JP2005515781A - 機能樹状細胞への単球の分化を誘導するための方法およびかかる樹状細胞を含む免疫療法組成物 - Google Patents
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Abstract
体外量の対象の血液に含まれる単球の機能的樹状抗原提示細胞への分化を誘導するための方法が提供される。単球は、従来のフォトフェレーシス装置におけるプラスチックチャンネルなど、プラスチックチャンネルを通じる単球の流れの結果生じる活性化力によって樹状細胞へ分化するように誘導される。誘導された単球から生成される機能的樹状細胞はアポトーシスまたは不活性化疾患エフェクター因子と共にインキュベートされ、疾患エフェクター因子によって発現される少なくとも1つの病原体の提示を増強する。図1は、免疫療法治療における使用にも提供される疾患エフェクター因子とともにインキュベートされたかかる樹状細胞を含む一夜インキュベーション後の樹状抗原提示細胞およびアポトーシスT細胞組成物の生成を示す図である。
Description
本発明は、機能樹状抗原提示細胞への単球の分化を誘導するためのインビボ方法に関し、より詳しくは、単球を処理し、インキュベートし、かかる分化を誘導するための体外方法に関する。本発明はさらに、これらの樹状細胞を含む免疫療法組成物を製造するための方法を提供する。具体的には、本発明は、アポトーシスまたは不活性化疾患エフェクター因子からのその表面抗原で発現する誘導単球由来の機能樹状細胞を含んで成る免疫療法組成物を提供する。
癌免疫療法における樹状細胞の使用は現在、重要な臨床的探求の分野である。樹状細胞は、反応性T細胞に対する抗原の発現においてきわめて有効であるが、しかし、樹状細胞は通常、血中単核白血球の1パーセント未満を構成している。したがって、樹状細胞の集団を拡大し、抗癌免疫を増大させる多くのインビトロ法が開発されている。増加した数の樹状細胞を腫瘍または他の病原細胞上の抗原に曝露することによって、抗原負荷樹状細胞の患者への再導入後、反応性T細胞に対するこれら抗原の提示が顕著に増強されうる。
例えば、顆粒球単球コロニー刺激因子(GM−CSF)およびインターロイキン−4(IL−4)の存在下に8日間の血液単核白血球の培養により多数の樹状細胞が生じる。次いで、これらの細胞は、T細胞に対する提示のために腫瘍由来ペプチド抗原で外部から負荷されうる。あるいは、樹状細胞を変換し、これらの抗原をそれ自身で産生および提示させることができる。T細胞を含む他の単核白血球を補強し、活性化するサイトカインを産生し、分泌するように変換された樹状細胞の集団の拡大は、抗腫瘍免疫応答を生成するさらにより有効な方法でありうる。
特定の一般的な腫瘍抗原および/または追加のサイトカインを産生するように培養樹状細胞を変換することは、手間と費用がかかる。さらに重要なことに、この方法は、個人の独自の癌に最も関係があるとみられるような複数の腫瘍抗原を産生し、提示することに失敗する可能性が高い。この問題を克服する幾つかの方法が提案されている。培養自己樹状細胞の腫瘍細胞とのハイブリダイゼーションにより、複数の未知の腫瘍抗原を処理し、提示する能力がある4倍体細胞が産生されうる。第2の方法案では、悪性細胞の表面からのクラスIおよびクラスII主要組織適合性複合体(MHC)の酸溶離により、広範囲の腫瘍由来ペプチドが遊離される。次いで、これら遊離されたペプチドは、自己培養樹状細胞のMHC複合体上へ外部から負荷されうる。
従来のフォトフェレーシスは、特有の腫瘍抗原が未知である場合でも白血病性リンパ球に対して患者にワクチン接種する方法である。この方法では、悪性細胞が、クラスIMHC結合腫瘍抗原の細胞表面ディスプレイを強化する光活性化8−メトキシソラレン(8−MOP)に曝露される。これら変性悪性リンパ球の元の患者への静脈内返還後、強力な抗腫瘍反応が患者の約25%において発生し、悪性細胞集団の減少および時々長期間にわたる寛解につながることがある。自己樹状細胞を最初に組織培養中で成長させ、次いで8−MOP処理腫瘍細胞と混合させるマウスにおける実験的試験は、従来のフォトフェレーシスの効果を増大させるように思われる。この実験プロトコルでは、腫瘍性マウスT細胞が8−MOPを用いるフォトフェレーシスおよび紫外線(UV)エネルギーへの曝露によってアポトーシスが付与される。この悪性リンパ球の化学変換後、自己培養樹状細胞がアポトーシスT細胞に添加され、この細胞混合物が攪拌とともに一夜インキュベートされ、T細胞と樹状細胞との接触を最大化する。アポトーシスT細胞/樹状細胞混合物は、生存腫瘍性2B4.11細胞でチャレンジ(challenge)された試験マウスにおける有効な細胞ワクチンであることが判明している。
上述した実験プロトコルは、別の方法よりも明らかに有効かつ包括的であるが、数日間にわたる大規模なエクスビボ細胞操作を必要とする。したがって、1日で多数の機能樹状細胞を提供し、その細胞をアポトーシス腫瘍細胞に曝露しうるインビボ処置は、それによって抗腫瘍細胞ワクチンが調製されうる手段を大幅に簡素化することになる。
本発明は、2つの異なる現象に基づき、すなわち機能樹状抗原提示細胞へのその分化を誘導する方法で単球を処理すること、および腫瘍細胞などの疾患エフェクター因子を処理し、それらにアポトーシスを付与し、またはそれらを不活性化することである。樹状抗原提示細胞を患者に戻す前に、疾患エフェクター因子に特有の疾患結合抗原の樹状細胞による処理および提示を最適化するのに十分な時間にわたってこれら処理集団を共にインキュベートすることによって、疾患結合抗原に対する臨床的に強化された免疫が達成される。
本明細書中で用いられる「疾患エフェクター因子」は、対象における病状の原因の中心となり、疾患結合抗原を発現する因子である。ある特定の状況では、これら疾患エフェクター因子は、血中に循環しており、それによって体外操作および処理が容易に可能となる病原細胞である。かかる病原細胞の例としては、悪性T細胞、悪性B細胞、自己免疫応答を仲介するT細胞およびB細胞、およびそれらの表面でウイルスまたは細菌ペプチドまたはタンパク質を発現するウイルスまたは細菌感染白血球が挙げられる。病原細胞を生じさせる典型的な疾患カテゴリーとしては、白血病、リンパ腫、自己免疫疾患、移植片対宿主病、および組織拒絶反応が挙げられる。これらの病状を仲介し、病原細胞由来である疾患結合抗原としては、MHCクラスI部位、MHCクラスII部位、またはMHC部位(すなわちシャペロン)へのおよび同部位からのペプチドの輸送に関係する熱ショックタンパク質に結合するペプチドが挙げられる。疾患結合抗原としては、感染白血球の表面で発現し、通常、MHCクラスIまたはクラスII分子と関係しているウイルスまたは細菌ペプチドも挙げられる。
他の病原細胞としては、肺癌、結腸癌、脳腫瘍、腎癌、または皮膚癌など充実性腫瘍から外科的に切除された試料から単離されたものが挙げられる。これらの細胞は、懸濁液に入れられ、または組織培養中で増殖された後に血中白血球と類似の方法で体外的に操作されうる。あるいは、場合によっては、充実性腫瘍を有する患者の循環血液が、腫瘍から決裂し、循環に入った悪性細胞を含有しうることがわかっている。[クレフト(Kraeft)ら、レアイベント・イメージングシステムを用いた血中および骨髄中の癌細胞の検出および分析(Detection and analysis of cancer cells in blood and bone marrow using a rare event imaging system)、Clinical Cancer Research、2000年(6)、pp.434−442。]これらの循環腫瘍細胞は、本発明の方法によってアポトーシスが付与され、本明細書中に記載され請求される方法によって形成される樹状細胞に提示されうる容易に利用可能な癌細胞源を提供しうる。
病原細胞に加えて、さらに本発明の範囲に含まれる疾患エフェクター因子としては、疾患結合抗原を発現する細菌、真菌、およびウイルスなどの微生物が挙げられる。ウイルスは「不完全」に加工されうること、すなわち、実際の感染因子として作用しうることなしに特徴的な病原抗原を産生し、かかる「不完全」ウイルスが本明細書中で用いられる「疾患エフェクター因子」なる用語の意味に含まれることを理解すべきである。
