SE523515C2 - Ny metod och komposition för framställning av ett cellulärt allogent vaccin - Google Patents

Description

25 30 35 . a Q . nu . ~ 523 515 Z tumörspecifik CTL-immunrespons eftersom också MHC-klass ll begränsade CD4+ celler kan aktiveras via den indirekta pathway.

Med denna kunskap vid handen var det nu öppet för att förädla denna princip, ex vivo och in vivo som baseras på en effektiv indirekt presentation av tumörantigen genom värd-APC. En självklar approach har varit att erhålla potenta APCs ex vivo, speciellt dendritiska celler (DCs) och därefter ladda dessa celler med tumörhärrörande proteiner antingen genom pulsning eller transfektion. Också så kallade dendritomvaccin där autologa tumörceller har fuserats med autologa monocythärrörande DCs har studerats. Ett problem med ex vivo propagering av autologa DCs är dock den mindre migrationen av dessa celler till dränerande lymfnoder (en förutsättning för att de injicerade DC ska möta naiva T-celler).

Studier i människor har visat att 1% maximalt av subkutant injicerade DCs__migrerar till regionala lymfkörtlar (lymfnoder).

En alternativ approach har därför utvecklats, framförallt fràn observationer under vaccination med GM-CSF-producerande tumörceller i gnagarrnodeller, med målet att inducera en effektiv rekrytering in vivo av värd-DCs till vaccinationssätet. Fas 1 försök i människor med protata- och renalt carcincm och melanom varvid man använde autologa GM-CSF-tumörcellsvacciner har undersökts och befunnits vara säkra men utan någon självklar klinisk effekt. Dessutom har ett vaccin baserat på autologa tumörceller visat sig skapa flera tekniska problem. För det första beror ett autologt vaccin på tillgängligheten av adekvat antal med tumörceller, som sällan är tillgängliga på grund av den reaktiva processen som hittas som infiltrerar tumörceller hos många vanliga cancrar. För det andra kräver ett autologt vaccin de novo genöverföring för behandling av varje patient, som är arbetsintensivt och kan orsaka variabla cytokinuttrycksnivåer mellan olika patientvacciner. För det tredje behövs signifikanta utgifter och tid för att säkerställa varje patients mängd vaccin så att de möter accepterade administrationsriktlinjer. Ett sätt att komma runt dessa tekniska problem är att använda en allogen vaccinstrategi baserat på en panel av cytokinuttryckande tumörcellinjer som kan formuleras och lagras före initiering av kliniska studier. Detta är ett speciellt attraktivt tillvägagångssätt för majoriteten av vanliga cancrar för vilka specifika tumörantigen ej har hittills identifierats. Två upptäckter tillhandahåller den immunologlska logiska grunden för en allogen vaccinapproach. För det första att DCs hos värden, istället för de vaccinerade tumörerna själva, är ansvariga för att prima CD4+ celler och CD8+ CTL, av vilka båda krävs för att generera systemisk antitumörimmunitet (se ovan). För det andra uttrycks vanligtvis många tumörantigen bland olika patienters tumörer. Ett GM-CSF-vaccin baserat på detta koncept studerades nyligen i ett Fas 1 försök och befanns vara säkert men utan någon självklar klinisk effekt. Mest troligt berodde denna kliniska otillräcklighet på framställandet av en ensam cytokin (GM-CSF) eftersom teoretiskt flera faktorer borde produceras lokalt för att inducera inte bara en effektiv rekrytering av omogna DCs utan också K:\Patenl\1100-\11008\110081800\O30808beSk.d0C ->»- ...- 10 15 20 25 30 35 » - » n n» *523 5,15 I? ett effektivt mognande av dessa celler. Nödvändiga faktorer inkluderar mest troligt kemotaktiska cytokiner såsom MlP-l alfa och/eller RANTES, mogningsfaktorer såsom intreleukin (lL)-1 beta, lL-6 och/eller tumönekrosfaktor (TNF) alfa och slutligen Th1- polariserande faktorer såsom interferon (IFN) gamma.

Inom transplantations- och transfusionsområdena brottas man dagligen med problemet med alloimmunisering vilken är en T-cellsmedierad immunisering mot indirekt presenterade donatorspecifika HLA-antigen. Sådan immunisering utvecklas frekvent med en stor kraft efter transfusioner med allogena blodprodukter och efter transplantation av solida organ. inte ens en kontinuerlig tung immunsuppressiv behandling efter en primär framgångsrik transplantation av ett HLA-inkompatibelt organ tycks förhindra en långsamt framåtskridande process hänvisad till såsom kronisk rejektion. Denna process medieras av CD4+-celler av Th1-typ som aktiveras genom allogena HLA-peptider indirekt presenterade av autologa APCs. Dessa CD4+ T-celler i sin tur aktiverar donatorspecifika antikropps-(lgG)- producerande B-celler och cytotoxiska T-celler och vävnadsmakrofager, som utgörde olika effektorrnekanismerna under kronisk rejektion. En väldigt central aktör för uppstartandet av en alloimmunisering tycks vara levande. metaboliskt intakta, donatorhärrörande APCs. Om dessa tas bort eller inaktiveras genom UVB-stràlning före en transfusion av t ex blodplättskoncentrat undviks sedan vanligtvis immunisering. Detta avser också passenger APCs i transplanterad vävnad; om dessa tas bort före transplantation minskar väsentligen risken för en senare immunisering med kroniska rejektioner. För icke-viabel allogen vävnad gäller samma immuniseringsregler liksom för andra främmande proteinhärrörande antigen, d v s för att åstadkomma en väsentlig immunisering är det nödvändigt att administrera antigenet i en relativt stor mängd tillsammans med ett adjuvans som t ex Freuds complete adjuvans (FCA). Samma gäller för in vitro primär stimulering med icke-viabla MHC- uttryckande allogena APCs eller rena MHC-härrörande allopeptider som ej inducerar någon väsentlig priming av naiva T-celler i direkt allo-härrörande peptider. En väsentlig priming av dessa T-celler erhålles dock genom att använda viabla allogena MHC-uttryckande APC under primär stimulering.

