CN109370992A - 一种通用型car-t细胞的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CAR‑T细胞的制备领域，具体而言，涉及一种通用型CAR‑T细胞的纯化方法。一种通用型CAR‑T细胞的纯化方法，包括以下步骤：通用型CAR‑T细胞在含有靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物的培养基中培养，得到纯化的通用型CAR‑T细胞。本发明提供的通用型CAR‑T细胞的纯化方法，选择性敲除T细胞的内源T细胞受体的ɑ链和β2微球蛋白(MHC I类分子)的编码基因编码；然后利用偶联小分子毒性药物的单克隆抗体(CD3单抗或TCR单抗及B2M单抗)靶向未敲除TCR和B2M的CAR‑T细胞，诱导细胞凋亡，从而获得高纯度的通用型CAR‑T细胞。

Description

一种通用型CAR-T细胞的纯化方法
技术领域
本发明涉及CAR-T细胞的制备领域，具体而言，涉及一种通用型CAR-T细胞的纯化方法。
背景技术
2017年8月以来美国FDA先后批准靶向CD19的两个CAR-T产品上市(诺华制药的kyriamh和凯特制药的yescarta)，因此CAR-T细胞在血液病肿瘤治疗的需求不断升高。但是目前过继性细胞治疗还是基于自体细胞的回输治疗方式，每个患者都有单独制备CAR-T细胞，操作复杂，生产制备成本非常昂贵，诺华制药kyriamh产品的上市价格为每例47.5万美元，凯特制药的yescarta价格也要37.5万美元。大部分肿瘤患者在进行CAR-T细胞治疗前均经过反复多次的其他方式治疗，尤其是放化疗，这就导致从其外周血获得的T淋巴细胞非常少，且这些T淋巴细胞在体外非常难扩增，制备自体CAR-T细胞也非常困难。另外，不少婴幼儿患者无法和重症患者在制备CAR-T细胞前无法从患者外周血获得足够的T淋巴细胞。因此，同种异体CAR-T细胞(即通用型CAR-T细胞)既能极大的降低CAR-T细胞的生产成本，也能为无法制备自体CAR-T细胞的患者提供治疗机会。通用型CAR-T细胞治疗比自体CAR-T细胞治疗有天然的优势，因此其研究开发越来越受到关注。
随着基因编辑技术的不断完善，敲除T细胞的TCR基因或同时敲除TCR基因和B2M基因的效率已越来越高。但基因编辑操作对T细胞的状态和生长速度有很大的影响，一般TCR基因和B2M基因的敲除效率越高，基因编辑后的T细胞状态越差、细胞生长速度越慢。因此为了兼顾二者平衡，在通用型CAR-T细胞制备过程中会将TCR和B2M基因敲除效率控制在一定程度。如此以来，制备的通用型CAR-T细胞如果要用于临床细胞治疗，就必须去除未敲除TCR和B2M基因的T细胞。否则，临床应用时会导致移植物抗宿主病(GvHD)或宿主抗移植物病(HvGD)。
T细胞表面的TCR分子与CD3分子形成复合物，目前常用的细胞纯化方法是将anti-CD3抗体交联到Dynabeads上，用此磁珠将TCR+的T细胞结合去除。但此纯化方法操作繁琐，CAR-T细胞回收率低，细胞状态差。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的CAR-T细胞纯化方法，通过靶向诱导使TCR+的CAR-T细胞凋亡，来达到纯化的目的。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种通用型CAR-T细胞的纯化方法，包括以下步骤：通用型CAR-T细胞在含有靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物的培养基中培养，得到纯化的通用型CAR-T细胞。
本发明提供的通用型CAR-T细胞的纯化方法，选择性敲除T细胞的内源T细胞受体的ɑ链和β2微球蛋白(MHC I类分子)的编码基因编码；然后利用偶联小分子毒性药物的单克隆抗体(CD3单抗或TCR单抗及B2M单抗)靶向未敲除TCR和B2M的CAR-T细胞，诱导细胞凋亡，从而获得高纯度的通用型CAR-T细胞。
小分子毒性药物，阿霉素(doxorubin，DOX)是一种周期非特异性抗癌药，对各期细胞均有作用，但对S期的早期最为敏感，M期次之，对G1期最不敏感。本药既含有脂溶性的蒽环配基，又有水溶性的柔红糖氨基，并有酸性酚羟基和碱性氨基，因此具有很强的抗癌活性。DOX是蒽环类抗生素，其部分分子结构可嵌入到DNA双链中形成稳定的复合物，影响DNA的结构和功能，阻止DNA和RNA的合成。
地塞米松是糖皮质激素中治疗急性淋巴白血病ALL的重要药物之一，其作用的基础依赖于糖皮质激素与糖皮质激素受体的相互作用。糖皮质激素广泛表达在各种实体肿瘤细胞表面。
进一步地，所述细胞毒性药物为细胞毒性小分子药物。
进一步地，所述细胞毒性小分子药物包括阿霉素、地塞米松。