本発明は、血中に含まれる単球の機能抗原提示樹状細胞への分化を誘導する患者の血液の体外量を処理するための方法を提供する。本発明の好ましい実施形態では、体外量の患者の血液は、従来のフォトフェレーシス装置を用いて処理され、樹状細胞への単球の分化を誘導する。特定の機序に限定されることは望ましくないが、発明者は、血中の単球がフォトフェレーシス装置におけるチャンネルのプラスチック表面に引きつけられ、かつ粘着し、それらはその後にチャンネルを通じた流体の流れからの剪断力によってプラスチック表面から放出されると考えている。したがって、単球がフォトフェレーシス装置を通過すると、それらはプラスチック表面への順次的な付着および同表面からの放出を受ける。これらのイベントの物理的力は、細胞膜を通じて活性化シグナルを送り、単球の機能樹状細胞への分化を誘導する。
フォトフェレーシス装置における処理後、機能樹状細胞はアポトーシス疾患エフェクター因子の存在下にインキュベートされ、樹状細胞による疾患エフェクター因子の貪食を可能にするともに、疾患エフェクター因子から対象の免疫系におけるT細胞への抗原の提示を可能にする。本発明の特に好ましい実施形態では、血液がフォトフェレーシス装置を通過し、単球の機能樹状細胞への分化を誘導すると、血中の疾患エフェクター因子は、光活性化可能物質で疾患エフェクター因子を処理し、フォトフェレーシス装置を通過すると血液を照射することによってアポトーシスが付与される。疾患エフェクター因子に単球が誘導されるアポトーシスを付与し、新しい樹状細胞を形成することによって、本発明の方法により結果として増加した数の抗原提示樹状細胞がもたらされ、これらは患者に再注入され、免疫療法反応を誘発しうる。
体外量の患者の血液がフォトフェレーシス装置で処理された後、組成物は約6〜約48時間、最も好ましくは約12〜約24時間にわたってインキュベートされる。この期間中、樹状細胞はアポトーシス疾患エフェクター因子を貪食し、それらの表面で貪食細胞から抗原を提示し、ここで樹状細胞は患者の免疫系におけるT細胞によって認識され、それによって患者における疾患エフェクター因子に対する免疫応答を誘導する。
血中に含まれる悪性T細胞の治療において特に有効である本発明の別の実施形態では、血中の疾患エフェクター因子はモノクローナル抗体を用いてアポトーシスが付与される。このモノクローナル抗体は抗体の末端で遊離Fcセグメントを含みうるが、これは樹状細胞の表面上で相補的受容体と結合しうる。抗体はこのようにしてアポトーシス疾患細胞と樹状細胞との間にブリッジを形成し、アポトーシス細胞が樹状細胞によって貪食され、処理される可能性を増大させる。あるいは、疾患エフェクター細胞は、他の方法によってアポトーシスが付与され、利用可能なFc受容体とともにモノクローナル抗体でコーティングされ、機能樹状細胞によるアポトーシス疾患エフェクター因子の摂取および処理を増強する。また、決裂し、血中に循環している充実性腫瘍からの癌細胞など、非アポトーシス疾患エフェクター因子は、抗体でコーティングされ、機能樹状細胞による癌細胞の摂取を増強しうる。
上記のとおり、単球分化は、患者の血液の体外量に含まれる単球を、従来のフォトフェレーシス装置のチャンネルの表面など、プラスチック表面上の単球の順次的な付着および放出の結果もたらされる物理的力に曝露することによって開始される。本発明の好ましい実施形態では、当業者に周知の種類の白血球アフェレーシス/フォトフェレーシス装置を用いる標準の白血球アフェレーシス実践に従い白血球濃縮物が調製される。白血球濃縮物には、単球、リンパ球、および一部の赤血球と血小板が含まれる。通常、20億個までの白血球が白血球アフェレーシス中に収集される。単球が収集された総白血球集団の約2%〜約50%を構成すると仮定すれば、約4000万〜10億個の単球が白血球濃縮物には存在する。
白血球アフェレーシスによる分離後、単球分化は複数のプラスチックチャンネルを有する装置を通じて血中細胞濃縮物を汲み上げることによって誘導される。プラスチックチャンネルは直径が約0.5mm〜5.0mmであることが好ましい。チャンネルの直径が1mm以下である従来のフォトフェレーシス装置が用いられることが最も好ましい。フォトフェレーシス装置の狭いチャンネルの構造は、フォトフェレーシス装置の中を流れる血中細胞濃縮物が曝露されるプラスチックの表面積を最大化する。しかし、本発明はこの点に関し限定されず、プラスチックチャンネルを有する適切な装置を用いて単球分化を誘導することができる。
血中細胞濃縮物がフォトフェレーシス装置を用いて処理される本発明の好ましい実施形態では、単球分化は、それらがフォトフェレーシス装置におけるプラスチックチャンネルを通じて流れると直面する物理的力によって誘導される。本発明は特定の機序に限定されないが、発明者は、血中細胞濃縮物における単球がフォトフェレーシス装置のプラスチックチャンネル壁に引きつけられるとともに、単球がチャンネル壁に付着すると考えている。流体は、単球をプラスチックチャンネル壁から放出させる付着単球上に剪断力を与えるチャンネルを通じて流れる。したがって、単球がフォトフェレーシス装置を通過すると、プラスチックチャンネル壁への付着および同壁からの放出という幾つかのエピソードを受ける。これらの物理的力は単球の細胞膜を通じて活性化因子シグナルを送り、これにより単球の機能樹状細胞への分化の誘導がもたらされる。
この方法によって単球を誘導して樹状細胞を形成することは、免疫療法治療に幾つかの利点を提供する。樹状細胞のすべてはきわめて短時間内に単球から形成されるため、樹状細胞はすべてほぼ同じ年齢である。樹状細胞は、そのライフサイクルの早期の明確な期間中にアポトーシス細胞を貪食する。さらに、貪食アポトーシス細胞に存在する抗原は、後期の明確な期間中に樹状細胞の表面で処理され、発現する。比較的狭い年齢プロファイルで樹状細胞を作製することによって、本発明の方法は、アポトーシス疾患エフェクター因子を貪食し、その後に免疫療法治療に使用されるその疾患エフェクター因子から抗原を提示する増加した数の樹状細胞を提供する。
単球の分化を開始させる処理後、処理された血中細胞濃縮物は、アポトーシスまたは不活性化疾患エフェクター因子の存在下にインキュベーションのために隔絶される。インキュベーション期間は、アポトーシス疾患エフェクター因子に比較的接近している血液濃縮物における樹状細胞の形成および成熟を可能にし、それによってアポトーシス疾患因子が樹状細胞によって消費され、処理される可能性が増大する。以下で説明されるとおり、疾患細胞は、血液濃縮物がフォトフェレーシス装置を通過するとアポトーシスに誘導され、または疾患細胞はアポトーシスを誘導するように別々に処理され、フォトフェレーシス装置を通じた血液濃縮物の通過前後に血液濃縮物に添加されうる。フォトフェレーシスにおいて一般的であるように、標準の血液バッグを細胞のインキュベーションのために使用することができる。しかし、実質的な量の可塑剤をろ過することがなく、気体、特にCO2およびO2の交換を可能にするのに十分に多孔性である種類の血液バッグを使用することが特に有利であることがわかっている。かかるバッグは、例えば、アミカス(Amicus)(商標)アフェレーシスキット(Apheresis Kit)の名称でバクスター ヘルス ケア社(Baxter Healthcare Corp.)のフェンウォール(Fenwall)事業部から入手可能である。種々の可塑剤を含まない血液バッグも米国特許第5,686,768号および同第5,167,657号に開示されており、その開示内容は本明細書中で参考によって援用される。
血中細胞濃縮物および疾患エフェクター細胞は、インキュベートされる細胞集団における機能抗原提示樹状細胞の数を最大限にするのに十分な時間にわたってインキュベートされる。通常、処理された血中細胞濃縮物および疾患エフェクター細胞は、約6〜約48時間にわたってインキュベートされるが、好ましいインキュベーション時間は約12〜約24時間に及ぶ。上述した方法で単球を処理し、次いで処理された細胞集団をインキュベートすることによって、多数の機能抗原提示樹状細胞を得ることができる。インキュベート期間中に、血液バッグに緩衝培地のほか、GM−CSFおよびIL−4など1つもしくはそれ以上のサイトカインを添加することが特に有利であることがわかっている。
