CN101570566B

CN101570566B - Vero细胞裂解蛋白、制备方法及其用途

Info

Publication number: CN101570566B
Application number: CN2008100433197A
Authority: CN
Inventors: 史晋; 施松明; 姚越; 刘毅
Original assignee: Shanghai Zerun Biotech Co Ltd
Current assignee: Yuxi Walvax Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2028-04-30
Also published as: CN101570566A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及Vero细胞裂解蛋白、制备方法及其用途。本发明公开了一种制备Vero细胞裂解蛋白的方法，包括下述步骤：Vero细胞培养、收获；细胞裂解；Vero细胞裂解蛋白的纯化；浓缩处理，即为Vero细胞裂解蛋白。本发明还公开了上述方法所制备的Vero细胞裂解蛋白及其用途。本发明所提供了Vero细胞裂解蛋白可作为免疫原建立Vero细胞HCP的检测方法和检测试验的标准品。这种方法制备的Vero细胞裂解蛋白应用范围更大，可以应用于Vero细胞生产疫苗制备过程中的质量控制与分析，并且灵敏度高，重复性好。

Description

Vero细胞裂解蛋白、制备方法及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及Vero细胞裂解蛋白、制备方法及其用途。

背景技术

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是一种理想的疫苗生产基质，其遗传背景清楚，核型稳定，无外源因子污染，适合大规模培养，可用生物反应器生产，保证了疫苗大批量生产的均质性和安全性。多年来，国外已成功的研制了多种采用Vero细胞生产的疫苗并获准上市，包括人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活(纯化)疫苗(IPV)、乙型脑炎灭活疫苗(JE)。采用Vero细胞生产的疫苗有两种生产方式：其一为分泌型病毒培养方式(病毒复制完成后，分泌到细胞外的培养液中)；在分泌型病毒培养过程中，其病毒为利用细胞环境进行病毒复制，造成宿主细胞结构受损，导致细胞死亡，致使细胞破裂后释放大量的宿主细胞结构蛋白于培养液中；同时由于细胞生长增殖需要，在Vero细胞生长增殖的过程中会向培养液中释放大量的促细胞生长因子。其二为非分泌型病毒培养方式，即病毒在宿主细胞内培养(病毒复制完成后，病毒存在于宿主细胞内)，非分泌型病毒如甲肝病毒等在宿主细胞内的培养过程中，病毒的复制不会对宿主细胞产生病变，因此，此类病毒的释放需要采取物理或化学的方法破碎细胞；在收获的病毒液中，除了含有细胞生长增殖过程中释放的促细胞生长因子外，还存在大量的由于细胞破碎而产生的成份更为复杂的细胞裂解蛋白。

经过多年的临床应用，证明Vero细胞作为疫苗生产基质是安全、有效的。但与此同时，不能排除Vero细胞生产疫苗在理论上的潜在致肿瘤性风险。控制该风险的措施有两个：其一为控制Vero细胞的代次在130～150代，其二为降低Vero细胞残余DNA含量、Vero细胞残余蛋白含量。鉴于目前国际上尚无特异性Vero细胞蛋白的检测手段，现仍以疫苗蛋白总量进行间接质量控制。(高恩明et al.国家食品药品监督管理局药品评审中心《关于Vero细胞疫苗残余物质的考虑》，20070112)。而这种情况下，未检出的残余宿主细胞蛋白(Host Cell Protein，HCP)中的某些组分有可能成为疫苗中的过敏原，因此WHO于1998年组织制定了《使用动物细胞作为细胞基质生产生物制品规程》，要求将传代细胞HCP含量降低至可接受水平。这一举动表明WHO已开始关注HCP的含量及其对于疫苗安全性的影响。

田博和丁志芬报道了定量检测疫苗中Vero细胞HCP(田博、丁志芬，中国生物制品杂志.2005，18(2)：159-161，164)；王辉等也报道了疫苗制品中Vero细胞残余蛋白的检测(王辉、张月兰、过琴媛等.中国生物制品杂志.2007，20(2)：937-939，947)。但上述文章中所述Vero细胞残余蛋白检测方法仅针对分泌型病毒培养所制备的疫苗中残余宿主蛋白的检测，并不适用于非分泌型病毒培养所制备的疫苗中残余宿主蛋白的检测。因此，上述文献中所述疫苗中Vero细胞HCP的检测方法尚存在不足。

