CN109568351A - 溶瘤病毒和car-t联合应用针对实体肿瘤的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了溶瘤病毒和CAR‑T联合应用技术，主要针对实体肿瘤的治疗。本发明将CAR‑T作为溶瘤病毒治疗实体肿瘤的载体，将溶瘤病毒携带到实体肿瘤部位，既克服了CAR‑T针对实体肿瘤杀伤效果不理想的弊端，又使得溶瘤病毒不单独暴露于体液免疫环境中，根据CAR‑T所针对的实体肿瘤靶点，将溶瘤病毒特异性运载并投递到实体肿瘤部位，充分发挥溶瘤病毒的裂解癌变细胞的能力和CAR‑T细胞特异性杀伤靶细胞的能力。

Description

溶瘤病毒和CAR-T联合应用针对实体肿瘤的治疗
技术领域
本发明涉及基因工程和靶向免疫技术领域，具体涉及溶瘤病毒和CAR-T联合应用针对实体肿瘤治疗的技术
背景技术
CAR-T细胞全称为嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigen Receptor T-Cell)。就是将来源于患者外周血的T细胞通过慢病毒转染等手段使其表达靶向特异性靶点的单链抗体，特异性靶向靶细胞。而对非靶蛋白表达的细胞不具有识别和杀伤能力。目前嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-TImmunotherapy)在癌症治疗方面尤其是血液型肿瘤治疗取得了巨大的成就，其特点是通过基因改造使T细胞具有靶向肿瘤细胞的能力，从而快速找出并结合靶细胞，对靶细胞造成杀伤[6,7]。目前多个产品已经批准上市，进入临床治疗应用阶段[8-10]，例如在B型急性白血病等血液肿瘤的治疗的诺华公司首款首款CAR-T疗法CTL019。
虽然CAR-T疗法在血液肿瘤治疗中比较成熟，但在实体肿瘤治疗方面仍然比较乏力。主要是因为实体肿瘤复杂的肿瘤微环境：缺氧、致密的包被、PD-1免疫监测点的表达、Treg细胞聚集等多种不利于T细胞的存活、渗透和杀伤。
溶瘤病毒为基因改造过的病毒，其只在癌细胞内有快速复制能力，在正常细胞里不能进行复制增殖，从而特异性的裂解杀伤癌变细胞。虽然其基因进行过改造编辑，减少了溶瘤病毒的免疫原性，但暴露于体液中终归还是会少量引起免疫反应，或进入正常细胞复制能力受到抑制使其逐渐丧失活性。所以现阶段溶瘤病毒应用与癌症治疗主要为原位注射给药法，如美国的T-VEC溶瘤病毒产品已经由FDA批准上市，是肿瘤部位原位注射给药的针对晚期黑色素瘤的治疗。
实体肿瘤占据肿瘤发生的绝大多数，所以仍需开发新的针对实体肿瘤的治疗方案[11]。
发明内容
针对现有技术中单纯的CAR-T细胞治疗针对实体肿瘤效果不理想，而单纯溶瘤病毒给药治疗时缺少靶向性和易引起体内免疫反应的缺点，鉴于经基因改造过的溶瘤病毒在肿瘤细胞中的裂解杀伤能力以及对正常组织细胞功能活性的低影响或不影响，我们提出溶瘤病毒与 CAR-T细胞结合的方案。
具体地，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了溶瘤病毒和CAR-T联合制备治疗实体肿瘤的药物的应用。
我们发现，将二者结合以后再去靶向治疗实体肿瘤，其效果远高于单独的溶瘤病毒治疗或者CAR-T治疗。
可选或优选的，所述溶瘤病毒选自HSV-1型溶瘤病毒、由HSV-1不同毒株构建的溶瘤病毒、基于牛痘病毒不同毒株构建的溶瘤病毒、或基于水泡型口炎病毒不同毒株改造的溶瘤病毒。