例えば、疾患エフェクター因子が悪性T細胞である場合など、疾患エフェクター因子が対象の血中で循環している場合に特に有用である本発明の好ましい実施形態では、単球がフォトフェレーシス装置において直面する物理的力によって樹状細胞を形成するように誘導されるとフォトフェレーシス装置においてアポトーシスが疾患エフェクター因子に付与される。疾患エフェクター細胞におけるアポトーシスを誘導する能力がある光活性化可能剤が、フォトフェレーシス装置を通過する前に血中細胞濃縮物に添加され、血中細胞濃縮物はフォトフェレーシス装置を通過すると照射され、疾患細胞にアポトーシスを付与する。フォトフェレーシス装置における疾患細胞にアポトーシスを付与することによって、これらの細胞は、単球が分化して樹状細胞を形成しているため、直ちに貪食されるように利用可能になる。
本発明のこの実施形態では、フォトフェレーシスの前に白血球濃縮物に食塩水を添加し、赤血球濃度を体積で約2%まで希釈し、それによって標的疾患細胞への活性化放射線のより有効な浸透を可能にする。白血球アフェレーシスおよびフォトフェレーシスのために対象から多量の血液を得る前に光活性化可能剤を対象に投与することができる。あるいは、または追加的に、通常、光活性化可能剤を白血球アフェレーシス/フォトフェレーシス装置につながるチューブに注射することによって、体外血流に直接、添加することができる。いつおよびいかにして特定の薬剤が投与されるかにかかわらず、疾患細胞は、薬剤が疾患細胞における細胞成分と反応するのに十分な時間にわたって光活性化可能剤に曝露されなければならない。
本発明において使用されうる典型的な光活性化可能剤は、ソラレン類、ポルフィリン類、ピレン類、フタロシアニン、レチノイド誘導体、光活性化コルチゾン、光活性化可能色素、およびポルフィリン分子に結合されているモノクローナル抗体である。本発明はこの点に関して限定されず、当業者に周知の適切な光活性化可能剤を使用することができる。
ソラレン類は、フォトフェレーシス処置における使用に好ましいクラスの光活性化可能剤である。ソラレン類は消化トラックから容易に吸収され、経口投与後1〜4時間で血中および他の組織中でピークレベルに達し、これらの薬剤はほぼ完全に24時間以内に排出される。したがって、ソラレン類は、対象の血液の体外量を得る前の経口投与に特に適している。ソラレン分子は照射への曝露前に不活性であり、照射後の励起状態に一時的に活性化される。好ましいソラレン類としては、8−メトキシソラレン(8−MOP)、4’アミノメチル−4,5’,8トリメチル−ソラレン(AMT)、5−メトキシソラレン(5−MOP)、およびトリメチル−ソラレン(TMP)が挙げられる。8−MOPは、本発明の方法との使用に最も好ましい光活性化可能剤であり、このソラレンの経口投与の状態は、米国特許第5,147,289号に記載されており、その開示内容は本明細書中で参考によって援用される。
フォトフェレーシスの照射段階は、血中細胞濃縮物がフォトフェレーシス装置を通過すると実施される。好ましい曝露装置としては、対向する照射源間に配置された約1mmの直径を有する透明のプラスチックチャンネルが挙げられる。再び好ましい実施形態を参照すると、血中細胞濃縮物がプラスチックチャンネルを通過すると、疾患細胞は約0.5mm超の血液によって照射源から決して分離されない。疾患細胞をこのように照射源に接近して維持することは、活性化放射線への疾患細胞の十分な曝露の確保において特に有効であることが判明している。8−MOPなどのソラレンが光活性化可能剤として用いられる場合、照射源が活性化放射線として紫外線A放射線(UVA)を放射する。ソラレンを活性化するには、処理された疾患細胞は通常、約15〜約150分間にわたって約1〜2ジュール/cm2のUVAに曝露される。
上述した方法の1つの実施形態の応用例は、皮膚T細胞性リンパ腫(CTCL)と呼ばれる特定の種類の癌の治療について図2〜10に示されている。図2〜10は個々の細胞の処理を示すが、実際には、対象の血液は以下に記載される複数の種々の細胞を含有し、複数の細胞は同時に処理されることを理解すべきである。図2を参考にすると、プラスチックチャンネル10は多量の対象の血液、または対象の血液が最初に白血球アフェレーシスによって処理されている場合は血中細胞濃縮物を含有する。血液は血中単球12および悪性CTCL細胞14を含有する。悪性CTCL細胞は、複数のアミノ酸18を含むクラス1結合ペプチド抗原16を示す。対象の血液はプラスチックチャンネルを通じて汲み上げられ、単球の樹状細胞への分化を誘導する。
図3に示されているとおり、対象の血液がプラスチックチャンネルを通じて汲み上げられると、単球12はプラスチックチャンネル10の壁15に付着する。図4に示されているとおり、単球を流れ過ぎる流体によって剪断力が付着単球上に与えられ、単球12は壁15から除去される。単球がプラスチックチャンネルを通じて流れると、それらはチャンネル壁から付着および除去の幾つかのエピソードを受けることがある。単球が直面する力の結果、単球を分化させ、図5に示されている未成熟樹状細胞20を形成する活性化信号が送信される。
上述したとおり、特に好ましい実施形態では、プラスチックチャンネルは従来のフォトフェレーシス装置の一部である。これにより、血液がプラスチックチャンネルを通過すると、悪性CTCL細胞にはアポトーシスが付与される。対象の血液は、8−MOPなど光活性化可能剤でチャンネル通過前に処理される。図6に示されているとおり、処理されたCTCL細胞14がフォトフェレーシス装置(図示せず)のプラスチックチャンネル10を通過すると、紫外線光22がフォトフェレーシス装置の透明なプラスチックチャンネル壁15を通じて伝達される。紫外線光22は光活性化可能剤を活性化し、それによって悪性CTCL細胞14のアポトーシスを誘導する。
血液がフォトフェレーシス装置を通過した後、対象の血液はインキュベートされ、樹状細胞の成熟およびアポトーシスCTCL細胞の貪食を可能にする。図7に示されているとおり、樹状細胞20はインキュベート期間中にアポトーシスCTCL細胞14を摂取する。樹状細胞は、インキュベート期間中に継続して成熟すると、アポトーシス悪性CTCL細胞を処理する。図8に示されているとおり、インキュベーション期間の終わりに、樹状細胞が悪性CTCL細胞を消化した後、結合クラス1ペプチド抗原16が樹状細胞20の表面に提示される。インキュベーション期間の後、抗原提示樹状細胞を含有する組成物は免疫療法のために対象へ再注入される。
対象の血流中への再注入後の抗原提示樹状細胞を示す図8および図9を参照すると、樹状細胞22はその表面で悪性CTCL細胞からクラス1ペプチド抗原の受容体部位26を有する健常T細胞24へクラス1ペプチド抗原16を提示する。図9に示されているとおり、健常T細胞24が樹状細胞からクラス1ペプチド抗原を受け取ると、健常T細胞は活性化し、同じクラス1ペプチド抗原を示す悪性T細胞を認識し、攻撃するT細胞クローンの形成を誘導する。その結果、図10に示されているとおり、対象の免疫系の健常T細胞クローン24は悪性CTCL細胞クローンによって示されたクラス1ペプチド抗原を認識し、クラス1ペプチド抗原を示す対象における悪性CTCL細胞クローン28を攻撃し、殺傷するように誘発される。
上述の説明はCTCLを処理するための方法に言及しているが、本発明はこの点に関して限定されないことを理解されるべきであり、この方法を用いて他の種類の癌または疾患を治療することができる。また、本明細書中でさらに説明されるとおり、この方法は、プラスチックチャンネルを有する任意の種類の装置を用いて実行し、単球分化を誘導することができる。さらに、癌細胞または他の疾患エフェクター因子は、当業者に周知の方法によってアポトーシスが付与され、本発明の方法によって形成される樹状細胞とともにインキュベートされうる。
上述したとおり、単球が樹状細胞への分化が誘導されるのと同時にフォトフェレーシス装置における疾患細胞のアポトーシスを誘導することによって、樹状細胞は疾患細胞を貪食し、免疫療法治療における使用のための疾患細胞から抗原を提示する可能性が高い。本発明のこの実施形態は、例えば、疾患細胞が悪性T細胞である場合など、疾患エフェクター因子が対象の血中に存在する場合に特に有用である。本発明のこの実施形態は、疾患細胞が充実性腫瘍からの細胞である場合にも使用することができる。少なくとも場合によっては、充実性腫瘍からの細胞が決裂し、血中に循環することが示されている。このような場合には、単球が樹状細胞への分化を受けるのと同時にフォトフェレーシス装置における腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することが好ましいとみられる。
