CN107858334A - 一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3‑双加氧酶的方法 - Google Patents

一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3‑双加氧酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及环境保护技术领域，尤其涉及一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3‑双加氧酶的方法，包括以下步骤：(1)微藻富集培养；(2)抽滤、洗涤、重悬浮，得到粗酶液A；(3)分级沉淀，透析过夜，得到粗酶液B；(4)梯度洗脱，透析过夜，得到邻苯二酚2,3‑双加氧酶酶液。本发明将邻苯二酚2,3‑双加氧酶的检测首次拓展至微藻，且操作方法简易、操作条件易满足，较为经济；具有高效的芳香烃降解率，进一步提取、纯化邻苯二酚2,3‑双加氧酶，纯度高、对烃的降解效果明显。

Description

一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法
技术领域
本发明涉及环境保护技术领域，尤其涉及一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法。
背景技术
近年来，海洋溢油所造成的环境污染越来越成为人们所关注的焦点问题。在烃类污染物中，芳香族化合物占了很大的比例。芳香族化合物是一类难降解的有机物，并且对人体有很大的毒害作用，可致癌并有神经毒性。一般来说，几乎所有的芳香族化合物在降解过程中都是先降解为邻苯二酚，而后邻苯二酚通过邻位或间位双加氧酶的作用裂解为粘康酸半醛或粘康酸，从而使苯环断裂。
邻苯二酚作为芳香族化合物降解过程中重要的中间产物，是通过邻苯二酚双加氧酶催化实现降解的。催化邻苯二酚内开环即邻位裂解的酶是邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)，而催化邻苯二酚外开环即间位裂解的酶是邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)。研究表明，自然界中存在着许多具有降解芳香族化合物能力的细菌，且能从菌体中提取、检测出C23O，但关于微藻中的C23O鲜有报道。微藻作为溢油的重要生物修复手段之一，其降解机理一直有待深入研究，而微藻在酶分子机制层面对石油烃的降解，第一步即是氧化还原作用。因此，从用于石油烃降解的微藻藻体内提取可催化降解芳香烃类的氧化还原酶C23O，并对其酶活性进行检测，可从量的层面确定邻苯二酚2,3-双加氧酶对芳烃的降解效果，继而利于研究氧化还原酶系对芳烃的降解，从而可进一步探讨微藻对石油烃类物质降解的机理，最后可将其应用于溢油及含芳香族化合物类工业废水的治理，具有重要的研究意义。
发明内容
本发明为了克服传统上述背景技术中存在的问题，提供了一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法，用以降解工业废水中的芳香族化合物。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法，包括以下步骤：
(1)将从溢油事故现场采集的水样进行微生物鉴定分离，从中筛选出微藻，对所述微藻进行富集培养7～15天，得到藻液；
(2)将步骤(1)得到的藻液抽滤，将富集着藻体的滤膜用锡箔纸包裹，放置液氮中冷却30～90s后取出，加入3～5g石英砂于研钵中进行研磨，用磷酸盐缓冲溶液洗出藻液，于离心机10000r/min离心15min，取上清液；沉淀部分再用磷酸盐缓冲溶液清洗2次，合并3次离心操作的上清液，再利用上述磷酸盐缓冲溶液进行重悬浮，得到粗酶液A；
(3)将步骤(2)所得的粗酶液A进行硫酸铵的分级沉淀，细胞抽提液加固体硫酸铵至饱和度40％，0～4℃静置过夜，11000r/min离心10min；取上清液加硫酸铵固体至饱和度55％，0～4℃静置过夜，11000r/min离心10min；取沉淀溶于少量磷酸盐缓冲溶液，在上述磷酸盐缓冲溶液中透析过夜，得到粗酶液B；
(4)将步骤(3)得到的粗酶液B利用0～600mmol/L的NaCl的缓冲液于DEAE 52层析柱进行梯度洗脱，合并具有酶活性的洗脱液，用磷酸盐缓冲溶液透析过夜，得到邻苯二酚2,3-双加氧酶酶液。
作为优选，步骤(1)中，所述微藻为小球藻。
作为优选，步骤(1)中，所述富集培养为：将培养基用海水煮沸10～20min，抽滤后添加营养盐，所述营养盐中各组分的浓度为NH4Cl 0.1～0.3g/L，K2HPO4 0.05～0.1g/L和柠檬酸铁0.005～0.02g/L。
为开展后期的小球藻粗酶液提取实验及藻种传代，进行小球藻的富集培养。所述富集培养为：将培养基用海水煮沸12～18min，抽滤后为补充小球藻生长必要的营养物质，添加相应的营养盐，添加NH4Cl为补充氮源、K2HPO4在补充磷源的同时可以补充营养元素钾、柠檬酸铁的添加则可满足小球藻在生长过程中对铁元素的需要，因此这三种营养盐中各组分的浓度分别为NH4Cl 0.2g/L，K2HPO4 0.05g/L和柠檬酸铁0.01g/L。
作为优选，步骤(2)中，研磨温度为0～4℃。
