SE523515C2

SE523515C2 - Producing cellular allogeneic vaccine based upon allogeneic antigen presenting cells, by modifying isolated antigen presenting cells with antigen, treating antigen presenting cells with agent

Info

Publication number: SE523515C2
Application number: SE0201726A
Authority: SE
Inventors: Alex Karlsson-Parra; Annacarin Wallgren; Bengt Andersson
Original assignee: Immunicum Ab
Priority date: 2002-06-06
Filing date: 2002-06-06
Publication date: 2004-04-27
Also published as: SE0201726D0; SE0201726L

Abstract

Producing (M1) a cellular allogeneic vaccine (I) based upon an allogeneic antigen presenting cells (APC) (II), involves isolating (II) from a subject, modifying (II) with an antigen using pulsing, transfection, infection or fusion, treating (II) with an agent capable of removing sialic acid on surface of (II) and optionally culturing the modified (II) a suitable medium. Producing (M1) a cellular allogeneic vaccine (I) based upon an allogeneic antigen presenting cells (APC) (II), involves: (a) isolating an (II) from a subject, preferably from a normal blood donor or a patient suffering from myeloid malignancies, or providing (II) already established and/or isolated from a myeloid leukemia cell line; (b) modifying (II) with an antigen using pulsing, transfection, infection or fusion; (c) treating (II) with an agent capable of removing sialic acid on the surface of (II) and optionally; (d) culturing the modified (II) a suitable medium. Independent claims are also included for the following: (1) a cellular allogeneic vaccine (III) obtainable by (M1); (2) a composition (IV) comprising (III) and a carrier; and (3) a frozen container comprising (IV).

Description

25 30 35 . a Q . nu . ~ 523 515 Z tumörspeciﬁk CTL-immunrespons eftersom också MHC-klass ll begränsade CD4+ celler kan aktiveras via den indirekta pathway. 25 30 35. a Q. now . ~ 523 515 Z tumor-specific CTL immune response because also MHC class II restricted CD4 + cells can be activated via the indirect pathway.

Med denna kunskap vid handen var det nu öppet för att förädla denna princip, ex vivo och in vivo som baseras på en effektiv indirekt presentation av tumörantigen genom värd-APC. En självklar approach har varit att erhålla potenta APCs ex vivo, speciellt dendritiska celler (DCs) och därefter ladda dessa celler med tumörhärrörande proteiner antingen genom pulsning eller transfektion. Också så kallade dendritomvaccin där autologa tumörceller har fuserats med autologa monocythärrörande DCs har studerats. Ett problem med ex vivo propagering av autologa DCs är dock den mindre migrationen av dessa celler till dränerande lymfnoder (en förutsättning för att de injicerade DC ska möta naiva T-celler).With this knowledge at hand, it was now open to refine this principle, ex vivo and in vivo based on an effective indirect presentation of tumor antigen by host APC. An obvious approach has been to obtain potent APCs ex vivo, especially dendritic cells (DCs) and then charge these cells with tumor-derived proteins either by pulsation or transfection. Also so-called dendritic vaccines where autologous tumor cells have been fused with autologous monocyte-derived DCs have been studied. However, a problem with ex vivo propagation of autologous DCs is the smaller migration of these cells to draining lymph nodes (a prerequisite for the injected DCs to encounter naive T cells).

Studier i människor har visat att 1% maximalt av subkutant injicerade DCs__migrerar till regionala lymfkörtlar (lymfnoder).Studies in humans have shown that a maximum of 1% of subcutaneously injected DCs migrate to regional lymph nodes (lymph nodes).

En alternativ approach har därför utvecklats, framförallt fràn observationer under vaccination med GM-CSF-producerande tumörceller i gnagarrnodeller, med målet att inducera en effektiv rekrytering in vivo av värd-DCs till vaccinationssätet. Fas 1 försök i människor med protata- och renalt carcincm och melanom varvid man använde autologa GM-CSF-tumörcellsvacciner har undersökts och befunnits vara säkra men utan någon självklar klinisk effekt. Dessutom har ett vaccin baserat på autologa tumörceller visat sig skapa flera tekniska problem. För det första beror ett autologt vaccin på tillgängligheten av adekvat antal med tumörceller, som sällan är tillgängliga på grund av den reaktiva processen som hittas som infiltrerar tumörceller hos många vanliga cancrar. För det andra kräver ett autologt vaccin de novo genöverföring för behandling av varje patient, som är arbetsintensivt och kan orsaka variabla cytokinuttrycksnivåer mellan olika patientvacciner. För det tredje behövs signifikanta utgifter och tid för att säkerställa varje patients mängd vaccin så att de möter accepterade administrationsriktlinjer. Ett sätt att komma runt dessa tekniska problem är att använda en allogen vaccinstrategi baserat på en panel av cytokinuttryckande tumörcellinjer som kan formuleras och lagras före initiering av kliniska studier. Detta är ett speciellt attraktivt tillvägagångssätt för majoriteten av vanliga cancrar för vilka specifika tumörantigen ej har hittills identifierats. Två upptäckter tillhandahåller den immunologlska logiska grunden för en allogen vaccinapproach. För det första att DCs hos värden, istället för de vaccinerade tumörerna själva, är ansvariga för att prima CD4+ celler och CD8+ CTL, av vilka båda krävs för att generera systemisk antitumörimmunitet (se ovan). För det andra uttrycks vanligtvis många tumörantigen bland olika patienters tumörer. Ett GM-CSF-vaccin baserat på detta koncept studerades nyligen i ett Fas 1 försök och befanns vara säkert men utan någon självklar klinisk effekt. Mest troligt berodde denna kliniska otillräcklighet på framställandet av en ensam cytokin (GM-CSF) eftersom teoretiskt flera faktorer borde produceras lokalt för att inducera inte bara en effektiv rekrytering av omogna DCs utan också K:\Patenl\1100-\11008\110081800\O30808beSk.d0C ->»- ...- 10 15 20 25 30 35 » - » n n» *523 5,15 I? ett effektivt mognande av dessa celler. Nödvändiga faktorer inkluderar mest troligt kemotaktiska cytokiner såsom MlP-l alfa och/eller RANTES, mogningsfaktorer såsom intreleukin (lL)-1 beta, lL-6 och/eller tumönekrosfaktor (TNF) alfa och slutligen Th1- polariserande faktorer såsom interferon (IFN) gamma.An alternative approach has therefore been developed, in particular from observations during vaccination with GM-CSF-producing tumor cells in rodent models, with the aim of inducing efficient in vivo recruitment of host DCs to the vaccination site. Phase 1 trials in humans with protate and renal carcinoma and melanoma using autologous GM-CSF tumor cell vaccines have been investigated and found to be safe but without any obvious clinical effect. In addition, a vaccine based on autologous tumor cells has been shown to create several technical problems. First, an autologous vaccine depends on the availability of adequate numbers of tumor cells, which are rarely available due to the reactive process found that infiltrates tumor cells in many common cancers. Second, an autologous de novo vaccine requires gene transfer to treat each patient, which is labor intensive and can cause variable cytokine expression levels between different patient vaccines. Third, significant expenses and time are needed to ensure each patient's amount of vaccine so that they meet accepted administration guidelines. One way to get around these technical problems is to use an allogeneic vaccine strategy based on a panel of cytokine-expressing tumor cell lines that can be formulated and stored prior to initiating clinical trials. This is a particularly attractive approach for the majority of common cancers for which specific tumor antigens have not been identified to date. Two findings provide the immunological logical basis for an allogeneic vaccine approach. First, DCs in the host, instead of the vaccinated tumors themselves, are responsible for priming CD4 + cells and CD8 + CTL, both of which are required to generate systemic antitumor immunity (see above). Second, many tumor antigens are usually expressed among different patients' tumors. A GM-CSF vaccine based on this concept was recently studied in a Phase 1 trial and was found to be safe but without any obvious clinical effect. Most likely, this clinical inadequacy was due to the production of a single cytokine (GM-CSF) because theoretically several factors should be produced locally to induce not only an efficient recruitment of immature DCs but also K: \ Patenl \ 1100- \ 11008 \ 110081800 \ O30808beSk .d0C -> »- ...- 10 15 20 25 30 35» - »nn» * 523 5,15 I? an effective maturation of these cells. Necessary factors most likely include chemotactic cytokines such as MIP-1 alpha and / or RANTES, maturation factors such as intreleukin (IL) -1 beta, IL-6 and / or tumor necrosis factor (TNF) alpha and finally Th1 polarizing factors such as interferon (IFN) gamma .