Något som skiljer (diskriminerar) primär stimulering med viabla allogena APCs från primär stimulering med icke viabla (lyserade eller apoptopiska) allogena APCs in vitro är den väldigt kraftfulla T-cellproliferationen i responder (värd) cellpopulation, som enbart ses under stimulering med viabla APCs. Denna reaktion som kallas allogen blandad leukocytreaktion (MLR) leder också till framställandet av vissa kemokiner och cytokiner, vilket inkludetar MlP- 1 alfa, RANTES, lL-1 beta, |L-6, TNF-alfa och IFN-gamma. MLR induceras i både naiva och minnesresponder T-celler korsreagerar med MHC molekyler på allogena APCs genom att man upplever dessa molekyler som deras egna MHC + främmande peptidsekvenser som T- cellerna var förbestämda att reagera mot. Det har visats att så många som 1 av 20 hos vàra KZ\Palent\1 100-\11008\1 10081800\030808beSk.d0C 10 15 20 25 30 35 , q ~ . -n 523 515 <1 cirkulerande T-celler kan delta i denna förbildade alloreaktivitet. Denna väldigt kraftfulla reaktion betraktas i allmänhet vara orsaken för den akuta rejektionsprocessen, vilken leder till fullständig rejektion av MHC inkompatibla allogena organ inom 7 till 10 dagar av icke immunsupprimerade recipienter.

En samadministrering av allogena DCs med autologa DC i vilket antigenen inkorporerades, till ett subjekt beskrives i WO 99/47687. Den autologa DC förväntades presentera antigenet för CTLs medan den allogena DC förväntades inducera en stark reaktion från alloreaktiva T- celler vilket resulterade i lokal frisättning av stimulatoriska molekyler som skulle amplifiera förmågan hos autologa DC att aktivera CTLs. lnga data stödjandes deras hypotes presenterades och ej heller någon frambringad immunrespons. . __ Vidare beskrivs vaccination med hybridceller bestående av autologa tumörceller metod för att inducera en antigenspecifik immunrespons genom fuserade med allogena mogna DC i "Regression of human metastatic cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids", A. Kugler et al. Nature Medicine, vol 6, No 3, mars 2000, sid 332-336. Teoretiskt baseras denna metod pà förväntandet att samexpression av allogen MHC-molekyl på den halvautologa tumörcellen (som uttrycker autologa MHC klass 1 molekyler + tumörpeptider) skulle aktivera alloreaktiva T-celler. Denna aktivering skulle resultera i en lokal frisättning av stimulatoriska cytokiner som skulle hjälpa att trigga aktiverandet av CTLs som tumörpeptiden hos autologa, tumörcellhärrörande MHC klass 1 molekyler. Genom att använda denna vaccinapproach uppvisade ett begränsat antal patienter med renal tumör ett kliniskt anticancerrespons.

Ett vaccin mot andra tumörer, varvid man använder dendritiska celler fuserade med igenkänner cancerceller, föreslås också i "Smallpox, polio and now a cancer vaccine?”, D. W. Kufe, Nature Medicin, vol 6, no 3, mars 2000, sid 252-253. Metodema av Kugler et al och Kufe ovan är dock begränsade av ett antal faktorer. För det första är ett autologt vaccin beroende av tillgängligheten av adekvat antal tumörceller, som är sällsynt tillgängliga på grund av den reaktiva processen som hittas som infiltrerar tumörceller hos många vanliga cancrar. För det andra kräver ett autologt vaccin de novo genöverförande för behandling av varje patient, som är arbetskraftintensiv och kan orsaka variabla cytokinuttrycksnivåer som skiljer mellan olika patientvacciner. För det tredje behovs det signifikanta kostnader och tid för att säkerställa att varje patients lot med vaccin är så att de möter accepterade administrationsriktlinjer Följaktligen finns det ett behov för ett vaccin som skapar en bättre immunrespons och som är bättre lämpat för lagring, framställningen i en stor skala och är oberoende av lagerbegränsningar.

Sammanfattning av uppfinningen K2\Patent\1100-\1 1008\1 10081800\03080BbeSk.d0c u ...- . < . - -~ 10 15 20 25 30 35 %523 515 f Föreliggande uppfinning löser problemen ovan genom att tillhandahålla i enlighet med en första aspekt en metod för framställning av ett cellulärt allogent vaccin innefattande följande steg: a) tillhandahållande av en APC som redan är etablerad och/eller isolerad från en myeloid leukemicellinje; b) modifierande av APC med ett antigen varvid man använder någon av följande metoder: pulsning, transfektion, infektion eller fusion; och c) behandling av APC med ett medel som kan avlägsna sialinsyra från ytan hos sagda APC; och eventuellt d) odling av modiferad APC i ett lämpligt medium. l enlighet med en andra aspekt tillhandahålles ett cellulärt allogent vaccin erhållbart genom en metod enligt den första aspekten. Enligt en tredje aspekt tillhandahålles en komposition innefattande ett vaccin enligt den andra aspekten och en farmaceutiskt acceptabel bärare.