本発明の別の実施形態では、対象の血液における疾患エフェクター因子は、疾患細胞の表面に選択的に結合するモノクローナル抗体でコーティングされる。結合モノクローナル抗体は、タンパク質鎖の末端で遊離Fcセグメントを含む長鎖タンパク質である。ドーダプカー(Dhodapker)ら[抗腫瘍モノクローナル抗体は細胞抗原の交差浸透および樹状細胞による骨髄腫特異的キラーT細胞の生成を増強する(Antitumor monoclonal antibodies enhance cross−penetration of cellular antigens and the generation of myeloma−specific killer T cells by dendritic cells)、Journal of Experimental Medicine、2002年(195)、pp.125−133]に記載されているとおり、モノクローナル抗体は疾患細胞に付着し、遊離Fcセグメントは、樹状細胞の表面上の相補的受容体に引きつけられ、かつこれと結合する。モノクローナル抗体上のFcセグメントと樹状細胞上の相補的受容体とのこの結合は、アポトーシス疾患エフェクター細胞とのブリッジを実質的に形成し、それによって樹状細胞によるアポトーシス疾患エフェクター細胞の摂取の可能性および速度を増大させる。抗体は、CD8抗腫瘍免疫応答を刺激する抗原において頂点に達する経路に摂取癌抗原を方向づけるようにも思われる。疾患エフェクター因子は、モノクローナル抗体でコーティングされる前にアポトーシスが付与されることが好ましい。しかし、本発明はこの点に関して限定されず、モノクローナル抗体を用いて、非アポトーシス疾患エフェクター因子の摂取および処理を増強することができる。
本発明の方法は、例えば、癌細胞を得る侵襲的な処置の必要なしに充実性腫瘍を有する対象の免疫療法治療に使用することができる。場合によっては、充実性腫瘍を有する患者の循環血液は、腫瘍から決裂し、循環に入った癌細胞を含有しうる[クレフト(Kraeft)ら、レアイベント・イメージングシステムを用いた血中および骨髄中の癌細胞の検出および分析(Detection and analysis of cancer cells in the blood and bone marrow using a rare event imaging system)、Clinical Cancer Research、2000年(6)、pp.434−442]。これらの循環する癌細胞は、細胞100万個当たり癌細胞10〜100個ほどの比較的低いレベルで循環血中に存在しうる。特定の種類の癌細胞と反応し、白血球と反応することがない抗体を血液に添加し、癌細胞と結合させることができる。特定の種類の癌細胞に特有であり、かつこれらに結合するかかる抗体は、当業者に公知である。抗体タンパク質鎖の末端での遊離セグメントは、樹状細胞上の相補的受容体部位に優先的に結合する。したがって、癌細部に結合した抗体は、癌細胞を樹状細胞に優先的に方向づけ、それによって樹状細胞による癌細胞の摂取を増強することができる。この処置により、抗体は血中に存在する癌細胞を樹状細胞に方向づけるように作用するため、治療前に患者から癌細胞を除去する必要を除去しうる。癌細胞は、抗体でコーティングする前にアポトーシスが付与されることが好ましいが、本発明はこの点に関して限定されず、非アポトーシス癌細胞を使用することができる。
皮膚T細胞性リンパ腫の場合、悪性T細胞をモノクローナル抗体でコーティングすることによりT細胞のアポトーシスが誘導され、樹状細胞による瀕死のT細胞の摂取が増大し、かつ樹状細胞によるT細胞抗原の処理速度が増大する。モノクローナル抗体は、癌細胞または病原Tリンパ球およびBリンパ球などの(自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、および幹細胞移植後の移植片対宿主病など)他の種類の病原細胞と使用し、樹状細胞による癌細胞の摂取および処理を増大させることができる。例えば、乳癌、結腸癌、および前立腺癌に対する抗体が利用可能であり、これらを用いて関連癌細胞をコーティングすることもできる。癌細胞は、当業者に周知の方法によってアポトーシスが付与されうるとともに、アポトーシス癌細胞は遊離Fcフラグメントを有する抗体でコーティングされうる。遊離Fcフラグメントは樹状細胞上の相補的受容体に結合し、それによって樹状細胞とアポトーシス疾患エフェクター因子との間のブリッジを形成するとともに、疾患細胞と樹状細胞との間のブリッジを形成し、樹状細胞によるアポトーシス疾患細胞の摂取および処理を増強する。
疾患エフェクター因子は、フォトフェレーシス装置を通じる血液の通過前に、アポトーシスに誘導され、かつ抗体でコーティングされ、単球の樹状細胞への分化を誘導することが好ましい。あるいは、対象の血中に含まれる疾患エフェクター因子は、フォトフェレーシス装置を通じる血液の通過後およびインキュベーション前にアポトーシスに誘導され、かつ抗体でコーティングされうる。必要に応じて、疾患エフェクター因子は、フォトフェレーシス装置を通過し、インキュベーション前に処理血液に添加される血中細胞濃縮物から別々に処理されうる。
処理前に白血球アフェレーシスによって体外量の患者の血液から単球を分離することが絶対に必要というわけではないことを理解すべきである。血中に含まれる単球が、プラスチックチャンネルを通じる流れによって与えられる物理的力に十分に曝露され、その後のインキュベーション後に樹状細胞への分化を開始する限り、単球集団の分離は必要ではない。
本発明による単球分化の誘導により、7日間もしくはそれ以上にわたるGM−CSFおよびIL−4などサイトカインの存在下の白血球の費用と手間のかかる培養によって得られる樹状細胞の数と同等またはそれを超える数の樹状細胞が提供される。本発明によって生成される多数の機能樹状細胞は、選択された疾患結合抗原を提示する迅速な手段を提供し、それによって効率的な免疫療法に貢献する。特定の免疫応答を誘い出すように選択され、例えば、腫瘍、病原非悪性細胞、または細菌、ウイルス、および真菌などの微生物由来の抗原調製物をインキュベーション中に血液バッグに直接添加することができる。これらの微生物は、8−MOPまたは他の薬剤への前曝露によって不活性化されうることが好ましい。8−MOPは、細菌および真菌におけるアポトーシスを引き起こし、ウイルスを不活性化しうることが知られている。成熟樹状細胞を血液バッグの範囲内でかかる抗原調製物と密着させることにより、多数の抗原負荷樹状細胞が得られる。抗原負荷樹状細胞は、その細胞を対象へ再注入することによって、または周知の方法に従い、皮下、皮内、または筋内注射など、細胞を投与して免疫応答を誘い出すことによって免疫原として使用することができる。以下に説明されるとおり、疾患結合抗原を発現する能力がある単球および疾患エフェクター因子を処理し、共インキュベートすることによって抗原負荷樹状細胞を生成することも可能である。
本発明の別の態様では、単球を機能樹状細胞へ分化するように誘導しうるとともに、疾患エフェクター因子はアポトーシスが付与され、もしくは不活性化され、または使用される血液もしくは血中細胞濃縮物から別々に処理し、樹状細胞を形成することができる。上述したとおり、かかる疾患エフェクター因子は、細菌、真菌、完全および不完全ウイルス、および個人独自の組織または移植組織を攻撃する悪性細胞のクローンまたは非悪性T細胞またはB細胞のクローンを含む細胞の病原クローン集団などの微生物を含む。これらの因子は、大部分の他の細胞から区別されることを可能にするその表面上に特有の抗原を有するため、免疫応答がその特有の抗原に対して理想的に発現されうる。次いで、これらの免疫応答は、疾患エフェクター因子集団を抑制または除去しうる。反応性免疫系に対する関連抗原を有効に導入する能力がある樹状抗原提示細胞の生成により、本発明はかかる疾患制御免疫応答の可能性を実質的に増強する。