HSV-1型溶瘤病毒全称为1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type1,HSV-1)，为双链DNA病毒，其基因组中特定基因删除可以提高其特异性在肿瘤细胞中复制的能力并减弱对正常细胞的影响。
由HSV-1不同毒株构建的溶瘤病毒是在野生型HSV-1不同毒株改造构建获得的，例如：由HSV-1不同毒株(HSV-1JS1、HSV-1F、HSV-117、HSV-1E19、HSV-1KOS、HSV-1v23、 HSV-1v29及其它临床野生毒株如HSV1-2006-50683、HSV1-2009-20371、HSV1-2011-3153 等)进行基因改造。其中基因改造方案可以为：删除两处UL34.5、删除UL47、在两处UL34.5 处插入人源GM-CSF基因的表达盒。改造方案不限于所列方式，还可以通过其他方式改造。
可选用的HSV-1病毒株如Onco Vex(其基因组中删除了ICP47和双拷贝γ34.5，插入了 GM-CSF)，或FDA批准的talimogene laherparepvec(T-Vec，Imlygic，安进公司，是一种经过基因修饰的1型单纯疱疹病毒(HSV-1)，它可以在肿瘤细胞内复制并表达免疫激活蛋白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))，或基于牛痘病毒删除胸苷激酶(thymidinekinase) 和病毒生长因子基因(viral growth factor genes)的双删减牛痘病毒(vvDD)，或基于水泡性口炎病毒在M蛋白突变改造的溶瘤病毒(VSVΔM51)。
近年来经基因技术改造的I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV-1)在实体肿瘤治疗中有一定的效果[1,2]。采用HSV进行的溶瘤病毒治疗就日益受到关注。其原理是通过对自然界存在的一些致病力较弱的病毒进行基因改造制成特殊的溶瘤病毒，利用靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，而在正常细胞中溶瘤病毒处于复制受抑制状态从而低影响或不影响正常细胞的功能活性[3,4]；另外它还能激发免疫反应，吸引更多免疫细胞来继续杀死残余癌细胞[1,5]。近几十年来，溶瘤病毒治疗引起了广泛关注，相关研究取得了巨大进展。
基于水泡型口炎病毒改造的溶瘤病毒：在M蛋白突变的毒株(VSVΔM51)。
基于牛痘病毒改造的溶瘤病毒：删除胸苷激酶(thymidine kinase)和删除病毒生长因子基因(viral growth factor genes)的双删减牛痘病毒(vvDD)。
可选或优选的，所述CAR-T中CAR基因里含有anti-EGFR基因、或anti-HER2基因、或anti-MUC1基因、或anti-IL13αⅡ基因、或anti-PSCA基因、或anti-GD2基因、或 Anti-Mesothelin基因。
可选或优选的，所述实体肿瘤为人星形胶质瘤和/或人脑胶质瘤。
第二方面，本发明提供了一种改造的CAR-T细胞，该细胞负载有溶瘤病毒。这种改造既避免了溶瘤病毒因暴露于体液环境中而被免疫系统消除的风险减少了体内免疫压力，又增加了CAR-T对实体肿瘤的杀伤效果。
可选或优选的，负载的溶瘤病毒选自HSV-1型溶瘤病毒、由HSV-1不同毒株构建的溶瘤病毒基因组双删减的牛痘病毒、或基于水泡型口炎病毒改造的溶瘤病毒。