Enligt en fiärde aspekt tillhandahålles terapeutisk användning av ett vaccin enligt den andra aspekten eller en komposition enligt den tredje aspekten.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Det avses genomgående i föreliggande beskrivning att uttrycket ”cellulär allogent vaccin” omfattar vilket reagens, cell eller förening som helst som kan frambringa en antigenspecifik immunrespons i ett subjekt, varvid sagda reagens, cell eller förening är av allogent ursprung, d v s har sitt ursprung från en donator, företrädesvis en human donator, annan än mottagaren, företrädesvis en human mottagare av det cellulära allogena vaccinet.

Såsom används i föreliggande beskrivning och krav, inkluderar den singulära formen ”en”, "ett" och "den" plurala motsvarigheter om inte sammanhanget klart dikterar annat. T ex inkluderar uttrycket ”en cell” en mängd celler, vilket inkluderar blandningar därav.

Uttrycken ”antigenpresenterande cell(er)”, ”APC” eller ”APCs” inkluderar både intakta, hela celler liksom andra molekyler som kan inducera presentation av en eller flera antigen, företrädesvis i förening med klass 1 MHC-molekyler. Exempel på lämpliga APCs diskuteras i detalj nedan och inkluderar men är ej begränsade till hela celler såsom monocyter, makrofager, dendritceller, monocythärrörande dentritceller, makrofaghärrörande dendritceller, B-celler och myeloida leukemiceller t ex cellinjer THP-1, U937, Hl-60 eller CEM-CM3. Myeloida leukemiceller sägs tillhandahålla så kallade premonocyter.

Uttrycken “cancer“, “neoplasm” och ”tumör” använda ombytbart och i endera singulära eller plurala formen, såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, avser celler som har genomgått en malign transformation som gör dem patologiska för värdorganismen. Primära cancerceller (d v s celler erhållna från nåra sätet hos den maligna transformationen) kan enkelt särskiljas från icke-cancerceller genom våletablerade tekniker, K2\Patent\1 100-\1 1008\1 1008180OSE\0401Zßnybesksidadoc 6 10 15 20 25 30 35 n n ø . nu .. . ...- u n an. u o _ _". . . u, . . u u a n n z : _ _ _ _. , ... . . . . . . _ _ , , .

IDC CIO n O I ' . l I _ . p . . .. _ .. . . . . . . . - ~ c e» 6 speciellt histologisk undersökning. Definitionen av en cancercell såsom används häri inkluderar inte bara en primär cancercell utan också vilken cell som helst härrörande från en cancercellstamfader. Detta inkluderar metastaserade cancerceller och in vitro odlingar och cellinjer härrörande från cancerceller. När man hänvisar till en typ av cancer som normalt tar sig uttryck som en solid tumör, är ”en kliniskt detekterbar" tumör en som är detekterbar på basis av tumörmassa; t ex genom sådana procedurer som CAT-skanning, magnetisk resonansbildåterglvning (MRl), röntgen, ultraljud eller palpation. Blokemiska eller immunologiska uppdaganden ensamma kan vara otillräckliga för att möta denna definition.

Uttrycket "genetiskt modifierad” avser, såsom det uppträder i föreliggande innehåller och/eller främmande gen eller nukleinsyrasekvens som i sin tur modifierar genotypen eller fenotypen hos cellen eller dess avkomma. Med andra ord avser den vilken addition, deletion eller splittring hos en cells endogena nukleotider. APCs modifierade varvid man använder transfektion, infektion eller fusion är exempel på genetiskt modifierade APCs. APCs som enbart är pulsade är ej beskrivning, att den uttrycker en genetiskt modifierade.

En "effektiv mängd", såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, är en mängd som är tillräcklig för att åstadkomma förmånliga eller önskvärda resultat. En effektiv mängd kan administreras i en eller flera administreringar, appliceringar eller doseringar.

Vaccinerna enligt föreliggande uppfinning kan administreras eller appliceras transdermalt, oralt, subkutant, lntramuskulärt, intravenöst eller parenteralt. För syften av denna uppfinning är en effektiv mängd av vacciner den mängd som provocerar fram en antigenspecifik immunrespons i ett subjekt. En lämplig mängd kan vara ungefär 10x10° celler för administrering till ett subjekt. En ampull (som kan vara frusen och upptinad före användning) kan innehålla 20x106 celler. Celler från en frusen ampull (eller liten flaska) kan vidare odlas igen för administrering till ett subjekt. Självklart kommer mängden bestämmas av den medicinska praktiseraren som kommer bedöma beskaffenheten och svårhetsgraden hos tillståndet hos subjektet i behov av behandling. Tillståndet hos subjektet kan också kräva återvaccinering som kan utföras var tredje till sjätte vecka. Före administrering av vaccinet eller kompositionen enligt föreliggande uppfinning är företrädesvis sagda vaccin eller komposition gammabestrålad.

Uttrycket ”ett medel som kan avlägsna sialinsyra på ce|lytor", som uppträder i föreliggande beskrivning och krav, avser ett medel som kan avlägsna sialinsyra från cellytor.

Exempel på sådana celler är APCs såsom lagts fram ovan. Medel som kan avlägsna sialinsyra från cellytor kan exemplifieras genom neuraminidas (NAS) och antikroppar frambringade mot CD 43 (anti-CD43). Företrädesvis är sagda medel NAS. NAS tros klyva sialinsyra från glykokonjugat och anti-CD43 tros bringa sialinsyran från ytan och in i cellen.

Andra exempel på sagda medel är gener som kodar för NAS eller NAS-framställande virus K:\Patenl\1 100-\1 1008\1100B1B00\030808beSk.d0G 10 15 20 25 30 35 . . n ø en fszs sis" 3 - ø u . no eller bakterier. NAS kan erhållas från bakterier och virus t ex från Vibrio cholerae, Newcastle virus, influensavirus eller Clostridium perfringens.

