WO2009132484A1

WO2009132484A1 - Vero细胞裂解蛋白、其制备方法以及包含该蛋白的vero细胞hcp检测试剂盒

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Publication number: WO2009132484A1
Application number: PCT/CN2008/001434
Authority: WO
Inventors: 崔志英; 刘毅; 刘伟旭; 史晋; 施松明; 姚越
Original assignee: 上海泽润生物科技有限公司
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2008-08-07
Publication date: 2009-11-05
Also published as: BRPI0822510A2; BRPI0822510B8; BRPI0822510B1; RU2010143974A; KR101632635B1; RU2526131C2; KR20110009210A

Description

FPCH08160059

Vero细胞裂解蛋白、其制备方法以及包含该蛋白的 Vero细胞 HCP检測试剂盒技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及 Vero细胞裂解蛋白、其制造方法以及使用该蛋白的 Vero细抱 HCP检测试剂盒.

背景技术

Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）是一种理想的疫苗生产基质，其遗传背景清楚，核型稳定，无外源因子污染，适合大规祺培养，可用生物反应器生产，保证了疫苗大批量生产的均质性和安全性.多年来，国内外已成功的研制了多种采用 Vero细胞生产的疫苗并获准上市，包括人用狂犬病纯化疫苗、脊髄灰质炎灭活（纯化）疫苗（1FV ) 、乙型脑炎灭活疫苗（JE ) 。采用 Vero细胞 _: 生产的疫苗有两种生产方式：其一为分泌型病毒培养方式（病毒复制完成后，分泌到细脃外的培养液中）；在分泌型病毒培养过程中，其病毒为利用细胞环境进行病毒复制，造成宿主细胞结构受损，导致细肐死亡，致使细胞破裂后释放大量的宿主细胞结构蛋白于培养液中；同时由于细跑生长增殖需要，在 Vero 细胞生长增殖的过程中会向培养液中释放大量的促细胞生长子.其二为非夯泌型病毒培养方式，即病毒在宿主细胞内培养（病毒复制完成后，病毒存在于宿主细胞内），非分泌型病毒如甲肝病毒等在宿主细胞内的培养过程中，病毒的复制不会对宿主细胞产生病变，因此，此类病毒的释放需要采取物理或化学的方法破碎细胞；在收获的病毒液中，除了含有细胞生长增殖过程中释放的细胞生长因子外，还存在大量的由于细胞破碎而产生的成份更为复杂的细胞裂解蛋白.

经过多年的临床应用，证明 Vero细作为疫苗生产基质是安全、有效的;, 但与此同时，不能排除 Vero细胞生产疫苗在理论上的潜在致肿瘤性风险. 镎制该风险的措施有两个：其一为控制 Vero细肐的代次在 130 ~ 150代，其二为降低 Vero细胞残余 DNA含量、 Vero细胞残余蛋白含量。鉴于目前国际上尚无特异性 _Vero细胞蛋白的检测手段，现仍以疫苗蛋白总量进行间接质量控制. (高恩明 et al. 国家食品药品监管理局药品评审中心《关于 Vero细孢疫苗残余物质的考虑》， 20070112 )。而这种情况下，残余宿主细胞蛋白（Host Cell Protein ,HCP ) 中的某些组分有可能成为疫苗中的过敏原， WHO于 1998年组织制定了《使用动物细胞作为细跑基盾生产生物制品规程》，要求将传代细胞 HCP含量降低至可接受水平. 这一举动表明 WHO 已开始关注 HCP的含

确认本量及其对于疫苗安全性的影响，

田博和丁志芬报道了定量检測疫苗中 Vero细胞 HCP的方法 (田博、丁, 芬，中国生物制品杂志.2005，18(2):159-161，164)；王辉等也报道了疫苗制品中 Vero细胞残余蛋白的检测 (王辉、张月兰、过琴媛等. 中国生物制品杂志 . 2007， 20(2): 937-939,947). 但上迷文章中所述 Vero细胞残余蛋白检测方法仅针对^ ^: 泌型病毒培养所制备的疫苗中残余宿主蛋白的检测，并不适用于非分泌型病 · 培养所制备的疫苗中残余宿主蛋白的检测. 因此，上述文献中所述在疫苗中 ' Vero细胞 HCP的检测方法尚存在不足.