本発明のこの態様の要となるのは、上述したとおり生成された、増加した数の抗原提示樹状細胞の、特有の抗原を有するアポトーシス病原細胞もしくは不活性化または不完全微生物のクローンとの共培養である。病原細胞、細菌、および真菌の場合、光活性化剤への曝露に加えて、アポトーシスを誘導する他の手段が適用可能でありうる。
例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)モチーフによる合成ペプチドを患者の血液、切除された充実性腫瘍、またはその組織培養株から単離された病原細胞の細胞懸濁液に添加しうる。RGDは、おそらくプロ−カスパーゼ−3の自己処理および活性化を誘発することによって、腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導することがわかっている(Nature、1999年、第397巻、pp.534〜539)。同様に、アポトーシスは、Fas受容体を有する細胞において、この受容体に対する抗体で刺激することによって誘導されうるが、このようにして、細胞の内部にシグナルを送り、通常、Fasリガンドによるのと同じ方法で、プログラム細胞死を開始させる。また、アポトーシスは、病原細胞を熱または寒冷ショック、一部のウイルス感染(すなわち、インフルエンザウイルス)、細菌毒素、およびX線またはガンマ線照射にかけることによって誘導されうる。あるいは、インフルエンザウイルスなど一部の感染性因子はアポトーシスを引き起こしうるとともに、これらを用いて病原細胞の細胞懸濁液におけるこの目的を達成することもできうる。
したがって、これらの方法は、光活性化8−MOPによるアポトーシスの誘導ほど通常好ましくないが、誘導された樹状抗原提示細胞とそれらの共培養および免疫化のために患者にそれらを戻す前に、病原細胞集団におけるアポトーシスまたは不活性化を開始させる目的を達成しうる。もちろん、ウイルスは細胞ではなく、それらはその用語が一般に理解され、当業者によって用いられているようにアポトーシスを受けることがありえないことを理解すべきである。しかし、ウイルスは、8−MOPおよび他の光活性化剤への曝露によって不活性化し、したがって、このようにして、誘導された樹状抗原提示細胞との共培養の前に処理しうることが知られている。
発明のプロトコルおよび適用の臨床結果
本発明の適用の例を、皮膚T細胞性リンパ腫を治療するための強化療法に特に関連して説明する。しかし、本発明はこの特定の適用に限定されず、かつ本発明を使用して、その独自の表面抗原によって区別可能な疾患エフェクター因子を成分として含む任意の病状を治療しうることを理解すべきである。かかる病状の数、成分エフェクター因子、および疾患結合抗原は上述されている。
本発明の適用の例を、皮膚T細胞性リンパ腫を治療するための強化療法に特に関連して説明する。しかし、本発明はこの特定の適用に限定されず、かつ本発明を使用して、その独自の表面抗原によって区別可能な疾患エフェクター因子を成分として含む任意の病状を治療しうることを理解すべきである。かかる病状の数、成分エフェクター因子、および疾患結合抗原は上述されている。
皮膚T細胞性リンパ腫(CTCL)は、異常T細胞の単一クローンの膨大な拡大によって引き起こされる免疫疾患である。これらの悪性細胞は、クローン特異的または腫瘍特異的細胞表面抗原によって区別され、少なくともその1セットは、クローン特異的T細胞受容体のクローン特異的タンパク質成分由来である。細胞毒性T細胞応答は、これらのクローン特異的抗原に対して選択的に生成されうる。過去10年の間に、フォトフェレーシスは進行性CTCLに対する標準の免疫療法になり、少なくとも部分的に、かかる抗CTCL免疫応答を生成することによって機能している。フォトフェレーシスを用いる標準のCTCL治療では、白血球および単球が体外量の対象の血液から白血球アフェレーシスによって分離される。単球および白血球は、生物学的に不活性な8−MOPが活性化され、悪性リンパ球におけるDNAおよび細胞質タンパク質に共有結合する、上述した種類の紫外線A曝露装置を通じて循環される。これは、薬剤がわずか数百万分の1秒間活性であり、それによって曝露領域における細胞のみを化学的に変化させ、全身の副作用の少なさを説明するため、きわめて特異的な療法である。フォトフェレーシスは、全身の免疫抑制を引き起こすことなく、曝露された白血球の免疫原性の増大を提供する。したがって、処理された細胞を対象に戻すことにより、「ワクチン接種」効果がもたらされ、大部分の反応性対象において、化学的に変化され、再導入された白血球に対する持続的な免疫応答を得ることができる。悪性T細胞の身体負荷量の5%未満の変化および返還は有意義な抗腫瘍反応を誘導しうるが、一部の対象においては、15年を超える継続する完全寛解をもたらした。CTCLの治療にフォトフェレーシスを適用する方法は、米国特許第5,114,721号および同第4838,852号、ならびに公開PCT出願国際公開第97/34472号パンフレットおよび国際公開第94/11016号パンフレットにおいて開示されており、その開示内容は本明細書中で参考によって援用される。
フォトフェレーシスのCTCLへの適用により達成された臨床結果は、2つの主な理由で治療の基礎をなす機序への探求を助長した。第1に、それらの悪性細胞に対してフォトフェレーシスが患者にワクチン接種する機序がよりよく理解されうる場合は、方法を精巧にし、その有効性を強化することが可能であろう。例えば、進行性CTCL患者の25%のみがフォトフェレーシスに対する主要な持続的反応を有している。これらの陽性反応は顕著であり、その頻度は従来の化学療法によって得られる頻度を超えるが、処置の有効性を増大させることが望ましいであろう。第2に、機序がよりよく理解されうる場合は、修正された療法を他の種類の悪性腫瘍および疾患過程に拡大適用することも可能であろう。この適用は、フォトフェレーシスに応じた樹状抗原提示細胞の役割の新しい理解に基づくとともに、より詳しくは、この役割を強化する方法に基づく。実験系における、および形質転換ヒト細胞系による試験により4系列の証拠が得られた。第1に、処理はCD8T細胞を刺激し、T細胞の病原クローンの活性を抑制する。第2に、これらのCD8細胞は、少なくとも病原T細胞の単一クローンのみが認められるCTCLにおいて、腫瘍細胞表面としてのクラスIMHC複合体との関連で腫瘍特異的ペプチド抗原を認識する。第3に、ヒトリンパ芽球の光活性化8−MOPへの曝露は、クラスI複合体のディスプレイを3倍にし、一夜インキュベーション後にピークに達する。最後に、処理は、リンパ球におけるアポトーシスおよびそれらの食作用性単核細胞による摂取も引き起こす。
複数の系列の臨床的および実験的証拠により、異常T細胞集団を選択的に抑制する能力がある強力なCD8反応の誘導と関係がある「ワクチン接種」現象が確認された。CTCLの場合、少なくとも抗癌CD8T細胞の一部は、悪性細胞のT細胞受容体タンパク質由来の腫瘍特異的ペプチドを選択的にターゲティングした。CD8T細胞のT細胞受容体は、クラスIMHCとの関連で抗原性ペプチドを認識するため、これら複合体のディスプレイに対する8−MOPの影響への注目が焦点となった。最近、8−MOPが、曝露後最大約22時間、形質転換ヒトリンパ球の細胞表面でクラスIMHCのディスプレイを3倍にし、この作用が細胞質タンパク質の劣化、およびTAP細孔を通じた小胞体上の生成ペプチドフラグメントの輸送に依存することが報告されている。この作用は、薬剤の他の主な分子標的、DNAのピリミジン塩基ではなく、細胞基質タンパク質の芳香族アミノ酸への8−MOPの結合によって開始されると思われる。
