CN106146652A

CN106146652A - 一种发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法

Info

Publication number: CN106146652A
Application number: CN201510194373.1A
Authority: CN
Inventors: 梁靖瑞
Original assignee: Shanghai Youjia Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Youjia Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明提供一种发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法。以发菜为原料，0.02～0.2M磷酸盐缓冲液与10～100U/g的果胶酶综合处理使藻蓝蛋白从刚毛藻细胞中渗出；离心得粗提液，清液过活性炭目数在20-100目的活性炭柱，收集清液；清液使用20～70％的硫酸铵分级盐溶、盐析，饱和度20～35％时收集上清液，饱和度55～70％时收集沉淀，电渗析脱盐；脱盐后的粗蛋白液用一种弱碱性阴离子树脂上柱处理，用0.02～0.2M磷酸盐缓冲液分梯度洗脱收集藻蓝蛋白溶液；使用超滤膜浓缩后得高纯度藻蓝蛋白溶液。

Description

一种发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法

技术领域

本发明涉及一种发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法，属于天然活性物质制备技术领域。

背景技术

藻胆蛋白是藻类吸收、传递光能，进行光合作用的重要辅助色素，其种类繁多，可以分类为藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)和藻红蓝蛋白(PEC)四种，其中PE和PC是人们研究比较多的蛋白种类。光谱学特性是藻胆蛋白的重要特征之一。经过光谱扫描，能够根据测定的OD值计算出藻胆蛋白的纯度以及含量，为藻胆蛋白的鉴定提供重要的依据。PE在564-568nm处有最大特征吸收峰，最大荧光发射峰在575nm-580nm之间。PC在615-620nm处有最大特征吸收峰，最大荧光发射峰在635-647nm之间。

藻胆蛋白的用途极为广泛，不仅可以作为天然色素应用于化妆品、纺织品等工业，也可作为重要生理活性物质应用于保健品、药品等医疗保健领域等，而且在探索光合作用的原初反应机理方面也具有重要的研究价值，并且可以作为生物体内的荧光示踪物质，应用于临床诊断、免疫标记及生物医学工程等领域的研究。

发菜是发状念珠藻的简称，隶属蓝藻门，念珠藻科，念珠藻属，是一种经济价值很高的食用性蓝藻，广泛分布于干旱、半干旱地区。发菜细胞在生长过程中向细胞外分泌大量的胶状物质，其主要成分为多糖。药理试验研究表明，发菜多糖能阻断病毒对寄主细胞的吸附，阻止病毒在寄主细胞内的复制，对流感病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等多种具封套的病毒均具有抗病毒作用。从藻细胞中分离得到的藻蓝蛋白的最大吸收峰位于615nm，荧光发射峰位于649nm，由α和β两个亚基组成，其分子质量分别为18000.0和19100.0Da。

目前藻胆蛋白释放方法的主要有溶胀法、超声波法、反复冻融法等，蛋白的提取方法主要有盐析法、等电点沉淀法、结晶法、超滤法等。藻胆蛋白粗提液经过离子交换柱层析，羟基磷灰石柱层析，凝胶过滤层析相结合的方法进行纯化。专利CN101240009A采用红藻为原料，溶胀法提取藻胆蛋白后，经硫酸铵沉淀后阴离子交换层析吸附并梯度洗脱制备藻红蛋白、藻蓝蛋白，缺点是由于藻胆蛋白为胞内蛋白，采用溶胀法提取得率低且耗时。专利CN104292327A公开了一种从螺旋藻中提取藻胆蛋白的方法，超声法处理螺旋藻细胞悬液，破壁后上清通过不同孔径滤膜进行微滤和超滤，收集300KD和100KD分子段的滤液并干燥制得藻胆蛋白粉，该方法虽便捷，但制得的藻胆蛋白粗品纯度底，不能满足制备医药级以上高附加值产品的需求。专利CN101343310A采用磷酸缓冲液为提取剂，将藻细胞破碎后，经硫酸铵分级盐溶、盐析、透析得到藻胆蛋白粗提物，再经羟基磷灰石柱层析，磷酸盐缓冲液梯度洗脱制得高纯度药品级藻红蛋白、藻蓝蛋白。不足在于化学试剂提取易使藻胆蛋白变性，羟基磷灰石柱填料颗粒太细，易堵塞层析柱，只能使用短小柱子纯化，因而只适于实验室小型规模，不易大规模操作。正由于藻红蛋白、藻蓝蛋白具有广泛的应用价值，但同时其提取纯化成本高，时间长，产率底使得该类蛋白的价格一直居高不下。