目前，国内外尚无检测 Vero细胞 HCP残余量的试剂盒出售.其原因主 ^ 在于 HCP残余量检测过程中需要的几种物质难以制备：其中之一就是 Vero 细胞裂解蛋白，它可以作为免疫原免疫动物产生抗体 -该抗体可用于后续检测反应；并在检测过程中起着试验标准品的作用，发明内容

本发明的目的是提供 Vero细胞裂解蛋白及其制备方法，该蛋白作为检 Vero细胞 HCP的标准品和抗原，用于在疫苗生产和质检中检測 Vero细胞 HCP 残余量.

本发明的另一个目的是提供包含 Vero细跑裂解蛋白的试剂盒，以克服现有 Vero细胞 HCP的检測方法存在不足，

为了达到上述目的，

一方面，本发明提供制备 Vero细胞裂解蛋白的方法，其包括：

a) Vero细胞培养、收获；

b) Vero细胞破碎裂解；

c) Vero细胞裂解蛋白的纯化；

d) 浓缩处理，即得 Vero细胞裂解蛋白.

关于 Vero细胞培养、收获： Vero细胞是被接受并被批准用于生产适用于疫苗制造的传代狼腎细胞系，其中所述涉及人用疫苗包括人用狂犬病纯化疫：苗、脊髄灰质炎灭活疫苗（IPV )、乙型脑炎灭活疫苗（JE )、甲型肝炎活疫苗（HAV ) ，上述疫苗的生产工艺均为本技术领域人员所公知，如甲型肝炎灭活疫苗（HAV )的 Vero细胞生产工艺可参考中国专利号 ZL 0210685.9 t 的描述.

本发明中采用的 Vero细胞可参照文献方法提取制备，例如可参照中国专利 ZL 0210685.9, 也为可得细皰，例如得自 ATCC ( ATCC 系列号为 No: CCL-81 ) . 正如 Kistner等人 (疫苗 ( Vaccine). 1998, 16: 960-968 )或

W096/15231中所描述的， Vero细胞适应于生长在有血清、无血清或无血清和蛋白质的培养基中. Vero细 J!fc培养和所涉及试剂均为本技术领域人员所公^，可参考美国专利号 4， 783, 407和 WO2003/049767中的描述. 对于在无血清^ 养基中的生长，使用补充有无机盐，氨基酸、碳酸氢钠（2 _g L )和酵母或豆提取物（l-10g/L )的 DMEM HAM's F12基本培养基或其它培养液.

关于细跑破碎裂解：本发明所述 Vero细孢裂解蛋白产物可经由化学的（例如有机溶剂 )、醉促的（例如溶菌酶以及 EDTA )、机械的、或是物理的（例如菌化作用、超音波振荡、高压均化、摩擦搅动）方法进行细孢破碎裂解，分离胞内产物亦包括机械和非机械方法的組合.优选的破碎裂解方法包括细皰化学裂解、渗透破碎、反复冻融、细胞晦裂解、超声波破碎和细胞机械裂解，更优选超声波破碎.

关于纯化：细胞外（细跑培养基）或是细胞内（溶解物）产物的纯化可用多种方法进行，以有利于产物純化或是去除非需要的污染物.一种方法为固液相分离（例如离心 /沉淀、萃取、过滤） . 另一种方法是浓缩（例如蒸发^ 超滤、吸附、沉淀），再一种方法为层析法（例如分子筛层析法、离子交换; & 层分析法、色层聚集法、疏水交互层析法、亲和层析法、金属离子螯合层析^、共价层析法） . 本领域技术人员容易实施这些技术，若有需要，也可以应用菌技术，例如过滤或加热或照射（有关蛋白盾纯化的更多资讯请参见

RatledgeC, KristlansenB ( 2001 ) Basic biotechnology， 2nd ed · Cambridge

University press, Cambridge， U.K . ) .

一种实施方案中，所述纯化包括粗纯化和精纯化步骤，粗純化方法包括等电点沉淀法、盐析法和有机溶刑抽提法，优选有机溶剂抽提法.精纯化为层析法，包括分子筛层析法、离子交换层析法、竑水层析法、亲和层析法、金属离子螫合层析法、共价层析法.

