CN105112378B - Ph450酶的大量制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种PH450酶的大量制备方法，包括：获取蓝藻并进行大量培养，并在培养过程中用PH450酶诱导剂进行诱导；在大量培养结束后收集蓝藻细胞，提取蓝藻细胞总蛋白；用人PH450酶作为抗原进行免疫反应，制备多克隆抗体；以多克隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱；将提取的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱。本发明上述PH450酶的大量制备方法，基于蓝藻和人PH450酶在蛋白质的三维结构、活性功能几乎完全相同，且蓝藻代谢简单、易于诱导和分离的情形，将蓝藻诱导培养产物用PH450酶的特异性抗体进行亲和层析；相比现有的基因工程菌发酵制备的方法，本发明大量制备的PH450酶是蓝藻细胞代谢中产生的活性酶，品质比较好具有活性；而且纯化分离过程简单，方法的效益更高。

Description

PH450酶的大量制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质提取技术领域，具体涉及一种PH450酶的大量制备方法。

背景技术

PH450色素代谢酶系，或者又称CYPH450酶、P450酶，是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，多位于细胞内质网上，催化多种内、外源物质的（包括大多数临床药物）代谢，因为分光光度法测得的吸收峰在450nm附近，故名。其主要分布在SER（内质网膜）中，但也存在于质膜、线粒体、高尔基体、过氧化物酶体、核膜等细胞器的膜中，具有解毒作用，通常可将脂溶性有毒物质，代谢为水溶性物质，使有毒物质排出体外。由于其作为一种末端加氧酶，参与了生物体内的解毒、甾醇类激素合成等过程，还是药物代谢过程中的关键酶，而且对细胞因子和体温调节都有重要影响；并且，其色素代谢功能可以迅速溶解和代谢皮肤各层次各种色数及毒素，打通皮肤排毒通道；所以在药物辅助吸收和面部色素清除等产品中均有广泛的应用。

目前，由于本身PH450酶发现是大量存在于人的肝脏中，虽然后续也发现了细菌、真菌及动植物中有其存在，比较难以自然地通过除杂并分离大量制备得到；为了满足大量应用的要求，大量进行PH450酶制备的过程一般是通过构建PH450酶基因工程菌的方式在体外进行大量表达获得。但是这一方式进行制备的过程中，由于表达的基因工程菌是根据基因序列表达获得PH450酶蛋白产物，由于不存在体内代谢过程中的表达后的功能修饰步骤，所以这一种方式制备得到的PH450酶的活性和品质大大降低，远无法达到高品质应用的要求。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种从蓝藻中进行具有完整生物活性PH450酶的大量制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种PH450酶的大量制备方法，包括如下步骤：

获取蓝藻并进行大量培养，并在培养过程中用PH450酶诱导剂进行诱导；

在所述大量培养结束后收集蓝藻细胞，提取蓝藻细胞总蛋白；

用人PH450酶作为抗原进行免疫反应，制备多克隆抗体；

以所述多克隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱；

将所述提取的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱。

本发明上述PH450酶的大量制备方法，基于蓝藻和人PH450酶在蛋白质的三维结构、活性功能几乎完全相同，且蓝藻代谢简单、易于诱导和分离的情形，将蓝藻诱导培养产物用PH450酶的特异性抗体进行亲和层析；相比现有的基因工程菌发酵制备的方法，本发明大量制备的PH450酶是蓝藻细胞代谢产生的在经过细胞内功能修饰的活性酶，品质比较好；而且纯化分离过程简单，方法的效益更高。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为人类CYP2C9与细菌CYPH450 BM3晶体结构的重叠图；

图2为本发明实施例以蓝藻培养物进行层析之后洗脱组分进行SDS-PAGE电泳银染的示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种PH450酶的大量制备方法，包括如下步骤：