Uttrycket "odling". såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav. avser in- vitro propagering av celler eller organismer på eller i media av olika slag. Det inses att efterföljarna av en cell odlad i odling behöver ej vara fullständigt identisk (antingen morfologiskt, genetiskt eller fenotypiskt) med modercellen. Ett lämpligt odlingsmedium kan väljas av fackmannen inom området och exempel på sådana medier är RPMl medium eller Eagles Minimal Essential Medium (EMEM).

Ett ”subjekt”, såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, är en vertebrat, företrädesvis ett däggdjur, mer föredraget en människa. Däggdjur inkluderar, menuär ej begränsade till, möss, apor, människor, boskap, sportdjur och husdjur. Subjektet kan också vara en patient.

Ett "antigen". såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, avser vilken species, specimen eller förening som kan frambringa en immunrespons t ex tumörspecimen, en tumörcell, ett virus, en bakterie, en svamp, en parasit, ett protein eller en peptid.

Tumörspecimen kan vidare erhållas från en bukspottskörteltumör eller vilken annan tumör som helst. l enlighet med en föredragen utföringsform av föreliggande uppfinning väljs tumörspecimen så att den representerar så många andra tumörtyper som möjligt. Om t ex ett vaccin mot cancer i bukspottskörteln är önskvärt, används då ett representativt specimen av bukspottskörtelcancer (antigen) för framställning av ett vaccin mot cancer i bukspottskörteln.

Om istället t ex ett vaccin mot bröstcancer är önskvärt används då ett representativt specimen av bröstcancer (antigen) för framställning av ett bröstcancervaccin.

En ”komposition", såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, avses betyda en kombination av aktivt medel, d v s vaccinet, och en annan förening eller komposition, inert (t ex, ett detekterbart medel eller markör) eller aktiv, såsom ett adjuvans. I en speciell aspekt innefattar en komposition enligt uppfinningen vaccinet och en farrnaceutisk acceptabel bärare lämplig för administrering till subjektet. En "fannaceutisk komposition", såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, avses inkludera kombinationen av ett aktivt medel med en bärare, inert eller aktivt, som gör kompositionen lämplig för diagnostisk eller terapeutisk användning in vitro, in vivo eller ex vivo.

Såsom används häri omfattar uttrycket ”farmaceutiskt acceptabel bärare", som uppträder i föreliggande beskrivning och krav, vilken som helst av standardfarmaceutiska bärare, såsom fosfatbuffrad salinlösning, vatten och emulsioner, såsom en olja/vatten eller vatten/olja emulsion, och olika typer av vätmedel. Kompositionerna kan också inkludera stabilisatorer och konserveringsämnen. För exempel på bärare, stabilisatorer och adjuvans se Martin, REMINGTONS PHARM. SCl. 15:e utgåvan (Mack Publ. Co., Easton (1975)).

KZ\Patent\1100-\1 1008\1 10081800\O30808beSk.d0c --nu 10 15 20 25 30 35 . . Q - nu 523 515 2 ~ n n | -- Uttrycken "större histokompatibilitetskomplex" eller "MHC" avser ett komplex av gener som kodar för cellytemolekyler som krävs för antigenpresentation till T-celler och för snabb implantatrejektion. I människor är också MHC-komplexet känt såsom HLA-komplex.

Proteinerna kodade av MHC-komplex är kända som ”MHC-molekyler” och klassificeras i klass l- och klass ll-MHC-molekyler. Klass l-MHC-molekyler inkluderar membran- heterodimera proteiner som består av en kedja kodad i MHC förenad ickekovalent med B2- mikroglubulin. Klass I MHC-molekyler uttrycks av nästan alla celler med kärna och har visats fungera i antigenpresentation för CD8+ T-celler. Klass l molekyler inkluderar HLA-A, -B och - C i människor. Klass l molekyler binder i allmänhet peptider med 8-10 aminosyror i längd.

Klass ll-MHC molekyler inkluderar också membranheterodimera proteiner. Klass ll-MHC är kända för att delta i antigenpresentation för CD4+ T-celler och i människor inkludera HLA- DP, -DQ och DR. Klass ll molekyler binder i allmänhet peptider som är l2-20 aminosyrarester i längd. Uttrycket "MHC-restriktion” avser ett karakteristikum hos T-celler som medger för dem att igenkänna antigen enbart efter att det behandlats och de resulterande antigena peptiderna uppvisas i förening med endera en egen klass l- eller klass lll-MHC molekyl.

Föreliggande uppfinning tillhandhåller sålunda en metod för att provocera fram antigenspecifika immunresponser, och speciellt immunresponser mot tumörantigen.