Inom transplantations- och transfusionsområdena brottas man dagligen med problemet med alloimmunisering vilken är en T-cellsmedierad immunisering mot indirekt presenterade donatorspecifika HLA-antigen. Sådan immunisering utvecklas frekvent med en stor kraft efter transfusioner med allogena blodprodukter och efter transplantation av solida organ. inte ens en kontinuerlig tung immunsuppressiv behandling efter en primär framgångsrik transplantation av ett HLA-inkompatibelt organ tycks förhindra en långsamt framåtskridande process hänvisad till såsom kronisk rejektion. Denna process medieras av CD4+-celler av Th1-typ som aktiveras genom allogena HLA-peptider indirekt presenterade av autologa APCs. Dessa CD4+ T-celler i sin tur aktiverar donatorspecifika antikropps-(lgG)- producerande B-celler och cytotoxiska T-celler och vävnadsmakrofager, som utgörde olika effektorrnekanismerna under kronisk rejektion. En väldigt central aktör för uppstartandet av en alloimmunisering tycks vara levande. metaboliskt intakta, donatorhärrörande APCs. Om dessa tas bort eller inaktiveras genom UVB-stràlning före en transfusion av t ex blodplättskoncentrat undviks sedan vanligtvis immunisering. Detta avser också passenger APCs i transplanterad vävnad; om dessa tas bort före transplantation minskar väsentligen risken för en senare immunisering med kroniska rejektioner. För icke-viabel allogen vävnad gäller samma immuniseringsregler liksom för andra främmande proteinhärrörande antigen, d v s för att åstadkomma en väsentlig immunisering är det nödvändigt att administrera antigenet i en relativt stor mängd tillsammans med ett adjuvans som t ex Freuds complete adjuvans (FCA). Samma gäller för in vitro primär stimulering med icke-viabla MHC- uttryckande allogena APCs eller rena MHC-härrörande allopeptider som ej inducerar någon väsentlig priming av naiva T-celler i direkt allo-härrörande peptider. En väsentlig priming av dessa T-celler erhålles dock genom att använda viabla allogena MHC-uttryckande APC under primär stimulering.In the areas of transplantation and transfusion, the problem of alloimmunization, which is a T-cell-mediated immunization against indirectly presented donor-specific HLA antigens, is wrestled with on a daily basis. Such immunization develops frequently with great force after transfusions with allogeneic blood products and after transplantation of solid organs. even a continuous heavy immunosuppressive treatment after a primary successful transplantation of an HLA-incompatible organ does not appear to prevent a slowly advancing process referred to as chronic rejection. This process is mediated by Th1-type CD4 + cells that are activated by allogeneic HLA peptides indirectly presented by autologous APCs. These CD4 + T cells in turn activate donor-specific antibody (IgG) -producing B cells and cytotoxic T cells and tissue macrophages, which constituted the various effector mechanisms during chronic rejection. A very central player for the start-up of an alloimmunization seems to be alive. metabolically intact, donor-derived APCs. If these are removed or inactivated by UVB radiation before a transfusion of, for example, platelet concentrate, then immunization is usually avoided. This also applies to passenger APCs in transplanted tissue; if these are removed before transplantation, the risk of a subsequent immunization with chronic rejections is significantly reduced. For non-viable allogeneic tissue the same immunization rules apply as for other foreign protein-derived antigens, i.e. in order to achieve a substantial immunization it is necessary to administer the antigen in a relatively large amount together with an adjuvant such as Freud's complete adjuvant (FCA). The same applies to in vitro primary stimulation with non-viable MHC-expressing allogeneic APCs or pure MHC-derived allopeptides that do not induce any significant priming of naive T cells in direct allo-derived peptides. However, substantial priming of these T cells is obtained by using viable allogeneic MHC-expressing APCs during primary stimulation.

Något som skiljer (diskriminerar) primär stimulering med viabla allogena APCs från primär stimulering med icke viabla (lyserade eller apoptopiska) allogena APCs in vitro är den väldigt kraftfulla T-cellproliferationen i responder (värd) cellpopulation, som enbart ses under stimulering med viabla APCs. Denna reaktion som kallas allogen blandad leukocytreaktion (MLR) leder också till framställandet av vissa kemokiner och cytokiner, vilket inkludetar MlP- 1 alfa, RANTES, lL-1 beta, |L-6, TNF-alfa och IFN-gamma. MLR induceras i både naiva och minnesresponder T-celler korsreagerar med MHC molekyler på allogena APCs genom att man upplever dessa molekyler som deras egna MHC + främmande peptidsekvenser som T- cellerna var förbestämda att reagera mot. Det har visats att så många som 1 av 20 hos vàra KZ\Palent\1 100-\11008\1 10081800\030808beSk.d0C 10 15 20 25 30 35 , q ~ . -n 523 515 <1 cirkulerande T-celler kan delta i denna förbildade alloreaktivitet. Denna väldigt kraftfulla reaktion betraktas i allmänhet vara orsaken för den akuta rejektionsprocessen, vilken leder till fullständig rejektion av MHC inkompatibla allogena organ inom 7 till 10 dagar av icke immunsupprimerade recipienter.Something that distinguishes (discriminates) primary stimulation with viable allogeneic APCs from primary stimulation with non-viable (lysed or apoptopic) allogeneic APCs in vitro is the very powerful T cell proliferation in the responder (host) cell population, which is only seen during stimulation with viable APCs. This reaction, called the allogeneic mixed leukocyte reaction (MLR), also leads to the production of certain chemokines and cytokines, including MlP-1 alpha, RANTES, IL-1 beta, | L-6, TNF-alpha and IFN-gamma. MLR is induced in both naive and memory responders T cells cross-react with MHC molecules on allogeneic APCs by perceiving these molecules as their own MHC + foreign peptide sequences that the T cells were destined to react against. It has been shown that as many as 1 in 20 of our KZ \ Palent \ 1 100- \ 11008 \ 1 10081800 \ 030808beSk.d0C 10 15 20 25 30 35, q ~. -n 523 515 <1 circulating T cells can participate in this preformed alloreeactivity. This very powerful reaction is generally considered to be the cause of the acute rejection process, which leads to complete rejection of MHC incompatible allogeneic organs within 7 to 10 days of non-immunosuppressed recipients.

En samadministrering av allogena DCs med autologa DC i vilket antigenen inkorporerades, till ett subjekt beskrives i WO 99/47687. Den autologa DC förväntades presentera antigenet för CTLs medan den allogena DC förväntades inducera en stark reaktion från alloreaktiva T- celler vilket resulterade i lokal frisättning av stimulatoriska molekyler som skulle amplifiera förmågan hos autologa DC att aktivera CTLs. lnga data stödjandes deras hypotes presenterades och ej heller någon frambringad immunrespons. . __ Vidare beskrivs vaccination med hybridceller bestående av autologa tumörceller metod för att inducera en antigenspecifik immunrespons genom fuserade med allogena mogna DC i "Regression of human metastatic cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids", A. Kugler et al. Nature Medicine, vol 6, No 3, mars 2000, sid 332-336. Teoretiskt baseras denna metod pà förväntandet att samexpression av allogen MHC-molekyl på den halvautologa tumörcellen (som uttrycker autologa MHC klass 1 molekyler + tumörpeptider) skulle aktivera alloreaktiva T-celler. Denna aktivering skulle resultera i en lokal frisättning av stimulatoriska cytokiner som skulle hjälpa att trigga aktiverandet av CTLs som tumörpeptiden hos autologa, tumörcellhärrörande MHC klass 1 molekyler. Genom att använda denna vaccinapproach uppvisade ett begränsat antal patienter med renal tumör ett kliniskt anticancerrespons.A co-administration of allogeneic DCs with autologous DCs in which the antigen was incorporated into a subject is described in WO 99/47687. The autologous DC was expected to present the antigen to CTLs while the allogeneic DC was expected to induce a strong response from alloreactive T cells resulting in local release of stimulatory molecules that would amplify the ability of autologous DCs to activate CTLs. No data supporting their hypothesis were presented, nor was any immune response elicited. . __ Furthermore, vaccination with hybrid cells consisting of autologous tumor cells is described method for inducing an antigen-specific immune response by fused with allogeneic mature DC in "Regression of human metastatic cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids", A. Kugler et al. Nature Medicine, Vol 6, No. 3, March 2000, pp. 332-336. Theoretically, this method is based on the expectation that coexpression of allogeneic MHC molecule on the semi-autologous tumor cell (expressing autologous MHC class 1 molecules + tumor peptides) would activate alloreactive T cells. This activation would result in a local release of stimulatory cytokines that would help trigger the activation of CTLs as the tumor peptide of autologous, tumor cell-derived MHC class 1 molecules. Using this vaccine approach, a limited number of patients with renal tumors showed a clinical anticancer response.

Ett vaccin mot andra tumörer, varvid man använder dendritiska celler fuserade med igenkänner cancerceller, föreslås också i "Smallpox, polio and now a cancer vaccine?”, D. W. Kufe, Nature Medicin, vol 6, no 3, mars 2000, sid 252-253. Metodema av Kugler et al och Kufe ovan är dock begränsade av ett antal faktorer. För det första är ett autologt vaccin beroende av tillgängligheten av adekvat antal tumörceller, som är sällsynt tillgängliga på grund av den reaktiva processen som hittas som infiltrerar tumörceller hos många vanliga cancrar. För det andra kräver ett autologt vaccin de novo genöverförande för behandling av varje patient, som är arbetskraftintensiv och kan orsaka variabla cytokinuttrycksnivåer som skiljer mellan olika patientvacciner. För det tredje behovs det signiﬁkanta kostnader och tid för att säkerställa att varje patients lot med vaccin är så att de möter accepterade administrationsriktlinjer Följaktligen finns det ett behov för ett vaccin som skapar en bättre immunrespons och som är bättre lämpat för lagring, framställningen i en stor skala och är oberoende av lagerbegränsningar.A vaccine against other tumors, using dendritic cells fused with recognizing cancer cells, is also proposed in "Smallpox, polio and now a cancer vaccine?", DW Kufe, Nature Medicine, vol 6, no 3, March 2000, pages 252-253 However, the methods of Kugler et al and Kufe above are limited by a number of factors: First, an autologous vaccine is dependent on the availability of adequate numbers of tumor cells, which are rarely available due to the reactive process found which infiltrates tumor cells in many common Second, an autologous de novo vaccine requires gene transfer for the treatment of each patient, which is labor intensive and can cause variable cytokine expression levels that differentiate between different patient vaccines. is that they meet accepted administration guidelines Consequently, there is a need for a vaccine that creates a better immune response ns and which is better suited for storage, the production on a large scale and is independent of storage limitations.