本発明は、免疫応答が関連抗原を含有する弱免疫原性複合体に対して発生される場合、かかる反応は複合体が抗原提示細胞上で最大化されている場合に最大化しうるという仮定に基づく。従来のフォトフェレーシスでは、T細胞は、アポトーシスがベースラインよりもわずかにやや上昇し、クラスI複合体もやや増強している時点で対象に直ちに戻される。本発明の方法では、処理された白血球は一夜、通常、約6〜48時間にわたってインキュベートされる。予想外の所見は、処理された細胞の一夜インキュベーションは、アポトーシスT細胞によるクラスI複合体の発現を増強するだけではなく、単球の機能樹状細胞への成熟を最大化したことである。したがって、これら2つの現象の収斂により、インキュベーション段階は、多数のアポトーシス悪性細胞をアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞のフラグメントを摂取する能力がある増大した数の機能樹状細胞と同格にもたらす単純な手段となった。以前、フォトフェレーシスバッグにおける単核細胞はすでにアポトーシスT細胞を貪食し始めているが、これらの単核細胞は樹状細胞の特性を有さないことが示されている。通常、抗原提示細胞は、クラスIIMHC経路を通じて取込まれた抗原を処理し、これが通常、クラスIMHCとの関連でのみ抗原を「見る」所望のCD8細胞毒性細胞ではなくCD4T細胞の発現を刺激する。しかし、最近、樹状細胞はクラスIMHC系を通じてアポトーシス細胞由来の抗原を処理し、提示する特殊な能力を有することが報告されていることに注目することが重要である。
本発明に基づく増強されたフォトフェレーシスプロトコルは、進行性CTCLに罹患した対象4例を含むパイロット試験において有望な臨床結果を提供した。しかし、試験の臨床結果を論じる前に、本発明の実施形態を説明する治療プロトコルを以下の実施例に記載する。
フォトフェレーシスプロトコル
フォトフェレーシスプロトコルである第1のステップは、FDA(米国食品衛生局)によって現在認可されているプロトコルと実質的に同じである。対象は、経口8−MOP(0.6mg/kg)または静注8−MOPを直接、フォトフェレーシス装置に受け、薬剤の50〜200ng/mlの濃度を得る。次に、血液を白血球アフェレーシスにかけ、軟膜を得、次いで、約1〜2ジュール/cm2の紫外線Aエネルギー(320nm〜400nm)を送出する連続閉回路紫外線A曝露装置の中を通過させる。このようにして、約1〜100分子の8−MOPが各百万塩基対のDNAに共有結合するように誘導される。ほぼ同等量の8−MOPが細胞質タンパク質の芳香族アミノ酸に共有結合するように誘導される。総量約250ccを含んで成る処理された白血球分画は、食塩水500ccと混合され、次いで、フォトフェレーシス処置には一般的である標準の血液バッグ中で隔絶される。フォトフェレーシス後、処理された画分は次の新しいインキュベーション段階プロトコルにかけられる。
フォトフェレーシスプロトコルである第1のステップは、FDA(米国食品衛生局)によって現在認可されているプロトコルと実質的に同じである。対象は、経口8−MOP(0.6mg/kg)または静注8−MOPを直接、フォトフェレーシス装置に受け、薬剤の50〜200ng/mlの濃度を得る。次に、血液を白血球アフェレーシスにかけ、軟膜を得、次いで、約1〜2ジュール/cm2の紫外線Aエネルギー(320nm〜400nm)を送出する連続閉回路紫外線A曝露装置の中を通過させる。このようにして、約1〜100分子の8−MOPが各百万塩基対のDNAに共有結合するように誘導される。ほぼ同等量の8−MOPが細胞質タンパク質の芳香族アミノ酸に共有結合するように誘導される。総量約250ccを含んで成る処理された白血球分画は、食塩水500ccと混合され、次いで、フォトフェレーシス処置には一般的である標準の血液バッグ中で隔絶される。フォトフェレーシス後、処理された画分は次の新しいインキュベーション段階プロトコルにかけられる。
インキュベーション段階プロトコル
8−MOPによる紫外線A活性化後のフォトフェレーシス後試料の収集後、処理された細胞集団を以下のとおりインキュベートする。
1.チューブの熱シールおよびキットへの末端接続部でチューブを切断することによってアフェレーシスキット(バクスター(Baxter)フェンウォール(Fenwall)4R 23−12)から2個のアミカス(Amicus)血小板貯蔵バッグ(バクスター(Baxter)フェンウォール(Fenwall)PL 2410)を除去する。
2.鋭いカテーテルをフェレーシスバッグ(スパイク)の中へ挿入し、それによって、チャーター メディカル(Charter Medical)3脚トランスファーセット(#03−220−02)で開封し、チューブをクランプする。2個のアミカスバッグを同じトランスファーセットの他の穴あけピンでスパイクし、それによって細胞懸濁液の移動用通路を確立する。
3.フェレーシスバッグを第IV(4)極に掛け、クランプを開き、フェレーシスの1/2を重力によって各アミカスバッグの中へ流れ出るようにし、次いで、チューブをクランプする。
4.スパイクを除去し、サンプリング部位カプラーで置き換える。
5.各アミカスバッグを別々のフェンウォール遠心分離バッグおよび遠心分離担体に配置する。
6.10分間、1000rpm、23℃で遠心分離し、各バッグの底でペレットとして濃縮し、可塑剤の痕跡を含有する大きな画分の血漿を除去させる。
7.遠心分離後、トランスファーパック上のチューブに付着した針をアミカスバッグの片方のサンプリングカプラーに挿入する。
8.アミカスバッグを血漿抽出器に注意深く配置し、細胞ペレットの再懸濁を回避する。抽出器を閉鎖し、ゆっくり抽出器を前方へ傾けることによって血漿をトランスファーバッグの中へ絞り出す。約50ccがトランスファーバッグの中へ流れ出た場合、かつ/またはペレットが再懸濁し始めた場合、抽出器を垂直な位置に戻し、針を除去する。
9.バッグの内容物を静かに攪拌することによって再混合し、注意深くバッグ壁に付着した接着細胞を再懸濁する。
10.ヘペス緩衝液(Hepes Buffer)を含む無色のRPMI 1640培地100ccを含有する500ccのビンをバクスター(Baxter)ベント式メディケーションセットでスパイクし、チューブをクランプする。付属の針を第1のアミカスバッグ上のサンプリングカプラーポートの中へ挿入する。ビンを第IV(4)極へ掛け、チューブを開放し、培地をバッグの中へ流れ出させる。
11.チューブをクランプし、針を除去し、メディケーションセットを廃棄する。静かに反転させることによってバッグを混合し、アーベル(Abel)を下にした棚上の370℃のインキュベーターに一夜、バッグを配置する。
12.第2のバッグでステップ8〜12を繰り返す。
13.6〜24時間のインキュベーション後、インキュベーターからバッグ1個を取出し、攪拌および反転によって静かに混合し、すべての接着細胞が再懸濁されていることをよく確認する。血液60ccを注射器に取出す。微生物学検査のために1つを好気血液培養ビンに、1つを嫌気血液培養ビンに注入する。血液学検査に送られる総白血球数(WBC)および白血球分画(differential)のためにラベンダートップチューブ(lavender top tube)に注入する。
14.第2のアミカスバッグを再懸濁し、両方のバッグを個別の遠心分離バッグおよび遠心分離機に配置する。
15.ステップ8〜10に記載されているとおり上清液を取出し、移動する。
16.十分に混合した血液を患者に戻す。
8−MOPによる紫外線A活性化後のフォトフェレーシス後試料の収集後、処理された細胞集団を以下のとおりインキュベートする。
1.チューブの熱シールおよびキットへの末端接続部でチューブを切断することによってアフェレーシスキット(バクスター(Baxter)フェンウォール(Fenwall)4R 23−12)から2個のアミカス(Amicus)血小板貯蔵バッグ(バクスター(Baxter)フェンウォール(Fenwall)PL 2410)を除去する。
2.鋭いカテーテルをフェレーシスバッグ(スパイク)の中へ挿入し、それによって、チャーター メディカル(Charter Medical)3脚トランスファーセット(#03−220−02)で開封し、チューブをクランプする。2個のアミカスバッグを同じトランスファーセットの他の穴あけピンでスパイクし、それによって細胞懸濁液の移動用通路を確立する。
3.フェレーシスバッグを第IV(4)極に掛け、クランプを開き、フェレーシスの1/2を重力によって各アミカスバッグの中へ流れ出るようにし、次いで、チューブをクランプする。
4.スパイクを除去し、サンプリング部位カプラーで置き換える。
5.各アミカスバッグを別々のフェンウォール遠心分離バッグおよび遠心分離担体に配置する。
6.10分間、1000rpm、23℃で遠心分離し、各バッグの底でペレットとして濃縮し、可塑剤の痕跡を含有する大きな画分の血漿を除去させる。
