CN112430575B - 通用型car-t细胞及其制备方法、应用以及抗肿瘤药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通用型CAR‑T细胞及其制备方法、应用以及抗肿瘤药物，涉及CAR‑T细胞技术领域。本发明公开的制备方法包括：往经电转技术处理后敲除TCRα/β基因和β2M基因的T细胞中加入刺激剂以刺激T细胞；所述刺激剂包括CD3抗体与CD28抗体。该制备方法可获得更多数量的通用型CAR‑T细胞，采用该制备方法所制得的通用型CAR‑T细胞具有正常的肿瘤杀伤功能，可以用于到抗肿瘤治疗中。
Description
技术领域
本发明涉及CAR-T细胞技术领域，具体而言，涉及一种通用型CAR-T细胞及其制备方法、应用以及抗肿瘤药物。
背景技术
过继性免疫细胞治疗是生物治疗技术的一种，对自体免疫细胞进行体外扩增或基因修饰，然后将其回输给肿瘤患者来治疗的方法，被认为是继手术、放疗以及化疗之后的第四种治疗方式，在临床治疗中广泛应用。
嵌合抗原受体又称CAR，是模拟TCR功能的人工受体，将单链抗体scfv取代TCR的，并引入4-1BB或CD28等胞内信号域。单链抗体特异靶向肿瘤细胞表面抗原，然后通过铰链区和跨膜区将信号传递至细胞内，胞内信号域再将信号转化为活化信号，激活效应细胞；效应细胞通过分泌穿孔素或产生细胞因子杀伤肿瘤细胞，同时效应细胞本身也扩增，进一步扩大免疫杀伤作用。
随着2017年8月以来美国FDA先后批准靶向CD19的两个CAR-T产品上市(诺华制药的kyriamh和凯特制药的yescarta)，CAR-T细胞在血液病肿瘤治疗的需求不断升高。但是目前过继性细胞治疗还是基于自体细胞的回输治疗方式，每个患者都有单独制备CAR-T细胞，操作复杂，生产制备成本非常昂贵，诺华制药kyriamh产品的上市价格为每例47.5万美元，凯特制药的yescarta价格也要37.5万美元。另外，大部分肿瘤患者在进行CAR-T细胞治疗前均经过反复多次的其他方式治疗，尤其是放化疗，这就导致从其外周血获得的T淋巴细胞非常少，且这些T淋巴细胞在体外非常难扩增。因此，CAR-T细胞临床治疗的应用推广受到很大的限制。
健康供体外周血T细胞数量多、活率高，用以制备CAR-T和细胞扩增相对比较容易；如果能用于替代肿瘤患者自体CAR-T细胞来治疗，即同种异体CAR-T细胞(也通用型CAR-T细胞)，将极大降低CAR-T细胞制备的周期和治疗的费用。同种异体细胞是指属于相同物种但在遗传上有所差异个体的细胞。同种异体CAR-T细胞用于肿瘤治疗的缺点在于，免疫排异问题。在免疫活力的宿主中，同种异体细胞迅速收到排异，这是一种称为宿主抗原移植物排异(HvG)的过程，而这限制了转移细胞的效力。在免疫无活力的宿主中，能够植入同种异体细胞，但它们的内源性T细胞受体特异性可能将宿主组织识别为外来物，导致移植物抗宿主病(GvHD)，这可能会导致严重的组织损伤和死亡。
为避免上述问题，目前在制备通用型CAR-T细胞的过程，大多数都是采用电转技术敲除CAR-T细胞的TCRα/β和β2M基因，但采用电转敲除带来的问题是，电转本身对CAR-T细胞的生长影响很大，导致电转敲除TCRα/β和β2M基因后的CAR-T细胞不增长或者扩增很慢，最终得到的通用型CAR-T数量相对很少。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通用型CAR-T细胞及其制备方法、应用以及抗肿瘤药物。本发明提供的通用型CAR-T细胞的制备方法可以促进CAR-T细胞的增殖，获得更多数量的通用型CAR-T细胞，采用该制备方法所制得的通用型CAR-T细胞具有正常的肿瘤杀伤功能，可以用于到抗肿瘤治疗中。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种通用型CAR-T细胞的制备方法，其包括：往经电转技术处理后敲除TCRα/β基因和β2M基因的T细胞中加入刺激剂以刺激上述CAR-T细胞；
其中，上述刺激剂包括CD3抗体与CD28抗体。
需要说明的是，上述T细胞可以是转染表达嵌合抗原受体基因前的T细胞，也可以是转染表达嵌合抗原受体基因后的CAR-T细胞。只要是经电转技术处理后敲除TCRα/β基因和β2M基因的T细胞，需要进行刺激，即可适用本发明提供的方法进行刺激。
在可选的实施方式中，上述T细胞为CAR-T细胞。
由于CD3分子和TCRα/β属于复合物，CAR-T细胞的TCRα/β基因敲除后，细胞表面不表达TCRα/β的同时也不会表达CD3分子，故本领域普遍认为，仅电转敲除TCRα/β基因和β2M基因后再加CD3抗体和CD28抗体将不再会对电转后的T细胞有刺激活化作用。
但是，本发明的发明人首次发现，在电转敲除TCRα/β基因和β2M基因后，使用CD3抗体与CD28抗体依然可以刺激CAR-T细胞，激活CAR-T细胞，促进其增殖，提高CAR-T细胞的数量。这样，通用型CAR-T细胞的生产成本得到明显降低，且得到通用型CAR-T细胞可以用于治疗更多需要通过CAR-T细胞进治疗的患者，患者的用药成本也降低。