Sammanfattning av uppﬁnningen K2\Patent\1100-\1 1008\1 10081800\03080BbeSk.d0c u ...- . < . - -~ 10 15 20 25 30 35 %523 515 f Föreliggande uppfinning löser problemen ovan genom att tillhandahålla i enlighet med en första aspekt en metod för framställning av ett cellulärt allogent vaccin innefattande följande steg: a) tillhandahållande av en APC som redan är etablerad och/eller isolerad från en myeloid leukemicellinje; b) modifierande av APC med ett antigen varvid man använder någon av följande metoder: pulsning, transfektion, infektion eller fusion; och c) behandling av APC med ett medel som kan avlägsna sialinsyra från ytan hos sagda APC; och eventuellt d) odling av modiferad APC i ett lämpligt medium. l enlighet med en andra aspekt tillhandahålles ett cellulärt allogent vaccin erhållbart genom en metod enligt den första aspekten. Enligt en tredje aspekt tillhandahålles en komposition innefattande ett vaccin enligt den andra aspekten och en farmaceutiskt acceptabel bärare.Summary of the invention K2 \ Patent \ 1100- \ 1 1008 \ 1 10081800 \ 03080BbeSk.d0c u ...-. <. The present invention solves the above problems by providing in accordance with a first aspect a method of making a cellular allogeneic vaccine comprising the steps of: a) providing an APC already established and / or isolated from a myeloid leukemia cell line; b) modifying APC with an antigen using any of the following methods: pulsation, transfection, infection or fusion; and c) treating APC with an agent capable of removing sialic acid from the surface of said APC; and optionally d) culturing modified APC in a suitable medium. In accordance with a second aspect, a cellular allogeneic vaccine obtainable by a method according to the first aspect is provided. According to a third aspect, there is provided a composition comprising a vaccine according to the second aspect and a pharmaceutically acceptable carrier.

Enligt en ﬁärde aspekt tillhandahålles terapeutisk användning av ett vaccin enligt den andra aspekten eller en komposition enligt den tredje aspekten.According to a fourth aspect, therapeutic use is provided by a vaccine according to the second aspect or a composition according to the third aspect.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Det avses genomgående i föreliggande beskrivning att uttrycket ”cellulär allogent vaccin” omfattar vilket reagens, cell eller förening som helst som kan frambringa en antigenspeciﬁk immunrespons i ett subjekt, varvid sagda reagens, cell eller förening är av allogent ursprung, d v s har sitt ursprung från en donator, företrädesvis en human donator, annan än mottagaren, företrädesvis en human mottagare av det cellulära allogena vaccinet.Detailed Description of the Invention Throughout the present specification it is intended that the term "cellular allogeneic vaccine" encompass any reagent, cell or compound which can elicit an antigen-specific immune response in a subject, said reagent, cell or compound being of allogeneic origin, i.e. having originates from a donor, preferably a human donor, other than the recipient, preferably a human recipient of the cellular allogeneic vaccine.

Såsom används i föreliggande beskrivning och krav, inkluderar den singulära formen ”en”, "ett" och "den" plurala motsvarigheter om inte sammanhanget klart dikterar annat. T ex inkluderar uttrycket ”en cell” en mängd celler, vilket inkluderar blandningar därav.As used in the present description and claims, the singular form includes "one", "one" and "the" plural equivalents unless the context clearly dictates otherwise. For example, the term "a cell" includes a plurality of cells, which includes mixtures thereof.

Uttrycken ”antigenpresenterande cell(er)”, ”APC” eller ”APCs” inkluderar både intakta, hela celler liksom andra molekyler som kan inducera presentation av en eller flera antigen, företrädesvis i förening med klass 1 MHC-molekyler. Exempel på lämpliga APCs diskuteras i detalj nedan och inkluderar men är ej begränsade till hela celler såsom monocyter, makrofager, dendritceller, monocythärrörande dentritceller, makrofaghärrörande dendritceller, B-celler och myeloida leukemiceller t ex cellinjer THP-1, U937, Hl-60 eller CEM-CM3. Myeloida leukemiceller sägs tillhandahålla så kallade premonocyter.The terms "antigen presenting cell (s)", "APC" or "APCs" include both intact, whole cells as well as other molecules that can induce presentation of one or more antigens, preferably in conjunction with class 1 MHC molecules. Examples of suitable APCs are discussed in detail below and include but are not limited to whole cells such as monocytes, macrophages, dendritic cells, monocyte-derived dendritic cells, macrophage-derived dendritic cells, B cells and myeloid leukemia cells eg cell lines THP-1, U9EM, H1-60, H1-60 -CM3. Myeloid leukemia cells are said to provide so-called premonocytes.

Uttrycken “cancer“, “neoplasm” och ”tumör” använda ombytbart och i endera singulära eller plurala formen, såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, avser celler som har genomgått en malign transformation som gör dem patologiska för värdorganismen. Primära cancerceller (d v s celler erhållna från nåra sätet hos den maligna transformationen) kan enkelt särskiljas från icke-cancerceller genom våletablerade tekniker, K2\Patent\1 100-\1 1008\1 1008180OSE\0401Zßnybesksidadoc 6 10 15 20 25 30 35 n n ø . nu .. . ...- u n an. u o _ _". . . u, . . u u a n n z : _ _ _ _. , ... . . . . . . _ _ , , .The terms "cancer", "neoplasm" and "tumor" are used interchangeably and in either singular or plural form, as appearing in the present specification and claims, refer to cells which have undergone a malignant transformation which renders them pathological to the host organism. Primary cancer cells (i.e., cells obtained from the near site of the malignant transformation) can be easily distinguished from non-cancer cells by well-established techniques, n n ø ø. now .. . ...- u n an. u o _ _ "... u,.. u u a n n z: _ _ _ _., ........ _ _,,.

IDC CIO n O I ' . l I _ . p . . .. _ .. . . . . . . . - ~ c e» 6 speciellt histologisk undersökning. Deﬁnitionen av en cancercell såsom används häri inkluderar inte bara en primär cancercell utan också vilken cell som helst härrörande från en cancercellstamfader. Detta inkluderar metastaserade cancerceller och in vitro odlingar och cellinjer härrörande från cancerceller. När man hänvisar till en typ av cancer som normalt tar sig uttryck som en solid tumör, är ”en kliniskt detekterbar" tumör en som är detekterbar på basis av tumörmassa; t ex genom sådana procedurer som CAT-skanning, magnetisk resonansbildåterglvning (MRl), röntgen, ultraljud eller palpation. Blokemiska eller immunologiska uppdaganden ensamma kan vara otillräckliga för att möta denna deﬁnition.IDC CIO n O I '. l I _. p. . .. _ ... . . . . . . - ~ c e »6 special histological examination. The ﬁ nition of a cancer cell as used herein includes not only a primary cancer cell but also any cell derived from a cancer cell progenitor. This includes metastatic cancer cells and in vitro cultures and cell lines derived from cancer cells. When referring to a type of cancer that normally manifests as a solid tumor, "clinically detectable" tumor is one that is detectable on the basis of tumor mass, for example, by procedures such as CAT scanning, magnetic resonance imaging (MR1), X-ray, ultrasound or palpation.Blocemic or immunological findings alone may be insufficient to meet this de ﬁ nition.

Uttrycket "genetiskt modifierad” avser, såsom det uppträder i föreliggande innehåller och/eller främmande gen eller nukleinsyrasekvens som i sin tur modiﬁerar genotypen eller fenotypen hos cellen eller dess avkomma. Med andra ord avser den vilken addition, deletion eller splittring hos en cells endogena nukleotider. APCs modifierade varvid man använder transfektion, infektion eller fusion är exempel på genetiskt modifierade APCs. APCs som enbart är pulsade är ej beskrivning, att den uttrycker en genetiskt modifierade.The term "genetically modified" as used herein refers to contains and / or foreign gene or nucleic acid sequence which in turn modifies the genotype or phenotype of the cell or its progeny. Modified APCs using transfection, infection or fusion are examples of genetically modified APCs APCs which are only pulsed are not described as expressing a genetically modified.

En "effektiv mängd", såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, är en mängd som är tillräcklig för att åstadkomma förmånliga eller önskvärda resultat. En effektiv mängd kan administreras i en eller ﬂera administreringar, appliceringar eller doseringar.An "effective amount", as appears in the present specification and claims, is an amount sufficient to produce beneficial or desirable results. An effective amount can be administered in one or more administrations, applications or dosages.

Vaccinerna enligt föreliggande uppﬁnning kan administreras eller appliceras transdermalt, oralt, subkutant, lntramuskulärt, intravenöst eller parenteralt. För syften av denna uppﬁnning är en effektiv mängd av vacciner den mängd som provocerar fram en antigenspecifik immunrespons i ett subjekt. En lämplig mängd kan vara ungefär 10x10° celler för administrering till ett subjekt. En ampull (som kan vara frusen och upptinad före användning) kan innehålla 20x106 celler. Celler från en frusen ampull (eller liten flaska) kan vidare odlas igen för administrering till ett subjekt. Självklart kommer mängden bestämmas av den medicinska praktiseraren som kommer bedöma beskaffenheten och svårhetsgraden hos tillståndet hos subjektet i behov av behandling. Tillståndet hos subjektet kan också kräva återvaccinering som kan utföras var tredje till sjätte vecka. Före administrering av vaccinet eller kompositionen enligt föreliggande uppfinning är företrädesvis sagda vaccin eller komposition gammabestrålad.The vaccines of the present invention may be administered or applied transdermally, orally, subcutaneously, intramuscularly, intravenously or parenterally. For the purposes of this invention, an effective amount of vaccines is the amount that elicits an antigen-specific immune response in a subject. A suitable amount may be about 10x10 ° cells for administration to a subject. One ampoule (which may be frozen and thawed before use) may contain 20x106 cells. Cells from a frozen ampoule (or vial) can be further cultured again for administration to a subject. Of course, the amount will be determined by the medical practitioner who will assess the nature and severity of the condition of the subject in need of treatment. The condition of the subject may also require re-vaccination which may be performed every three to six weeks. Prior to administration of the vaccine or composition of the present invention, said vaccine or composition is preferably gamma irradiated.

Uttrycket ”ett medel som kan avlägsna sialinsyra på ce|lytor", som uppträder i föreliggande beskrivning och krav, avser ett medel som kan avlägsna sialinsyra från cellytor.The term "an agent capable of removing sialic acid on cell surfaces" as used in the present specification and claims refers to an agent capable of removing sialic acid from cell surfaces.