I enlighet med en vidare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahålles ett vaccin varvid sagda APC är en allogen monocyt, d v s en monocyt härrörande från en annan del (någon annan) (ej härrörande från samma subjekt som man avser behandla med vaccinet enligt föreliggande uppfinning). l en annan aspekt av uppfinningen kan APCs, företrädesvis monocyter isoleras från den vita blodcellsfraktionen hos ett däggdjur, såsom en råtta. en apa eller människa, företrädesvis en människa. Den vita blodcellsfraktionen kan vara från perifert blod hos däggdjuret, företrädesvis en normal blodgivare. Denna metod inkluderar följande steg: (a) tillhandahållande av en vit blodcellsfraktion erhållen från en däggdjurkälla genom metoder kända inom området såsom leukaferes; (b) separerande av den vita blodcellsfraktionen i steg (a) till fyra eller flera subfraktioner genom motströms centrifugal elutration. Monocyter kan också utvinnas från PBMC genom elutriation, Ficoll och Percoll gradienter, genom deras förmåga att fästa till plast eller genom negativ eller positiv selektion varvid man använder antikroppar sammanbundna till kulort ex magnetiska kulor. l enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahålles en metod innefattande ett ytterligare steg mellan steg a) och steg (b): odling av en APC, företrädesvis en monocyt, eller differentiering av en APC, företrädesvis en monocyt i ett lämpligt medium till monocythärrörande DC, makrofag eller makrofaghärrörande DC. Detta kan åstadkommas genom att inkubera monocyter eller KI\Patent\1100-\1 1008\1 10081800\030808besk.d0c ...- 10 15 20 25 30 35 . - u | u; ß #523 515 7 myeloida Ieukemiceller i närvaro av dlffarantieringsfaktorer (tillväxtfaktorer) såsom GM-CSF och/eller lL-4 och/eller TNF-alfa och/eller monocytkolonibildande faktor (MCSF) och/eller lFN-gamma i olika kombinationer. l enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid APC är en allogen monocyt eller en in-vitro differentierad cell som direkt eller indirekt härrör från en allogen monocyt. l enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid antigenet som nämns i steg b) är ett cancerantigen, företrädesvis i form av ett lösligt antigen, ett tumörcellslysat eller en viabel tumörcall, varvid alla är av allogent ursprung.

I enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av__föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid steg b) utförs genom att inkorporera antigenet in i APC varvid man använder någon av följande metoder: pulsning med lösligt antigen eller tumörcellslysat, transfektion med gener kodade för antigenet eller fusion med en allogen tumörcell. Som ett resultat tillhandahållas ett vaccin som är anpassat för användning mot cancer. En blandning av olika cancarantigen kan också användas.

I enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid medlet som kan avlägsna sielinsyra från cellytan hos APC, såsom nämns i steg c), är neuraminidas (NAS), en eller flera gener kodande för neuraminidas eller neuraminidasframställande virus eller bakterier.

I enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid behandlingen i steg c), utförs genom någon av följande metoder: behandling av APC med NAS, transfektering av APC med gener kodande för NAS eller infekterande APC med NAS-framställande virus eller bakterier såsom nämnts ovan. Företrädesvls kan APCs transfekteras med NAS efter modifiaring, t ex transfektion, med antigenet såsom lagts fram ovan tidigare. l enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod innefattande ett ytterligare steg i vilken APC utsätts för hypertermi (värmestress) under steg b) eller mellan b) och c). l enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid hypertermin såsom nämnts ovan utförs vid en temperatur av från 39 till 42°C under från 2 till 6 timmar. Denna värmestrass utföres företrädesvis vid en temperatur av från 39 till 42°C under ungefär 3 timmar. Företrädesvis pulsning, d v s ett sätt att modifiera APCs utförs under samma tid, d v s parallellt.

I enlighet med en ytterligare utföringsform av den tredje aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en frusen behållare (såsom ett provrör, en ampull eller en liten flaska) innefattande en komposition enligt den tredje aspekten.

K:\Pat6nt\1 100-\11008\1 1 O081800\030608beSk.d0c »s-a 10 15 20 25 30 35 . - n Q se 523 515 /0 l enlighet med en ytterligare utföringsform av denfiärde aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahålles terapeutisk användning av en effektiv mängd av ett vaccin enligt den andra aspekten av uppfinningen eller en komposition enligt den tredje aspekten av uppfinningen. l enlighet med en ytterligare utföringsform av den fjärde aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas ett vaccin enligt den första aspekten för medicinsk användning.

I enlighet med en ytterligare utföringsform av den fjärde aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahålles användning av ett vaccin enligt den första aspekten för framställning av ett läkemedel för användning mot cancer.

En förklaring till den oväntade effekten som de föreliggande uppfinningarna ej är bunden till pà något sätt hos föreliggande uppfinning kan vara att allogena__modifierade APCs, företrädesvis monocyter, när de injicerats in i ett subjekt i allmänhet inducerar en lokal MLR som skapar en miljö som är gynnsam för rekrytering och mognande av DC-prekursorer som under deras differentieringlmogning också kräver t ex tumörhärrörande peptider från lokalt lyserade allogena hybridceller, d v s modifierade APCs. Sålunda kan den normalt negativa effekten inducerad genom en transplanterad eller en transfuserad allogen APC (alloimmunisering) användas på ett positivt sätt, d v s immunisering mot andra främmande antigen såsom cancerantigen.

Föredragna särdrag av varje aspekt av uppfinningen är som för var och en av de andra aspekterna med vederbörliga ändringar. Dokumenten inom den tidigare kända tekniken nämnd häri inkorporeras i största möjliga utsträckning som medges av lag.

Uppfinningen beskrivs ytterligare i följande exempel i samband med de bilagda ritningama, som ej begränsar omfånget av uppfinningen pà något sätt. Utföringsforrner av föreliggande uppfinning beskrives sålunda mer i detalj med hjälp av exempel hos utföringsformer och figurer, varvid det enda syftet hos dessa är att belysa uppfinningen och är ej på något sätt avsedda att begränsa dess utsträckning.

Beskrivning av figurer Figur 1 belyser allogena monocyter som bärare för tumörantigen.

Figur 2 belyser vaccinkonceptet enligt föreliggande uppfinning.

Figur 3 belyser resultaten av förbehandling varvid man använder neuraminidas (NAS).

Figur 4 visar en optimal formel för in-vivo-propagering av mogna DCs bärandes fagocyterade tumörantigen, d v s en föredragen utföringsform av föreliggande uppfinning.