在可选的实施方式中，在上述CAR-T细胞经电转技术处理后的第5-7h加入上述刺激剂，优选为在第6h加入上述刺激剂。
进一步地研究发现，在电转后的短时间内加入刺激剂才会有刺激活化作用，同时经电转后的CAR-T细胞需要一定的时间恢复状态；基于此，发明人发现在电转后的第5-7h优选为第6h加入刺激剂可以起到较好的刺激效果，CAR-T细胞的增殖效果较好。
在可选的实施方式中，上述CD3抗体与上述CD28抗体的加入量各自为90～100ng/ml(是指，CD3抗体和CD28抗体与CAR-T细胞混合后的体系中，CD3抗体和CD28抗体的终浓度各自为90～100ng/ml)。
在可选的实施方式中，上述CD3抗体与上述CD28抗体以单独或共同偶联在载体上的形式加入至上述CAR-T细胞中。
需要说明的是，CD3抗体和CD28抗体也可以直接加入到CAR-T细胞中进行刺激。将其以偶联到载体的形式加入到CAR-T细胞中后期的分离和纯化。
在可选的实施方式中，上述载体为磁珠或培养皿。
当载体为培养皿时，是指将CD3抗体和CD28抗体预先包被在培养皿中，刺激时，将CAR-T细胞加入该培养皿中，使CAR-T细胞与CD3抗体和CD28抗体接触，进而起到等同的刺激效果。
在可选的实施方式中，上述CD3抗体与上述CD28抗体以共同偶联在磁珠上的形式加入至上述CAR-T细胞中。
在可选的实施方式中，所述刺激剂为CD3/CD28抗体偶联磁珠，该CD3/CD28抗体偶联磁珠的加入量与CAR-T细胞的数量比为(1-3):1，优选为2:1。
在可选的实施方式中，在加入上述刺激剂后，上述制备方法还包括：将上述CAR-T细胞置于37℃下培养13天以上。
在可选的实施方式中，培养13-17天，进一步优选为培养15-17天。
本发明的研究进一步发现，使用刺激剂后，CAR-T细胞的增殖倍数呈指数增长，在培养13天后，CAR-T细胞的增殖明显。在培养15天后，其CAR-T细胞的增殖更加明显，细胞数量相较于对照，有及其明显的增长。
在可选的实施方式中，采用电转技术处理上述CAR-T细胞的所用的电转仪器为市面是普通的电转仪器，电转条件按其提供的操作说明书设置即可，本发明对电转仪以及电转条件不作任何限定。
需要说明的是，本发明对上述的CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体的类别不进行限定，也对转染嵌合抗原受体的基因序列的方法不作限定，采用任何方法以及表达任何类型的嵌合抗原受体均适用于本发明的制备方法。
第二方面，本发明实施例提供一种通用型CAR-T细胞，其由前述实施方式任一项上述的制备方法制得。
第三方面，本发明实施例提供如前述实施方式上述的通用型CAR-T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
在可选的实施方式中，上述肿瘤选自淋巴瘤、白血病、肺癌、胃癌和胰腺癌中任意一种。
第四方面，本发明实施例提供一种抗肿瘤药物，其含有如前述实施方式上述的通用型CAR-T细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为正常T细胞不表达CD19-CAR(左图)，经CD19慢病毒感染后的CAR-T细胞正常表达CD19-CAR(右图)，表达效率为64.8％。
图2为电转后添加CD3/CD28-beads组和未加CD3/CD28-beads组中细胞增殖情况，添加CD3/CD28-beads组细胞在第13天后增殖速率明显快于未加CD3/CD28-beads组。
图3为采用流式检测添加CD3/CD28-beads和未加CD3/CD28-beads组中TCRα/β和β2M双阴性细胞百分比，结果表明基本无差别，说明电转后添加CD3/CD28-beads不仅是刺激TCRα/β没有敲除的细胞，而是刺激所有细胞活化增殖。图中：negative：未加抗体染色的CAR-T细胞；CAR-T：加TCRα/β和β2M染色的CAR-T细胞；CAR-T KO：CAR-T细胞电转敲除TCRα/β和β2M基因后不加磁珠的细胞；CAR-T KO+Beads：CAR-T细胞电转敲除TCRα/β和β2M基因后加磁珠的细胞。
图4为通过纯化去除TCRα/β和β2M单阳和双阳性细胞，得到TCRα/β和β2M双阴性的通用型CAR-T细胞，流式检测纯化效果，结果表明纯度很高，达到99％以上。
图5为电转后使用CD3/CD28-beads刺激活化制备的UCAR-T细胞与未使用CD3/CD28-beads刺激活化制备的UCAR-T细胞在体外抗肿瘤活性基本一致，说明在电转后，使用CD3/CD28-beads刺激UCAR-T细胞并不会改变UCAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的通用型CAR-T细胞的制备方法如下：