Exempel på sådana celler är APCs såsom lagts fram ovan. Medel som kan avlägsna sialinsyra från cellytor kan exempliﬁeras genom neuraminidas (NAS) och antikroppar frambringade mot CD 43 (anti-CD43). Företrädesvis är sagda medel NAS. NAS tros klyva sialinsyra från glykokonjugat och anti-CD43 tros bringa sialinsyran från ytan och in i cellen.Examples of such cells are APCs as set forth above. Agents that can remove sialic acid from cell surfaces can be exemplified by neuraminidase (NAS) and antibodies raised against CD 43 (anti-CD43). Preferably, said means are NAS. NAS is believed to cleave sialic acid from glycoconjugate and anti-CD43 is believed to bring sialic acid from the surface and into the cell.

Andra exempel på sagda medel är gener som kodar för NAS eller NAS-framställande virus K:\Patenl\1 100-\1 1008\1100B1B00\030808beSk.d0G 10 15 20 25 30 35 . . n ø en fszs sis" 3 - ø u . no eller bakterier. NAS kan erhållas från bakterier och virus t ex från Vibrio cholerae, Newcastle virus, influensavirus eller Clostridium perfringens.Other examples of said agents are genes encoding NAS or NAS-producing virus K: \ Patenl \ 1 100- \ 1 1008 \ 1100B1B00 \ 030808beSk.d0G 10 15 20 25 30 35. . n ø en fszs sis "3 - ø u. no or bacteria. NAS can be obtained from bacteria and viruses eg from Vibrio cholerae, Newcastle virus, influenza virus or Clostridium perfringens.

Uttrycket "odling". såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav. avser in- vitro propagering av celler eller organismer på eller i media av olika slag. Det inses att efterföljarna av en cell odlad i odling behöver ej vara fullständigt identisk (antingen morfologiskt, genetiskt eller fenotypiskt) med modercellen. Ett lämpligt odlingsmedium kan väljas av fackmannen inom området och exempel på sådana medier är RPMl medium eller Eagles Minimal Essential Medium (EMEM).The term "cultivation". as appears in the present description and claims. refers to in vitro propagation of cells or organisms on or in media of various kinds. It will be appreciated that the successors of a cell grown in culture need not be completely identical (either morphologically, genetically or phenotypically) to the parent cell. A suitable culture medium can be selected by those skilled in the art and examples of such media are RPM1 medium or Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM).

Ett ”subjekt”, såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, är en vertebrat, företrädesvis ett däggdjur, mer föredraget en människa. Däggdjur inkluderar, menuär ej begränsade till, möss, apor, människor, boskap, sportdjur och husdjur. Subjektet kan också vara en patient.A "subject", as appears in the present description and claims, is a vertebrate, preferably a mammal, more preferably a human. Mammals include, menu not limited to, mice, monkeys, humans, livestock, sport animals and pets. The subject may also be a patient.

Ett "antigen". såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, avser vilken species, specimen eller förening som kan frambringa en immunrespons t ex tumörspecimen, en tumörcell, ett virus, en bakterie, en svamp, en parasit, ett protein eller en peptid.An "antigen". as appears in the present specification and claims, refers to any species, specimen or compound which can elicit an immune response such as the tumor specimen, a tumor cell, a virus, a bacterium, a fungus, a parasite, a protein or a peptide.

Tumörspecimen kan vidare erhållas från en bukspottskörteltumör eller vilken annan tumör som helst. l enlighet med en föredragen utföringsform av föreliggande uppﬁnning väljs tumörspecimen så att den representerar så många andra tumörtyper som möjligt. Om t ex ett vaccin mot cancer i bukspottskörteln är önskvärt, används då ett representativt specimen av bukspottskörtelcancer (antigen) för framställning av ett vaccin mot cancer i bukspottskörteln.The tumor specimen can further be obtained from a pancreatic tumor or any other tumor. In accordance with a preferred embodiment of the present invention, the tumor specimen is selected to represent as many other tumor types as possible. If, for example, a vaccine against pancreatic cancer is desired, then a representative specimen of pancreatic cancer (antigen) is used to prepare a vaccine against pancreatic cancer.

Om istället t ex ett vaccin mot bröstcancer är önskvärt används då ett representativt specimen av bröstcancer (antigen) för framställning av ett bröstcancervaccin.If instead, for example, a vaccine against breast cancer is desired, then a representative specimen of breast cancer (antigen) is used for the preparation of a breast cancer vaccine.

En ”komposition", såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, avses betyda en kombination av aktivt medel, d v s vaccinet, och en annan förening eller komposition, inert (t ex, ett detekterbart medel eller markör) eller aktiv, såsom ett adjuvans. I en speciell aspekt innefattar en komposition enligt uppfinningen vaccinet och en farrnaceutisk acceptabel bärare lämplig för administrering till subjektet. En "fannaceutisk komposition", såsom uppträder i föreliggande beskrivning och krav, avses inkludera kombinationen av ett aktivt medel med en bärare, inert eller aktivt, som gör kompositionen lämplig för diagnostisk eller terapeutisk användning in vitro, in vivo eller ex vivo.A "composition", as appears in the present specification and claims, is intended to mean a combination of active agent, i.e. the vaccine, and another compound or composition, inert (eg, a detectable agent or label) or active, such as an adjuvant. a particular aspect comprises a composition of the invention comprising the vaccine and a pharmaceutically acceptable carrier suitable for administration to the subject. makes the composition suitable for diagnostic or therapeutic use in vitro, in vivo or ex vivo.

Såsom används häri omfattar uttrycket ”farmaceutiskt acceptabel bärare", som uppträder i föreliggande beskrivning och krav, vilken som helst av standardfarmaceutiska bärare, såsom fosfatbuffrad salinlösning, vatten och emulsioner, såsom en olja/vatten eller vatten/olja emulsion, och olika typer av vätmedel. Kompositionerna kan också inkludera stabilisatorer och konserveringsämnen. För exempel på bärare, stabilisatorer och adjuvans se Martin, REMINGTONS PHARM. SCl. 15:e utgåvan (Mack Publ. Co., Easton (1975)).As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" as used in the present specification and claims includes any of the standard pharmaceutical carriers, such as phosphate buffered saline, water and emulsions, such as an oil / water or water / oil emulsion, and various types of wetting agents. The compositions may also include stabilizers and preservatives. For examples of carriers, stabilizers and adjuvants, see Martin, REMINGTONS PHARM. SCl. 15th Edition (Mack Publ. Co., Easton (1975)).

KZ\Patent\1100-\1 1008\1 10081800\O30808beSk.d0c --nu 10 15 20 25 30 35 . . Q - nu 523 515 2 ~ n n | -- Uttrycken "större histokompatibilitetskomplex" eller "MHC" avser ett komplex av gener som kodar för cellytemolekyler som krävs för antigenpresentation till T-celler och för snabb implantatrejektion. I människor är också MHC-komplexet känt såsom HLA-komplex.KZ \ Patent \ 1100- \ 1 1008 \ 1 10081800 \ O30808beSk.d0c --nu 10 15 20 25 30 35. . Q - nu 523 515 2 ~ n n | - The term "major histocompatibility complex" or "MHC" refers to a complex of genes encoding cell surface molecules required for antigen presentation to T cells and for rapid implant rejection. In humans, the MHC complex is also known as the HLA complex.

Proteinerna kodade av MHC-komplex är kända som ”MHC-molekyler” och klassiﬁceras i klass l- och klass ll-MHC-molekyler. Klass l-MHC-molekyler inkluderar membran- heterodimera proteiner som består av en kedja kodad i MHC förenad ickekovalent med B2- mikroglubulin. Klass I MHC-molekyler uttrycks av nästan alla celler med kärna och har visats fungera i antigenpresentation för CD8+ T-celler. Klass l molekyler inkluderar HLA-A, -B och - C i människor. Klass l molekyler binder i allmänhet peptider med 8-10 aminosyror i längd.The proteins encoded by MHC complexes are known as “MHC molecules” and are classified into Class I and Class II MHC molecules. Class 1 MHC molecules include membrane heterodimeric proteins consisting of a chain encoded in MHC joined non-covalently with B2 microglubulin. Class I MHC molecules are expressed by almost all cells with nuclei and have been shown to function in antigen presentation for CD8 + T cells. Class I molecules include HLA-A, -B and -C in humans. Class I molecules generally bind peptides of 8-10 amino acids in length.

Klass ll-MHC molekyler inkluderar också membranheterodimera proteiner. Klass ll-MHC är kända för att delta i antigenpresentation för CD4+ T-celler och i människor inkludera HLA- DP, -DQ och DR. Klass ll molekyler binder i allmänhet peptider som är l2-20 aminosyrarester i längd. Uttrycket "MHC-restriktion” avser ett karakteristikum hos T-celler som medger för dem att igenkänna antigen enbart efter att det behandlats och de resulterande antigena peptiderna uppvisas i förening med endera en egen klass l- eller klass lll-MHC molekyl.Class II MHC molecules also include membrane heterodimeric proteins. Class II MHCs are known to participate in antigen presentation for CD4 + T cells and in humans include HLA-DP, -DQ and DR. Class II molecules generally bind peptides that are 1-2-20 amino acid residues in length. The term "MHC restriction" refers to a characteristic of T cells that allows them to recognize antigen only after it has been treated and the resulting antigenic peptides are presented in association with either their own class I or class III MHC molecule.

Föreliggande uppﬁnning tillhandhåller sålunda en metod för att provocera fram antigenspeciﬁka immunresponser, och speciellt immunresponser mot tumörantigen.The present invention thus provides a method for provoking antigen-specific immune responses, and in particular immune responses to tumor antigen.

