適切な体積の凍結保存溶液（例えば、ＳＴＥＭＣＥＬＬによってＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０の商品名で販売されている凍結保存溶液）に再懸濁する。

１３．１ｍｌ／クライオバイアルに小分けし、適切に凍結する（例えば、マイナス８０℃の冷凍庫内）；凍結２４時間以内に液体窒素保存に移す。

１４．１７日目に、２ｍｌ／ウェルの新鮮なＴＰＭＭを添加し、培養を継続する。

１５．２１日目に、ウェルの中央にある細胞から１００ｕｌをピペットで取ることによってフローサイトメトリー用の試料を採取し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。

１６．ウェルの中心にある細胞から別の１００μｌを取り、細胞生存率カウンターを用いて計数する。

１７．ＴＣＲ発現が５０％超であり、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ発現が２０％超であり、細胞サイズが減少している場合（ＨＳＣからＴ細胞への発達を示す）、細胞を凍結保存し、同種療法のために提供され得るか、または必要に応じて、段階４によって提供されるように拡大され得る。これらのパラメータが満たされない場合、必要なフィードおよび分割を行って培養を継続する。２ｍｌ／ウェル未満を除去し、３～４日毎に２ｍｌ／ウェルの新鮮なＴＰＭＭを補充し、コンフルエンスに近づく場合は培養物を分割する。上記の基準が満たされるまで、２４／２５日目および２８日目にこのチェックを再度実施する。

段階４：ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の生成；任意の拡大：
２１～２８日目（２１日目に基準が満たされたと仮定して、それに応じて調整する）：刺激（期間：１週間）

１．２１日目に、細胞生存率カウンターを使用して細胞を採取および計数する（関連するエクセルシートにカウントを記録する）
ａ．細胞を静かにピペッティングしてプレートから取り出し、コニカルチューブに移すことによって細胞を収集する
ｂ．プレートにまだ付着している細胞を除去し、コニカルチューブに移すために、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによってＯｐＴｍｉｚｅｒの商品名で提供される細胞拡大培地等の冷細胞拡大培地（ＥＭ）でウェルを洗浄する（４ウェルあたり２ｍｌ）
ｃ．顕微鏡下で確認し、必要に応じて冷ＥＭで追加の洗浄を実施し、プレートから細胞を収集する。
ｄ．０．２×１０^６細胞のアリコートを取り出し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
ｅ．適切な体積の細胞を取り出して段階４のために播種し、３００ｇで１０分間ペレット化する。
ｆ．上清を吸引する。
ｇ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ中２×１０^６細胞／ｍｌで細胞を再懸濁する