7.遠心分離後、トランスファーパック上のチューブに付着した針をアミカスバッグの片方のサンプリングカプラーに挿入する。
8.アミカスバッグを血漿抽出器に注意深く配置し、細胞ペレットの再懸濁を回避する。抽出器を閉鎖し、ゆっくり抽出器を前方へ傾けることによって血漿をトランスファーバッグの中へ絞り出す。約50ccがトランスファーバッグの中へ流れ出た場合、かつ/またはペレットが再懸濁し始めた場合、抽出器を垂直な位置に戻し、針を除去する。
9.バッグの内容物を静かに攪拌することによって再混合し、注意深くバッグ壁に付着した接着細胞を再懸濁する。
10.ヘペス緩衝液(Hepes Buffer)を含む無色のRPMI 1640培地100ccを含有する500ccのビンをバクスター(Baxter)ベント式メディケーションセットでスパイクし、チューブをクランプする。付属の針を第1のアミカスバッグ上のサンプリングカプラーポートの中へ挿入する。ビンを第IV(4)極へ掛け、チューブを開放し、培地をバッグの中へ流れ出させる。
11.チューブをクランプし、針を除去し、メディケーションセットを廃棄する。静かに反転させることによってバッグを混合し、アーベル(Abel)を下にした棚上の370℃のインキュベーターに一夜、バッグを配置する。
12.第2のバッグでステップ8〜12を繰り返す。
13.6〜24時間のインキュベーション後、インキュベーターからバッグ1個を取出し、攪拌および反転によって静かに混合し、すべての接着細胞が再懸濁されていることをよく確認する。血液60ccを注射器に取出す。微生物学検査のために1つを好気血液培養ビンに、1つを嫌気血液培養ビンに注入する。血液学検査に送られる総白血球数(WBC)および白血球分画(differential)のためにラベンダートップチューブ(lavender top tube)に注入する。
14.第2のアミカスバッグを再懸濁し、両方のバッグを個別の遠心分離バッグおよび遠心分離機に配置する。
15.ステップ8〜10に記載されているとおり上清液を取出し、移動する。
16.十分に混合した血液を患者に戻す。
図1は、上記のフォトフェレーシスおよびインキュベーションのプロトコルによる処理後の樹状抗原提示細胞とアポトーシスT細胞の生成を示す合成グラフである。図1に示されているとおり、処理前血液は、ほとんど検出できない数の樹状細胞を含み、確認するためにαVβ5またはCD11cマーカーのいずれかを用いた。約22時間のインキュベーション後、これらマーカーのいずれも多数の成熟樹状細胞を示した。同様に、前処理血液は、ほとんどアポトーシスT細胞を含まなかった。わずか一夜のインキュベーション後に、CD3マーカーによるT細胞およびAPO2マーカーによるアポトーシス細胞の同時確認によって示されているとおり、アポトーシスT細胞は顕著に明らかとなった。
グラフの右端の4番目の一連の棒は、紫外線への曝露なしに、物理的摂動およびインキュベーションのみによる単球の成熟樹状細胞への分化を示す。分化は、白血球アフェレーシスによって体外量の血液から単球およびT細胞を単離することによって開始された。単離された単球およびT細胞は、フォトフェレーシスにかけられなかったが、白血球アフェレーシスと関連した遠心力にのみ曝露された。次いで、単離細胞集団を上記のインキュベーションプロトコルに従い約22時間にわたってインキュベートされた。図1に示されているとおり、白血球アフェレーシス中にかけられる物理的力は、一夜インキュベーションとともに、αVβ5マーカーおよびCD11cマーカーによって確認されるとおり、単球の機能樹状細胞への発達を効率良く引き起こした。T細胞の顕著なアポトーシスは確認されず、8−MOPによる処理の後、UVへの曝露、または上述した一部の他の処理形態が、T細胞のアポトーシスを誘導するために必要であることを示した。
グラフのY軸は、1立方センチメートル当りの機能樹状細胞の数を示す。22時間にわたりインキュベートされた総量は250ccであったため、CD11cマーカーによって3番目の一連の棒によって示されているとおり、3250万個の樹状細胞(130,000×250)が生成された。このレベルの成熟を有する樹状細胞はアポトーシス細胞を貪食し、かかる細胞由来の抗原を効率的に提示する。単球もアポトーシス細胞またはかかる細胞のフラグメントを摂取するが、単球は、アポトーシス細胞からCD8細胞毒性T細胞へ処理される抗原物質を効率的に提示することができない。CD8T細胞は、抗原提示細胞の表面でクラスIMHCと関係がある抗原のみを認識する。単球は、CD8T細胞が認識することができないクラスIIMHC分子に関連して摂取細胞由来の抗原を主に提示する。他方、樹状細胞は、ひとつには、それらがαVβ5インテグリンを含むという理由で、アポトーシス細胞の消化由来の抗原を提示し、CD8細胞毒性T細胞が認識することができるクラスIMHC分子と関連した処理抗原を示すことによって、CD8T細胞を「交差刺激(cross−prime)」する特殊な能力を有する。これは、機能樹状細胞が、腫瘍免疫の刺激、またはそれらを引き起こす異常T細胞を攻撃することによって望ましくない免疫学的過程の抑制においてきわめて有用である主な理由である。
図1に示されているグラフは、混合細胞集団の最適なインキュベーション時間を決定する有効な手段をさらに示す。使用される特定のマーカーにより樹状細胞およびアポトーシスT細胞の数が同時に定量化が可能であるため、アポトーシス細胞と新たに形成された樹状細胞の最適な組合せがもたらされるインキュベーション時間を容易に決定することができる。これは、インキュベーションを終了させ、インキュベートされた細胞を対象へ再注入する時機を確立する決定因子を制御することである。
既述のとおり、約12〜約48時間のインキュベーション時間により最大数の樹状細胞がもたらされる。アポトーシスT細胞は、約6〜約40時間で最大化する。したがって、約6〜約24時間のインキュベーションが、アポトーシスT細胞と樹状細胞の最も有利な組合せを提供する。この持続時間のインキュベート期間の後、アポトーシス細胞の数は最大であり、多数の機能樹状細胞もインキュベーションバッグ中に存在する。したがって、病原性抗原を発現する能力がある最大数のアポトーシス細胞が存在し、それらの抗原を処理し、提示する能力がある多数の機能樹状細胞も存在する。疾患エフェクター因子が外来源由来であり、かつインキュベーションバッグに添加される場合、アポトーシス細胞の数を最大限にするために必要とされるインキュベーション期間は明らかに要因ではない。かかる場合には、誘導される樹状細胞の数を最大化するために必要とされる時間は、共インキュベーションの持続時間を決定する要因である。
併用治療および共インキュベーションの臨床効果
本発明によって開示された治療方法は、その疾患が進行性であると同時に標準のフォトフェレーシスで治療されていたCTCLの対象4例を含むパイロット試験で試験されている。パイロット試験における患者4例は、3つの基準に基づき大きなCTCL集団から注意深く選択された。すなわち(1)従来のフォトフェレーシスの継続にかかわらず全身腫瘍組織量の増加、(2)血中で定量化されうる悪性クローン、および(3)低い絶対血中CD8レベル。対象の3例における白血病細胞は、そのクローンT細胞受容体表現型がフルオレセイン標識抗ファミリーV T細胞受容体モノクローナル抗体(V mAb)を用いて認識可能であったため、正常T細胞と容易に区別することができた。5%を超える値は、悪性クローンの拡大を示す。第4の患者のCTCL細胞のクローンT細胞受容体は、現在利用可能なV mAbに結合することはないが、CD4/CD8比により同患者の白血性集団の定量化も可能である。従来のフォトフェレーシスに対する患者4例の不応答は、臨床的応答者は通常、無傷CD8コンパートメントを必要とするため、同患者のCD8T細胞欠乏を反映していると思われる。したがって、これらの患者は新しい治療方法にとって重要な課題を示す。試験集団は小さかったが、この不良予後患者群における疾患進行の逆転を定量化することは容易であった。