I enlighet med en vidare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahålles ett vaccin varvid sagda APC är en allogen monocyt, d v s en monocyt härrörande från en annan del (någon annan) (ej härrörande från samma subjekt som man avser behandla med vaccinet enligt föreliggande uppﬁnning). l en annan aspekt av uppﬁnningen kan APCs, företrädesvis monocyter isoleras från den vita blodcellsfraktionen hos ett däggdjur, såsom en råtta. en apa eller människa, företrädesvis en människa. Den vita blodcellsfraktionen kan vara från perifert blod hos däggdjuret, företrädesvis en normal blodgivare. Denna metod inkluderar följande steg: (a) tillhandahållande av en vit blodcellsfraktion erhållen från en däggdjurkälla genom metoder kända inom området såsom leukaferes; (b) separerande av den vita blodcellsfraktionen i steg (a) till fyra eller flera subfraktioner genom motströms centrifugal elutration. Monocyter kan också utvinnas från PBMC genom elutriation, Ficoll och Percoll gradienter, genom deras förmåga att fästa till plast eller genom negativ eller positiv selektion varvid man använder antikroppar sammanbundna till kulort ex magnetiska kulor. l enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahålles en metod innefattande ett ytterligare steg mellan steg a) och steg (b): odling av en APC, företrädesvis en monocyt, eller differentiering av en APC, företrädesvis en monocyt i ett lämpligt medium till monocythärrörande DC, makrofag eller makrofaghärrörande DC. Detta kan åstadkommas genom att inkubera monocyter eller KI\Patent\1100-\1 1008\1 10081800\030808besk.d0c ...- 10 15 20 25 30 35 . - u | u; ß #523 515 7 myeloida Ieukemiceller i närvaro av dlffarantieringsfaktorer (tillväxtfaktorer) såsom GM-CSF och/eller lL-4 och/eller TNF-alfa och/eller monocytkolonibildande faktor (MCSF) och/eller lFN-gamma i olika kombinationer. l enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid APC är en allogen monocyt eller en in-vitro differentierad cell som direkt eller indirekt härrör från en allogen monocyt. l enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid antigenet som nämns i steg b) är ett cancerantigen, företrädesvis i form av ett lösligt antigen, ett tumörcellslysat eller en viabel tumörcall, varvid alla är av allogent ursprung.According to a further embodiment of the first aspect of the present invention there is provided a vaccine wherein said APC is an allogeneic monocyte, i.e. a monocyte derived from another part (any other) (not derived from the same subject which is intended to be treated with the vaccine according to the present invention). recovery). In another aspect of the invention, APCs, preferably monocytes, can be isolated from the white blood cell fraction of a mammal, such as a rat. a monkey or human, preferably a human. The white blood cell fraction may be from the peripheral blood of the mammal, preferably a normal blood donor. This method includes the following steps: (a) providing a white blood cell fraction obtained from a mammalian source by methods known in the art such as leukapheresis; (b) separating the white blood cell fraction in step (a) into four or more subfractions by countercurrent centrifugal elution. Monocytes can also be recovered from PBMC by elutriation, Ficoll and Percoll gradients, by their ability to attach to plastics or by negative or positive selection using antibodies bound to beads such as magnetic beads. In accordance with a further embodiment of the first aspect of the present invention there is provided a method comprising a further step between step a) and step (b): culturing an APC, preferably a monocyte, or differentiating an APC, preferably a monocyte in a suitable medium for monocyte-derived DC, macrophage or macrophage-derived DC. This can be accomplished by incubating monocytes or KI \ Patent \ 1100- \ 1 1008 \ 1 10081800 \ 030808besk.d0c ... - u | u; ß # 523 515 7 myeloid leukemia cells in the presence of sub-guaranteeing factors (growth factors) such as GM-CSF and / or IL-4 and / or TNF-alpha and / or monocyte colony forming factor (MCSF) and / or IFN-gamma in various combinations. In accordance with a further embodiment of the first aspect of the present invention there is provided a method wherein APC is an allogeneic monocyte or an in vitro differentiated cell derived directly or indirectly from an allogeneic monocyte. In accordance with a further embodiment of the first aspect of the present invention there is provided a method wherein the antigen mentioned in step b) is a cancer antigen, preferably in the form of a soluble antigen, a tumor cell lysate or a viable tumor cell, all of which are of allogeneic origin.

I enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av__föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid steg b) utförs genom att inkorporera antigenet in i APC varvid man använder någon av följande metoder: pulsning med lösligt antigen eller tumörcellslysat, transfektion med gener kodade för antigenet eller fusion med en allogen tumörcell. Som ett resultat tillhandahållas ett vaccin som är anpassat för användning mot cancer. En blandning av olika cancarantigen kan också användas.According to a further embodiment of the first aspect of the present invention there is provided a method wherein step b) is performed by incorporating the antigen into the APC using any of the following methods: pulsing with soluble antigen or tumor cell lysate, transfection with genes encoded for the antigen or fusion with an allogeneic tumor cell. As a result, a vaccine adapted for use against cancer is provided. A mixture of different cancarantigen can also be used.

I enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid medlet som kan avlägsna sielinsyra från cellytan hos APC, såsom nämns i steg c), är neuraminidas (NAS), en eller flera gener kodande för neuraminidas eller neuraminidasframställande virus eller bakterier.According to a further embodiment of the first aspect of the present invention there is provided a method wherein the agent capable of removing soul acid from the cell surface of APC, as mentioned in step c), is neuraminidase (NAS), one or more genes encoding neuraminidase or neuraminidase producing virus or bacteria.

I enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid behandlingen i steg c), utförs genom någon av följande metoder: behandling av APC med NAS, transfektering av APC med gener kodande för NAS eller infekterande APC med NAS-framställande virus eller bakterier såsom nämnts ovan. Företrädesvls kan APCs transfekteras med NAS efter modiﬁaring, t ex transfektion, med antigenet såsom lagts fram ovan tidigare. l enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod innefattande ett ytterligare steg i vilken APC utsätts för hypertermi (värmestress) under steg b) eller mellan b) och c). l enlighet med en ytterligare utföringsform av den första aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en metod varvid hypertermin såsom nämnts ovan utförs vid en temperatur av från 39 till 42°C under från 2 till 6 timmar. Denna värmestrass utföres företrädesvis vid en temperatur av från 39 till 42°C under ungefär 3 timmar. Företrädesvis pulsning, d v s ett sätt att modifiera APCs utförs under samma tid, d v s parallellt.According to a further embodiment of the first aspect of the present invention, there is provided a method wherein the treatment in step c) is performed by any of the following methods: treating APC with NAS, transfecting APC with genes encoding NAS or infecting APC with NAS producing viruses or bacteria as mentioned above. Preferably, APCs can be transfected with NAS after modification, eg transfection, with the antigen as presented above previously. In accordance with a further embodiment of the first aspect of the present invention, there is provided a method comprising a further step in which APC is subjected to hyperthermia (thermal stress) during step b) or between b) and c). In accordance with a further embodiment of the first aspect of the present invention there is provided a method wherein the hypertermination as mentioned above is carried out at a temperature of from 39 to 42 ° C for from 2 to 6 hours. This heating strap is preferably carried out at a temperature of from 39 to 42 ° C for about 3 hours. Preferably pulsation, i.e. a method of modifying APCs is performed during the same time, i.e. in parallel.

I enlighet med en ytterligare utföringsform av den tredje aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahållas en frusen behållare (såsom ett provrör, en ampull eller en liten flaska) innefattande en komposition enligt den tredje aspekten.According to a further embodiment of the third aspect of the present invention, there is provided a frozen container (such as a test tube, an ampoule or a vial) comprising a composition according to the third aspect.

K:\Pat6nt\1 100-\11008\1 1 O081800\030608beSk.d0c »s-a 10 15 20 25 30 35 . - n Q se 523 515 /0 l enlighet med en ytterligare utföringsform av denﬁärde aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahålles terapeutisk användning av en effektiv mängd av ett vaccin enligt den andra aspekten av uppfinningen eller en komposition enligt den tredje aspekten av uppfinningen. l enlighet med en ytterligare utföringsform av den fjärde aspekten av föreliggande uppﬁnning tillhandahållas ett vaccin enligt den första aspekten för medicinsk användning.K: \ Pat6nt \ 1 100- \ 11008 \ 1 1 O081800 \ 030608beSk.d0c »s-a 10 15 20 25 30 35. According to a further embodiment of the fourth aspect of the present invention, there is provided therapeutic use of an effective amount of a vaccine according to the second aspect of the invention or a composition according to the third aspect of the invention. In accordance with a further embodiment of the fourth aspect of the present invention, there is provided a vaccine according to the first aspect for medical use.

I enlighet med en ytterligare utföringsform av den fjärde aspekten av föreliggande uppfinning tillhandahålles användning av ett vaccin enligt den första aspekten för framställning av ett läkemedel för användning mot cancer.In accordance with a further embodiment of the fourth aspect of the present invention there is provided the use of a vaccine according to the first aspect of the manufacture of a medicament for use against cancer.

En förklaring till den oväntade effekten som de föreliggande uppﬁnningarna ej är bunden till pà något sätt hos föreliggande uppﬁnning kan vara att allogena__modiﬁerade APCs, företrädesvis monocyter, när de injicerats in i ett subjekt i allmänhet inducerar en lokal MLR som skapar en miljö som är gynnsam för rekrytering och mognande av DC-prekursorer som under deras differentieringlmogning också kräver t ex tumörhärrörande peptider från lokalt lyserade allogena hybridceller, d v s modiﬁerade APCs. Sålunda kan den normalt negativa effekten inducerad genom en transplanterad eller en transfuserad allogen APC (alloimmunisering) användas på ett positivt sätt, d v s immunisering mot andra främmande antigen såsom cancerantigen.One explanation for the unexpected effect to which the present inventions are not bound in any way by the present invention may be that allogeneic-modified APCs, preferably monocytes, when injected into a subject generally induce a local MLR that creates an environment conducive to recruitment and maturation of DC precursors which during their differentiation maturation also require, for example, tumor-derived peptides from locally lysed allogeneic hybrid cells, ie modified APCs. Thus, the normally negative effect induced by a transplanted or a transfused allogeneic APC (alloimmunization) can be used in a positive way, i.e. immunization against other foreign antigens such as cancer antigen.