Figur 5 visar att en subpopulation av CD83+/CD14-|ägre celler med en stark expression av B7.2 och HLA-DR, d v s fenotypiskt mogna DCs utvecklades efter 6 dagar under en så kallad envägs-MLR. Den övre grafen avbildar ett kontrollexperiment med enbart K:\Patent\1100-\11008\110081800\030BO8besk.doc . - . ~ .- 10 15 20 25 30 35 *S23 515 // - n ; . .Q medium efter 6 dagar och grafen som uppträder nedan avbildar ett experiment varvid man använder supernatant efter 6 dagar.

Figur 6 visar att det var möjligt att erhålla DCs från en monocytpopulation genom att odla monocyter i ett odlingsmedium där supernatanten från en MLR-odling, också benämnd ett MLR-använt medium (MLR-CM), hade tillsatts (50%). Resultaten från dag 0 till dag 8 belyses där graferna på den vänstra sidan avbildar kontrollexperiment och graferna som uppträder på den högra sidan avbildar experiment varvid man använde supernatant från en MLR odling.

Figur 7 visar cytokinprofilen bestämd i en MLR-CM varvid man använde Luminex.

Exempel Exemgel 1: Framställning av monocyter från leukocyter Monocyter kan erhållas varvid man använder perifert blod av en människa. Denna metod inkluderar följande steg: (a) tillhandahållande av en vit blodcellfraktion erhållen från en human källa genom Ieukaferes; (b) separerande av den vita blodcellsfraktionen i steg (a) i fyra eller flera subfraktioner genom motströms centrifugal elutriation. Monocyter kan också utvinnas från PBMC genom elutriation. Ficoll och Percoll gradienter eller genom deras förmåga att fästa vid plast. Negativ selektion av monocyter varvid man använder magnetiska kulor sammanbundna till vissa antikroppar tillgängliga frán Dynal eller Miltenyi är också möjlig.

Modifiering av monocyter Monocyterna kan sedan genomgå pulsningsbehandling varvid monocyterna behandlas (inkuberas) i en lösning med rent lösligt tumörprotein (antigen) vid en proteinkoncentration på 1-10 mg/ml under 3 timmar vid 37°C. Pulsning kan också användas när antigenet är tumörcellysat erhållna t ex från a) upprepad hetta - upptining eller b) sonikering båda med senare centrifugering. Sedan mäts proteinkoncentrationen i supernatanten och justeras till 100-200 pm/ml.

Monocyter kan dessutom fuseras (varvid man använder PEG, d v s polyetylenglykol, som fusionskemikalie; PEG-lösningen är företrädesvis 50% och utspäds senare) med tumörceller vilket sålunda skapar odödliga celler (hybrider) och sålunda vacciner. Fusionen utförs mellan allogena tumörceller och allogena monocyter från en andra part (se vidare nedan). Transfektion med gener kodande för antigen kan också användas för att skapa modifierade monocyter, d v s vacciner (se figur 1 och 2).

Neuraminidas (NAS) behandling De modifierade monocyterna kan behandlas med 25 mU/ml av NAS. NAS- behandlingen har visats öka de flesta av kemokinernalcytokinerna (se figur 3). Monocyterna kan också förtransfekteras med en lämplig gen kodande för en NAS, t ex fràn V.ko|erae.

K:\Patent\1 100-\1 1008\110081800\030808b6Sk.d0C ...- 10 15 20 25 30 35 . . ; . .n 523 515 /2 . a ; . .- Effekt av neuraminidas (NAS)-behandling på direkt alloigenkänning och på kemokinlcytokinproduktion Det har varit känt under längre än en dekad att behandling av stimulator-APC med neuraminidas, vilket leder till avlägsnande av sialinsyra på cellmembranet, signifikant ökar dess förmåga att simulera allogena T-celler i en allogen MLR. Det har antytts att ökat cellulärt vidhäftande inducerat av ökad cellyteladdning är en trolig orsak hos denna neuraminidaseffekt. Det har också föreslagits att en neuraminidasbehandlad APC skulle kunna tillhandahålla viss oidentifierad tillgänglighetsfaktor krävd av T-celler för aktivering. Det har nu observerats att allogena perifera blodmononukleära celler (PBMC) behandlade med NAS från Vibrio kolerae (25 mU/ml) inducerar en starkt proliferativ respons bland responder- T-celler i en envägs MLR jämfört med obehandlade PBMC. Dessutom, genom att mäta kemokin- och cytokinproduktion under en envägsallogen MLR upptäcktes att MlP-alfa, RANTES, IL1-beta, TNF-alfa och lFN-gamma framställs i flerfaldigt högre mängder när stimulatorceller (bestrålade monocyter) har behandlats med NAS (figur 3).

Hypertermi Hypertermi (värmestressbehandling) av modifierade celler kan utföras genom att utsätta de modifierade monocyterna för upphettning vid 40°C under 3 timmar.

Feberbehandlingen har vidare visats att uppreglera mängden av HSP-kopplat tumörantigen (i lysosomet och/eller i cytoplasma) inom monocyterna. Denna behandling har också visats öka mängden av immunogena tumörpeptider. Presentationen påverkas ej negativt.

Effekten av värmestress på direkt alloigenkänning Cytosola vårmechockproteiner (HSP) under värmestress och det är väl etablerat att HSP-förenade peptider blir mer immunogena in vivo. Detta är förmodligen beroende på ett mer effektivt upptag av DC (receptormedierad endocytos/fagocytos). Dessutom har vissa HSPs visats inducera mogning av omogna DC in vitro. Man har funnit att en mild hypertennisk stress (41°C under 2 timmar), känd för att inducera en väsentlig uppreglering av oellulär HSP- expression ej negativt påverkar den stimulatorlska kapaciteten hos bestrålad PBMC för att liksom lysosomala proteiner år kända att vara förenade med inducera allogena T-cellsresponser såsom bestämts genom proliferation i en envägs MLR (figur 4).