目前，市面上也没有出售用于检测Vero细胞HCP残余量的试剂盒，其原因主要在于HCP残余量检测过程中需要的几种物质难以制备：其中之一就是Vero细胞裂解蛋白，它可以作为免疫原免疫动物产生抗体-该抗体可用于后续检测反应；并在检测过程中起着试验标准品的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供了检测Vero细胞HCP的标准品和抗原，以备在疫苗生产和质检中检测Vero细胞HCP残余量。

为了解决上述技术问题，

一方面，本发明公开了一种制备Vero细胞裂解蛋白的方法，包括下述步骤：

a)Vero细胞培养、收获；

b)细胞破碎裂解；

c)Vero细胞裂解蛋白的纯化；

d)浓缩处理，即为Vero细胞裂解蛋白。

其中，所述细胞破碎裂解包括细胞化学裂解、渗透破碎、反复冻融、细胞酶裂解、超声波破碎和细胞机械裂解，优选超声波破碎；

所述纯化包括粗纯化和精纯化步骤，粗纯化方法包括等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂抽提法，优选有机溶剂抽提法。精纯化为层析法，包括分子筛层析法、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法、金属离子螯合层析法、共价层析法。

在一实施例中，粗纯化步骤为破碎后的细胞液加入与等体积的三氯甲烷，振摇20分钟，以4000rpm的速度2～8℃离心20分钟，吸取上层蛋白水相。

在一实施例中，精纯化步骤为粗纯化后样品用膜超滤，经疏水柱纯化、分子筛层析，收集所需的目的蛋白。

在实施方案中，所述目的蛋白的收集蛋白峰范围与疫苗生成工艺中病毒及其成分收集峰相同。

在一实施例中，所述病毒及其成分为甲型肝炎病毒及其成分。

在一实施例中，所述疏水柱纯化为Phenyl Sepharose 6FF疏水纯化，上样缓冲液流速为30～60cm/h，后以pH值6.0～7.5的1.0mol/L PB溶液淋洗3CV(管柱体积)，pH6.0～7.5的0.02mol/L PB溶液线性洗脱5CV，收集电导值低于48mS/cm的洗脱液。所述分子筛层析为Sepharose 4 Fast Flow型分子筛凝胶层析，用0.01mol/L PBS(pH7.4)溶液以45cm/h的流速进行洗脱，收集第二洗脱峰。

另一方面，本发明公开了上述方法所制备的Vero细胞裂解蛋白。

在一实施例中，本发明所述的Vero细胞裂解蛋白为蛋白混合物，分子量范围为11KD、17～34KD、55KD、72KD～170KD。

另一方面，本发明公开了上述方法所制备的Vero细胞裂解蛋白在制备Vero细胞HCP检测试剂中的用途。

本发明所提供了Vero细胞裂解蛋白及其制备方法，并以该蛋白作为免疫原建立Vero细胞HCP的检测方法和检测试验的标准品。这种方法制备的Vero细胞裂解蛋白应用范围更大，不仅可以应用于甲肝病毒等胞内非分泌型病毒疫苗，还可以用于其它Vero细胞生产疫苗制备过程中的质量控制与分析，并且特异性强、灵敏度高，重复性好。