进一步地，所述靶向TCR的抗体为靶向TCR的单抗。
进一步地，所述B2M抗体为B2M单抗。
进一步地，所述靶向TCR的单抗包括TCR单抗、CD3单抗中的任一种。
CD3分子由γ、δ、ε、ζ四种或γ、δ、ε、ζ和η五种多肽链组成。CD3分子以非共价键与T细胞抗原受体(TCR)组成TCR/CD3复合物，不仅参与TCR/CD3复合体的包浆内组装，而且通过各多肽链包浆区的免疫受体络氨酸活化基序传递抗原刺激信号。在T细胞成熟过程中，TCR/CD3复合体中任何一个亚单位缺陷，可能导致细胞功能低下，甚至引起临床症状。
OKT3单抗是ortho公司开发针对CD3分子ε链的单抗药物，可用于器官移植急性排异反应治疗。该抗体通过与所有成熟的T细胞相互作用，有效地抑制淋巴细胞的功能。
OKT3对T细胞的影响决定于T细胞所处的状态，对于处于静止期的T细胞，OKT3是其强有力的激活剂，可造成T细胞的有丝分裂和细胞因子的合成、分泌。而对于已活化的T细胞，OKT3能够通过细胞凋亡的方式，诱导T细胞死亡，即所谓激活诱导的细胞死亡。
进一步地，所述CD3单抗为针对CD3分子ε链的单抗。
优选地，所述CD3单抗为OKT3。
进一步地，所述靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物对所述通用型CAR-T细胞采用以下方法培养：
先用含有浓度均为0.2-0.3mg/ml的靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物的培养基培养2-3天，然后持续用含有浓度均为3-5mg/ml的靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物的培养基培养，得到纯化的通用型CAR-T细胞。
进一步地，含有浓度均为3-5mg/ml的靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物的培养基培养10天以上，优选为培养12-15天。
该培养的过程即是对含有未敲除TCR和B2M的CAR-T细胞的淘汰过程，通过诱导其凋亡，从而获得更高纯度的目的CAR-T细胞。
本发明为了满足CAR-T细胞的临床治疗需要，公开了通过靶向未敲除TCR和B2M的CAR-T细胞，诱导细胞凋亡，从而获得高纯度的通用型CAR-T细胞。特别地，利用CD3单抗和B2M单抗偶联细胞毒性小分子药物来纯化制备通用型CAR-T细胞的方法，将小分子毒性药物阿霉素或地塞米松偶联到CD3单抗和B2M单抗，利用单抗特异性靶向基因编辑操作时未敲除TCR和B2M的CAR-T细胞，诱导细胞凋亡，从而提高通用型CAR-T细胞的纯度，该方法制备的通用型CAR-T细胞纯度可达到临床应用要求。
进一步地，所述靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物均采用以下方法制备：
细胞毒性药物处理得到氧化型细胞毒性药物，经活化得到活化型细胞毒性药物，所述活化型细胞毒性药物加入抗体溶液中进行偶联，即得。
进一步地，所述活化型细胞毒性药物加入抗体溶液中，惰性气体保护下反应，然后加入乙醇胺反应，去除沉淀，透析，即可。
具体地，所述活化型细胞毒性药物加入抗体溶液中，惰性气体如氮气保护下反应，反应在低温下进行，一般在0-4℃，反应时间为2h左右，反应后缓慢升温至室温，继续反应24±4h，然后加入乙醇胺，反应20-40min，离心去除沉淀，上清液透析，即可。
活化型细胞毒性药物滴加到抗体溶液中，抗体一般是在缓冲液中存在，如pH为6.8左右的PB缓冲液。
进一步地，细胞毒性药物在酸性条件下进行氧化反应，得到氧化型细胞毒性药物；
所述氧化型细胞毒性药物进行活化反应，得到活化型细胞毒性药物。
进一步地，所述酸性条件为pH为3±0.5，所述氧化反应采用的氧化剂为KIO4。
其中，小分子毒性药物的重量与氧化剂的重量比优选为1:0.5-1.5。
氧化反应时，氧化剂以溶液的形式滴加到含有小分子毒性药物的溶液中。
进一步地，所述氧化反应为在惰性气体中避光反应。
进一步地，氧化反应的时间为22-25h。
进一步地，氧化反应完成后除去溶剂，经纯化得到所述氧化型细胞毒性药物。
氧化反应完成后，除去溶剂，可采用旋转蒸发除去溶剂，得到白色沉淀。
进一步地，所述纯化为：碱液溶解，然后调至酸性，抽滤，洗涤，干燥得到所述氧化型细胞毒性药物。
进一步地，所述NaOH溶液溶解沉淀，用强酸调节pH为1.5-2.5，室温放置1-3h，2-6℃放置过夜，抽滤，洗涤滤饼2-3次，用真空干燥。
NaOH溶液的浓度为0.02-0.1mol/L，强酸可采用盐酸或硫酸，浓度一般为0.5-2mol/L。
进一步地，所述活化为：所述氧化型细胞毒性药物溶解后，加入EDC和NHS反应，得到活化型细胞毒性药物。