S10，将蓝藻进行大量培养，并在培养过程中用PH450酶诱导剂进行诱导；

S20，步骤S10的大量培养完成之后，提取蓝藻细胞总蛋白；

S30，以人PH450酶作为抗原进行免疫反应，制备多克隆抗体；

S40，以多克隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱；

S50，将步骤S20提取的蓝藻细胞总蛋白于步骤S40的亲和层析柱进行过柱。

本发明的上述方法，其制备的过程以蓝藻大量诱导培养，在蓝藻代谢的过程中大量产生细胞修饰的PH450酶，其具有完全的生物活性结构；然后再用层析柱的方式，用免疫制备的能与PH450酶特异性结合的多克隆抗体进行分离和收集，便可以在保持高活性的基础上直接得到纯度较高的PH450酶相比现有的方法不需要进行繁琐的化学提纯步骤，更加简便。

而其中上述发明实施的过程中，基于蓝藻是具有大量色素合成的原核细胞，其自身代谢中就具有较多的PH450酶，并且进一步采用诱导的方式进一步提升大量表达产生PH450酶量；同时蓝藻相比人肝细胞、植物细胞，更容易在体外进行大量培养和扩增，而且其代谢过程表达的蛋白类型较人肝细胞、植物细胞更少，更利于产物的分离和纯化。之后，再采用人PH450酶作为抗原进行免疫反应，就可以得到针对人PH450酶产生的特异性亲和吸附的多克隆抗体。

而进一步上述人PH450酶作为抗原产生的特异性多克隆抗体，能进行特异性吸附分流蓝藻的PH450酶其机理在于，不同的物种之间的细胞色素CYPH450超家族是从一个共同祖先基因衍生进化而来，虽然不同种属间CYPs的一级氨基酸序列差异大，但其螺旋结构和疏水性特征存在高度保守性，最终蛋白的三维结构是具有非常高的相似度的；经典的PH450C末端的血红素结合区，有一高度保守的F22G222G2G结构，这一基元(motif)常被用作鉴定PH450蛋白的主要特征。与膜结合的微粒体PH450N末端有一疏水序列作为跨膜信号，在此疏水序列内有三个区域(氨基酸带负电荷)，紧接此区还有一富含Pro的区域也相当保守，在所有生物中具有同源性不同PH450形成螺旋倾向的位置十分匹配。比如，图1所示的是人类CYP2C9（PH450酶系中的一个大亚型）与细菌CYPH450 BM3晶体结构的重叠图；从图1中可以看出人所表达的CYP2C9与细菌表达的CYPH450 BM3在蛋白质的三维结构空间结构簇上是几乎完全相同的。所以本发明基于人PH450酶免疫得到的特异性抗体，也能够特异性吸附蓝藻大量产生的PH450酶。

在上述基础上，采用免疫亲和层析的方式分离得到的蓝藻PH450酶，是在蓝藻中表达后的经过细胞功能修饰之后的得到的具有成熟螺旋结构和活性构象的PH450酶，相比PH450酶基因工程菌的方式在体外进行大量表达获得的PH450酶具有更好的品质。

其中，上述步骤S10中对蓝藻进行培养，培养过程的实施方式采用BG-11培养基即可，当然培养的过程中，为了在短期内获得大量的诱导培养物，可以采用光照通气培养和摇床培养进行；通气培养可以通CO₂或洁净的空气，视培养物的多少来决定通气泵的大小，在通气的硅胶管中设置一个缓冲瓶，塞上灭菌后的脱脂棉，帮助净化空气，如果对通气有更高的要求，可以在通气管中加上一层滤膜。

培养的过程中，同时培养的过程中进一步用诱导剂提升蓝藻PH450酶的表达量，根据现有的不同的亚型所对应的最适诱导剂类型的表：

在培养的过程中采用利福平和依非韦伦两者结合进行诱导，因为2C系列和3A系列是PH450酶中占比量最多（其中3A亚型占30%左右、2C系列亚型占比12%左右）的两个亚型；采用利福平和依非韦伦这两种诱导物质进行诱导，利福平是多种亚型的诱导剂、而依非韦伦有利于诱导产生最大量的3A4亚型，所以采用这两种诱导剂基本上没有太多相互干扰，且能得到PH450酶诱导类型和量的良好的效果。如果在更加多样的诱导剂成分，可能会导致相互干扰。代谢过程中按照0.2~1mmol/L的利福平、以及0.1~0.4mmol/L的依非韦伦进行即可，太过量的浓度也会是细胞毒素，诱导之后其会慢慢被蛋白包被和降解，对大量培养影响不大。