附图说明

图1为Vero细胞裂解蛋白制备方法流程图。

图2为Vero细胞Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水凝胶纯化色谱图。

图3为Vero细胞Sepharose 4 Fast Flow分子筛凝胶层析色谱图。

图4为Vero细胞裂解蛋白标准品SDS-PAGE银染图。

图5为Vero细胞裂解蛋白标准品的ELISA双抗体夹心法标准曲线图。

图6为本发明Vero细胞HCP检测方法的特异性试验。

具体实施方式

目前Vero细胞是广泛应用于生产疫苗的传代猴肾细胞系，其中人用疫苗包括狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)、乙型脑炎灭活疫苗(JE)、甲型肝炎灭活疫苗(HAV)，上述疫苗的生产工艺均为本技术领域人员所公知，如甲型肝炎灭活疫苗(HAV)的Vero细胞生产工艺可参考中国专利号ZL0210685.9中的描述。本发明中，Vero细胞，保藏号为ATCC CCL-81，如Kistner等人(Vaccine 1998，16：960-968)或WO96/15231中所描述的，细胞适应于生长在有血清、无血清或无血清和蛋白质的培养基中。Vero细胞培养和所涉及试剂均为本技术领域人员所公知，可参考中国专利号ZL 0210685.9中的描述。对于在无血清培养基中的生长，可使用补充有无机盐、氨基酸、碳酸氢钠(2g/L)和酵母或大豆提取物(1-10g/L)的DMEM HAM’s F12基本培养基或其它培养液。

Vero细胞裂解蛋白产物亦经由化学的(例如有机溶剂)、酶促的(例如溶菌酶以及EDTA)、机械的、或是物理细胞破碎方法(例如菌化作用、超音波振荡、高压均化、摩擦搅动)。分离胞内产物亦包括机械和非机械方法的组合。

细胞外(细胞培养基)或是细胞内(溶解物)产物的纯化可用多种方法进行，以有利于产物纯化或是去除非需要的污染物。一种方法为固-液相分离(例如离心/沉淀、萃取、过滤)。另一种方法是浓缩(例如蒸发、超滤、吸附、沉淀)。再一种方法为层析法(例如分子筛层析法、离子交换色层分析法、色层聚集法、疏水层析法、亲和层析法、金属离子螯合层析法、共价层析法)。本领域技术人员容易实施这些技术。若有需要，也可以应用杀菌技术，例如过滤或加热或照射(有关蛋白质纯化的更多资讯请参见Ratledge C，Kristlansen B(2001)Basic biotechnology，2nd.Cambridge University Press，Cambridge，U.K.)。

在本发明中，“效价”采用终末效价，即是能检测到阳性抗体的血清最大稀释度来表示。

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量和/或体积，除非特别说明。

实施例1：Vero细胞裂解蛋白的制备

材料来源：

Vero细胞工作种子细胞：ATCC系列号为No：CCL-81

主要仪器设备：

细胞超声破碎仪：SONICS VCF1500，最大输出功率为1500W

超滤器：Pellicon 2 Cassette Filter；(Millipore公司)；

超滤膜，Biomax-100A(MWCO＝100KD)(Millipore公司)；

超滤浓缩器：(MWCO＝100KD)(Millipore公司)；

色谱纯化仪：

(GE Healthcare公司)

色谱柱：BPG 140/950；INdEX 140/500(GE Healthcare公司)

纯化介质：Phenyl Sepharose 6 Fast Flow型疏水凝胶(GE Healthcare公司)Sepharose 4 Fast Flow型分子筛凝胶(GE Healthcare公司)

制备方法：参见图1

1.细胞培养收获：取工作细胞库中的1支Vero细胞株细胞管，将细胞接种到细胞培养瓶中，加入含10％小牛血清的199培养基后置37±1℃培养。待复苏细胞生长成致密单层后用胰酶消化Vero细胞进行传代扩增，置35±1℃培养25天收获。用胰酶进行消化，以3500rpm、4℃离心30分钟，收集细胞沉淀。作为裂解蛋白制备样品源备用。

2.细胞破碎裂解：收获的Vero细胞用超声方法进行破碎裂解，以1400W输出功率，细胞破碎至无完整细胞结构。

3.氯仿抽提蛋白：在破碎后的细胞液中加入等体积的氯仿，在往复式振荡器上以300rpm的速率振荡20min，使氯仿与细胞液充分接触，待细胞碎片沉淀后，用4000rpm、4℃、20min离心，抽取上层的蛋白水相，向离心杯中补充等量的0.01mol/L PBS(pH7.8)反复提取4次。