其中，氧化型细胞毒性药物与EDC和NHS的摩尔比为1:2±0.2:2±0.2。
进一步地，所述氧化型细胞毒性药物在N,N-二甲基甲酰胺中溶解，溶解后浓度为0.02-0.03g/ml。
进一步地，所述反应在惰性气体保护下进行。
进一步地，所述反应的温度为0-2℃，反应的时间为3h以上。
本发明中，稀有气体包括但不限于氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气等。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供一种通用型CAR-T细胞的新型纯化方法，利用偶联小分子毒性药物(地塞米松或阿霉素)的单克隆抗体(CD3单抗或TCR单抗及B2M单抗)靶向未敲除TCR和B2M的CAR-T细胞，诱导细胞凋亡，从而获得高纯度的通用型CAR-T细胞。
(2)本发明提供的方法在通用型CAR-T细胞培养的过程中淘汰非目的细胞，方法简单，利于实施。
(3)本发明提供的通用型CAR-T细胞的纯化方法，纯度可达99.9％以上，回收率高，细胞仍保持良好的性能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例2中OKT3单抗偶联地塞米松示意图；
图2为本发明实施例3中CAR质粒图谱；
图3为本发明实施例3中pX330-spCAS9-HF1质粒图谱；
图4为本发明实施例3中双基因敲除的阴性对照组的细胞流式图；
图5为本发明实施例3中双基因敲除的阳性对照组的细胞流式图；；
图6为本发明实施例3中双基因敲除的样品组的细胞流式图；
图7为本发明实施例3中双基因敲除后的KO细胞初步纯化后的细胞分选图；
图8为本发明实施例3中本发明提供的方法进一步纯化后的细胞分选图；
图9为本发明实施例4中不同细胞检测膜表面活化分子CD25和CD69的刺激状态图；
图10为本发明实施例5中不同细胞的体外杀瘤效果曲线图；
图11为本发明实施例5中不同细胞体系中IL-2含量的柱形图；
图12为本发明实施例5中不同细胞体系中IFN-γ含量的柱形图；
图13为本发明实施例5中不同细胞的体内杀瘤效果动物图；
图14为本发明实施例5中不同细胞的体内杀瘤效果曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
人B2M单克隆抗体的制备
将重组B2M蛋白抗原(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)等量与弗氏佐剂(sigma，货号F5881)混合进行乳化。背部皮下多点免疫注射健康BALB/C小鼠(广东省实验动物中心，6周龄，雌性)；14天后腹腔加强免疫；四次加强免疫后采小鼠尾血进行效价检测，选取效价最高的小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。
小鼠末次免疫后第三天，在无菌条件取出小鼠脾脏，置于平皿中，RPMI1640(gibco，货号12633012)基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上研磨，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI1640培养液重悬。将脾细胞与提前准备好的小鼠骨髓瘤细胞SP20以10:1比例混合均匀，然后用1ml 50％的PEG1500(sigma，货号81210)进行细胞融合，融合1分钟后加入15ml的RPMI1640完全培养液终止细胞融合。1000rpm，离心5分钟，弃上清，用50ml的RPMI1640筛选培养液轻轻重悬，平分于10块96孔板，100μl/孔，37℃，5％CO2培养。培养至第6天，换HAT培养液两次。第二天取细胞上清，用人B2M抗原采用ELISA方法检测。检测阳性孔对应的细胞采取有限稀释法进行单克隆化；经过3次亚克隆，筛选获得多株能稳定分泌单抗的细胞株，其中一株B2M-2B1(CCTCC NO:C2013130)细胞株。
B2M-2B1杂交瘤细胞用RMPI1640培养液进行大规模培养，收获细胞上清，用蛋白G亲和层析柱(amersham bioscience公司)亲和纯化获得高纯度的B2M-2B1单抗。
实施例2
OKT3单抗偶联细胞毒性小分子药物(地塞米松)
1)氧化型地塞米松的合成
将0.1g的地塞米松(Dex，sigma公司)溶于20mL无水乙醇中，用2.5mol/L的H2SO4溶液调节pH＝3，滴加15mL的25mmol/L的KIO4溶液，在N2保护下避光反应24h，旋转蒸发除去溶剂得到白色沉淀，加入0.05mol/L的NaOH溶解沉淀,，用1mol/L HCl溶液调节pH＝2，室温放置2h，4℃放置过夜。抽滤，洗涤滤饼2次，用P2O5真空干燥即得产物氧化型地塞米松(O-Dex)。
