CN106222147A - 微藻中用于石油烃降解的细胞色素p450酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶提取领域,公开了一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,包括:1)冻融处理;2)研磨处理;3)微波辐射处理;4)浓缩透析;5)纯化:DEAE纤维素柱纯化,MonoQ柱纯化,干燥后制得成品。本发明方法提取率高,且制备的细胞色素P450酶纯度高,活性好,对石油烃具有高效的降解效果。
Description
技术领域
本发明涉及酶提取领域,尤其涉及微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法。
背景技术
溢油对海洋生态环境和海洋资源都有长期的危害,海洋溢油污染已经成为人们必须面对的重大环境问题。微生物修复技术可以处理物理方法和化学方法无法清除的残余溢油,是恢复生态环境的最佳途径,得到了研究者的重视。微藻作为海洋环境中主要的初级生产者,数量巨大,对溢油发生后生态修复发挥了十分重要的作用。在石油烃生物氧化过程中,石油烃羟化酶为石油烃好氧降解的起始酶,是其代谢途径的关键酶之一。
因此,亟需开发出一种从微藻中提取而得的、高活性、能够高效降解石油烃的酶。如果将其应用于海洋溢油治理,可望获得较好的治理效果。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法。本发明方法提取率高,且制备的细胞色素P450酶纯度高,活性好,对石油烃具有高效的降解效果。
本发明的具体技术方案为:一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,包括以下步骤:
1)冻融处理:将微藻液用0.45微米的滤膜过滤,将滤膜装入离心管中并在-10℃至-16℃的温度下冷冻3-5h,接着取出在30-40℃水浴中融解8-12min,重复上述方法冷冻-融解数次。
本发明在提取前对微藻进行冻融处理,对微藻进行往复多次的冻融处理,在低温环境下,细胞中的大部分水遇冷形成冰晶, 冰晶的形成产生了膨胀压, 导致细胞发生破损,而未形成冰晶的细胞残存液, 由于在冻结过程中冰晶的析出致使溶质浓度变高,电解质升高、渗透压改变、pH 改变、蛋白变性等。在后续的融解过程中,细胞又发生溶胀,最终使细胞壁、细胞膜破碎。如此,细胞液中大量活性物质流出,为后续的提取提供了有利条件。
2)研磨处理:分两次向离心管中添加水将离心管中的滤膜及液体转移至研钵中,向研钵中添加石英砂并研磨10-20min。
对冻融处理后的微藻再进行研磨,进一步加速细胞液的流出。
3)微波辐射处理:分两次向研钵中加入水转移至离心管,以3000-4000r/min的转速离心处理后,取上清液,将上清液转移至微波萃取仪中萃取2-4min,得到萃取液。
在微波辐射过程中,细胞内分子发生剧烈振动,加速细胞破裂,只需数分钟就能使细胞液大量流出。本发明中冻融、研磨与微波辐射的配合,能够极大限度地提高提取效率。
4)浓缩透析:萃取液经聚乙二醇PEG20000浓缩,并用10mmol/L的磷酸钾缓冲液透析12-24h,得到细胞色素P450酶粗品。
5)纯化:用10mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液对DEAE纤维素柱平衡后,将细胞色素P450酶粗品上样,用20mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液洗脱;经聚乙二醇PEG20000浓缩后,用5mmol/L的磷酸缓冲液透析12-24h,用超滤膜再次浓缩;用5 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液对MonoQ柱平衡后,将首次纯化后的细胞色素P450酶粗品上样,用20 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液洗脱,用5 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液透析12-24h,用超滤膜浓缩,干燥后制得成品。
对细胞色素P450酶粗品进行两次纯化,能够有效提高产品纯度。
作为优选,步骤1)中所述微藻液的制备方法为:将微藻接种于微藻培养液中,在温度为10-20℃、盐度为10-30‰、pH值为7-9的环境下异养培养14-16天,得到微藻液。
经过本发明人的长期研究,发现不同的微藻的培养方式,细胞中细胞色素P450酶对于降解石油烃具有不同的活性。因此需要通过对微操的培养方式进行严格限定,以提高其细胞色素P450酶的活性。
本发明通过大量创造性劳动,发现微藻在异养条件下,其细胞色素P450酶的活性最高,同时在异养条件下配上上述培养环境,其细胞色素P450酶的活性进一步提高。
作为优选,所述微藻培养液的配方如下:原油1-5g/L,硝酸钠0.2g/L,氯化铵0.2g/L,磷酸氢二钾0.1g/L,柠檬酸铁0.05g/L,溶剂为海水。
在上述培养液中进行培养的微藻,其细胞色素P450酶活性能够进一步得到提升。
作为优选,所述微藻在微藻培养液中的接种量为5-10wt%。
作为优选,步骤1)中重复冷冻-融解2-4次。
作为优选,步骤3)中微波萃取仪的功率为400-500W,温度45-55℃。
作为优选,步骤5)中洗脱时,磷酸缓冲液的流速为3.5-4.5mL/min。
作为优选,步骤5)中所述超滤膜的分子截留量为10000。