可选或优选的，CAR-T中CAR基因里含有anti-EGFR基因、或anti-HER2基因、或anti-MUC1基因、或anti-IL13αⅡ基因、或anti-PSCA基因、或anti-GD2基因、或Anti-Mesothelin 基因。
可选或优选的，CAR由以下依次连接的部分组成：CD8α信号肽-Anti-EGFR vⅢscFv- CD8铰链区-CD28跨膜结构域-CD28胞内域-4-1BB-CD3ζ胞内域；所述溶瘤病毒为HSV-1型溶瘤病毒。
第三方面，本发明还提供了上述任一改造的CAR-T细胞的制备方法，其包括以下步骤：将CAR基因构建入慢病毒载体，利用293T细胞进行慢病毒包装，收集慢病毒，并作慢病毒活性及滴度分析实验。检测合格后将其感染从人体内分离的T细胞，获得CAR-T细胞；随后利用溶瘤病毒感染CAR-T细胞，获得负载溶瘤病毒的CAR-T细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.克服了单纯的CAR-T细胞治疗针对实体肿瘤效果不理想的弊端。
2.克服了单纯溶瘤病毒给药治疗时缺少靶向性和易引起体内免疫反应的缺点。
3.本发明将CAR-T作为溶瘤病毒体内治疗实体肿瘤的载体，将溶瘤病毒携带到实体肿瘤部位，既克服了CAR-T针对实体肿瘤杀伤效果不理想的弊端，又使得溶瘤病毒不单独暴露于体液免疫环境中，根据CAR-T所针对的实体肿瘤靶点，将溶瘤病毒特异性运载并投递到实体肿瘤部位，充分发挥溶瘤病毒的裂解癌变细胞的能力和与CAR-T细胞结合杀伤靶细胞的能力。
附图说明
图1：anti-EGFR vⅢ CAR结构示意图。
图2：T细胞或CAR-T细胞溶瘤病毒负载检测结果。
图3：针对神经胶质瘤细胞系U251-MG的体外杀伤实验结果。其OV组X轴代表其病毒颗粒数与U251-MG细胞的比例，即(MOI)，其他组X轴均为效应T细胞与靶细胞的比例；％Viable 为杀瘤后的靶细胞(U251-MG)的存活率。E：T即效靶比。OV：溶瘤病毒组，CAR-T：Anti-EGFR vⅢ CAR-T细胞；T：T细胞；OCAR-T：负载溶瘤病毒的Anti-EGFR vⅢ CAR-T 细胞；OT：负载溶瘤病病毒的T细胞。
图4：针对神经胶质瘤细胞系U373-MG的体外杀伤实验结果。其OV组X轴代表其病毒颗粒数与U373-MG细胞的比例，即(MOI)，其他组X轴均为效应T细胞与靶细胞的比例；％Viable 为杀瘤后的靶细胞(U251-MG)的存活率。E：T即效靶比。OV：溶瘤病毒组，CAR：Anti-EGFR vⅢ CAR-T细胞；T：T细胞；OCAR：负载溶瘤病毒的Anti-EGFR vⅢ CAR-T细胞；OT：负载溶瘤病病毒的T细胞。
图5：溶瘤病毒和CAR-T细胞联合制备含有溶瘤病毒的CAR-T细胞并用于杀伤实体肿瘤的原理图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
1慢病毒构建：
1.1利用OE PCR技术按照图1所示结构将anti-EGFR vⅢ CAR基因构建入慢病毒载体 pLVX-EF1α-IRES-Puro中。
1.2将步骤1构建好的慢病毒载体与慢病毒载体psPAX2和慢病毒载体pMD2.G按照比例6:3:1转染HEK293T细胞，每10cm皿质粒总量10μg，PEI细胞转染液30μg。具体转染方案参考PEI细胞转染液使用说明书。