粗纯化的一种实施方案中，粗纯化步猓为破碎后的细胞液加入与等体积的三氯甲烷，振摇 20~30分钟，以 4000rpm的速度 2~8Ό离心 20-25分钟，吸取上层蛋白水相.

粗纯化的一种优选实施方案中，粗纯化步骤为破碎后的细胞液加入与等体积的三氯甲烷，振摇 20分钟，以 4000rpm的速度 ²~8Ό离心 ²0分钟，吸取层蛋白氷相。精纯化的一种实施方案中，精纯化步骤为粗纯化后样品用膜超滤，经跪水柱纯化、分子篩层析，收集所需的目的蛋白. 所述目的蛋白的收集蛋白峰范围与疫苗生成工艺中病毒及其成分收集峰相同，所述病毒及其成分的非限制性例子为甲型肝炎病毒及其成分.

优选实施方案中，所述竑水柱纯化为 Phenyl Sepharose 6FF竑水纯化， t 样緩冲液流速为 30 - 60cm/h, 后以 pH值 6.0 ~ 7.5 的 1.0 mol/L PB溶液淋洗 3CV (管柱体积）， pH6.0 ~ 7.5的 0.02 mol/L PB溶液线性洗脱 5CV, 收集导值低于 48 mS/cm的洗胧液. 所述分子锌层析为 Sepharose 4 Fast Flow型分子筛凝胶层析，用 0.01 mol/L PBS ( pH7. )溶液以 45cm/h的流速进行洗脱，收集笫二洗胧峰.

另一方面，本发明提供上述方法所制备的 Vero细孢裂解蛋白，

本发明 Vero细胞裂解蛋白为蛋白混合物，其分子量范围包括 11KD、

17~34KD、 55KD、 72KD~170KD。

本发明 Vero细胞裂解蛋白可用于制备 Vero细胞 HCP检测试剂，可以该蛋白为免疫原建立 Vero细胞 HCP的检测方法和检测试验的标准品.

将本发明 Vero细皰裂解蛋白作为抗原可制备相应的抗体.该抗体与 Vero 细胞裂解蛋白具有特异性结合能力，本抗体为多克隆抗体，其非限制性的例为兔^ Vero细胞裂解蛋白 IgG和豚鼠抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG.

再一方面，本发明提供 Vero细胞 HCP检测试剂盒，其包含固相、位于相中的抗体、标记物偶联抗体、蛋白标准品，其特征在于所述抗体为抗本发^ 的 Vero细胞裂解蛋白抗体，所述蛋白标准品为本发明的 Vero细胞裂解蛋白. 一种优选实施方案中，本发明所述的 Vero细胞 HCP检测试剂盒进一步包含生物素修饰的抗体、标记物偶联的抗生物素蛋白.

另一种优选实施方案中，本发明所述的 Vero细胞 HCP检测试刑盒进一步包含 2， 4 -二硝基苯盼修饰的抗体、标记物偶联的抗 2， 4 -二硝基苯盼蛋白 · 本发明所述试剂盒，根据需要也可包含用于检测上述标记物偶联的（或样记的）抗生物素蛋白或标记物偶联的（或标记的）抗 2，4 -二硝基苯盼蛋白的试剂.

关于蛋白标准品：

本发明试剂盒中，以根据上迷制备方法得到的本发明 Vero细胞裂解蛋白作为蛋白标准品，用于在疫苗生产和质检中检测 Vero细胞 HCP残余量. 关于抗体:

如如本本文文所所用用，，所所说说""抗抗 VVeerroo细细跑跑裂裂解解蛋蛋白白抗抗体体""是是指指将将上上迷迷 VVeerroo细细胞胞裂裂解解蛋蛋白白作作为为抗抗原原制制备备得得到到的的抗抗体体.. 该该抗抗体体与与 VVeerroo

能力，本抗体为多克隆抗体.其非限制性的例子为兔抗 Vero细胞裂解蛋白 I_gG 和豚鼠抗 Vero细胞裂解蛋白 I_gG。

抗 Vero细胞裂解蛋白抗体的制备可通过以 Vero细胞裂解蛋白为抗原，可以通过本领域已知的常规方法获得相应的各种抗体.