2)活化型地塞米松的合成
将0.05g(约0.13mmol)O-Dex溶解于2ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.05g(约0.26mmol)EDC和0.03g(约0.26mmol)NHS，在N2保护下于0℃反应4h，得到活化的O-Dex溶液。
3)OKT单抗-地塞米松偶联物(OKT3-Dex)的合成
将2ml的活化O-Dex溶液逐滴加入10mg/ml的OKT3单抗溶液中(OKT3单抗buffer为pH6.8的PB缓冲液)，在N2保护下于0℃下搅拌反应2h，缓慢升温至室温，继续反应24h；加入0.5ml的2mol/l的乙醇胺，反应0.5h，离心去除沉淀，上清用DPBS透析2天，收集OKT3-Dex溶液，分装冻存备用。OKT3单抗偶联地塞米松示意图见图1。
4)B2M单抗-地塞米松偶联物(anti-B2M-Dex)的合成
同步骤3)制备得到B2M单抗偶联地塞米松(anti-B2M-Dex)。
实施例3
TCR/B2M基因敲除及细胞纯化
1)TCR/B2M基因敲除
在六孔板的孔中铺1×106个T细胞，CAR质粒图谱见图2，pX330-spCAS9-HF1质粒图谱见图3，在200μL的OPTI-MEM中加入1μgpX330-spCAS9-HF1-TRAC的TRAC sgRNA表达质粒，1μgpX330-spCAS9-HF1-B2M的B2M sgRNA表达质粒混合均匀，再加入4μLPEI或者6μLlipo2000试剂，混合均匀后室温静置15min，滴入孔中。6-8h后将细胞换回新鲜培养基培养。换液48h后通过流式细胞分选(FACS)分析TCR/B2M基因KO细胞比例，阴性对照如图4(标记物为β2M)所示，阳性对照如图5所示，该样品的检测如图6(横坐标标记物为TCRα/β，纵坐标标记物为β2M)所示。得到，TCR/B2M基因双敲除效率为61.33％。
此外，编辑工具还可以以RNA及RNP形式通过电转及病毒感染的方式进入细胞。
2)KO细胞初步纯化
取电转后培养4天后的细胞，离心，一定量DPBS重悬密度至1*10^8个/ml，加入100μl/ml CD3-biotin冰上避光孵育20min，再向其中加入PESlection cocktail至100μl/ml，避光孵育15min，抗PE磁珠加入量为50μl/ml，抗Biotin磁珠加入量为200ul/ml孵育10min，经MS柱收集流出的目的细胞。取2*10^5个/ml细胞利用APC-anti-human TCR a/β和PE-anti-human B2M抗体孵育15min流式检测细胞纯度。TCR/B2M基因敲除细胞纯度为84.78％(见图7)。
3)UCAR-T细胞的扩增及TCR/B2M基因未敲除T淋巴细胞的再次去除
KO细胞初步纯化后，将纯化后的细胞转入T225中培养，先用0.25mg/ml的OKT3-Dex和B2M-Dex培养基培养2天，然后将细胞转入2L培养袋中继续培养，同时持续续用5mg/ml的OKT3-Dex和B2M-Dex培养基培养，去除TCR/B2M基因未敲除T淋巴细胞的，培养至15天，检测UCAR-T细胞纯度，纯度99.93％(见图8)。
实施例4
通用型CAR-T细胞的纯度分析
本实施例中效应细胞为UCAR-T细胞、CAR-T细胞及T细胞(后两者为对照)，24孔板，每孔接种5.0*10^5个细胞，体积500μl，加PHA-P浓度2.5μg/ml，48h后检测膜表面活化分子CD25和CD69，结果通过两步纯化后通用型CAR-T(UCAR-T cells)不能被再次激活，对照明显被激活(见图9)。
实施例5
通用型CAR-T细胞的体外活性
本实施例中效应细胞为UCAR-T细胞、CAR-T细胞及T细胞(后两者为对照)，靶细胞为K562，K562-CD19(简称K19)，先利用cytocalceinTM violet 550对靶细胞进行染色，其次调整效应细胞密度为5*10^6个/ml，靶细胞密度为5*10^5个/ml，将上述效应细胞与靶细胞按照1：1，5：1及10：1加入96孔板中混匀共培养6h及24h，在上述时间段显微镜下观察凋亡情况，并将混合细胞离心，上清利用Human IL-2Ready-SET-Go！与Human IFN gamma ELISAReady-SET-Go！ELISA试剂盒检测IL-2及IFN-γ，沉淀部分用100ul binding buffer重悬，300g离心5min，添加1.2μlAPC-Annexin V和1.2μl PI染料，避光孵育15min，添加100μlbinding buffer流式检测凋亡效率，通用型CAR-T细胞的体外杀瘤效果(见图10)。图11和图12分别测定IL-2和IFN-γ的含量。