２．刺激の所望の方法（複数可）に応じて、以下の命令のサブセットに従う。ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度を１×１０^６ｍｌの条件の間で固定する
ａ．刺激なし
ｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ培地で細胞を１×１０^６細胞／ｍｌに希釈する
ｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５パーセントＣＯ２でインキュベートする
ｂ．コーティングされたＣＤ３／可溶性ＣＤ２８
ｉ．プレートを１．２３ｕｇ／ｍｌのＣＤ３で３７℃で２時間コーティングし、使用前にＰＢＳで洗浄する。
ｉｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭで細胞を１×１０^６細胞／ｍｌに希釈する。
ｉｉｉ．可溶性ＣＤ２８を細胞懸濁液に１ｕｇ／ｍｌで添加する。
ｉｖ．細胞を播種し、３７℃、５パーセントＣＯ２でインキュベートする。
ｃ．ＰＢＭＣを含む可溶性ＣＤ３／可溶性ＣＤ２８
ｉ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、６，０００ｒａｄで照射する。
ｉｉ．ＩＬ－７およびＩＬ－１５と共にＥＭ中にＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍｌで再懸濁する。
ｉｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０^６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をＰＢＭＣと１：２～３（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ＰＢＭＣ）の比で組み合わせる。
ｉｖ．可溶性ＣＤ３および可溶性ＣＤ２８を細胞懸濁液に１ｕｇ／ｍｌで添加する。
ｖ．細胞を播種し、３７℃、５パーセントＣＯ２でインキュベートする。
ｄ．ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化因子、例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒの商品名で販売されている活性化因子を提供する。
ｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭ培地で細胞を１×１０^６細胞／ｍｌに希釈する。
ｉｉ．ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化因子を２５ｕｌ／ｍｌで細胞懸濁液に添加する。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５パーセントＣＯ２でインキュベートする。
ｅ．ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子、例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒの商品名で販売されている活性化因子を提供する。
ｉ．１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭで細胞を１×１０^６細胞／ｍｌに希釈する。
ｉｉ．ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子を２５ｕｌ／ｍｌで細胞懸濁液に添加する。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５パーセントＣＯ２でインキュベートする。
ｆ．ａＧＣ－担持ＰＢＭＣ
ｉ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍する。
ｉｉ．２ｕｇ／ｍｌ ａＧＣを含むＥＭ中１０×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁し、３７℃、５パーセントＣＯ２で１時間インキュベートする。
ｉｉｉ．ａＧＣ担持ＰＢＭＣを収集し、６，０００ｒａｄで照射する。
ｉｖ．未結合ａＧＣを除去するために、ＥＭで細胞を少なくとも２回の洗浄を実施する
ｖ．ＩＬ－７およびＩＬ－１５と共にＥＭ中にＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍｌで再懸濁する。
ｖｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０^６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をＰＢＭＣと１：２～３（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ＰＢＭＣ）の比で組み合わせる。
ｖｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５パーセントＣＯ２でインキュベートする。
ｇ．Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
ｉ．培養物からａＡＰＣを収集し、１０，０００ｒａｄで照射する。
ｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０^６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をａＡＰＣと４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比で組み合わせる。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５パーセントＣＯ２でインキュベートする。
ｈ．Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ－ＣＤ１ｄ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ－ＣＤ１ｄ）。
ｉ．培養物からａＡＰＣを収集し、１０，０００ｒａｄで照射する。
ｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０^６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をａＡＰＣと４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比で組み合わせる。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５パーセントＣＯ２でインキュベートする。
ｉ．ａＧＣ担持Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ－ＣＤ１ｄ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ－ＣＤ１ｄ）。
ｉ．培養からａＡＰＣを収集する。
ｉｉ．２ｕｇ／ｍｌ ａＧＣを含むＥＭ中１０×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁し（α－ＧａｌＣｅｒ Ｐｒｅｐ ＳＯＰを参照）、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
ｉｉｉ．ａＧＣ担持ａＡＰＣを収集し、１０，０００ｒａｄで照射する。
ｉｖ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０^６細胞／ｍｌになるように、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞をａＡＰＣと４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比で組み合わせる。
ｖ．細胞を播種し、３７℃、５パーセントＣＯ２でインキュベートする。

３．２４日目に、細胞カウンター（関連するエクセルシートにカウントを記録する）を用いて細胞を計数し、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭを用いて細胞を１×１０^６細胞／ｍｌに希釈し、必要に応じて培養容器を移す。ＰＢＭＣまたはａＡＰＣを利用する場合、この時点で採取された細胞数は解釈が困難な場合があり、この場合、細胞を乱すことなく培養培地の半分を慎重に除去し、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含む同等の体積の新鮮なＥＭを添加する。ＰＢＭＣまたはａＡＰＣを用いない条件が希釈を必要としない場合、この半培地交換も実施する。

４．２６日目に、細胞生存率カウンター（関連するエクセルシートにカウントを記録する）を用いて細胞を計数し、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭを用いて細胞を１×１０^６細胞／ｍｌに希釈し、必要に応じて培養容器を移す。

５．２８日目に、細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌを使用して計数する（関連するエクセルシートにカウントを記録する）。
ａ.０．２×１０^６細胞のアリコートを取り出し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
ｂ．追加のフロー染色の特徴付けのために、０．２×１０^６個の細胞のアリコートを取り出し、９６ウェルＶ底プレートに播種する。
ｃ．１×１０^６細胞のアリコートを採取し、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＥＭを使用して１×１０^６細胞／ｍｌに希釈し、長期追跡のために播種する（任意工程、細胞凍結完了後に優先させる）。
ｄ．残存細胞を３００ｇで１０分間ペレット化し、上清を吸引する。
ｅ．適切な体積の凍結保存培地に再懸濁して、２５～５０×１０^６細胞／ｍＬを達成する。
ｆ．１ｍｌ／クライオバイアルに分注し、適切に凍結させ、凍結から２４時間以内に液体窒素貯蔵部に移す。

実施例５：ＨＳＣからのマルチＴＣＲ Ｔ細胞の生成
この実施例は、単一の活性化工程が使用され、３０日以内に完了する、本発明の方法を使用してＴ細胞を産生するための実験結果およびデータを提供する。

図４は、この実施例のＴ細胞を産生するために使用される工程の概要を提供する。図４に示すように、使用した方法は、上記の実施例１～４で説明したものに倣う。この実施例では、臍帯血を２人のドナー（ＡＢＪＹ００６の「ドナーＡ」およびＡＢＪＹ０１４の「ドナーＢ」）から得た。ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを臍帯血から得た。