举例而言，兔抗 Vero细跑裂解蛋白 IgG或豚鼠抗 Vero细皰裂解蛋白 IgG 可采用以下步骤制备：

1 )用本发明 Vero细胞裂解蛋白对家兔或豚鼠进行 4次免疫、采血：对于家兔，例如体重为 2kg,初次免疫剂量为 0.5 mg蛋白 /只， 4周后进衧第二次免疫，剂量为 0.5 mg蛋白 /只， 10天后同法进行第三次免疫，最后于第三次免疫 2周后进行第四次免疫，一周后采血；

对于豚鼠，例如体重为 250g，初次免疫剂量为 0.2 mg蛋白 /只， 2周后进行第二次免疫，剂量为 0.4 mg蛋白 /只， 10天后同法进行第三次免疫. 最后于第三次免疫 2周后进行第四次免疫，一周后采血；

2 )分别选择该两种动物效价较高的抗血清进行纯化；

3 )纯化后效价检测.

IgG纯化可采用硫酸铵盐析、辛酸-砥酸铵法、 Protein-A亲和柱层析等方法。

在本发明中， "效价 "采用终末效价，即是能检测到阳性抗体的血清最大稀幹度来表示.

关于标记物偶联抗体（或又称标记的抗体）：

正如本领域技术人员所公知的，采用过氡化物醉、 p-D-半乳糖苷酶、减性磷酸酶及 6-磷酸葡糖脫氢蘇等酶标记（或偶联）、荧光标记（或偶联）或用放射性同位素标记（或偶联），可以使纯化的抗体定量化，将这样的抗体称 4 为"标记物偶联抗体"或"标记的抗体".如采用醉标记抗体时，该醉在合适的皋物存在下进行反应时，将晦联反应生成物作为标记物，可定量或定性检测与^ 体特异性结合的抗原，另外，应用荧光标记和放射性同位素标记抗体时，将荧光和放射活性作为标记物时，也可定量或定性检测与抗体特异性结合的抗原. 在"标记物偶联抗体"或"标记的抗体"中进一步包含通过生物素、 ²， 4- 硝基苯盼等修饰的抗体. 生物素与抗生物素蛋白特异地结合，而 ²， 4-二硝基苯盼与抗 2， 4-二硝基苯盼蛋白特异地结合. 进而，上述标记的抗体可通过^、核素或荧光素标记的抗生物素蛋白和抗 2， 4-二硝基苯盼蛋白进行定量或定性: 测定，

上述标记的抗体可通过生物素标记的试刑 (NHS-LC-Biotin, Pierce公司）和 /或如带有偶联剂的过氧化物嗥 ( Maleimide activated HRP, Pierce公司）与抗体反应制得.

本发明 Vero细胞 HCP检测试刑盒的一些实施方案中，所述标记物偶联抗体中标记物包括但不限于醉、核素、荧光素. 其中，所述蘇非限制性地选禽过氧化物醉、 P-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸醉及 6-磚酸葡糖脱氢酶；所述核素非限制性地选自 ³H、 ¹⁸⁸Re、 ¹³¹1；荧光素非限制性地选自异硤 L酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异砥酸罗丹明、 3价镧系螯合物如铕（ Eu³⁺ )、铽（ Tb³⁺ )、铈（Ce³⁺ )等，

当所述标记物为晦时，本发明试剂盒还包括辅助试刑，包括醉联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗緩冲液.

一种辅助试刑配制方法如下：

1.底物溶液：璘酸-柠檬酸緩冲液（pH5.0 )配制的 3 % H₂0₂;

2.显色液： 0.0004mol/L TMB甲醇溶液或 0.0013mol/L TMB盐酸盐溶液；

3.反应终止液： 2mol/L碗酸；

4.清洗緩冲液： PBS溶液.

关于固相：

在本文中，"固相"是指能用本发明的方法在其上对多个液体样品进行分^ 检验的任何固体基质，如 ELISA试验平板、蛋白芯片栽体如薄膜、玻璃片等': 如本文所用，固相的 "反应孔"是指固相上作为平板样品接受区的范围.典型的固相的反应孔，是通过在平板表面形成凹陷来得到的，该凹陷足够接收并容纳样品体积和检测过程中任一步中所加入的緩冲液或洗涤液的体积。如本文所.: 用，对于靶分子的 "测量"，是指检测、定量或者测定某一分析物或靶分子的量. 本发明提供的 Vero细胞 HCP检测盒有效应用于 Vero细孢 HCP残余量的检测，其应用步骤如下：提取样本；采用上述 Vero细胞 HCP检测试剂盒检测：分析结果.