其中，在诱导的过程中，由于蓝藻自身具有PH450酶的表达基因，且自身也需要进行色素的合成和代谢，所以自身一般能自行采用基本营养物质合成而不需要引发。但是在实施培养诱导的过程中，由于蓝藻是原核细胞，生命代谢比较简单缓慢，所以实施的过程中，需要加速引发。引发的方式可以采用向培养基中添加瑞格列奈进行，因为瑞格列奈是3A4和2C8这两种亚型的最合适的合成底物，采用之后加快形成蓝藻中的PH450酶的表达途径，便能加速产物的形成。下述实施细节中有描述，优选采用实验室BG-11蓝藻培养基，并有详细的配方成分描述。

进一步，步骤S10培养到PH450酶的表达差不多稳定之后，即可停止培养。因为本发明的目的仅仅是需要获得PH450酶产物，而不是要进行蓝藻的发酵表达，所以基本上不需要如其他的发酵培养至衰退期；在培养的过程中随时取蓝藻细胞进行PH450酶的检测，当检测到表达水平差不多稳定之后即可停止培养。

然后步骤S20收获培养得到的细胞，并破碎细胞去除细胞壁、细胞器等，最终收集到总蛋白质，其中就有大量表达的PH450酶产物。

进一步，在本发明中为了提升PH450酶产物的分离纯化的品质，并且避免现有的化学纯化方法中导致产生形状和功能结构的破坏，本发明中设计采用免疫亲和层析的方式进行分离提纯。提纯的过程中，首先步骤S30中采用从人PH450酶标准品作为抗原进行免疫反应，通过免疫即可得到与PH450酶特异性亲和吸附的抗体。其中免疫反应的过程可以采用本身色素代谢比较少的动物进行，这样其产生的免疫原性更强，免疫体优选采用大白鼠，将从人肝脏中获取的PH450酶标准品（一般获取都是含有多种亚型混合的同工酶系，或者可以通过购买获得），皮下注射的方式进行，免疫之后从大鼠血液中即可得到抗体，当然活体免疫之后得到的抗体是多抗。

之后步骤S40将步骤S30获得的多抗作为亲和配体，固定至固相载体上制备特异性吸附PH450酶的层析柱；固相载体作为层析的载体，亲和配体与固相载体固定结合的方式可以采用共价交联等通常方式实现。其中，能够作为亲和配体本身是基于人PH450酶免疫得到的特异性抗体，也能够特异性吸附蓝藻大量产生的PH450酶；而层析柱中的固相介质本发明中优选采用Sepharose CL 4B（交联葡聚糖凝胶的一种）作为层析柱的固相基质，Sepharose CL 4B相比其他种类的基质，具有比较好的多孔性，可以增加吸附的容量，避免因为待测样品中的其他高丰度蛋白的竞争性造成目的蛋白吸附不足的情形。

而最后步骤S50进行过柱分离，在层析过程的过程中，蓝藻产生的和人产生的PH450酶还存在一些区别，人的PH450酶修饰后一般是弱碱性性质，而在蓝藻中可能由于原核细胞代谢环境和修饰的过程不同，所以最终得到的PH450酶是弱酸性性质，所以在过柱之前，可以用平衡液平衡改变介质的pH，提升特异性吸附的能力。在实施的过程中，为了减少或者降低层析柱与蓝藻蛋白中其他成分的非特异性吸附，可以将制备的蓝藻总蛋白先用只含有固相基质而不含有上述多抗配体的空柱子先过柱处理，采用该未偶联多克隆抗体只含有固相基质的空白柱子进行过柱，目的是将其作为背景，可以引起非特异性结合的因素、以及小颗粒碎片等等被阻留在该空白层析柱上，从而实现初步去除背景干扰，更进一步提升多抗层析柱对于待测样品的特异性吸附的效果。