Föredragna särdrag av varje aspekt av uppﬁnningen är som för var och en av de andra aspekterna med vederbörliga ändringar. Dokumenten inom den tidigare kända tekniken nämnd häri inkorporeras i största möjliga utsträckning som medges av lag.Preferred features of each aspect of the invention are as for each of the other aspects with appropriate modifications. The documents in the prior art mentioned herein are incorporated to the fullest extent permitted by law.

Uppﬁnningen beskrivs ytterligare i följande exempel i samband med de bilagda ritningama, som ej begränsar omfånget av uppﬁnningen pà något sätt. Utföringsforrner av föreliggande uppfinning beskrives sålunda mer i detalj med hjälp av exempel hos utföringsformer och figurer, varvid det enda syftet hos dessa är att belysa uppfinningen och är ej på något sätt avsedda att begränsa dess utsträckning.The invention is further described in the following examples in connection with the accompanying drawings, which do not limit the scope of the invention in any way. Embodiments of the present invention are thus described in more detail by means of examples of embodiments and figures, the sole purpose of which is to illustrate the invention and are not in any way intended to limit its scope.

Beskrivning av figurer Figur 1 belyser allogena monocyter som bärare för tumörantigen.Description of figures Figure 1 illustrates allogeneic monocytes as carriers for tumor antigen.

Figur 2 belyser vaccinkonceptet enligt föreliggande uppfinning.Figure 2 illustrates the vaccine concept of the present invention.

Figur 3 belyser resultaten av förbehandling varvid man använder neuraminidas (NAS).Figure 3 illustrates the results of pretreatment using neuraminidase (NAS).

Figur 4 visar en optimal formel för in-vivo-propagering av mogna DCs bärandes fagocyterade tumörantigen, d v s en föredragen utföringsform av föreliggande uppfinning.Figure 4 shows an optimal formula for in-vivo propagation of mature DCs carrying phagocytosed tumor antigen, i.e. a preferred embodiment of the present invention.

Figur 5 visar att en subpopulation av CD83+/CD14-|ägre celler med en stark expression av B7.2 och HLA-DR, d v s fenotypiskt mogna DCs utvecklades efter 6 dagar under en så kallad envägs-MLR. Den övre grafen avbildar ett kontrollexperiment med enbart K:\Patent\1100-\11008\110081800\030BO8besk.doc . - . ~ .- 10 15 20 25 30 35 *S23 515 // - n ; . .Q medium efter 6 dagar och grafen som uppträder nedan avbildar ett experiment varvid man använder supernatant efter 6 dagar.Figure 5 shows that a subpopulation of CD83 + / CD14- | lower cells with a strong expression of B7.2 and HLA-DR, i.e. phenotypically mature DCs developed after 6 days during a so-called one-way MLR. The upper graph depicts a control experiment with only K: \ Patent \ 1100- \ 11008 \ 110081800 \ 030BO8besk.doc. -. ~ .- 10 15 20 25 30 35 * S23 515 // - n; . .Q medium after 6 days and the graph that appears below depicts an experiment using supernatant after 6 days.

Figur 6 visar att det var möjligt att erhålla DCs från en monocytpopulation genom att odla monocyter i ett odlingsmedium där supernatanten från en MLR-odling, också benämnd ett MLR-använt medium (MLR-CM), hade tillsatts (50%). Resultaten från dag 0 till dag 8 belyses där graferna på den vänstra sidan avbildar kontrollexperiment och graferna som uppträder på den högra sidan avbildar experiment varvid man använde supernatant från en MLR odling.Figure 6 shows that it was possible to obtain DCs from a monocyte population by culturing monocytes in a culture medium where the supernatant from an MLR culture, also called an MLR-used medium (MLR-CM), had been added (50%). The results from day 0 to day 8 are illustrated where the graphs on the left side depict control experiments and the graphs that appear on the right side depict experiments using supernatant from an MLR culture.

Figur 7 visar cytokinproﬁlen bestämd i en MLR-CM varvid man använde Luminex.Figure 7 shows the cytokine profile determined in an MLR-CM using Luminex.

Exempel Exemgel 1: Framställning av monocyter från leukocyter Monocyter kan erhållas varvid man använder perifert blod av en människa. Denna metod inkluderar följande steg: (a) tillhandahållande av en vit blodcellfraktion erhållen från en human källa genom Ieukaferes; (b) separerande av den vita blodcellsfraktionen i steg (a) i fyra eller flera subfraktioner genom motströms centrifugal elutriation. Monocyter kan också utvinnas från PBMC genom elutriation. Ficoll och Percoll gradienter eller genom deras förmåga att fästa vid plast. Negativ selektion av monocyter varvid man använder magnetiska kulor sammanbundna till vissa antikroppar tillgängliga frán Dynal eller Miltenyi är också möjlig.Example Example gel 1: Preparation of monocytes from leukocytes Monocytes can be obtained using the peripheral blood of a human. This method includes the following steps: (a) providing a white blood cell fraction obtained from a human source by Ieukaferesis; (b) separating the white blood cell fraction in step (a) into four or more subfractions by countercurrent centrifugal elutriation. Monocytes can also be recovered from PBMC by elutriation. Ficoll and Percoll gradients or by their ability to adhere to plastic. Negative selection of monocytes using magnetic beads linked to certain antibodies available from Dynal or Miltenyi is also possible.

Modifiering av monocyter Monocyterna kan sedan genomgå pulsningsbehandling varvid monocyterna behandlas (inkuberas) i en lösning med rent lösligt tumörprotein (antigen) vid en proteinkoncentration på 1-10 mg/ml under 3 timmar vid 37°C. Pulsning kan också användas när antigenet är tumörcellysat erhållna t ex från a) upprepad hetta - upptining eller b) sonikering båda med senare centrifugering. Sedan mäts proteinkoncentrationen i supernatanten och justeras till 100-200 pm/ml.Modification of monocytes The monocytes can then undergo pulsation treatment in which the monocytes are treated (incubated) in a solution with pure soluble tumor protein (antigen) at a protein concentration of 1-10 mg / ml for 3 hours at 37 ° C. Pulse can also be used when the antigen is tumor cell lysate obtained, for example, from a) repeated heat thawing or b) sonication both with later centrifugation. Then the protein concentration in the supernatant is measured and adjusted to 100-200 pm / ml.

Monocyter kan dessutom fuseras (varvid man använder PEG, d v s polyetylenglykol, som fusionskemikalie; PEG-lösningen är företrädesvis 50% och utspäds senare) med tumörceller vilket sålunda skapar odödliga celler (hybrider) och sålunda vacciner. Fusionen utförs mellan allogena tumörceller och allogena monocyter från en andra part (se vidare nedan). Transfektion med gener kodande för antigen kan också användas för att skapa modiﬁerade monocyter, d v s vacciner (se figur 1 och 2).In addition, monocytes can be fused (using PEG, i.e. polyethylene glycol, as the fusion chemical; the PEG solution is preferably 50% and diluted later) with tumor cells thus creating immortal cells (hybrids) and thus vaccines. The fusion is performed between allogeneic tumor cells and allogeneic monocytes from a second party (see further below). Transfection with genes encoding antigen can also be used to create modified monocytes, i.e. vaccines (see Figures 1 and 2).

Neuraminidas (NAS) behandling De modifierade monocyterna kan behandlas med 25 mU/ml av NAS. NAS- behandlingen har visats öka de ﬂesta av kemokinernalcytokinerna (se figur 3). Monocyterna kan också förtransfekteras med en lämplig gen kodande för en NAS, t ex fràn V.ko|erae.Neuraminidase (NAS) treatment The modified monocytes can be treated with 25 mU / ml of NAS. NAS treatment has been shown to increase most of the chemokinernal cytokines (see Figure 3). The monocytes can also be pre-transfected with a suitable gene encoding a NAS, eg from V.ko | erae.

K:\Patent\1 100-\1 1008\110081800\030808b6Sk.d0C ...- 10 15 20 25 30 35 . . ; . .n 523 515 /2 . a ; . .- Effekt av neuraminidas (NAS)-behandling på direkt alloigenkänning och på kemokinlcytokinproduktion Det har varit känt under längre än en dekad att behandling av stimulator-APC med neuraminidas, vilket leder till avlägsnande av sialinsyra på cellmembranet, signiﬁkant ökar dess förmåga att simulera allogena T-celler i en allogen MLR. Det har antytts att ökat cellulärt vidhäftande inducerat av ökad cellyteladdning är en trolig orsak hos denna neuraminidaseffekt. Det har också föreslagits att en neuraminidasbehandlad APC skulle kunna tillhandahålla viss oidentiﬁerad tillgänglighetsfaktor krävd av T-celler för aktivering. Det har nu observerats att allogena perifera blodmononukleära celler (PBMC) behandlade med NAS från Vibrio kolerae (25 mU/ml) inducerar en starkt proliferativ respons bland responder- T-celler i en envägs MLR jämfört med obehandlade PBMC. Dessutom, genom att mäta kemokin- och cytokinproduktion under en envägsallogen MLR upptäcktes att MlP-alfa, RANTES, IL1-beta, TNF-alfa och lFN-gamma framställs i flerfaldigt högre mängder när stimulatorceller (bestrålade monocyter) har behandlats med NAS (ﬁgur 3).K: \ Patent \ 1 100- \ 1 1008 \ 110081800 \ 030808b6Sk.d0C ...- 10 15 20 25 30 35. . ; . .n 523 515/2. a; . Effect of neuraminidase (NAS) therapy on direct allogeneic recognition and on chemokine / cytokine production It has been known for more than a decade that treatment of stimulator APC with neuraminidase, leading to the removal of sialic acid on the cell membrane, significantly increases its ability to simulate allogeneic T cells in an allogeneic MLR. It has been suggested that increased cellular adhesion induced by increased cell surface charge is a likely cause of this neuraminidase effect. It has also been suggested that a neuraminidase-treated APC could provide some unidentified availability factor required by T cells for activation. It has now been observed that allogeneic peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) treated with NAS from Vibrio cholerae (25 mU / ml) induce a strong proliferative response among responder T cells in a one-way MLR compared to untreated PBMCs. In addition, by measuring chemokine and cytokine production during a one-way allogeneic MLR, it was found that MIP-alpha, RANTES, IL1-beta, TNF-alpha and IFN-gamma are produced in multiples of higher amounts when stimulator cells (irradiated monocytes) have been treated with NAS (ﬁ gur 3 ).