关于检测方式：

抗体是许多应用于医学、兽医学和其它领域的检测技术中的关键试剂 .这类测定包括许多常规使用的免疫測定技术，例如蛋白芯片、醉联免疫吸附测：定法（ELISA )、放射免疫测定（ RIA )、免疫组织化学（ IHC )和免疫荧光（ IF ) 测定.这些技术的一般指导，参见 Ausubel等 (1987 )的" Current Protocols Molecular Biology" John Wiley and Sons， New York, N.Y. 另外，免疫测定可是一种用来观测组织样品中的免疫組织化学（IHC )染色或免疫荧光（IF ) , 方法，参见" Principles and Practice of Immunoassay" (1991) Christopher P.Price和 David J.Neoman, Stockton Press, New York, N.Y.

在一种具体实施方案中，本发明的分析方法为免疫醉分析法，其通过使用针对待测的特定分子形式的 Vero细胞裂解蛋白多克隆抗体，来测定如疫苗样品等中总的（非复合的加上与抗体复合的）或游离的（非复合的） Vero细胞. 裂解蛋白量. 所述免疫酶分析法的一种非限制性的例子如下：

1. 平板包被：用抗 Vero细胞裂解蛋白抗体，以最佳浓度包被于试验平板的反应孔的表面，最佳抗体浓度是通过用已知浓度的 Vero细胞裂解蛋白一条标准曲线来确定的，该曲线在所要求的有效浓度范围中具有所要求的杲度和精确度. 对于 Vero细胞裂解蛋白，本试剂盒可以检测的有效 Vero细; !fe i 裂解蛋白浓度范围为 62.5 ng/ml到 4000ng/ml，本领域的普通技术人员，可以方便地确定在所要求范围内是否具有合适灵敏度和精确度，而无须进行多余的实验.

2. 平板洗涤：将包被溶液倒去，加入洗涤緩冲液（每孔大约 400徵升）然后倒去.按要求将这个洗涤循环重复多次.洗涤缓冲液可选为 0.01 mol/L磷酸緩冲液 (0.0027 mol/L 氯化钾， 0.137 mol/L氯化钠， ρΗ7·4，含有 0.01 % w^v TritonX-100 ) .

3.平板封闭：将含有蛋白质和去垢剂封闭緩冲液 (含 1% BSA /0.1 % Triton X-100 的包被緩冲溶液）加入反应孔. 平板可以此形式储存.

4. 样品和标准品的加入：平板按上述方式进行洗涤，

向平板反应孔内分別加入标准品与待测样本各 100μΙ，然后每孔分別偶联物试剂 50μΙ , 轻轻混合 15秒后置 37*C縛育 60分钟，丟弃反应液，用緩冲液清洗反应板 5次，吸干多于水分，向反应孔内加入 50μ1显色液，置于 37/C 孵育 15分钟，终止反应，将反应板置于酶标仪上读取光密度值. 每一孔内^ 色反应不同，光密度值也不同-

5. 用于定量复合物显色的合适蟓底物的例子有：用于碱性磷酸嗥的硝基 r 苯磷酸，或用于辣根过氧化物的四甲基联苯胺璜酸盐（TMBS ) , 显色的程麾可通过吸光度单位（AU，如果是对硝基盼，读取 405nm 的吸光度；如果是 TMBS, 读取 450nm 的吸光度）读出，可以作为测试样品中 HCP的含量的指标，其确切浓度可以通过读取测试样品的吸光度、再参考由 HCP标准品所作出的标准曲线来换算得出.

6. 读数当得到足够检测信号时，使用如全波长晦标仪或荧光瑭标仪等^ 器对信号进行测量.

7. 数据处理用己知浓度的 Vero细胞裂解蛋白标准溶液所获得的检测信号，来建立一奈校正曲线. 该校正曲线用于换算出试验样品中 Vero细胞裂解蛋白的浓度.

有益效果

本发明提供了 Vero细胞裂解蛋白及其制备方法，该蛋白可作为免疫原建立 Vero细胞 HCP的检测方法和检测试验的标准品. 本发明 Vero细胞裂解蛋白应用范围广泛，不仅可以应用于曱肝病毒等胞内非分泌型病毒疫苗，还可以用于其它 Vero细胞生产疫苗制备过程中的质量控制与分析，并且特异性强:、灵敏度高，重复性好.