1.3质粒转染后第二天每皿补液5ml，放入细胞培养箱继续培养。
1.4转染第三天收取上清至50ml管，4℃4000g离心半小时。
1.5离心后用0.22μm滤膜过滤，滤液分出3ml放入4℃冰箱保存准备做滴度，其余转入超滤离心杯中准备浓缩。
1.64℃30000g超滤离心2.5小时。抽弃上清，用500μl T细胞培养基重悬，留2μl细胞重悬液测病毒滴度，其它按100μl每份分装入冻存管，立即放入-80℃冰箱冻存。
2.慢病毒滴度测定：
2.1步骤1.6的细胞重悬液去上清，用无菌PBS清洗细胞，用Versene(1×)消化293T(HEK293T)细胞，T75瓶加入2ml/瓶，37℃进行消化。(注：T75瓶是细胞培养瓶，T75是型号，代表底面积为75cm2)。
2.2待细胞变圆变亮且部分细胞脱落后，加3ml DMEM完全培养基。
2.3吹打混匀，计数，铺6孔板，使每个孔的细胞量为5×10^5个(若铺24孔板，则每孔细胞量为1×10^5)。
2.4按10μl/孔加入Polybrene，使每孔浓度为4μg/ml，按原液加10μl，50μl，浓缩液加 0.1μl，0.5μl，1μl的体积加入病毒，并设1个阴性对照，每个批次病毒设6个孔(24孔板设) 重复。
2.5前后或者左右方向晃动孔板，使细胞在孔板里分布均匀，防止中心聚集，放入37℃， 5％CO2培养箱。
2.6三天后，收集细胞，送流式细胞检测。预热无血清DMEM培养基，Versene和无菌PBS，弃去细胞培养基，先加无菌PBS清洗细胞，抽弃PBS，6孔板内加Versene 0.5ml/孔(24孔板加0.2ml/孔)，37℃消化，待细胞变圆变亮后，6孔板加无血清DMEM培养基1.5ml/孔(24孔板加0.3ml/孔)，吹打混匀，使细胞分散成单个细胞，取无菌1.5ml EP管，收集细胞，做好标记，送去做流式细胞检测。
2.7根据流式结果注明已入库病毒活性滴度
3人外周血单个核细胞(PBMC)的分离：
3.1取人外周血40ml置于50ml离心管中，在18℃于700g条件离心10min(升快、降慢)，去除血浆；
3.2血细胞用氯化钠注射液重悬；
3.3将用氯化钠注射液重悬后的血细胞悬液充分混匀后缓慢加入到分装有20ml淋巴细胞分离液的50ml离心管中，此步动作轻柔，将氯化钠充血的血细胞加至淋巴细胞分离液的上层。 18℃于700g条件离心20min(升慢、降慢)；
3.4离心完成后，吸取中间白膜层至50ml离心管中，补加氯化钠注射液定容至50ml，混匀后在18℃于700g条件离心6min(升快、降快)，去除上清，收集单个核细胞沉淀。
4T细胞的分选
4.1用20ml氯化钠注射液重悬步骤3.4收集的单个核细胞沉淀，取样计数后，补加至50 ml混匀，在18℃于500g条件离心6min，去除上清；
4.2每107个细胞加入30～80μlAutoMACS Running Buffer混匀(可根据上清残留量适当减少Buffer用量),每107个细胞加入5～20μl CD3MicroBeads,human(可根据经验适当减少 CD3MicroBeads的用量)重悬，在4℃条件下孵育10～20min。
4.3孵育完成后，加50ml AutoMACS Running Buffer重悬细胞以洗脱未吸附的CD3MicroBeads，在18℃于500g条件离心6min(升快、降快)，去除上清。
4.4用5mlAutoMACS Running Buffer重悬细胞沉淀.