Hypertermi Hypertermi (värmestressbehandling) av modiﬁerade celler kan utföras genom att utsätta de modifierade monocyterna för upphettning vid 40°C under 3 timmar.Hyperthermia Hyperthermia (heat stress treatment) of modified cells can be performed by subjecting the modified monocytes to heating at 40 ° C for 3 hours.

Feberbehandlingen har vidare visats att uppreglera mängden av HSP-kopplat tumörantigen (i lysosomet och/eller i cytoplasma) inom monocyterna. Denna behandling har också visats öka mängden av immunogena tumörpeptider. Presentationen påverkas ej negativt.The fever treatment has also been shown to upregulate the amount of HSP-linked tumor antigen (in the lysosome and / or in the cytoplasm) within the monocytes. This treatment has also been shown to increase the amount of immunogenic tumor peptides. The presentation is not negatively affected.

Effekten av värmestress på direkt alloigenkänning Cytosola vårmechockproteiner (HSP) under värmestress och det är väl etablerat att HSP-förenade peptider blir mer immunogena in vivo. Detta är förmodligen beroende på ett mer effektivt upptag av DC (receptormedierad endocytos/fagocytos). Dessutom har vissa HSPs visats inducera mogning av omogna DC in vitro. Man har funnit att en mild hypertennisk stress (41°C under 2 timmar), känd för att inducera en väsentlig uppreglering av oellulär HSP- expression ej negativt påverkar den stimulatorlska kapaciteten hos bestrålad PBMC för att liksom lysosomala proteiner år kända att vara förenade med inducera allogena T-cellsresponser såsom bestämts genom proliferation i en envägs MLR (figur 4).The effect of heat stress on direct allo recognition Cytosola heat shock proteins (HSP) under heat stress and it is well established that HSP-linked peptides become more immunogenic in vivo. This is probably due to a more efficient uptake of DC (receptor-mediated endocytosis / phagocytosis). In addition, some HSPs have been shown to induce maturation of immature DC in vitro. It has been found that a mild hypertensive stress (41 ° C for 2 hours), known to induce a significant upregulation of oellular HSP expression, does not adversely affect the stimulatory capacity of irradiated PBMC to induce, like lysosomal proteins, to be associated with inducing allogeneic T cell responses as determined by proliferation in a one-way MLR (Figure 4).

Fenotypiska studier genom FACS och cytokinlkemokinmätningar Tidigare studier av andra har visat att monocytanvânt medium (supernatanter tagna från monocytodlingar aktiverade av deras Fc-receptorer) liksom T-cellanvänt medium (supernatanter tagna från T-cellsodlingar aktiverade genom stimulering med anti-CD3 antikroppar) effektivt inducerar DC mogning. Vår hypotes var att immuninteraktionen mellan allogena monocyter och responder-T-celler leder till framställning av en kemokin/cytokin ”cocktail” som också kunde inducera en slutlig mogning av omogen DC in vitro. Genom att K:\Patent\1 100-\11008\11006180U\030BOBbeSk.d0c 10 15 20 25 30 35 s n n n en v »523 5,15 /3 utföra primära fenotypiska studier under en traditionell MLR upptäcktes ett intressant fenomen. Under en så kallad envägs-MLR (bestrålade stimulatorceller) men e] under en tvåvägs MLR eller under stimulering med nekrotisk eller apoptotisk allogen PBMC utvecklades en subpopulation av CD83+/CD14 lägre celler med en stark expression av B7.2 och HLA-DR d v s fenotypiskt mogna DCs efter 6 dagar. Resultaten belyses i ﬁgur 5 där den övre grafen avbildar kontrollexperiment med enbart medium efter 6 dagar och grafen som uppträder nedan avbildar ett experiment varvid man använde supernatant efter 6 dagar.Phenotypic studies by FACS and cytokine chemokine measurements Previous studies of others have shown that monocyte-used medium (supernatants taken from monocyte cultures activated by their Fc receptors) as well as T-cell-used medium (supernatants taken from T-cell cultures activated by stimulation with anti-CD3 antibodies) effectively induce DC maturation. Our hypothesis was that the immune interaction between allogeneic monocytes and responder T cells leads to the production of a chemokine / cytokine "cocktail" that could also induce a final maturation of immature DC in vitro. By performing primary phenotypic studies during a traditional MLR, an interesting phenomenon was discovered by performing primary phenotypic studies under a traditional MLR. During a so-called one-way MLR (irradiated stimulator cells) but e] during a two-way MLR or during stimulation with necrotic or apoptotic allogeneic PBMC, a subpopulation of CD83 + / CD14 lower cells developed with a strong expression of B7.2 and HLA-DR ie phenotypically mature DCs after 6 days. The results are illustrated in Figure 5 where the upper graph depicts control experiments with medium only after 6 days and the graph that appears below depicts an experiment using supernatant after 6 days.

Dessa celler utvecklades från en population av ickebestrålade responderceller. Dessutom upptäcktes det att det var möjligt att erhålla sådana DCs från en monocytpopulation genom att odla monocyterna i ett odlingsmedium där supernatanten från en MLR-odling, också benämnd som MLR använt medium (MLR-CM), hade tillsatts (50%). Resultaten från dag 0 till dag 8 belyses i figur 6 där graferna till vänster avbildar kontrollexperiment och graferna som uppträder på den högra sidan avbildar experiment varvid man använder supernatant från en MLR-odling. Tillsats av MLR-CM inducerade också en slutlig mogning av monocyt- härrörande omogna DCs som hade framställts genom att odla i GM-CSF/iL-4 innehållande medium. Av speciellt intresse är att en hög expression av CCR7 kunde visas på dessa mogna DCs som är av central vikt för migrering till regionala lymfkörtlar. Genom att använda multianalyt proﬁleringsteknik (Luminex) bestämdes cytokinproﬁlen i en MLR-CM och flera cytokineråmed känd effekt pà monocytdifferentiering och mogning hos DCs hittades vilket inkluderade TNF-alfa, IFN-gamma, IL-1 beta. Resultaten avbildas i ﬁgur 7. Dessutom framställes flera kemokiner vilket inkluderar MIP-1 alfa. Genom förbehandling av de stimulatoriska cellerna med neuraminidas (NAS) från Wbrio cholerae àstadkoms en ytterligare ökning av kemokinlcytokinproduktionen i en MLR (se ﬁgur 3).These cells evolved from a population of non-irradiated responder cells. In addition, it was discovered that it was possible to obtain such DCs from a monocyte population by culturing the monocytes in a culture medium where the supernatant from an MLR culture, also referred to as MLR used medium (MLR-CM), had been added (50%). The results from day 0 to day 8 are illustrated in Figure 6 where the graphs on the left depict control experiments and the graphs that appear on the right side depict experiments using supernatant from an MLR culture. Addition of MLR-CM also induced a final maturation of monocyte-derived immature DCs that had been prepared by culturing in GM-CSF / iL-4 containing medium. Of particular interest is that a high expression of CCR7 could be shown on these mature DCs which are of central importance for migration to regional lymph nodes. Using multi-analyte proliferation technique (Luminex), the cytokine profile was determined in an MLR-CM and several cytokine ratios with known effect on monocyte differentiation and maturation in DCs were found which included TNF-alpha, IFN-gamma, IL-1 beta. The results are depicted in Figure 7. In addition, several chemokines are prepared which include MIP-1 alpha. By pretreating the stimulatory cells with neuraminidase (NAS) from Wbrio cholerae, a further increase in chemokine / cytokine production was achieved in an MLR (see Figure 3).

För att sammanfatta kan upptäckten ovan väl förklara varför viabla passenger APCs är så viktiga för alloimmunisering. Den förbildade T-cellsreaktiviteten mot direkt presenterat alloantigen på dessa celler leder sålunda till en fördelaktig miljö för rekrytering och lokal mogning av DCs hos den transplanterade individen. Denna ackumulering och mognad av DCs är ett fördelaktigt krav för en senare effektiv priming av naiva alloreaktiva T-celler (som igenkänner allopeptider via den indirekta rutten) i sekundära lymfoida organ.To summarize, the above finding may well explain why viable passenger APCs are so important for alloimmunization. The preformed T cell reactivity to directly presented alloantigen on these cells thus leads to a favorable environment for recruitment and local maturation of DCs in the transplanted individual. This accumulation and maturation of DCs is an advantageous requirement for a later efficient priming of naive alloreactive T cells (which recognize allopeptides via the indirect route) in secondary lymphoid organs.