本発明によって開示された治療方法は、その疾患が進行性であると同時に標準のフォトフェレーシスで治療されていたCTCLの対象4例を含むパイロット試験で試験されている。パイロット試験における患者4例は、3つの基準に基づき大きなCTCL集団から注意深く選択された。すなわち(1)従来のフォトフェレーシスの継続にかかわらず全身腫瘍組織量の増加、(2)血中で定量化されうる悪性クローン、および(3)低い絶対血中CD8レベル。対象の3例における白血病細胞は、そのクローンT細胞受容体表現型がフルオレセイン標識抗ファミリーV T細胞受容体モノクローナル抗体(V mAb)を用いて認識可能であったため、正常T細胞と容易に区別することができた。5%を超える値は、悪性クローンの拡大を示す。第4の患者のCTCL細胞のクローンT細胞受容体は、現在利用可能なV mAbに結合することはないが、CD4/CD8比により同患者の白血性集団の定量化も可能である。従来のフォトフェレーシスに対する患者4例の不応答は、臨床的応答者は通常、無傷CD8コンパートメントを必要とするため、同患者のCD8T細胞欠乏を反映していると思われる。したがって、これらの患者は新しい治療方法にとって重要な課題を示す。試験集団は小さかったが、この不良予後患者群における疾患進行の逆転を定量化することは容易であった。
上記のプロトコルによる治療後、患者4例のそれぞれは、12か月のプロトコルにわたって絶対的循環悪性プールの減少を示した。完全な血液学的寛解はだれも経験しなかったが、血中CTCL細胞の以前の急速な増加は好転した。免疫系がそのCTCLによって損なわれている個人において一般的な症候性感染、およびこの疾患に対する療法には直面しなかった。全身腫瘍組織量および臨床応答の測定は、臨床的に最も重篤な皮膚病変の生検における浸潤性T細胞の数の血中測定および定量化に重点を置いた。患者4例中3例における皮膚病変の重篤度および分布が緩和したことに注目することが重要である。患者1例において、難治性掻痒と関連した長期にわたる最大の全身性剥脱性紅皮症が低悪性度のほとんど無症候性紅皮症に一変し、他の患者2例はほぼ完全な皮膚の寛解を示した。
この研究で試験されたフォトフェレーシス/インキュベーションプロトコルは、従来のフォトフェレーシスと同様、これらの対象において副作用は直面されなかったため、安全であると思われる。さらに、反応性免疫系に対するこれらの抗原を提示する能力がある機能樹状細胞とともに関連免疫抗原を有する悪性アポトーシス細胞を結びつけるプロトコルの能力は、CTCLの治療の域を越えた免疫療法の可能性を提供する。例えば、最近報告された無作為化対照臨床試験において、従来の免疫抑制剤とフォトフェレーシスの組合せは、心臓移植レシピエントが直面する拒絶反応エピソードの数の減少において有効であることを示した。予備的に、それぞれの試験では、関節リウマチおよび乾癬性関節炎、紅斑性狼瘡、強皮症、および(同種骨髄移植後の)移植片対宿主病など一部の自己免疫疾患における従来のフォトフェレーシスの有効性も示した。多数の樹状細胞のインビボ源を提供する本発明の能力は、これらの療法を強化するであろう。プロトコルの修正は、懸濁したアポトーシス充実性腫瘍細胞、アポトーシス感染微生物、もしくは不活性化または不完全ウイルスを含む誘導された単球由来の樹状細胞の共培養も可能にしうる。
したがって、上記のとおり、本発明の一部の態様がCTCLに対する強化療法に関連して説明されているが、本発明は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく広範囲な免疫疾患に適用可能であることを理解すべきである。
Claims (25)
- 体外量の対象の血液から機能抗原提示樹状細胞を製造するための方法であって、該方法が、
(a)前記体外量の血液を血中に含まれる疾患エフェクター因子におけるアポトーシスを誘導する能力がある光活性化可能剤で処理するステップと、
(b)前記体外量の血液を直径が約1mm以下であるプラスチックチャンネルを有するフォトフェレーシス(photopheresis)装置を通じて流すステップと、
(c)前記フォトフェレーシス装置を通じて流れる前記体外量の血液を照射するステップと、
(d)前記フォトフェレーシス装置における処理後に前記体外量の血液をインキュベートするステップと
を含んで成る方法。 - ステップ(b)の前に前記方法が、
前記体外量の血液を白血球アフェレーシス(leukapheresis)処理にかけることによって前記体外量の血液から白血球および単球を分離するステップをさらに含んで成る、請求項1に記載の方法。 - 前記光活性化可能剤がソラレンである、請求項2に記載の方法。
- 光活性化可能剤が8−MOPである、請求項3に記載の方法。
- 前記疾患エフェクター因子が悪性T細胞である、請求項4に記載の方法。
- 前記疾患エフェクター因子が、前記体外量の血液中に含まれる充実性腫瘍からの癌細胞である、請求項1に記載の方法。
- インキュベーションが、約6〜48時間にわたって行われる、請求項1に記載の方法。
- インキュベーションが、約12〜24時間にわたって行われる、請求項7に記載の方法。
- 体外量の対象の血液から機能抗原提示樹状細胞を製造するための方法であって、該方法が、
(a)前記体外量の血液に含まれる疾患エフェクター因子のアポトーシスを誘導するステップと、
(b)前記体外量の血液を直径が約0.5mm〜約5mmであるプラスチックチャンネルを通じて流すステップと、
(c)前記プラスチックチャンネルの通過後に前記体外量の血液をインキュベートするステップと
を含んで成る方法。 - 前記体外量の血液をプラスチックチャンネルの中に流すステップが、直径が約1mm以下であるチャンネルを有するフォトフェレーシス装置で行われる、請求項9に記載の方法。
- 前記体外量の血液に含まれる疾患エフェクター因子のアポトーシスを誘導するステップが、
(d)光活性化可能剤を前記体外量の血液に添加するステップと、
(e)前記体外量の血液を紫外線で照射するステップと
から成る、請求項9に記載の方法。 - 前記光活性化可能剤が8−MOPである、請求項11に記載の方法。
- 前記体外量の血液を白血球アフェレーシス装置で処理し、白血球濃縮液を調製するステップをさらに含んで成る、請求項9に記載の方法。
- インキュベーションが、約6〜約48時間にわたって行われる、請求項9に記載の方法。
- インキュベーションが、約12〜約24時間にわたって行われる、請求項14に記載の方法。
- 体外量の対象の血液から機能抗原提示樹状細胞を製造するための方法であって、該方法が、
(a)遊離Fcセグメントを有するモノクローナル抗体で前記体外量の血液中の疾患エフェクター因子をコーティングするステップと、
(b)前記体外量の血液を直径が約0.5mm〜約5mmであるプラスチックチャンネルを通じて流すステップと、
(c)前記プラスチックチャンネルの通過後に前記体外量の血液をインキュベートするステップと
を含んで成る方法。 - 前記疾患エフェクター因子が、前記体外量の対象の血液中に含まれる充実性腫瘍癌細胞である、請求項16に記載の方法。
- 前記体外量の血液中に含まれる前記疾患エフェクター因子のアポトーシスを誘導するステップをさらに含んで成る、請求項16に記載の方法。
- 前記疾患エフェクター因子が悪性T細胞である、請求項18に記載の方法。
- インキュベーションが、約6〜約48時間にわたって行われる、請求項16に記載の方法。
- インキュベーションが、約12〜約24時間にわたって行われる、請求項17に記載の方法。
- 体外量の対象の血液から機能抗原提示樹状細胞を製造するための方法であって、該方法が、
(a)前記対象から単離された疾患エフェクター因子のアポトーシスを誘導するステップと、
(b)前記体外量の血液を直径が約1mm以下であるプラスチックチャンネルを通じて流すステップと、
(c)前記アポトーシス疾患エフェクター因子を前記体外量の血液と混合するステップと、
(d)前記混合アポトーシス疾患エフェクター因子および処理血液をインキュベートするステップと
を含んで成る方法。 - 遊離Fcセグメントを有するモノクローナル抗体で前記アポトーシス疾患エフェクター因子をコーティングするステップをさらに含んで成る、請求項19に記載の方法。
- インキュベーションが、約6〜約48時間にわたって行われる、請求項19に記載の方法。
- インキュベーションが、約12〜約24時間にわたって行われる、請求項21に記載の方法。
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