同时在上述步骤S50中，待测样品进行过柱处理之后，可以进一步用缓冲液对亲和层析柱进行洗涤，以去除没有结合而滞留在间质空隙内的蛋白，降低本底干扰。用于洗涤的缓冲液可以采用任何不干扰抗原-抗体结合反应的缓冲液都可以。吸附之后最后再采用咪唑等洗脱液进行洗脱、浓缩之后，即可分离得到纯度较高的蓝藻PH450酶。

在本发明上述方法的实施过程中，步骤S50的过柱过程中，还可以先将提取的蓝藻蛋白进行梯度沉降离心，因为PH450酶是7K-10K左右的蛋白，初步采用梯度离心可以大致上除去分子量更小或者远大于上述分子量的蛋白质，进而初步过滤掉更多的非目的蛋白，而提升目的蛋白特异性吸附过程中的竞争性优势。

本发明的上述方法实施过程中，基于免疫亲和层析的分离方式，因为蓝藻细胞代谢基质不如人肝脏细胞，代谢过程比较简单，生成的蓝藻PH450酶的亚型不如人肝脏中PH450酶的亚型数量多；所以在可行的基础上如果要更好地提升亲和的单一性，也可以对应制备蓝藻PH450酶类型的单抗，然后用单抗作为亲和配体制作层析柱。

采用本发明的上述PH450酶的大量制备方法，基于蓝藻和人肝脏中表达的PH450酶在蛋白质的三维结构、活性功能几乎完全相同，且蓝藻代谢过程更加简单易于诱导提升和分离的情形，将蓝藻大量诱导培养之后，用PH450酶的特异性抗体进行亲和层析；相比现有的基因工程菌发酵制备的方法，本发明大量制备得到的PH450酶是在蓝藻代谢中产生经过细胞内功能修饰的活性酶，而且纯化的过程可以避免杂质的干扰，方法的效益更高。

为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明的能够大量制备的PH450酶的性能和品质，以及方法的生产效益，以下通过具体的实施例进行举例说明。

实施例1

S11，配置BG-11培养基（按照微生物实验手册中记载的母液成分培养进行配置），并同时获取蓝藻藻种（本发明优选瑞士纳沙泰尔湖水晶蓝藻和“水生1042号”蓝藻，选用它的目的在于比通常的国内的“水生1042号”色素代谢上比其他蓝藻更加活跃，产酶的量要高一些，适于本发明的大量生产）；S12，之后将蓝藻藻种接种至BG-11培养基中进行培养：先将少量的藻种转接到新鲜的培养基中，接种的比例按照30~200万细胞/ml培养基（一般尽量多接种一些，），并且采用同期培养箱中进行；放在冷白荧光灯管（200-400footcandle）保持1~2天，观察最初的生长状况，生长较好以后，移到2000lux的光照下快速大量培养。并且，每天要定期给一段时间的置于黑暗中培养，按照光暗比都是12~16h：12~8h之间进行控制和调整。

培养的过程中，随时进行搅拌，并将温度恒定控制24^oC（一般蓝藻培养温度在24~27^oC，本发明实施中选择在24^oC进行，其他技术人员也可以根据生长情况和自行喜好调低或者调高），同时培养箱中定期补充无菌空气，培养前期通气量相对少一些，并随着培养时间的延长逐渐加大通气量，并是当适当地根据情况补充新鲜培养基；S13，当步骤S20培养中培养到对数增长所减缓的时候，向培养基中添加利福平和依非韦伦至利福平的浓度为0.8mmol/L、依非韦伦的浓度为0.4mmol/L；同时还添加一定量的瑞格列奈，量不需要多，添加到0.1mmol/L即可；然后继续诱导培养，同时随时观察生长状况；S14在步骤S30实施中，定期抽空取标准量的含有蓝藻的培养液，并洗涤离心分离其中的蓝藻细胞，用上海酶联生物出售的用于检测cyPH450的ELISA检测试剂盒检测蓝藻的cyPH450酶的含量；当基本上趋于稳定不增加时，停止培养收获蓝藻细胞。

S21，将步骤S14收获的蓝藻细胞用加有溶菌酶到TE溶液重悬细胞，然后用细胞超声粉碎仪超声处理3~5次（超声功率800W，每次20min），并且在超声处理间隔中进行1次冻融，冻融用-20^oC冰箱进行；完成之后破碎蓝藻细胞壁，得到裂解液；