4.浓缩：合并所有的抽提液，用MWCO＝100KD的超滤膜进行浓缩；超滤浓缩液中加入PB缓冲盐，并使缓冲盐充分溶解，PB终浓度为1.0mol/L、pH6.8。

5.纯化：以50cm/h的流速经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow型疏水凝胶吸附，吸附完毕用1.0mol/L PB(pH6.8)溶液淋洗3CV(管柱体积)后，开始用0.02mol/LPB(pH6.S)溶液进行线性洗脱5CV，收集电导值低于48mS/cm的洗脱液，参见图2；收集的洗脱液用MWCO＝100KD的超滤膜进行浓缩，后上样于Sepharose 4 Fast Flow型分子筛凝胶，用0.01mol/L PBS(pH7.4)溶液以45cm/h的流速进行洗脱，收集第二洗脱峰，参见图3。

6.再次浓缩：将收集液先经用MWCO＝100KD的超滤膜浓缩至200ml，再用50ml、MWCO＝100KD超滤离心管浓缩至30ml，即可获得特异性Vero细胞裂解蛋白。

7.纯化后Vero细胞裂解蛋白SDS-PAGE电泳，银染。

实验结果：Lowry法测得Vero细胞裂解蛋白浓度为540μg/ml，本发明的相关实验数据见以下列表。

表1各纯化工艺阶段样品蛋白含量变化表

SDS-PAGE、银染，结果参见图4，1：标准分子量蛋白；2：步骤4的Vero细胞裂解总蛋白；3：纯化后Vero细胞裂解蛋白，结果表明经过纯化得到的Vero细胞裂解蛋白，含多种蛋白组分，分子量范围为55KD、11KD处及170KD～72KD、34～17KD之间。

实施例2抗Vero细胞裂解蛋白多抗制备

材料来源：

纯化Vero细胞裂解蛋白来源于实施例1。

试验动物

家兔(普通级)来源于上海普欣生物公司

豚鼠(清洁级)来源于中国科学院上海实验动物中心

其它仪器试剂

Protein-A亲和层析柱、羊抗兔-HRP、羊抗豚鼠-HR均购白KPL公司；福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购自Sigma公司。

1.免疫家兔：

免疫三只家兔，初次免疫每只家兔用0.5mg实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏完全佐剂，乳化充分后，背部皮下注射6～8点。4周后第二次免疫：用0.5mg实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏不完全佐剂，乳化充分后，皮下、肌肉多点注射。第二次免疫10天后同法进行第三次免疫。最后于第三次免疫2周后进行第四次免疫一周后采血，并测定效价。

表2免疫兔血清效价

2.免疫豚鼠：

免疫三只豚鼠，初次免疫每只豚鼠用0.2mg实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏完全佐剂，乳化充分后，在背部皮下注射5～6点，每点0.1ml。2周后第二次免疫：每只豚鼠用0.4mg实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏不完全佐剂，乳化充分后，皮下多点注射。第二次免疫10天后同法进行第三次免疫。最后于第三次免疫2周后进行第四次免疫一周后采血，并测定效价。

表3免疫豚鼠血清效价

3.抗血清纯化：

分别选择上述步骤中两种动物效价较高的抗血清进行纯化。用市售预装Protein-A Sepharose affinity column进行亲和层析，得到抗Vero细胞裂解蛋白IgG，测定280nm和260nm吸光度。计算蛋白含量：C(mg/ml)＝1.45×OD_280nm-0.74×OD_260nm。

表4纯化后抗体蛋白含量

4.纯化后抗体效价检测：

采用间接ELISA法检测，用碳酸缓冲液(0.05mol/L CB，pH9.6)将实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白稀释至10μg/ml，100μl/孔包被，4℃过夜。次日用PBS洗涤2次，加入2％BSA封闭，125μl/孔，室温2h，PBS洗涤二次。将步骤3中抗Vero细胞裂解蛋白IgG分别稀释至1mg/ml后再系列10倍稀释，加入微孔板，100μl/孔，37℃孵育60分钟后，洗涤拍干，各孔分别加入100μl酶标二抗(羊抗兔-HRP，羊抗豚鼠-HRP)37℃孵育30分钟后，洗涤拍干。各孔加入显色液A液、B液37℃孵育15分钟。2mol/L硫酸终止反应，在酶标仪上比色。计算抗体效价。

表5纯化后抗体效价

5.酶标抗体制备

选用高碘酸钠法(骆加里等，生物化学与生物物理学报，1981，13：1)，分别选取步骤3中抗体效价最高的抗Vero细胞裂解蛋白IgG(1#豚鼠抗、2#兔抗)标记辣根过氧化物酶(HRP)。