Fenotypiska studier genom FACS och cytokinlkemokinmätningar Tidigare studier av andra har visat att monocytanvânt medium (supernatanter tagna från monocytodlingar aktiverade av deras Fc-receptorer) liksom T-cellanvänt medium (supernatanter tagna från T-cellsodlingar aktiverade genom stimulering med anti-CD3 antikroppar) effektivt inducerar DC mogning. Vår hypotes var att immuninteraktionen mellan allogena monocyter och responder-T-celler leder till framställning av en kemokin/cytokin ”cocktail” som också kunde inducera en slutlig mogning av omogen DC in vitro. Genom att K:\Patent\1 100-\11008\11006180U\030BOBbeSk.d0c 10 15 20 25 30 35 s n n n en v »523 5,15 /3 utföra primära fenotypiska studier under en traditionell MLR upptäcktes ett intressant fenomen. Under en så kallad envägs-MLR (bestrålade stimulatorceller) men e] under en tvåvägs MLR eller under stimulering med nekrotisk eller apoptotisk allogen PBMC utvecklades en subpopulation av CD83+/CD14 lägre celler med en stark expression av B7.2 och HLA-DR d v s fenotypiskt mogna DCs efter 6 dagar. Resultaten belyses i figur 5 där den övre grafen avbildar kontrollexperiment med enbart medium efter 6 dagar och grafen som uppträder nedan avbildar ett experiment varvid man använde supernatant efter 6 dagar.

Dessa celler utvecklades från en population av ickebestrålade responderceller. Dessutom upptäcktes det att det var möjligt att erhålla sådana DCs från en monocytpopulation genom att odla monocyterna i ett odlingsmedium där supernatanten från en MLR-odling, också benämnd som MLR använt medium (MLR-CM), hade tillsatts (50%). Resultaten från dag 0 till dag 8 belyses i figur 6 där graferna till vänster avbildar kontrollexperiment och graferna som uppträder på den högra sidan avbildar experiment varvid man använder supernatant från en MLR-odling. Tillsats av MLR-CM inducerade också en slutlig mogning av monocyt- härrörande omogna DCs som hade framställts genom att odla i GM-CSF/iL-4 innehållande medium. Av speciellt intresse är att en hög expression av CCR7 kunde visas på dessa mogna DCs som är av central vikt för migrering till regionala lymfkörtlar. Genom att använda multianalyt profileringsteknik (Luminex) bestämdes cytokinprofilen i en MLR-CM och flera cytokineråmed känd effekt pà monocytdifferentiering och mogning hos DCs hittades vilket inkluderade TNF-alfa, IFN-gamma, IL-1 beta. Resultaten avbildas i figur 7. Dessutom framställes flera kemokiner vilket inkluderar MIP-1 alfa. Genom förbehandling av de stimulatoriska cellerna med neuraminidas (NAS) från Wbrio cholerae àstadkoms en ytterligare ökning av kemokinlcytokinproduktionen i en MLR (se figur 3).

För att sammanfatta kan upptäckten ovan väl förklara varför viabla passenger APCs är så viktiga för alloimmunisering. Den förbildade T-cellsreaktiviteten mot direkt presenterat alloantigen på dessa celler leder sålunda till en fördelaktig miljö för rekrytering och lokal mogning av DCs hos den transplanterade individen. Denna ackumulering och mognad av DCs är ett fördelaktigt krav för en senare effektiv priming av naiva alloreaktiva T-celler (som igenkänner allopeptider via den indirekta rutten) i sekundära lymfoida organ.

Etablering av monocytomcellinjer genom fusion av humancancercellinjer med allogena perifera blodmonocyter Humana tumörcellinjer (TCLs) inkluderande bröstcancercellinje MCF7 och prostatacellinje DU 145, köpt från American Tissue Culture Collection, kan användas. TCLs kan odlas i RPMI 1640 medium supplementerat med 10% värmeinaktiverat humant AB serum. 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 mikrogram/ml streptomycin tills fusion. isolerade allogena perifera blodmonocyter från friska blodgivare kan inkuberas med TCL under 5 minuter vid ett förhållande av 10:1 i serumfritt RPMI 1640 medium innehållande 50% K2\Patenl\1 100-\11008\1 10081800\03080Bbesk.d0c k... . . - ~ -~ 10 15 20 25 30 35 523 515 /9 polyetylenglykol (PEG). RPM! 1640 tillsätts sedan långsamt för att späda ut PEG. Efter tvättning och eliminering av ofuserade celler genom densitetsgradient kan monocytomerna återsuspenderas i RPMI 1640 medium supplementerat med humant AB serum, L-glutamin, penicillin och streptomycin såsom nämnts ovan.