4.5将美天旎专用LS柱置于磁力架上，使用3mlAutoMACS Running Buffer润湿LS柱，将细胞悬液加入到LS柱里，使之流尽。
4.6用5mlAutoMACS Running Buffer洗LS柱一次，待液体流尽。
4.7新加入5mlAutoMACS Running Buffer于LS柱内，将配置的活塞置于LS柱上，将LS柱内的CD3+细胞快速冲洗在一支新的离心管内。
4.8用30mlAutoMACS Running Buffer重悬CD3+细胞，取样计数，在18℃于500g条件离心6min，得细胞沉淀，即可用于培养。
T培养基配制：取10ml HEPES溶液、10ml已融化完全的L-谷氨酰胺、100万IU的IL-2、一支OpTmizerTMCTS T-Cell Expansion Supplement加入一瓶OpTmizerTMCTSTMT-CellExpansion Basal Medium中，混匀，分装备用。
4.9用配置好的T细胞专用培养基重悬细胞沉淀后转移至培养瓶或培养板内(细胞接种密度控制在1.0-2.0×106个/ml)进行培养，同时加入CD3/CD28(每106个细胞加入10～30μl，可根据经验适当减少CD3/CD28用量)。
5.CAR-T细胞的制备：
5.1计数取T细胞约5×106个/份T细胞两份于15ml管，分别标记为对照组和CAR-T组，均在22℃300g离心5分钟，抽弃上清。用500μl配好的T培养基重悬T细胞(确保终细胞密度约为107个/ml)转移至24孔板中。
5.2按照MOI＝1～5向CAR-T组加入构建好并浓缩后的慢病毒，对照组加入等体积的T 培养基。向两组各加入终浓度5μg/ml的Polybrene。置于37℃，5％CO2培养箱中转染3～6小时。
5.33～6小时后，将上述两组T细胞各自取至6孔板中，补加T细胞培养基至1×106细胞密度，置于37℃，5％CO2培养箱中过夜。
5.4T细胞第2天上午将上述两组细胞取至15ml离心管中，300g，22℃离心5分钟。弃上清，后补加等体积T细胞培养基至终细胞密度为1×106个/ml。放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
5.5每天观察T细胞状态，计数，按照1×106补充T细胞培养基调整T细胞密度。于T细胞第4天通过流式细胞液测定CAT-T细胞的比例即转效。
经慢病毒转染后获得的CAR-T细胞即Anti-EGFR vⅢ CAR-T细胞。
6.T细胞负载溶瘤病毒
6.1约T细胞第7天时计数T细胞。T细胞和CAR-T细胞各取2.4×105个于15ml离心管各两组，分别编号为：OCAR-T、CAR-T、OT、T。22℃，300g离心5分钟，用T细胞培养基重悬至细胞密度为5×106。
6.2按照MOI＝1向OCAR-T和OT加入浓缩后的含有外源基因GM-CSF的HSV-1型溶瘤病毒，放入培养箱感染4个小时。
6.3取出四组细胞22℃，300g离心5分钟，弃掉上清。用10ml PBS重悬，22℃，300g离心5分钟。重复清洗3次。
6.4梯度稀释T细胞，准备梯度稀释做杀瘤实验。
总结：
OCAR-T负载溶瘤病毒后成为负载了溶瘤病毒的Anti-EGFR vⅢ CAR-T细胞；
OT负载溶瘤病毒后成为负载溶瘤病病毒的T细胞；
CAR-T为Anti-EGFR vⅢ CAR-T细胞(没有负载溶瘤病毒)；
T为T细胞。
7.对T细胞或CAR-T细胞进行溶瘤病毒负载检测
含有外源基因GM-CSF的HSV-1型溶瘤病毒，用MOI＝0.3，1，3分别感染T细胞和CAR-T 细胞三个小时，用PBS10ml洗3遍，抽提总基因组，利用靶向溶瘤病毒的荧光探针检测病毒基因组，用β-globin靶向细胞基因组确定细胞数量。得到溶瘤病毒基因组拷贝数相对细胞数的定量，结果如图2所示。结果显示T细胞、CAR-T细胞均成功负载了溶瘤病毒。
实施例2体外杀瘤实验
1.用Versene消化U251-MG细胞和U373-MG细胞，重悬细胞并计数。按照每孔1×104细胞种94孔板，每孔100μl培养基。放入细胞培养箱中培养6-8小时。