作为优选，步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为1.0～1.5mmol/L；
步骤(3)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.005～0.015mmol/L；
步骤(4)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.8～1.2mmol/L。
作为优选，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0～8.2。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)近些年研究表明，用于检测微生物中邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法，多以细菌为研究对象。而本发明中所应用的微生物研究材料—小球藻，将邻苯二酚2,3-双加氧酶的检测首次拓展至微藻，且操作方法简易、操作条件易满足，较为经济；
(2)小球藻作为广泛存在的微生物，具有易培养、繁殖较快等特点。本发明中小球藻为从溢油事故现场采集、分离、培养而得，经过驯化后，具有高效的芳香烃降解率，在此基础上，进一步提取、纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶，纯度高、且对烃的降解效果明显。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1
(1)将从溢油事故现场采集的水样进行微生物鉴定分离，从中筛选出小球藻，对所述小球藻进行富集培养：将培养基用海水煮沸15min，抽滤后添加营养盐，所述营养盐中各组分的浓度为NH4Cl 0.2g/L，K2HPO4 0.05g/L和柠檬酸铁0.01g/L，15天后得到藻液；
(2)将步骤(1)得到的藻液抽滤，将富集着藻体的滤膜用锡箔纸包裹，放置液氮中冷却30s后取出，加入4g石英砂于研钵中于4℃条件下进行研磨，用1.2mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲溶液洗出藻液，于离心机10000r/min离心15min，取上清液；沉淀部分再用磷酸盐缓冲溶液清洗2次，合并3次离心操作的上清液，再利用上述磷酸盐缓冲溶液进行重悬浮，得到粗酶液A；
(3)将步骤(2)所得的粗酶液A进行硫酸铵的分级沉淀，细胞抽提液加固体硫酸铵至饱和度40％，3℃静置过夜，11000r/min离心10min；取上清液加硫酸铵至饱和度55％，4℃静置过夜，11000r/min离心10min；取沉淀溶于少量的0.01mol/L pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液，在上述磷酸盐缓冲溶液中透析过夜，得到粗酶液B；
(4)将步骤(3)得到的粗酶液B利用0～600mmol/L的NaCl的缓冲液于DEAE 52层析柱进行梯度洗脱，合并具有酶活性的洗脱液，用0.8mmol/L pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液透析过夜，得到邻苯二酚2,3-双加氧酶酶液。
实施例2
(1)将从溢油事故现场采集的水样进行微生物鉴定分离，从中筛选出小球藻，对所述小球藻进行富集培养：将培养基用海水煮沸10min，抽滤后添加营养盐，所述营养盐中各组分的浓度为NH4Cl 0.1g/L，K2HPO4 0.1g/L和柠檬酸铁0.005g/L，10天后得到藻液；
(2)将步骤(1)得到的藻液抽滤，将富集着藻体的滤膜用锡箔纸包裹，放置液氮中冷却90s后取出，加入3g石英砂于研钵中于0℃条件下进行研磨，用1.5mmol/L，pH为7.5磷酸盐缓冲溶液洗出藻液，于离心机10000r/min离心15min，取上清液；沉淀部分再用磷酸盐缓冲溶液清洗2次，合并3次离心操作的上清液，再利用上述磷酸盐缓冲溶液进行重悬浮，得到粗酶液A；
(3)将步骤(2)所得的粗酶液A进行硫酸铵的分级沉淀，细胞抽提液加固体硫酸铵至饱和度40％，2℃静置过夜，11000r/min离心10min；取上清液加硫酸铵至饱和度55％，2℃静置过夜，11000r/min离心10min；取沉淀溶于少量的0.005mol/L pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液，在相同缓冲液中透析过夜，得到粗酶液B；
(4)将步骤(3)得到的粗酶液B利用0～600mmol/L的NaCl的缓冲液于DEAE 52层析柱进行梯度洗脱，合并具有酶活性的洗脱液，用1mmol/L pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液透析过夜，得到邻苯二酚2,3-双加氧酶酶液。
实施例3
(1)将从溢油事故现场采集的水样进行微生物鉴定分离，从中筛选出小球藻，对所述小球藻进行富集培养：将培养基用海水煮沸20min，抽滤后添加营养盐，所述营养盐中各组分的浓度为NH4Cl 0.3g/L，K2HPO4 0.075g/L和柠檬酸铁0.02g/L，7天后得到藻液；