S22，将步骤S21的裂解液离心，去除下层沉淀后，将上清液加大量的盐进行盐析沉淀，之后分离沉淀得到初步分离的蛋白；

S23，将步骤S22中分离的蛋白用梯度沉降，梯度沉降之后取分子量介于3K和15K之间的蛋白，然后备用；S31，取购买的人PH450酶（美国西格玛）2mL，与2 mL弗氏完全佐剂混合，超声波乳化完全，然后对3只大白鼠进行皮下多点注射，并于耳根静脉取血样保存；

S32，加强免疫：两周后同样再次取2mL人PH450酶，与2 ml弗氏不完全佐剂混合，超声波乳化完全，对3只大白鼠进行皮下多点注射，并于大白鼠根静脉取血样保存；

S33，将步骤S32的大白鼠血样用ELISA实验测定生成的多克隆抗体的对人PH450酶的特异性吸附情况；当ELISA试验检测免疫的家兔血滴度达到10⁴~10⁵时，处死大白鼠取血。如果ELISA试验检测结果达不到标准，那么继续重复步骤S32对大白鼠进行增强免疫，直至达到符合标准时，处死大白鼠取血。

S34，将步骤S33处死大鼠血样中分离血浆，一般一只家兔可放血40 mL左右；将取得的血液放入预先装有抗凝剂的容器，充分混匀后，1000 rpm 4℃离心5 min，取出上清即为血浆；S35，从步骤S34的兔血浆中取出10mL，提取多克隆抗体；

用pH7.0的PBS缓冲液稀释5倍待用；取出Protein G柱（1ml），先用pH7.0的PBS缓冲液冲洗，直至蛋白核酸检测仪显示的数据达到基线；取出pH7.0的PBS缓冲液稀释的大鼠血浆溶液，以0.5 ml/min的流速上Protein G柱，上样完成后用pH 7.0的PBS缓冲液冲洗至基线，收集流穿液；当然，这一个步骤中收集的流穿液中也可能还含有尚未被吸附的多克隆抗体，所以该流穿液可以重复多次过柱，以降低多克隆抗体的浪费；

用pH2.5Gly-HCl缓冲液冲洗介质，接收洗脱蛋白溶液，即为针对人PH450酶的多克隆抗体，然后立即调节pH值至中性；测定A280nm以及A260nm，估算蛋白浓度；对洗脱蛋白溶液进行SDS-PAGE分析。

S40，制备多克隆抗体亲和柱：

S41，获取Sepharose CL 4B介质（购自上海源叶生物CAS No.61970-08-9）；

S42，然后将步骤S41的Sepharose CL 4B介质，用去离子水500 mL清洗，抽干成湿饼状（沉降体积为约45 mL），转移到200 mL烧杯中；凝胶悬浮在100 mL去离子水中，用磁力搅拌棒轻轻搅拌；

S43，取4.2 g CNBr溶解在50 ml HPLC级乙腈中，加入到凝胶悬液中，放入pH探头，用20%的NaOH维持反应混合物的pH在11.0，整个系统处于冰浴中，温度维持0℃；反应10~15min时，检查CNBr是否全部溶解。此时，NaOH消耗速度将减少；pH稳定在11.0后，反应混合物倾入预冷的砂芯玻璃漏斗中，用1L冰冷的去离子水和500mL冰冷的偶联缓冲掖（pH8.5，0.1MNaHCO₃）快速地洗涤凝胶，由于活化载体的不稳定性，凝胶必须立即偶联蛋白质或配基；

滤出液用500 mL0.1 M FeSO₄中和没反应的CNBr，倒入废液缸；

S44，用pH 8.5的0.1M NaHCO₃透析从步骤S35制备获得的洗脱蛋白溶液（即免疫步骤中分离的人PH450酶多抗），并与介质混合，4℃环境下均匀混合35h；加入乙醇胺0.5 ml，4℃环境下振荡5 h；用pH 7.0，0.01 M的PBS缓冲液清洗介质后，装柱。