与现有技术对比,本发明的有益效果是:本发明方法提取率高,且制备的细胞色素P450酶纯度高,活性好,对石油烃具有高效的降解效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,包括以下步骤:
微藻的培养:将微藻以10wt%的接种量接种于微藻培养液中,在温度为20℃、盐度为30‰、pH值为9的环境下异养培养16天,得到微藻液。所述微藻培养液的配方如下:原油5g/L,硝酸钠0.2g/L,氯化铵0.2g/L,磷酸氢二钾0.1g/L,柠檬酸铁0.05g/L,溶剂为海水。
1)冻融处理:将微藻液用0.45微米的滤膜过滤,将滤膜装入离心管中并在-16℃的温度下冷冻3h,接着取出在40℃水浴中融解8min,重复上述方法冷冻-融解4次。
2)研磨处理:分两次向离心管中添加水将离心管中的滤膜及液体转移至研钵中,向研钵中添加石英砂并研磨20min。
3)微波辐射处理:分两次向研钵中加入水转移至离心管,以4000r/min的转速离心处理后,取上清液,将上清液转移至微波萃取仪中在功率为500W,温度55℃的条件下萃取2min,得到萃取液。
4)浓缩透析:萃取液经聚乙二醇PEG20000浓缩,并用10mmol/L的磷酸钾缓冲液透析24h,得到细胞色素P450酶粗品。
5)纯化:用10mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液对DEAE纤维素柱平衡后,将细胞色素P450酶粗品上样,用20mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液以4.5mL/min的流速洗脱;经聚乙二醇PEG20000浓缩后,用5mmol/L的磷酸缓冲液透析24h,用分子截留量为10000的超滤膜再次浓缩;用5 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液对MonoQ柱平衡后,将首次纯化后的细胞色素P450酶粗品上样,用20 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液以4.5mL/min的流速洗脱;用5 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液透析24h,用分子截留量为10000的超滤膜浓缩,干燥后制得成品。
实施例2
一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,包括以下步骤:
微藻的培养:将微藻以7.5wt%的接种量接种于微藻培养液中,在温度为15℃、盐度为20‰、pH值为8的环境下异养培养15天,得到微藻液。所述微藻培养液的配方如下:原油3g/L,硝酸钠0.2g/L,氯化铵0.2g/L,磷酸氢二钾0.1g/L,柠檬酸铁0.05g/L,溶剂为海水。
1)冻融处理:将微藻液用0.45微米的滤膜过滤,将滤膜装入离心管中并在-13℃的温度下冷冻4h,接着取出在35℃水浴中融解10min,重复上述方法冷冻-融解3次。
2)研磨处理:分两次向离心管中添加水将离心管中的滤膜及液体转移至研钵中,向研钵中添加石英砂并研磨15min。
3)微波辐射处理:分两次向研钵中加入水转移至离心管,以3500r/min的转速离心处理后,取上清液,将上清液转移至微波萃取仪中在功率为450W,温度50℃的条件下萃取3min,得到萃取液。
4)浓缩透析:萃取液经聚乙二醇PEG20000浓缩,并用10mmol/L的磷酸钾缓冲液透析18h,得到细胞色素P450酶粗品。
5)纯化:用10mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液对DEAE纤维素柱平衡后,将细胞色素P450酶粗品上样,用20mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液以4mL/min的流速洗脱;经聚乙二醇PEG20000浓缩后,用5mmol/L的磷酸缓冲液透析18h,用分子截留量为10000的超滤膜再次浓缩;用5 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液对MonoQ柱平衡后,将首次纯化后的细胞色素P450酶粗品上样,用20 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液以4mL/min的流速洗脱;用5 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液透析18h,用分子截留量为10000的超滤膜浓缩,干燥后制得成品。
实施例3
一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,包括以下步骤:
微藻的培养:将微藻以5wt%的接种量接种于微藻培养液中,在温度为10℃、盐度为10‰、pH值为7的环境下异养培养14天,得到微藻液。所述微藻培养液的配方如下:原油1g/L,硝酸钠0.2g/L,氯化铵0.2g/L,磷酸氢二钾0.1g/L,柠檬酸铁0.05g/L,溶剂为海水。
1)冻融处理:将微藻液用0.45微米的滤膜过滤,将滤膜装入离心管中并在-10℃的温度下冷冻5h,接着取出在30℃水浴中融解12min,重复上述方法冷冻-融解2次。
2)研磨处理:分两次向离心管中添加水将离心管中的滤膜及液体转移至研钵中,向研钵中添加石英砂并研磨10min。