(2)将步骤(1)得到的藻液抽滤，将富集着藻体的滤膜用锡箔纸包裹，放置液氮中冷却60s后取出，加入5g石英砂于研钵中于2℃条件下进行研磨，用1.0mmol/L，pH为7.5磷酸盐缓冲溶液洗出藻液，于离心机10000r/min离心15min，取上清液；沉淀部分再用上述磷酸盐缓冲溶液清洗2次，合并3次离心操作的上清液，再利用上述磷酸盐缓冲溶液进行重悬浮，得到粗酶液A；
(3)将步骤(2)所得的粗酶液A进行硫酸铵的分级沉淀，细胞抽提液加固体硫酸铵至饱和度40％，0℃静置过夜，11000r/min离心10min；取上清液加硫酸铵至饱和度55％，0℃静置过夜，11000r/min离心10min；取沉淀溶于少量的0.015mol/L pH 8.2的磷酸盐缓冲溶液，在上述磷酸盐缓冲溶液中透析过夜，得到粗酶液B；
(4)将步骤(3)得到的粗酶液B利用0～600mmol/L的NaCl的缓冲液于DEAE 52层析柱进行梯度洗脱，合并具有酶活性的洗脱液，用1.2mmol/L pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液透析过夜，得到邻苯二酚2,3-双加氧酶酶液。
采用分光光度法对实施例1-3从微藻中提取与纯化的邻苯二酚2,3-双加氧酶的酶活力进行测定：测定系统总体积3mL，内含1μmol邻苯二酚、130μmol pH 7.5磷酸钾缓冲液和0.2mL酶液。30℃反应1min，在375nm处测定光吸收的增加值。一个酶单位(U)定义为在该反应条件下，1min内催化产生1μmol 2-羟粘糠酸半醛(HMS)所需要的酶量。测定结果如表1所示。
表1.测定结果
性能指标 实施例1 实施例2 实施例3
酶活性(U) 158.65 145.27 138.38
由表1可以看出，本发明从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法，可有效检测出邻苯二酚2,3-双加氧酶的酶活力，且酶活力值均相对较高。这表明，在酶纯化提取的过程中，其活性得以有效保持，即此提纯方法可行。被检测的样品，针对不同的实验条件能积极响应相应的酶活，说明本发明提出的邻苯二酚2,3-双加氧酶检测方法灵敏、高效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (6)

1.一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将从溢油事故现场采集的水样进行微生物鉴定分离，从中筛选出微藻，对所述微藻进行富集培养7～15天，得到藻液；
(2)将步骤(1)得到的藻液抽滤，将富集着藻体的滤膜用锡箔纸包裹，放置液氮中冷却30～90s后取出，加入3～5g石英砂于研钵中进行研磨，用磷酸盐缓冲溶液洗出藻液，于离心机10000r/min离心15min，取上清液；沉淀部分再用磷酸盐缓冲溶液清洗2次，合并3次离心操作的上清液，再利用上述磷酸盐缓冲溶液进行重悬浮，得到粗酶液A；
(3)将步骤(2)所得的粗酶液A进行硫酸铵的分级沉淀，细胞抽提液加固体硫酸铵至饱和度40％，0～4℃静置过夜，11000r/min离心10min；取上清液加硫酸铵固体至饱和度55％，0～4℃静置过夜，11000r/min离心10min；取沉淀溶于少量磷酸盐缓冲溶液，在上述磷酸盐缓冲溶液中透析过夜，得到粗酶液B；
(4)将步骤(3)得到的粗酶液B利用0～600mmol/L的NaCl的缓冲液于DEAE 52层析柱进行梯度洗脱，合并具有酶活性的洗脱液，用磷酸盐缓冲溶液透析过夜，得到邻苯二酚2,3-双加氧酶酶液。
2.根据权利要求1所述的一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述微藻为小球藻。
3.根据权利要求1或2所述的一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述富集培养为：将培养基用海水煮沸10～20min，抽滤后添加营养盐，所述营养盐中各组分的浓度为NH4Cl 0.1～0.3g/L，K2HPO4 0.05～0.1g/L和柠檬酸铁0.005～0.02g/L。
4.根据权利要求1或2所述的一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，研磨温度为0～4℃。
5.根据权利要求1或2所述的一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法，其特征在于，
步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为1.0～1.5mmol/L；
步骤(3)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.005～0.015mmol/L；
步骤(4)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.8～1.2mmol/L。
6.根据权利要求1或2所述的一种从微藻中提取与纯化邻苯二酚2,3-双加氧酶的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0～8.2。
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