(1)在采用电转技术敲除TCRα/β基因和β2M基因的CAR-T细胞中加入CD3抗体与CD28抗体作为刺激剂，刺激活化CAR-T细胞；
其中，CAR-T细胞经电转处理后的第6h，加入CD3抗体与CD28抗体。
为便于后期的分离纯化，CD3抗体与CD28抗体共同偶联在磁珠上的方式加入至含CAR-T细胞的溶液中。
控制CD3抗体与CD28抗体在溶液中的终浓度各自为100ng/ml。
(2)在加入CD3抗体与CD28抗体后，将CAR-T细胞置于37℃下培养，得到通用型CAR-T细胞。
其中，培养时间可以根据情况而定，优选培养13天以上。
实施例2
本实施例提供的通用型CAR-T细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)健康志愿者外周血中分离T细胞
1)健康供者外周血的采集：采集的外周血4℃冰箱暂存，24h内，经由配备有恒温设备的转运车运至GMP实验室进行分离和培养。
2)外周血单个核细胞(PBMC)的制备：用移液管吸取DPBS(Dulbecco's PhosphateBuffered Saline)或者生理盐水加入到步骤(1)采集的外周血中(体积比1：1)，稀释，将血细胞稀释液，缓慢加入装有淋巴细胞分离液(Ficoll或者Histopaque-1077)的离心管中，以800g离心20min后，吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞，转入一个新的离心管中，加入Lonza x-vivo 15培养基离心后弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀，即得到外周血单个核细胞。
3)T细胞的分离和激活：将得到的外周血单个核细胞进行计数，按照数量比1:1的比例加入偶联CD3和CD28抗体的磁珠(以下简称CD3/CD28-beads，货号：40203D，厂家：life)，轻轻震荡20min，利用磁力架的吸附作用，得到CD3阳性的T细胞，此时的T细胞处于激活状态，加入完全培养基(Lonza x-vivo15+IL-2+5％FBS)，对T细胞进行培养扩增。本实施例分选T为CD3/CD28正选，T细胞的分离还可以利用EasySepTM Human T Cell EnrichmentKit从PBMC中进行负选得到T细胞。
(2)CAR-T细胞制备
利用CD3/CD28-beads将PBMC中的T细胞分选和激活后，用Lonza x-vivo 15培养基将细胞密度调至4×106cell/mL，加入终浓度为10ug/ml的助转剂并按照MOI＝5：1的比例加入包装有靶向CD19的CAR的慢病毒(公知技术，本领域的技术人员按照相关教科书即可制得或市面上购买得到)，4h后补加完全培养基至浓度为1×106cell/mL，次日换液，48h后观察细胞的状态并流式检测CAR表达情况，见图1。
图1显示结果正常T细胞未表达CAR，CAR-T细胞成功表达CAR，转导效率为64.8％。
(3)电转敲除TCRα/β和β2M基因
在电转杯中，加入3×106T细胞CAR-T细胞，加入Cas9酶12ug，TCRα/β-sgRNA(CUUCAAGAGCAACAGUGCUG)6ug和β2M-sgRAN(GGCCACGGAGCGAGACAUCU)6ug，以敲除TCRα/β和β2M基因，混匀，放入Lonza 4D电转仪，选择human stim Tcell程序，电转即可。
电转完后将细胞转入6孔培养板中培养。
(4)电转后加CD3/CD28-beads和不加CD3/CD28-beads细胞增殖及敲除效率情况
电转完后6h，各取一半细胞分两个孔培养，一孔按照beads：CAR-T细胞为数量比2:1加CD3/CD28-beads，另一空不加CD3/CD28-beads，正常培养，采用Countstar细胞计数仪进行计数，根据活细胞密度和培养体积来计算活细胞总数，增殖倍数和培养天数关系见图2；在Day17天通过流式细胞分选(FACS)分析TCRα/β和β2M基因敲除细胞(KO细胞)比例，结果见图3。
图2结果显示，加入CD3/CD28-beads刺激的CAR-T细胞其增殖倍数呈指数增殖，其在培养13天后，增殖倍数开始高于未用CD3/CD28-beads刺激的CAR-T细胞，并表现出良好的增长趋势，在第15天和第17其增殖倍数均明显高于未用CD3/CD28-beads刺激的CAR-T细胞。而未用CD3/CD28-beads刺激的CAR-T细胞在培养13天停止了增殖。
图3结果显示，在第17天检测加入CD3/CD28-beads刺激和未加入CD3/CD28-beads刺激的TCRα/β和β2M双敲效率上基本无差别，说明加入CD3/CD28-beads是能够刺激电转后所有细胞增殖的，而不是仅仅只刺激未敲除TCRα/β基因的细胞。