表6HRP-抗Vero细胞裂解蛋白IgG

实施例3：ELISA双抗体夹心法的建立：

包板：将实施例2制备的豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG用0.05mol/LCB(pH 9.6)稀释成5～20μg/ml，包被微孔板，100μl/孔，4℃过夜。次日，用0.01mol/L PBS(pH 7.4)洗涤2次，每孔加2％BSA-PBS 150μl，置室温封闭2h。PBS洗涤2次，风干，用自封袋密封，每袋内置一小包干燥剂。4℃保存，备用。

加样品：用PBS-T将实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白标准品稀释成4000ng/ml、2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml。各孔分别加入100μl上述标准品、0.01mol/L PBS-T和待测样品。37℃反应60min，用PBS-T洗涤4次，拍干。

加HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG：用PBS-T(含10％小牛血清及0.03％proclin300)将实施例2制备的HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG稀释成适当比例(1∶500～1∶1000)。每孔加入100μl已稀释的HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG，振荡混匀，37℃反应60min，用PBS-T洗涤4次，拍干。

显色：每孔加入底物显色剂A(0.1mol/L乙酸钠-柠檬酸缓冲液，含0.0038mol/L过氧化氢，2万单位/L庆大霉素，pH5.0)，显色剂B(0.02mol/L Tris盐酸缓冲液，含0.0005mol/L二水合乙二胺四乙酸二钠，0.0013mol/L TMB盐酸盐)，37℃反应10min。

比色：每孔加入终止液(2mol/L H₂SO₄)50μl，振荡混匀。于酶标仪450nm波长读取各孔OD值。

计算：将各浓度标准品及样品OD值减去0ng/ml标准品(即样品稀释液：0.01mol/L PBS-T)的OD值(消零)，绘制标准曲线。显示直线回归方程及R²值。参照标准曲线计算计算样品Vero细胞HCP含量。

实施例4 ELISA双抗体夹心法检测Vero细胞HCP特异性试验

实施例3所述方法主要用来检测Vero细胞疫苗生产中的中间产品中宿主细胞蛋白含量，这些中间产品可能含有的除宿主细胞蛋白外的其他成分不应产生对本检测的干扰，这些成分主要有：小牛血清、细胞培养液、BSA、卵清蛋白、甲型肝炎病毒(HAV)、抗HAV-IgG、胰酶、水解乳蛋白。因此，以小牛血清、细胞培养液、2％BSA、2％卵清蛋白、HAV(1∶4稀释，2.7ug/ml)、抗HAV-IgG(2IU/mL)、0.25％胰酶、2％水解乳蛋白作为样品，按照实施例3所述进行检测，判断该检测方法的特异性。

结果参见图6，图中1)Vero细胞裂解蛋白标准品；2)PBS-T；3)细胞培养液；4)小牛血清；5)BSA；6)卵清蛋白；7)HAV；8)HAV-IgG；9)胰酶；10)水解乳蛋白。结果表明本发明的检测方法与小牛血清、细胞培养液、BSA、卵清蛋白、HAV、抗HAV-IgG、胰酶、水解乳蛋白无交叉反应，具有很高的特异性。

实施例5：Vero细胞裂解蛋白作为标准品用于检测疫苗中Vero细胞HCP残留量

1.标准品的相关性

实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白标准品，用0.01mol/L PBS-T的样品稀释液自4000ng/ml倍比稀释至62.5ng/ml的不同浓度，按照实施例3的方法检测。以Vero细胞裂解蛋白浓度为纵坐标，将各浓度标准品OD值减去0ng/ml标准品(即样品稀释液：0.01mol/L PBS-T)的OD值(消零)×1000为横坐标，绘制其曲线图参见图5，为一条近似的直线，标准品浓度在62.5～4000ng/ml之间时，相关性成立(R²≥0.99)。

表7Vero细胞裂解蛋白标准品测定结果

Vero细胞标准品含量(ng/ml)	62.5	125	250	500	1000	2000	4000
								OD_450nm	0.057	0.100	0.217	0.396	0.880	1.623	3.135