－２日目に、臍帯血ＨＳＰＣを、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５培地、Ｆｌｔ３－リガンド、幹細胞因子、トロンボポエチンおよびＩＬ－３中で短期培養に供し、その間に、実施例１～４に記載されるように、細胞にウイルスベクターを形質導入した。この短期培養中に分化は起こらなかった。

０日目に、形質導入細胞を分化工程に供した。リンパ球分化コーティング材料（好ましくはＤＬＬ４を含む）上で培養したリンパ球前駆体拡大培地を使用して細胞を培養した。分化中、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、細胞をＴ細胞系統に向かわせるが、これは、細胞における最初のＴＣＲ表面発現において明らかであった。

１４日目に、好ましくはＤＬＬ４を含むリンパ球コーティング材料上で培養した前駆細胞成熟培地を使用して細胞を成熟させた。この成熟化工程の間、Ｔ細胞は発達を継続し、ＣＤ４およびＣＤ８のダブルポジティブ表面発現を得た。

２１日目に、単一の活性化工程を用いて細胞を活性化した。細胞を、ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ培地および活性化試薬（ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ－７およびＩＬ－１５）を使用して活性化した。活性化中、Ｔ細胞は、ダブルネガティブ（ＣＤ４－／ＣＤ８－）またはＣＤ８シングルポジティブ表面発現への発達を完了した。

「ドナーＡ」（ＡＢＪＹ００６）の臍帯血から得られた幹細胞に、以下に示すようにコンストラクトをコードする４つの異なるベクターの１つを形質導入し、図４に概説されるプロセスに従って製造した。

試料ＩＤ コンストラクト
ＡＣＵＡ ＃１ ｉＮＫＴ＋ＣＤ １９．１ ｄｕａｌ Ｔｄ
ＡＣＵＡ ＃２ ｉＮＫＴ－ｓＩＬ１５＋ＣＤ１９．１ ｄｕａｌ Ｔｄ
ＡＣＵＡ ＃３ ｉＮＫＴ－ＣＤ １９．１－ｓＩＬ １５ ｓｉｎｇｌｅ Ｔｄ
ＣＡＲＴ ＃１ キメラ抗原受容体（対照として）

したがって、３つの試料に、幹細胞を特異的受容体を発現するｉＮＫＴ細胞に分化させるように設計されたコンストラクトを形質導入した。第４の試料にＣＡＲコンストラクトを形質導入し、これを対照として使用した。

図５Ａ～図５Ｂは、細胞に曝露された場合のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣおよびＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱを認識するｍＡｂについてのアッセイ結果を提供する。示されるように、ＡＣＵＡ＃１、＃２および＃３について、ＣＡＲＴ＃１対照と比較した場合、ＭＨＣＩ／ＩＩ発現はほとんどなく、これは、ＭＨＣＩ／ＩＩ、ユニバーサルＨＳＣ操作ヒトｉＮＫＴ細胞の発現が低い細胞の産生の成功を示している。

図６は、図５Ａ～図５ＢのｉＮＫＴ細胞のアッセイ結果を提供し、それらのＴＣＲ発現およびＣＤ４／ＣＤ８発現を示す。ＴＣＲ発現結果に基づいて示されるように、製造プロセスが進行するにつれて、ＮＫＴ細胞の数は、数および総細胞の割合の両方で増加する。また示されるように、得られた細胞は適切にはＣＤ８＋／ＣＤ４－またはＣＤ８－／ＣＤ４－である。

「ドナーＢ」（ＡＢＪＹ０１４）の臍帯血から得られた幹細胞に、以下に示すようにコンストラクトをコードする２つの異なるベクターの１つを形質導入し、図４に概説されるプロセスに従って製造した。

試料ＩＤ コンストラクト
ＡＣＵＡ ＃４ ｉＮＫＴ－ＣＤ１９．１－ｓＩＬ１５
ＣＡＲＴ ＃２ キメラ抗原受容体（対照として）

したがって、１つの試料に、幹細胞を特異的受容体を発現するｉＮＫＴ細胞に分化させるように設計されたコンストラクトを形質導入した。第２の試料にＣＡＲコンストラクトを形質導入し、これを対照として使用した。

図７Ａ～図７Ｂは、細胞に曝露された場合のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣおよびＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱを認識するｍＡｂについてのアッセイ結果を提供する。示されるように、ＡＣＵＡ＃４について、ＣＡＲＴ＃１対照と比較した場合、ＭＨＣＩ／ＩＩ発現はほとんどなく、これは、ＭＨＣＩ／ＩＩ、ユニバーサルＨＳＣ操作ヒトｉＮＫＴ細胞の発現が低い細胞の産生の成功を示している。