(5)KO细胞纯化
取电转后培养4天后的细胞，离心，一定量DPBS重悬密度至1×108个/ml，加入50ul/ml PE-anti-human TCR a/β，PE-anti-human B2M及100ul/ml CD3-biotin冰上避光孵育20min，再向其中加入PE Slection cocktail至100ul/ml，避光孵育15min，抗PE磁珠加入量为50ul/ml，抗Biotin磁珠加入量为200ul/ml孵育10min，经MS柱收集流出的目的细胞。取2×105个/ml细胞利用APC-anti-human TCR a/β和PE-anti-human B2M抗体孵育15min流式检测细胞纯度。TCR/B2M基因敲除及细胞纯度检测结果见图4。
图4结果显示。CD19CAR-T KO细胞经过纯化后，UCAR-T细胞(通用型CAR-T细胞)纯度能够达到99％以上，说明此纯化方法的效果很好，能够满足通用型CAR-T的纯度要求。
(6)加CD3/CD28-beads和不加CD3/CD28-beads体外杀瘤效果
以本实施例中经过CD3/CD28-beads刺激激活的通用型CAR-T细胞(add beadsUCAR-T)、未经过CD3/CD28-beads刺激激活的通用型CAR-T细胞(no beads UCAR-T)、以及普通的T细胞(T-cell)作为效应细胞(后两者为对照)，以人B淋巴白血病细胞系Nalm-6作为靶细胞，先利用cytocalceinTM violet 550对靶细胞进行染色，其次调整效应细胞密度为5×106个/ml，靶细胞密度为5×105个/ml，将上述效应细胞与靶细胞按照0：1，0.25：1，0.5：1，1：1，2：1，4：1加入96孔板中混匀共培养6h，在上述时间段显微镜下观察凋亡情况，并将混合细胞离心，沉淀部分用100ul binding buffer重悬，300g离心5min，添加1.2ul APC-AnnexinV和1.2ul PI染料，避光孵育15min，添加100ul binding buffer流式检测凋亡效率，结果见图5。
图5结果显示，电转后使用CD3/CD28-beads刺激活化制备的UCAR-T细胞与未使用CD3/CD28-beads刺激活化制备的UCAR-T细胞在体外抗肿瘤活性基本一致，说明在电转后使用CD3/CD28-beads刺激UCAR-T细胞并不会改变UCAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，其包括：往经电转技术处理后敲除TCRα/β基因和β2M基因的T细胞中加入刺激剂以刺激所述T细胞；其中，所述T细胞为CAR-T细胞，所述刺激剂包括CD3抗体与CD28抗体，所述刺激剂在所述CAR-T细胞经电转技术处理后的第5至7小时加入，所述CD3抗体与所述CD28抗体的加入量各自为90~100ng/ml；
在加入所述刺激剂后，所述制备方法还包括：将所述CAR-T细胞置于37℃下培养13天以上。
2.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，在所述CAR-T细胞经电转技术处理后的第6小时加入所述刺激剂。
3.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述CD3抗体与所述CD28抗体以单独或共同偶联在载体上的形式加入至所述CAR-T细胞中。
4.根据权利要求3所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述载体为磁珠或培养皿。
5.根据权利要求4所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述CD3抗体与所述CD28抗体以共同偶联在磁珠上的形式加入至所述CAR-T细胞中。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述刺激剂为CD3/CD28抗体偶联磁珠，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠的加入量与CAR-T细胞的数量比为(1-3):1。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠的加入量与CAR-T细胞的数量比为2:1。
8.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，将所述CAR-T细胞置于37℃下培养13-17天。
9.根据权利要求8所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，将所述CAR-T细胞置于37℃下培养15-17天。
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