Etablering av monocytomcellinjer genom fusion av humancancercellinjer med allogena perifera blodmonocyter Humana tumörcellinjer (TCLs) inkluderande bröstcancercellinje MCF7 och prostatacellinje DU 145, köpt från American Tissue Culture Collection, kan användas. TCLs kan odlas i RPMI 1640 medium supplementerat med 10% värmeinaktiverat humant AB serum. 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 mikrogram/ml streptomycin tills fusion. isolerade allogena perifera blodmonocyter från friska blodgivare kan inkuberas med TCL under 5 minuter vid ett förhållande av 10:1 i serumfritt RPMI 1640 medium innehållande 50% K2\Patenl\1 100-\11008\1 10081800\03080Bbesk.d0c k... . . - ~ -~ 10 15 20 25 30 35 523 515 /9 polyetylenglykol (PEG). RPM! 1640 tillsätts sedan långsamt för att späda ut PEG. Efter tvättning och eliminering av ofuserade celler genom densitetsgradient kan monocytomerna återsuspenderas i RPMI 1640 medium supplementerat med humant AB serum, L-glutamin, penicillin och streptomycin såsom nämnts ovan.Establishment of monocytoma cell lines by fusion of human cancer cell lines with allogeneic peripheral blood monocytes Human tumor cell lines (TCLs) including breast cancer cell line MCF7 and prostate cell line DU 145, purchased from the American Tissue Culture Collection, can be used. TCLs can be grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% heat-inactivated human AB serum. 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin and 100 micrograms / ml streptomycin until fusion. isolated allogeneic peripheral blood monocytes from healthy blood donors can be incubated with TCL for 5 minutes at a ratio of 10: 1 in serum-free RPMI 1640 medium containing 50% K2 \ Patenl \ 1 100- \ 11008 \ 1 10081800 \ 03080Bbesk.d0c k .... . - ~ - ~ 10 15 20 25 30 35 523 515/9 polyethylene glycol (PEG). RPM! 1640 is then added slowly to dilute the PEG. After washing and elimination of unfused cells by density gradient, the monocytomas can be resuspended in RPMI 1640 medium supplemented with human AB serum, L-glutamine, penicillin and streptomycin as mentioned above.

Selektion av monocytoma cellinjer från icke-hybrida celler Frambringandet av cellhybrider kan utföras i analogi med frambringandet med hybridom framställande monoklonala antikroppar. Detta stödjer sig på att HGPRT kan fuseras för både positiv och negativ selektion. l ett första skede, kan 6-tioguanln användas för att selektera cancercelllnjer som har muterat HGPRT-genen. Denna kemikalie överförs till en toxisk intermediär genom HGPRT genprodukt. De muterade cellerna fuseras sedan till monocyterldendritceller varvid man använder PEG eller elektrofusion och när de _odlas sedan i HAT medium kommer enbart fuserade celler att överleva. Detta beror på att HAT medium kommer att döda cancerceller som saknar HGPRT gen och att monocyter/dendritceller ej är långlivade i odling fastän de har en aktiv gen. ln vitro priming av humana Th1 celler mot tumör antigen Förmågan hos en primär allogen MLR att inducera en substantiell priming av antigenspeciﬁka CD4+ Th1 celler kan säkerställas (som) följer: Monocyter kan pulsas med enedera lösliga tumörproteiner (1-10 mg/ml under 3 timmar) vilket inkluderar lösligt antigen fràn prostata (PSA) och cancerantigen (CA)-125 eller upprepade frystinade tumörcellslysat (100-200 mikrogram cancercellprotein/ml under 3 timmar) från tumörcellinjer inkluderande bröstcancer och prostatacancerceller. Efter tvättning och gammastrålning kan de pulsade monocyterna användas som stimulatoriska celler i en primär MLR varvid man använder allogen PBMC som responders. Efter 6 dagar kan cellodlingen tvättas och återinsättas i färskt odlingsmedium innehållande 10 U/ml interleukin (lL)-2. Två dagar senare kan cellerna från den primära MLR àterstimuleras genom att tillsätta bestrålad PBMC, autolog med responderceller i den primära MLR, pulsad med antigenet som användes under den primära MLR. Antalet CD4+ Th1 celler som primades under den primära MLR kan sen registreras 1-2 dagar senare varvid man använder en ELISPOT analys specifik för IFN-gammaproducerande celler. Genom att använda samma analysprincip kan förmågan hos allogena monocytomer för att prima CD4+ TH1 celler varvid man använder en primär MLR studeras efter återstimulering med autologa PBMC pulsade med ett cellysat från monocytomer använda i primär MLR.Selection of monocytoma cell lines from non-hybrid cells The generation of cell hybrids can be performed in analogy to the generation of hybridoma-producing monoclonal antibodies. This is based on the fact that HGPRT can be fused for both positive and negative selection. In a first step, the 6-thioguanine can be used to select cancer cell lines that have mutated the HGPRT gene. This chemical is transferred to a toxic intermediate through the HGPRT gene product. The mutated cells are then fused to monocyte dendritic cells using PEG or electrofusion and when cultured in HAT medium, only fused cells will survive. This is because HAT medium will kill cancer cells that lack the HGPRT gene and that monocytes / dendritic cells are not long-lived in culture even though they have an active gene. In vitro priming of human Th1 cells against tumor antigen The ability of a primary allogeneic MLR to induce a substantial priming of antigen-specific CD4 + Th1 cells can be ensured (as follows): Monocytes can be pulsed with either soluble tumor proteins (1-10 mg / ml for 3 hours ) which includes soluble prostate antigen (PSA) and cancer antigen (CA) -125 or repeated freeze-thawed tumor cell lysates (100-200 micrograms cancer cell protein / ml for 3 hours) from tumor cell lines including breast cancer and prostate cancer cells. After washing and gamma radiation, the pulsed monocytes can be used as stimulatory cells in a primary MLR using allogeneic PBMC as responders. After 6 days, the cell culture can be washed and reinserted in fresh culture medium containing 10 U / ml interleukin (II) -2. Two days later, the cells from the primary MLR can be restimulated by adding irradiated PBMC, autologous with responder cells in the primary MLR, pulsed with the antigen used during the primary MLR. The number of CD4 + Th1 cells primed during the primary MLR can then be recorded 1-2 days later using an ELISPOT assay specific for IFN-gamma-producing cells. Using the same assay principle, the ability of allogeneic monocytomas to prime CD4 + TH1 cells using a primary MLR can be studied after restimulation with autologous PBMC pulsed with a cell lysate from monocytomas used in primary MLR.

Olika utföringsformer av föreliggande uppfinning har beskrivits ovan men en fackman inom området inser vidare mindre förändringar, som skulle falla inom omfånget för föreliggande uppfinning. Bredden och omfånget hos föreliggande uppfinning bör ej begränsas av någon av ovannämnda exempelutformningar, utan bör definieras enbart i enlighet med följande krav och deras ekvivalenter. T ex kan någon av de ovannämnda Kt\Patent\1 100-\1 1008\1 10081800\030808beSk.d0C ..-~ ' . . i A523 515 /S kompositionerna och/eller metoderna kombineras med kända terapier eller kompositioner.Various embodiments of the present invention have been described above, but one skilled in the art will further recognize minor changes that would fall within the scope of the present invention. The breadth and scope of the present invention should not be limited by any of the above exemplary embodiments, but should be defined solely in accordance with the following claims and their equivalents. For example, any of the above-mentioned Kt \ Patents \ 1 100- \ 1 1008 \ 1 10081800 \ 030808beSk.d0C ..- ~ '. . in A523 515 / S the compositions and / or methods are combined with known therapies or compositions.

Andra aspekter, fördelar och modiﬁeringar inom omfånget av uppﬂnningen kommer att vara uppenbara för fackmännen inom området för vilka uppfinningen avser.Other aspects, advantages and modifications within the scope of the invention will be apparent to those skilled in the art to which the invention pertains.

K:\Patent\1 100-\1 1008\1 10081800\0308OBbeSk.d0cK: \ Patent \ 1 100- \ 1 1008 \ 1 10081800 \ 0308OBbeSk.d0c

Claims

10 15 20 25 30 35. n o o nu a t523 515 ¿:; g; - ~ 16 n. - Q ø a PATENT CLAIM

A method of preparing a cellular allogeneic vaccine comprising the steps of: a) providing an APC already established and / or isolated from a myeloid leukemia cell line; b) modifying APC with an antigen using any of the following methods: pulsation, transfection, infection or fusion; and c) treating APC with an agent capable of removing sialic acid from the surface of said APC; and optionally d) culturing the modified APC in a suitable medium. __

A method according to claim 1 comprising a further step between step a) and step b): culturing an APC, preferably a monocyte, or differentiating an APC, preferably a monocyte, in a suitable medium for monocyte-derived DC, macrophage or macrophage-derived DC.

A method according to claim 1 wherein the APC is an allogeneic monocyte or an in vitro differentiated cell derived directly or indirectly from an allogeneic monocyte.

A method according to claim 1 wherein the antigen as mentioned in step b) is a cancer antigen, preferably in the form of a soluble antigen, a tumor cell lysate or a viable tumor cell, all of which are of allogeneic origin.

A method according to claim 4 wherein step b) is performed by incorporating the antigen within the APC using any of the following methods: pulsing with soluble antigen or tumor cell lysate, transfection with genes encoding the antigen or fusion with an allogeneic tumor cell.

A method according to claim 1, wherein the agent capable of removing sialic acid from the cell surface of APC, as mentioned in step c), is neuraminidase (NAS), one or more genes encoding neuraminidase or neuraminidase-producing viruses or bacteria.

A method according to claim 6, wherein the treatment in step c) is performed by any of the following methods: treating APC with NAS, transfecting APC with genes encoding NAS or infecting APC with NAS-producing viruses or bacteria.

A method according to claim 1 comprising a further step in which APC is subjected to hyperthermia during step b) or between steps b) and c).

A method according to claim 8 wherein the hypertension is performed at a temperature of from 39 to 42 ° C and for from 2 to 6 hours.

A cellular allogeneic vaccine obtainable by a method according to any one of claims 1 to 9. K: \ Patent \ 1 100- \ 11008 \ 110081800 \ 030812pkrav.d0C ...-,. ø - .a .. .. _ f '' '.... .u n. 0 0' °. .qn- i: * "...,... - - - - - 'I'... - - ~ - 'Z -' u n .. u» U. - v ~ *., g ', .. - ~ ~ __ ~,. .. - - ~ - H. Uu ~ ° 'I?

A composition comprising a vaccine according to claim 10 and a pharmaceutically acceptable carrier.

A frozen container comprising a composition according to claim 11.

A vaccine according to claim 10 for medical use.

Use of a vaccine according to claim 10 for the manufacture of a medicament for use in cancer. K: \ Pat6nt \ 1 100- \ 1 1008 \ 110081800 \ O30812pkrav.d0c