发明内容

本发明提供一种从发菜中制备高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法。

本发明的方法包括以下步骤：

1、将新鲜的或干燥的发菜制成发菜粉；

2、按发菜粉和缓冲溶液以1∶5～20的质量/体积比混合，加入的磷酸盐缓冲液的浓度为0.02～0.2M，优选为0.02～0.1M，pH值为6.5，加入的果胶酶的含量为10～100U/g刚毛藻粉，综合处理使藻蓝蛋白渗出得破壁液。

3、将破壁液离心取蛋白粗提液，粗提液上活性炭柱三柱串联处理，收集柱下清液。所用活性炭为柱状果壳活性炭，目数为20～100目，优选为40～80目；上柱速度为0.5～1BV/h，柱下清液与上柱溶液透光率基本一致时开始串珠处理，收集柱下在280nm有吸光度值的溶液，吸附饱和的炭柱用0.5～5％的氢氧化钠溶液再生，再生液上柱速率1～1.5BV/h。

4、活性炭柱下清液使用20～70％的硫酸铵分两级盐溶、盐析。在活性炭处理液中加入固体硫酸铵至浓度为20～35％，静置2～3h，离心去除杂蛋白收集上清液，继续加入硫酸铵至浓度为55～70％，静置2～3h，离心收集沉淀。

5、沉淀使用0.01～0.2M磷酸盐缓冲液溶解后，电渗析脱盐处理。所用电渗析膜为截留分子量小于10KD的离子交换膜，藻蓝蛋白在电渗析脱盐过程中基本无损失。

6、脱盐后清液用一种弱碱性阴离子树脂上柱处理，使用0.02～0.2M磷酸盐缓冲液分梯度洗脱分别收集藻蓝蛋白溶液。使用的弱碱性阴离子树脂为D301、D311、LS300、LS200中的任意一种。上柱速率为1～1.5BV/h，先使用pH5.0的0.01～0.1M磷酸盐缓冲液洗脱，解吸速率为0.5～1.0BV/h，柱下收集在280nm有吸光度值的蓝色溶液，得到纯化的藻蓝蛋白溶液。

7、藻蓝蛋白溶液使用截留分子量为10～15KD的超滤膜浓缩，操作压力0.2～0.4MPa，浓缩倍数2～4倍。浓缩后的藻蓝蛋白溶液A615/A280＞3.5。

综上所述，本发明的优点在于：

1、针对藻细胞中除藻蓝蛋白之外杂质较多，在进行阴离子树脂吸附梯度洗脱前，对蛋白粗提液进行多次除杂操作。在进行弱碱性阴离子树脂吸附时，会提高树脂的吸附容量和弱化杂质蛋白的影响。

2、在硫酸铵盐析沉淀前，为提高盐析收率，使用活性炭柱串联处理蛋白粗提液，去除了大部分多糖、色素及少部分杂质蛋白。

3、硫酸铵盐析后使用电渗析脱盐处理，比之透析处理，处理效率高，使用截留分子量小于10KD的离子交换膜，藻蓝蛋白在电渗析脱盐过程中基本无损失。

4、阴离子树脂处理后，使用不同截留分子量的超滤膜浓缩蛋白溶液，进一步提高藻蓝蛋白的浓度和纯度。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明提供的方法进一步说明，但并不因此而限制本发明，还应包括：在不偏离本发明范围条件下，对公开的方案进行本领域技术人员显而易见各种改变。

实施例1

1、取50g发菜干粉，按发菜粉和缓冲溶液以1∶10的质量/体积比混合，加入500mL pH＝6.5的0.05磷酸盐缓冲液，加入10U/g发菜粉的果胶酶，综合处理使藻蓝蛋白渗出得破壁液。

2、将破壁液离心取蛋白粗提液，粗提液上活性炭柱三柱串联处理，收集柱下清液。所用活性炭为40～60目柱状果壳活性炭；上柱速度为0.5BV/h，柱下清液与上柱溶液透光率基本一致时开始串珠处理，收集柱下在280nm有吸光度值的溶液，吸附饱和的炭柱用0.5％的氢氧化钠溶液再生，再生液上柱速率1BV/h。

3、在活性炭处理液中先加入固体硫酸铵至浓度为20％，静置2～3h，离心去除杂蛋白收集上清液，继续加入硫酸铵至浓度为60％，静置2～3h，离心收集沉淀。

4、沉淀使用0.01M pH＝6.5磷酸盐缓冲液溶解后，电渗析脱盐处理。所用电渗析膜为截留分子量10KD的离子交换膜。

5、脱盐后清液用一种弱碱性阴离子树脂D311上柱处理，使用0.05M磷酸盐缓冲液分梯度洗脱分别收集藻蓝蛋白溶液。上柱速率为1.0BV/h，解吸时先使用pH5.0的0.05M磷酸盐缓冲液洗脱，解吸速率为1.0BV/h，柱下收集在280nm有吸光度值的蓝色溶液，得到纯化的藻蓝蛋白溶液。