Selektion av monocytoma cellinjer från icke-hybrida celler Frambringandet av cellhybrider kan utföras i analogi med frambringandet med hybridom framställande monoklonala antikroppar. Detta stödjer sig på att HGPRT kan fuseras för både positiv och negativ selektion. l ett första skede, kan 6-tioguanln användas för att selektera cancercelllnjer som har muterat HGPRT-genen. Denna kemikalie överförs till en toxisk intermediär genom HGPRT genprodukt. De muterade cellerna fuseras sedan till monocyterldendritceller varvid man använder PEG eller elektrofusion och när de _odlas sedan i HAT medium kommer enbart fuserade celler att överleva. Detta beror på att HAT medium kommer att döda cancerceller som saknar HGPRT gen och att monocyter/dendritceller ej är långlivade i odling fastän de har en aktiv gen. ln vitro priming av humana Th1 celler mot tumör antigen Förmågan hos en primär allogen MLR att inducera en substantiell priming av antigenspecifika CD4+ Th1 celler kan säkerställas (som) följer: Monocyter kan pulsas med enedera lösliga tumörproteiner (1-10 mg/ml under 3 timmar) vilket inkluderar lösligt antigen fràn prostata (PSA) och cancerantigen (CA)-125 eller upprepade frystinade tumörcellslysat (100-200 mikrogram cancercellprotein/ml under 3 timmar) från tumörcellinjer inkluderande bröstcancer och prostatacancerceller. Efter tvättning och gammastrålning kan de pulsade monocyterna användas som stimulatoriska celler i en primär MLR varvid man använder allogen PBMC som responders. Efter 6 dagar kan cellodlingen tvättas och återinsättas i färskt odlingsmedium innehållande 10 U/ml interleukin (lL)-2. Två dagar senare kan cellerna från den primära MLR àterstimuleras genom att tillsätta bestrålad PBMC, autolog med responderceller i den primära MLR, pulsad med antigenet som användes under den primära MLR. Antalet CD4+ Th1 celler som primades under den primära MLR kan sen registreras 1-2 dagar senare varvid man använder en ELISPOT analys specifik för IFN-gammaproducerande celler. Genom att använda samma analysprincip kan förmågan hos allogena monocytomer för att prima CD4+ TH1 celler varvid man använder en primär MLR studeras efter återstimulering med autologa PBMC pulsade med ett cellysat från monocytomer använda i primär MLR.

Olika utföringsformer av föreliggande uppfinning har beskrivits ovan men en fackman inom området inser vidare mindre förändringar, som skulle falla inom omfånget för föreliggande uppfinning. Bredden och omfånget hos föreliggande uppfinning bör ej begränsas av någon av ovannämnda exempelutformningar, utan bör definieras enbart i enlighet med följande krav och deras ekvivalenter. T ex kan någon av de ovannämnda Kt\Patent\1 100-\1 1008\1 10081800\030808beSk.d0C ..-~ ' . . i A523 515 /S kompositionerna och/eller metoderna kombineras med kända terapier eller kompositioner.

Andra aspekter, fördelar och modifieringar inom omfånget av uppflnningen kommer att vara uppenbara för fackmännen inom området för vilka uppfinningen avser.

K:\Patent\1 100-\1 1008\1 10081800\0308OBbeSk.d0c

Claims (14)

10 15 20 25 30 35 . n o o nu a t523 515 ¿:;g;-~ 16 n . - Q ø en PATENTKRAV

1. En metod för framställning av ett cellulärt allogent vaccin innefattande följande steg: a) tillhandahållande av en APC som redan är etablerad ochleller isolerad från en myeolid leukemicellinje; b) modifierande av APC med ett antigen varvid man använder någon av följande metoder: pulsning, transfektion, infektion eller fusion; och c) behandling av APC med ett medel som kan avlägsna sialinsyra hos ytan hos sagda APC; och eventuellt d) odling av den modifierade APC i ett lämpligt medium. __

2. En metod enligt krav 1 innefattande ett ytterligare steg mellan steg a) och steg b): odling av en APC, företrädesvis en monocyt, eller differentierande av en APC, företrädesvis en monocyt, i ett lämpligt medium till monocythärrörande DC, makrofag eller makrofaghärrörande DC.

3. En metod enligt krav 1 varvid APC är en allogen monocyt eller en in- vitrodifferentierad cell som direkt eller indirekt härrör från en allogen monocyt.

4. En metod enligt krav 1 varvid antigenet såsom nämns i steg b) är ett cancerantigen, företrädesvis i form av ett lösligt antigen, ett tumörcellslysat eller en viabel tumörcell, varvid alla är av allogent ursprung.

5. En metod enligt krav 4 varvid steg b) utförs genom att inkorporera antigenet inom APC varvid man använder någon av följande metoder: pulsning med lösligt antigen eller tumörcellslysat, tranfektion med gener kodande för antigenet eller fusion med en allogen tumörcell.

6. En metod enligt krav 1 varvid medlet som kan avlägsna sialinsyra hos cellytan hos APC, såsom nämns i steg c), är neuraminidas (NAS), en eller flera gener kodande för neuraminidas eller neuraminidasframställande virus eller bakterier.

7. En metod enligt krav 6 varvid behandlandet i steg c) utförs genom någon av följande metoder: behandlade av APC med NAS, transfektering av APC med gener kodande för NAS eller infekterande av APC med NAS-producerande virus eller bakterier.

8. En metod enligt krav 1 innefattande ett ytterligare steg i vilken APC utsätts för hypertermi under steg b) eller mellan steg b) och c).

9. En metod enligt krav 8 varvid hypertenni utförs vid en temperatur av från 39 till 42°C och under från 2 till 6 timmar.

10. Ett cellulärt allogent vaccin erhàllbart genom en metod enligt något av kraven 1 till 9. K:\Patent\1 100-\11008\110081800\030812pkrav.d0C ...- , . ø - .a .. .. _ f ' ' '... .u n. 0 0 ' ° . .qn- i: *" . . . , . . . - - - - - ' I '. . . - - ~ - ' Z -' u n.. u» U . - v ~ * . , g' , . .. - ~ ~__~ ,. .. - - ~ - H . u u ~ °' I?

11. En komposition innefattande ett vaccin enligt krav 10 och en farmaceutiskt acceptabel bärare.

12. En frusen behållare innefattande en komposition enligt krav 11.

13. Ett vaccin enligt krav 10 för medicinsk användning.

14. Användning av ett vaccin enligt krav 10 för framställning av ett läkemedel för användning mot cancer. K:\Pat6nt\1 100-\1 1008\110081800\O30812pkrav.d0c