この実施例に示されるように、本発明の方法は、単一の活性化工程および３０日以内に終了する全プロセスを使用して、ＨＳＣから開始して、複数のタイプの操作された免疫細胞を首尾よく作製することができる。
参照による組み込み

特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ等の他の文書への参照および引用は、本開示を通して行われている。そのようなすべての文書は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
等価物

本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の様々な修正およびその多くの更なる実施形態は、本明細書に引用された科学文献および特許文献への参照を含むこの文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。

Claims (32)

1. Ｔ細胞を産生する方法であって、
   造血幹細胞（ＨＳＣ）のＴ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および成熟を含むプロセスを行うことを含むが、ただし、前記プロセスが、前記Ｔ細胞の活性化のその後のｉｎ ｖｉｔｒｏ工程を含まないことを条件とする、方法。
2. 前記方法が、対象への導入後にｉｎ ｖｉｖｏで前記Ｔ細胞を活性化および拡大させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｔ細胞が、ＴＣＲネガティブ細胞から精製される、請求項１に記載の方法。
4. 前記方法が、細胞精製工程を伴わずに実施される、請求項１に記載の方法。
5. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏのプロセスが、前記ＨＳＣに少なくとも１つのＴＣＲまたはＣＡＲを発現させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＨＳＣが、前駆細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
7. 前記前駆細胞が、多能性幹細胞である、請求項６に記載の方法。
8. 前記多能性幹細胞が、体液から得られる、請求項７に記載の方法。
9. 前記幹細胞を分化させることが、ダブルネガティブ前駆Ｔ細胞を生成することを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記ダブルネガティブ前駆細胞をサイトカインおよび／またはケモカイン、ならびに増殖因子のカクテルで処置し、それにより前記Ｔ細胞を産生することを更に含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記方法が、前記Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大させることを含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記方法が、５週間未満で実施される、請求項１に記載の方法。
13. 前記Ｔ細胞を分析して、前記Ｔ細胞によって発現される１またはそれを超えるタンパク質を同定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記１またはそれを超えるタンパク質が、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、またはＣＤ４５ＲＡを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記Ｔ細胞を凍結保存することを更に含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記Ｔ細胞が、インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞である、請求項１に記載の方法。
17. 前記ｉＮＫＴ細胞が、アルファ／ベータｉＮＫＴ細胞である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ＨＳＣ細胞が、１またはそれを超える追加の導入遺伝子を更に含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記１またはそれを超える追加の導入遺伝子が、少なくとも１つのサイトカイン、チェックポイント阻害剤、トランスフォーミング増殖因子ベータシグナル伝達の阻害剤、サイトカイン放出症候群の阻害剤、または神経毒性の阻害剤を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つを含む、請求項１９に記載の方法。
21. Ｔ細胞を産生する方法であって、
    １つ以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化工程を伴うＴ細胞への造血幹細胞（ＨＳＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および成熟を含むプロセスを行うことと、
    処置に使用するために前記Ｔ細胞を提供することと
    を含む、方法。
22. 前記方法が、単一のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性化工程を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記活性化工程が、活性化抗体を含む活性化培地中で前記Ｔ細胞を培養することを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記Ｔ細胞活性化工程の間に、前記方法が、異なるタイプの活性化抗体を前記Ｔ細胞に導入することを含まない、請求項２２に記載の方法。
25. 前記Ｔ細胞活性化工程が、７日間以下続く、請求項２２に記載の方法。
26. 前記活性化工程が、ＰＢＭＣベースのＴ細胞活性化工程を含む、請求項２２に記載の方法。
27. 前記活性化工程が、アルファ－ガラクトシルセラミド担持ＰＢＭＣ、可溶性抗ＣＤ３／ＣＤ２８＋ＰＢＭＣ、および可溶性抗ＣＤ２／３／２８＋ＰＢＭＣを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記活性化工程が、ａＡＰＣベースのＴ細胞活性化工程を含む、請求項２２に記載の方法。
29. 前記活性化工程が、ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－ＣＡＲ抗原、ａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄおよび／またはａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄ＋／－ａＧＣを発現する操作されたＫ５６２細胞を含むａＡＰＣを含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記活性化工程が、フィーダーフリーベースのＴ細胞活性化工程を含む、請求項２２に記載の方法。
31. 前記活性化工程が、抗ＣＤ３＋、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２／３／２８、および抗ＣＤ３／２８を含む可溶性抗体を含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記活性化工程が、１またはそれを超えるＩＬ－７／１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２＋２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８またはＩＬ－１５を含む培養培地を含む、請求項２２に記載の方法。