6、藻蓝蛋白溶液使用截留分子量为10KD的超滤膜浓缩，操作压力0.3MPa，浓缩倍数2倍。浓缩后的藻蓝蛋白溶液A615/A280＝3.6。

实施例2

1、取50g发菜干粉，按发菜粉和缓冲溶液以1∶5的质量/体积比混合，加入250mL pH＝6.5的0.02磷酸盐缓冲液，加入50U/g发菜粉的果胶酶，综合处理使藻蓝蛋白渗出得破壁液。

2、将破壁液离心取蛋白粗提液，粗提液上活性炭柱三柱串联处理，收集柱下清液。所用活性炭为20～40目柱状果壳活性炭；上柱速度为1.0BV/h，柱下清液与上柱溶液透光率基本一致时开始串珠处理，收集柱下在280nm有吸光度值的溶液，吸附饱和的炭柱用1％的氢氧化钠溶液再生，再生液上柱速率1BV/h。

3、在活性炭处理液中先加入固体硫酸铵至浓度为25％，静置2～3h，离心去除杂蛋白收集上清液，继续加入硫酸铵至浓度为70％，静置2～3h，离心收集沉淀。

4、沉淀使用0.05M pH＝6.5磷酸盐缓冲液溶解后，电渗析脱盐处理。所用电渗析膜为截留分子量5KD的离子交换膜。

5、脱盐后清液用一种弱碱性阴离子树脂LS300上柱处理，使用0.02M磷酸盐缓冲液分梯度洗脱分别收集藻蓝蛋白溶液。上柱速率为0.75BV/h，解吸时先使用pH5.0的0.02M磷酸盐缓冲液洗脱，解吸速率为0.5BV/h，柱下收集在280nm有吸光度值的蓝色溶液，得到纯化的藻蓝蛋白溶液。

6、藻蓝蛋白溶液使用截留分子量为15KD的超滤膜浓缩，操作压力0.3MPa，浓缩倍数3倍。浓缩后的藻蓝蛋白溶液A615/A280＝37。

Claims

1.一种发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)将新鲜的或干燥的发菜制成发菜粉；

(2)按发菜粉和缓冲溶液以一定的的质量/体积比混合，加入磷酸盐缓冲溶液，然后加入一定量的果胶酶综合处理，使藻蓝蛋白渗出得破壁液；

(3)将破壁液离心取蛋白粗提液，粗提液上活性炭柱串联处理，收集柱下清液；

(4)清液使用20～70％的硫酸铵分级盐溶、盐析；饱和度20～35％时收集上清液，饱和度55～70％时收集沉淀；

(5)沉淀使用0.01～0.2M磷酸盐缓冲液溶解后，电渗析脱盐处理；

(6)脱盐后清液用一种弱碱性阴离子树脂上柱处理，使用0.02～0.2M磷酸盐缓冲液分梯度洗脱收集藻蓝蛋白溶液；

(7)藻蓝蛋白溶液使用超滤膜浓缩得高纯度高浓度的藻蓝蛋白溶液。

2.根据权利要求1中所述的发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于步骤(2)中发菜粉和缓冲溶液的质量体积比为1∶5～20，加入的磷酸盐缓冲液的浓度为0.02～0.2M，优选为0.02～0.1M，pH值为6.5，加入的果胶酶的含量为10～100U/g发菜粉，综合处理使藻蓝蛋白渗出得破壁液。

3.根据权利要求1中所述的发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于步骤(3)中所用活性炭为柱状果壳活性炭，目数为20～100目，优选为40～80目；处理方法为三柱串联处理，柱下清液与上柱溶液透光率基本一致时开始串珠处理，吸附饱和的炭柱用0.5～5％的氢氧化钠溶液再生，收集柱下在280nm有吸光度值的溶液。

4.根据权利要求1中所述的发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于步骤(4)中硫酸铵盐析步骤为在活性炭处理液中加入固体硫酸铵至浓度为20～35％时去除杂蛋白收集上清液，继续加入硫酸铵至浓度为55～70％时收集沉淀。

5.根据权利要求1中所述的发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于步骤(5)中盐析沉淀使用0.01～0.2M磷酸盐缓冲液溶解后，电渗析脱盐处理，所用电渗析膜为截留分子量小于10KD的离子交换膜，藻蓝蛋白在电渗析脱盐过程中基本无损失。

6.根据权利要求1中所述的发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于步骤(6)中使用的弱碱性阴离子树脂为D301、D311、LS300、LS200中的任意一种。

7.根据权利要求1中所述的发菜中藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于步骤(7)中藻蓝蛋白溶液使用截留分子量为10～15KD的超滤膜浓缩。