2.疫苗样品检测及重复性试验：

参考中国专利号ZL 0210685.9中的描述制备甲型肝炎灭活疫苗样品4批，按照实施例3的方法连续检测6次，Vero细胞HCP含量结果如表8所示。平均CV＝6.2％，重复性良好。

表8疫苗样品Vero细胞HCP含量

3.检测疫苗样品中总蛋白与检测Vero细胞HCP的比较。

对上述四批疫苗样品用Lowry法对总蛋白进行检测，并且将结果与Vero细胞甲型肝炎灭活样品Vero细胞HCP检测结果进行对照。证明本发明作为以Vero细胞生产甲型肝炎灭活疫苗的质量标准检测之一，较以疫苗蛋白总量进行间接质量控制目的更明确，提高了疫苗样品的质量标准。对疫苗的安全性更有保障。

表9两种检测结果比较

	NO.1批疫苗样品	NO.2批疫苗样品	NO.3批疫苗样品	NO.4批疫苗样品
					总蛋白(ug/ml)	3.3	2.4	2.2	1.5
Vero细胞HCP(ng/ml)	382	395	289	234

4.回收率试验

按照实施例3所述步骤，以上述NO.3批疫苗样品(对倍稀释后)稀释实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白标准品，与用PBS-T稀释的Vero细胞裂解蛋白标准品同时检测，Vero细胞HCP在疫苗样品中的回收率平均为96％。表明疫苗样品基质对本方法测定Vero细胞HCP的特异性无任何干扰。

表10Vero细胞裂解蛋白标准品(HCP)及疫苗样品(对倍稀释)测定结果

HCP标准品含量(ng/ml)	62.5	125	250	500	1000	2000	4000	疫苗样品(ng/ml)	133
										OD₄₅₀	0.057	0.100	0.217	0.396	0.880	1.623	3.135	疫苗样品OD₄₅₀	0.130

表11回收率检测

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims

1.一种制备Vero细胞裂解蛋白的方法，包括下述步骤：

a)Vero细胞培养、收获；

b)细胞破碎裂解；

c)Vero细胞裂解蛋白的纯化；

d)浓缩处理：将收集液先经用MWCO=100KD的超滤膜浓缩，再用MWCO=100KD的超滤离心管浓缩，即为Vero细胞裂解蛋白；

所述纯化包括粗纯化和精纯化步骤；所述精纯化步骤为粗纯化后样品用MWCO=100KD膜超滤，经疏水柱纯化、分子筛层析，收集所需的目的蛋白，所述目的蛋白的收集蛋白峰范围与疫苗生成工艺中病毒及其成分收集峰相同；所述疏水柱纯化为Phenyl Sepharose 6FF疏水纯化，上样缓冲液流速为30～60cm/h，后以pH值6.0～7.5的1.0mol/L PB溶液淋洗3管柱体积，pH6.0～7.5的0.02mol/L PB溶液线性洗脱5管柱体积，收集电导值低于48mS/cm的洗脱液，所述分子筛层析为Sepharose 4 Fast Flow型分子筛凝胶层析，用pH7.4 0.01mol/L PBS溶液以45cm/h的流速进行洗脱，收集第二洗脱峰。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述细胞破碎裂解为细胞化学裂解、渗透破碎、反复冻融、细胞酶裂解、超声波破碎或细胞机械裂解。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述细胞破碎裂解为超声波破碎。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述粗纯化方法为有机溶剂抽提法。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述有机溶剂抽提法为破碎后的细胞液加入与其等体积的三氯甲烷，振摇20分钟，以4000rpm的速度2～8℃离心20分钟，吸取上层蛋白水相。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述病毒及其成分为甲型肝炎病毒及其成分。

7.按照权利要求1-6任一项方法所制备的Vero细胞裂解蛋白。

8.根据权利要求7所述的Vero细胞裂解蛋白，其特征在于所述的Vero细胞裂解蛋白为蛋白混合物，分子量范围为11KD、17～34KD、55KD、72KD～170KD。

9.权利要求7所述的Vero细胞裂解蛋白在制备Vero细胞HCP检测试剂中的用途。