2.按照效靶比1/4、1/2、1、2、4梯度稀释上述负载溶瘤病毒后的OCAR-T细胞、负载溶瘤病毒后的OT细胞、没负载溶瘤病毒的CAR-T细胞、没负载溶瘤病毒的T细胞、溶瘤病毒。每孔按照100μl体系加入到靶细胞中。细胞培养箱中孵育16至24小时(具体时间由杀瘤效果显微镜观察决定，溶瘤病毒组具体时间与实验组保持一致)。
3.杀瘤孵育完成后，抽弃各孔所有上清，用含5％胎牛血清的PBS清洗板底的T细胞并在显微镜下观察，至板底没有T细胞附着为止。溶瘤病毒组直接抽弃各孔所有上清、用含5％胎牛血清的PBS清洗板一遍即可。
4.抽弃清洗上清，按照1:10将Alamar Blue与靶细胞培养基混匀，每孔100μl加入到各孔中，放入细胞培养箱中孵育2至3个小时。
5.1～3个小时后用酶标仪读取各孔的荧光值。其中发射波长为560nm，发射波长为590nm。
6.根据公式：
杀瘤效率＝(实验组FI 590–阴性对照组FI 590)/(阳性对照组FI 590-阴性对照组FI 590) ×100％。
注：FI 590为发射波长为560nm，发射波长为590nm时测得的荧光值。
杀瘤实验结果：
各组标记及内容对应表
标记 内容
OCAR-T 负载溶瘤病毒的Anti-EGFR vⅢ CAR-T细胞
OT 负载溶瘤病病毒的T细胞
CAR-T Anti-EGFR vⅢ CAR-T细胞
T T细胞
OV 溶瘤病毒组
针对神经胶质瘤细胞系U251-MG的体外杀伤实验结果参见图3，结果显示联合实验组 (OCAR-T)杀瘤效果明显优于其他各组。
针对神经胶质瘤细胞系U373-MG的体外杀伤实验结果参见图4，结果显示，联合实验组 (OCAR-T)杀瘤效果也明显优于其他各组。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
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Claims (9)

1.溶瘤病毒和CAR-T联合在制备治疗实体肿瘤的药物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述溶瘤病毒选自HSV-1型溶瘤病毒、或由HSV-1不同毒株构建的溶瘤病毒、或基于牛痘病毒不同毒株改造的溶瘤病毒、或基于水泡型口炎病毒改造的溶瘤病毒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CAR-T中CAR基因里含有anti-EGFR基因、或anti-HER2基因、或anti-MUC1基因、或anti-IL13αⅡ基因、或anti-PSCA基因、或anti-GD2基因、或Anti-Mesothelin基因。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述实体肿瘤为人星形胶质瘤和/或人脑胶质瘤。
5.一种改造的CAR-T细胞，其特征在于，该细胞负载有溶瘤病毒。
6.根据权利要求5所述的CAR-T细胞，其特征在于，负载的溶瘤病毒选自HSV-1型溶瘤病毒、或由HSV-1不同毒株构建的溶瘤病毒、或基于牛痘病毒不同毒株改造的溶瘤病毒、或基于水泡型口炎病毒改造的溶瘤病毒。
7.根据权利要求5所述的CAR-T细胞，其特征在于，CAR-T中CAR基因里含有anti-EGFR基因、或anti-HER2基因、或anti-MUC1基因、或anti-IL13αⅡ基因、或anti-PSCA基因、或anti-GD2基因。
8.根据权利要求5所述的CAR-T细胞，其特征在于，CAR由以下依次连接的部分组成：CD8α信号肽-Anti-EGFR vⅢscFv-CD8铰链区-CD28跨膜结构域-CD28胞内域4-1BB-CD3ζ胞内域；所述溶瘤病毒为HSV-1型溶瘤病毒。
9.权利要求5～8任一所述改造的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将CAR基因构建入慢病毒载体，利用293T细胞进行慢病毒包装，收集慢病毒，并作慢病毒活性及滴度分析实验；检测合格后将其感染从人体内分离的T细胞，获得CAR-T细胞；随后利用溶瘤病毒感染CAR-T细胞，获得负载溶瘤病毒的CAR-T细胞。
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