本发明还提供了相应的 Vero细胞 HCP检测试剂盒，该试剂盒特异性；灵敏度高，重复性好，不仅可以应用于甲肝病毒等非分泌型病毒疫苗，还可用于其它 Vero细胞生产疫苗制备过程中的质量控制与分析.

附图说明

图 1为 Vero细孢裂解蛋白制备方法流程图.

图 2 为 Vero细胞 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow兢水凝胶纯化色谱图 . 图 3 为 Vero细胞 Sepharose 4 Fast Flow分子筛凝胶层析色谙图 .

图 4为 Vero细胞裂解蛋白标准品 SDS-PAGE银染图.

图 5为 Vero细胞裂解蛋白标准品的 ELISA双抗体夹心法标准曲线图. 图 6为本发明 Vero细肐 HCP检测方法的特异性试验，

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明.应理解，这些实施例仅用子 ¾1 明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件. 比例和百分比基于 i 量或体积，除非特別说明。

材料来源：

g Vero细抱工作种子细胞： ATCC 系列号为 No: CCL-81 试验动物

家兔（普通级，体重规格： 2Kg )来源于上海普欣生物公司

豚鼠（清洁级，体重规格： MOg )来源于中国科学院上海实验动物中心主要仪器试剂：

细抱超声破碎仪： SONICS VCF1500, 最大揄出功率为 1500W; 超滤器； Pellicon 2 Cassette Filter; Biomax-100 A ( MWCO=100KD ) ( Millipore公司 ); 超滤浓缩器，（ MWCO=100KD ) ( MiHipore公司）；色谘纯化仪： ΑΚΤΑ Ρί ( GE Healthcare公司）；色诿柱： BPG 140/950; INdEX 140/500(GE Healthcare 公司）；纯化介质： Phenyl Sepharose 6 Fast Flow型跣水凝胶 (GE

Healthcare公司）； Sepharose 4 Fast Flow型分子筛凝胶 (GE Healthcare公司）； Protein-A亲和层析柱、辣根过氧化物酶（HRP ) ( Sigma公司）；酶标板（ Costar公司）；晦标仪， Thermo Multiskan MK3型；小牛血清购自兰州民海生物技术有限公司，批号： 051203; 细胞培养液为 199培养基（GIBCO ) ; 牛血清白蛋白（BSA， Fraction V )， Calbiochem公司制造，怡成生物科技有限公司分装；羊抗兔 -HRP、羊抗豚鼠 -HRP均购自 KPL公司；卵清蛋白

( Albumin from chicken egg white ) , sigma公司制造；甲型肝炎病毒 ( HAV )， Hepatitis A Virus Strain pHM175, 10.81ug/ml 购自 BIODESIGN

International;抗 HAV-IgG标准品， 75 IU/ml,购 ll中国药品生物制品检定所; 胰酶， BD公司制造；水解乳蛋白， GIBCO公司制造； Proclin 300; Supe!cp 公司制造； TMB盐酸盐，购自苏州新区贝克精细化学品有限公司.

实施例 1 : Vero细胞裂解蛋白的制备

制备方法： 1.细胞培养收获：取工作细胞库中的 1支 Vero细胞林细胞管，将细胞接种到细胞培养瓶中，加入含 10%小牛血清的 199培养液后置 ³7±1 Ό 培养. 待复苏细胞生长成致密单层后用胰酶消化 Vero细胞进行传代扩增，置 35±1 Ό培养 25天收获. 用胰蘇进行消化，以 3500rpm、 4Ό离心 30分钟，收集细胞沉淀. 作为裂解蛋白制备样品源备用.

2.细胞破碎裂解：收获的 Vero细胞用超声方法进行破碎裂解，以 1400W 输出功率，细胞破碎至无完整细胞结构.

3.氯仿抽提蛋白：在破碎后的细胞液中加入等体积的氣仿，在往复式振荡器上以 300rpni的速率振荡 20min，使氯仿与细胞液充分接觖，待细胞碎片 * ^ a Annn^_nm A T . 20min离心，抽取上层的蛋白水相，向离心杯中补充等量的 0.01 mol/L PBS ( pH7.8 )反复提取 4次.