3)微波辐射处理:分两次向研钵中加入水转移至离心管,以3000r/min的转速离心处理后,取上清液,将上清液转移至微波萃取仪中在功率为400W,温度45℃的条件下萃取4min,得到萃取液。
4)浓缩透析:萃取液经聚乙二醇PEG20000浓缩,并用10mmol/L的磷酸钾缓冲液透析12h,得到细胞色素P450酶粗品。
5)纯化:用10mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液对DEAE纤维素柱平衡后,将细胞色素P450酶粗品上样,用20mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液以3.5mL/min的流速洗脱;经聚乙二醇PEG20000浓缩后,用5mmol/L的磷酸缓冲液透析12h,用分子截留量为10000的超滤膜再次浓缩;用5 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液对MonoQ柱平衡后,将首次纯化后的细胞色素P450酶粗品上样,用20 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液以3.5mL/min的流速洗脱;用5 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液透析12h,用分子截留量为10000的超滤膜浓缩,干燥后制得成品。
本发明中所用原料、设备,若无特别说明,均为本领域的常用原料、设备;本发明中所用方法,若无特别说明,均为本领域的常规方法。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换,均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (8)
1.一种微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)冻融处理:将微藻液用0.45微米的滤膜过滤,将滤膜装入离心管中并在-10℃至-16℃的温度下冷冻3-5h,接着取出在30-40℃水浴中融解8-12min,重复上述方法冷冻-融解数次;
2)研磨处理:分两次向离心管中添加水将离心管中的滤膜及液体转移至研钵中,向研钵中添加石英砂并研磨10-20min;
3)微波辐射处理:分两次向研钵中加入水转移至离心管,以3000-4000r/min的转速离心处理后,取上清液,将上清液转移至微波萃取仪中萃取2-4min,得到萃取液;
4)浓缩透析:萃取液经聚乙二醇PEG20000浓缩,并用10mmol/L的磷酸钾缓冲液透析12-24h,得到细胞色素P450酶粗品;
5)纯化:用10mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液对DEAE纤维素柱平衡后,将细胞色素P450酶粗品上样,用20mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液洗脱;经聚乙二醇PEG20000浓缩后,用5mmol/L的磷酸缓冲液透析12-24h,用超滤膜再次浓缩;用5 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液对MonoQ柱平衡后,将首次纯化后的细胞色素P450酶粗品上样,用20 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液洗脱,用5 mmol/L,pH7.2的磷酸缓冲液透析12-24h,用超滤膜浓缩,干燥后制得成品。
2.如权利要求1所述的微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,其特征在于,步骤1)中所述微藻液的制备方法为:将微藻接种于微藻培养液中,在温度为10-20℃、盐度为10-30‰、pH值为7-9的环境下异养培养14-16天,得到微藻液。
3.如权利要求2所述的微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,其特征在于,所述微藻培养液的配方如下:原油1-5g/L,硝酸钠0.2g/L,氯化铵0.2g/L,磷酸氢二钾0.1g/L,柠檬酸铁0.05g/L,溶剂为海水。
4.如权利要求2或3所述的微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,其特征在于,所述微藻在微藻培养液中的接种量为5-10wt%。
5.如权利要求1所述的微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,其特征在于,步骤1)中重复冷冻-融解2-4次。
6.如权利要求1所述的微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,其特征在于,步骤3)中微波萃取仪的功率为400-500W,温度45-55℃。
7.如权利要求1所述的微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,其特征在于,步骤5)中洗脱时,磷酸缓冲液的流速为3.5-4.5mL/min。
8.如权利要求1或7所述的微藻中用于石油烃降解的细胞色素P450酶的制备方法,其特征在于,步骤5)中所述超滤膜的分子截留量为10000。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20161214 |