S50，上样过柱：

S51，将步骤S23的制备的蛋白样品取20µL，加入980 µl 10 mM PBS；使用公式：C（mg/ml）=1.45ｘA_280nm-0.74ｘA_260nm估算样品的蛋白浓度；根据估算的浓度取约含1 mg待测样品备用；

S52，取Sepharose CL 4B介质制备一空白层析柱，将步骤S51制备的待测样品上10mM的PBS平衡过的空白层析柱后，并用PBS清洗3个体积收集流穿液；

S53，将步骤S,52中用空白层析柱初步过滤之后收集的流穿液，上10mM的PBS平衡过的步骤S44制备的层析柱；并用PBS冲洗介质3~4个柱体积，接收各流穿溶液（该流穿液可以再次进行过柱，并重复2~3次）；

S54，将步骤S53过柱之后的亲和层析柱用咪唑洗脱液进行洗脱，收集洗脱组分。

为了验证这一结果，本发明中继续进行下述过程：

S60，然后将步骤S54中获得的洗脱液进行SDS-PAGE电泳银染，当然重复做3个对照，其SDS-PAGE电泳银染的结果图如附图2所示。从图2的电泳结果中，根据分子标记条带M的分子量指示和条带1-3的染色情况，说明有蓝藻PH450酶产生，同时1-2条带中有2个亮色条带，且条带3中拖带比较多，估计原因一方面是亚型种类不同可能会有分子量的不同，一方面可能蛋白被分解。

并且，以上采用的是10mL的小层析柱进行的实验，用大的层析柱将1L的蓝藻细胞培养液（细胞和培养液的混合），全部提取之后，能收获到2~6mg的蓝藻PH450酶；相比通过构建生物工程菌的方式生产的发酵液中1L发酵液能有大概100~200mg左右的PH450酶；相比而言，本发明的产量比工程菌发酵生产的产量低很多，但是其本身是基于诱导产生，而且制备的是修饰后的具有完整生物活性的PH450酶，其性能和品质上是具有绝对优势的，而且分离制备的过程中，只需一次过柱之后洗脱浓缩即可，而不需要进行多种化学除杂、萃取、纯化等复杂的工艺，所以基本达到这样的产率，在成本和收益上还是比较可观的。当然，其用途上由于存在种属的不同，或许在作为蛋白药物进行使用时可能不太适合，但是如果作为化妆品的活性添加成分，清除脸部色素等等用途上，是完全能满足产品需求的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种PH450酶的大量制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取蓝藻并进行大量培养，并在培养过程中用PH450酶诱导剂进行诱导；

在所述大量培养结束后收集蓝藻细胞，提取蓝藻细胞总蛋白；

用人PH450酶作为抗原进行免疫反应，制备多克隆抗体；

以所述多克隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱；

将所述提取的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱；

所述PH450酶诱导剂包括利福平和依非韦伦；所述利福平在蓝藻培养基中的浓度为0.8mmol/L；所述依非韦伦在蓝藻培养基中的浓度为0.4mmol/L；所述蓝藻为瑞士纳沙泰尔湖水晶蓝藻或“水生1042号”蓝藻；

获取所述蓝藻并进行大量培养，并在培养过程中用PH450酶诱导剂进行诱导步骤中，还包括：

向蓝藻培养基中添加瑞格列奈，所述瑞格列奈在蓝藻培养基中的浓度为0.1mmol/L；

以所述多克隆抗体作为亲和介质制备亲和层析柱步骤中，所述亲和层析柱采用的固相基质为Sepharose CL 4B；

将所述提取的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱步骤之前，还包括：

将所述提取的蓝藻细胞总蛋白进行梯度沉降处理；

将所述提取的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱步骤之前，还包括：

将所述提取的蓝藻细胞总蛋白用不含有所述多克隆抗体的空白层析柱进行过柱；

将所述提取的蓝藻细胞总蛋白于所述亲和层析柱进行过柱步骤之后，还包括：

用洗脱液对所述亲和层析柱进行洗脱，并收集洗脱组分；

将所述洗脱组分进行浓缩处理。