图中，K562细胞没有CD19，K19就是K562-CD19是带有CD19抗原的，T是T细胞，CART是未进行基因敲除的CART细胞，UCAR-T细胞也即KO细胞，是进行双基因敲除后经本发明的方法纯化后的CART细胞。
得到，UCAR-T细胞体外杀瘤效果：与常规CAR-T相当。
另外，还测定体内杀瘤效果：与常规CAR-T相当(见图13-14)。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种通用型CAR-T细胞的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：通用型CAR-T细胞在含有靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物的培养基中培养，得到纯化的通用型CAR-T细胞。
2.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的纯化方法，其特征在于，所述细胞毒性药物为细胞毒性小分子药物；
进一步地，所述细胞毒性小分子药物包括阿霉素、地塞米松。
3.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的纯化方法，其特征在于，所述靶向TCR的抗体为靶向TCR的单抗；
进一步地，所述B2M抗体为B2M单抗。
4.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的纯化方法，其特征在于，所述靶向TCR的单抗包括TCR单抗、CD3单抗中的任一种。
5.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的纯化方法，其特征在于，所述CD3单抗为针对CD3分子ε链的单抗；
优选地，所述CD3单抗为OKT3。
6.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的纯化方法，其特征在于，所述靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物对所述通用型CAR-T细胞采用以下方法培养：
先用含有浓度均为0.2-0.3mg/ml的靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物的培养基培养2-3天，然后持续用含有浓度均为3-5mg/ml的靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物的培养基培养，得到纯化的通用型CAR-T细胞。
7.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的纯化方法，其特征在于，含有浓度均为3-5mg/ml的靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物的培养基培养10天以上，优选为培养12-15天。
8.根据权利要求1-7任一项所述的通用型CAR-T细胞的纯化方法，其特征在于，所述靶向TCR的抗体偶联细胞毒性药物和B2M抗体偶联细胞毒性药物均采用以下方法制备：
细胞毒性药物处理得到氧化型细胞毒性药物，经活化得到活化型细胞毒性药物，所述活化型细胞毒性药物加入抗体溶液中进行偶联，即得；
进一步地，所述活化型细胞毒性药物加入抗体溶液中，惰性气体保护下反应，然后加入乙醇胺，去除沉淀，透析，即可。
9.根据权利要求8所述的通用型CAR-T细胞的纯化方法，其特征在于，细胞毒性药物在酸性条件下进行氧化反应，得到氧化型细胞毒性药物；
所述氧化型细胞毒性药物进行活化反应，得到活化型细胞毒性药物；
进一步地，所述酸性条件为pH为3±0.5，所述氧化反应采用的氧化剂为KIO4；
进一步地，所述氧化反应为在惰性气体中避光反应；
进一步地，氧化反应的时间为22-25h；
进一步地，氧化反应完成后除去溶剂，经纯化得到所述氧化型细胞毒性药物；
进一步地，所述纯化为：碱液溶解，然后调至酸性，抽滤，洗涤，干燥得到所述氧化型细胞毒性药物；
进一步地，所述NaOH溶液溶解沉淀，用强酸调节pH为1.5-2.5，室温放置1-3h，2-6℃放置过夜，抽滤，洗涤滤饼2-3次，用真空干燥。
10.根据权利要求8所述的通用型CAR-T细胞的纯化方法，其特征在于，所述活化为：所述氧化型细胞毒性药物溶解后，加入EDC和NHS反应，得到活化型细胞毒性药物；
进一步地，所述氧化型细胞毒性药物在N,N-二甲基甲酰胺中溶解；
进一步地，所述反应在惰性气体保护下进行；
进一步地，所述反应的温度为0-2℃，反应的时间为3h以上。
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