4.浓縮：合并所有的抽提液，用 MWCO 100KD的超滤膜进行浓缩；超滹浓縮液中加入 PB緩冲盐，并使緩冲盐充分溶解， PB终浓度为 1.0 mol/L pH6.8,

5.纯化：以 50cm/h的流速经 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow型跪水凝胶附，吸附完毕用 1.0

?8( 116.8 )溶液淋洗3<：¥后，开始用 0.02 mol/L PB

( pH6.8 )溶液进行线性洗脱 5CV, 收集电导值低于 48mS/cm的洗脱液；收的洗; ¾液用 MWCO 100KD的超滤膜进行浓缩，后上样于 Sepharose 4 Fast Flow型分子筛凝胶，用 0.01 mol/L PBS ( pH7. )溶液以 45cm/h的流速进行 ¾ 脫，收集第二洗脫峰.

6.再次浓缩：将收集液先经用 MWCO-100 D的超瀘膜浓缩至 200ml, 再用 50ml ( MWCO=100KD )超滤离心管浓绾至 30ml，即可获得特异性 Vero细胞裂解發白（Vero细胞裂解蛋白标准品或 Vero细胞 HCP ) .

实验结果：用 Lowry法测得 Vero细胞裂解蛋白浓度为 540pg/ml，本发明的相关实验数据见以下列表.

各纯化工艺阶段样品蛋白含量变化表

SDS-PAGE电泳、银染，结果参见图 4， 1: 标准分子量蛋白； 2: 步 4 的未纯化 Vero细胞裂解蛋白； 3: Vero细胞裂解蛋白，结果表明经过纯化得到的 Vero细胞裂解蛋白，含多种蛋白组分，分子量范围为 5⁵KD、 11KD处犮 170KD-72KD, 34~17KD之间.

实施例 2 Vero细胞裂解蛋白抗体制备

1.免疫家兔：

免疫三只家兔，初次免疫每只家兔用 0.5 mg 实施例 1制备的 Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏完全佐刑，乳化充分后，背部皮下注射 6 ~ 8点. 4肩后第二次免疫：用 0.5 mg实施例 1制备的 Vero细胞裂解蛋白加入等体积福^ 不完全佐剂，乳化充分后，皮下、肌肉多点注射. 第二次免疫 10天后同法行第三次免疫. 最后于第三次免疫 2周后进行第四次免疫，一周后采血，并定效价，表 2 免疫兔血清效价

家兔血清体积（ ml ) 效价

1 35 1:106

2 40 1:106

3 41 1:106

2·免疫膝鼠：

免疫三只豚鼠，初次免疫每只豚鼠用 0.2mg实施例 1制备的 Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏完全佐剂，乳化充分后，在背部皮下注射 5~6点，每点 5 0.1ml, 2周后第二次免疫：每只豚鼠用 0.4mg实施例 1制备的 Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏不完全佐剂，乳化充分后，皮下多点注射，第二次免疫 10天后同法进行第三次免疫。最后于第三次免疫 2周后进行第四次免疫，一周后采血，并测定效价.

表 3 免疫豚鼠血清效价

Ji^氣血清体积（ ml ) 效价

1 5 1:105

2 4 1:105

3 5.5 1:105

3.抗血清纯化：

分别选择上述步猓中两种动物效价较高的抗血清进行纯化. 用市售预装 Protein-A Sepharose affinity column进行亲和层析，得到抗 Vero细胞裂解蛋白. IgG,测定 280nm和 260nm吸光度.计算蛋白含量： C( mg/ml ) = 1.45xOD280xihi - 0.74xOD260nm.

表 4 纯化后抗体蛋白舍量

OD280nm OD260nm 稀释倍数蛋白含量 mg/ml

1#豚鼠抗 0.226 0.163 20 4.109

2#豚鼠抗 0.208 0.154 20 3.722

3#豚鼠抗 0.196 0.149 20 3.449

1#兔抗 0.204 0.148 20 3.696

2#兔抗 0.215 0.156 20 3.895

3#兔抗 0.182 0.141 20 3.163

4.纯化后抗体效价检测:

采用间接 ELISA法检测，用碳酸緩冲液（ 0.05mol/L CB, pH9.6 )将实旅例 1制备的 Vero细胞裂解蛋白稀舞至 10pg/ml， ΙΟΟμΙ/孔包被，过夜. ^ 日用 PBS洗涤 2次，加入 2%BSA封闭， 125μ1/孔，室温 2h， PBS洗涤二，〉 '？ n Φ抗 Vern细胞裂解蛋白 IgG分別禪释至 lmg/ml后再按 10倍系列稀释，加入微孔板， ΙΟΟμΙ/孔， 37Ό孵育 60分钟后，洗涤拍干，各孔分別加入 ΙΟΟμΙ酶标二抗（羊抗兔 -HRP或羊抗豚鼠 -HRP) 37Ό孵育 30分钟后，洗涤拍干. 各孔加入显色液 Α液、 B液 37Ό孵育 15分钟， 2 mol/L碗酸终止反应，在嗥标仪上比色. 计算抗体效价。

表 5 纯化后抗体效价

1#豚鼠抗 2#膝氣抗 3#豚鼠抗 1#兔抗 2#兔抗 3#兔抗效价 1:106 1:105 1:105 1:105 1:106 1:105

实施例 3 晦标抗体制备

选用高碘酸钠法（骆加里等，生物化学与生物物理学报， 1981， 13: 1 ) ,·, 分别选取步骤 3中抗体效价最高的抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG ( 1#豚鼠抗 Vero 细胞裂解蛋白 IgG、 2#兔抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG )标记辣根过氧化物酶 (HRP).

实施例 4豚鼠抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG最佳包被浓度的确定.

将实施例 2制备的豚鼠抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG用 0.05mol/L CB(pH 9.6) 稀释成 5 - 20pg/ml ,包被微孔板， ΙΟΟμΙ/孔， 4Ό过夜.次日，用 0.01mol/L PBS(pH 7.4)洗涤 2次，每孔加 2%BSA-PBS 150μ1, 置室温封闭 2h, PBS洗涤 1次!: _;j 风干. 加入系列稀释的 Vero细胞裂解蛋白标准品（实施例 1制备，浓度参见表 7 )， 37Ό反应 60min，洗涤 4次，拍干 ·用 PBS-T(含 10%小牛血清及 0.0³% proclin300 )将嗥标抗体 HRP-兔抗 Vero细孢裂解蛋白 IgG ( 1:500 - 1:1000 ) 每孔 ΙΟΟμΙ，37Ό反应 60min，用 PBS-T洗涤 4次，拍干.显色 ³7Ό反应 ΙΟήιίίϊ 终止，比色. 根据结果分析：反应板条最佳包被浓度范 ¾在⁵ ~ ²0 ₈/1111. ^:

实施例 5 HRP-兔抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG最佳稀释比例确定.

用实施例 2中纯化豚鼠抗 Vero细胞裂解蛋白 G ( lOpg/ml )包被的微孔板，加入系列稀释的 Vero细胞裂解蛋白标准品（实施例 1制备，浓度参见表 8 )， 37Ό 反应 60min，洗涤 4次，拍干.用 PBS-T (含 10%小牛血清及 0.03% proclin300 ) 将酶标抗体 HRP-兔抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG稀释成适当比例（ 1:500 ~ 1:1000 )1 每孔加入 ΙΟΟμΙ 已稀释的酶标抗体，振荡混匀， 37Ό反应 60min，用 PB T洗涤 4次，拍干.显色 37Ό反应 lOmin. 终止，比色.根据结果分析： HRP-兔抗 Vero 细胞裂解蛋白 IgG最佳稀释浓度在 1:500 - 1:1000之间 .

实施例 6 ELISA双抗体夹心法的建立：

包板：将纯化豚鼠抗 Vero细孢裂解蛋白 IgG用 0.05mol/L CB(pH 9.6) 释成 5 ~ 20pg/ml，包被微孔板， ΙΟΟμΙ/孔， 4Ό过夜.次日，用 0.01mol/L PBS(pH 7.4)洗涤 2次，每孔加 2%BSA-PBS 150μΙ, 置室温封闭 2h. , PBS洗涤 2次，风干，用自封袋密封，每袋放一小包干燥剂. ⁴*C保存，备用。加样品：用 PBS-T将实施例 1制备的 Vero细胞裂解蛋白标准品秭释成 4000ng/mK 2000ng/ml、 lOOOng/mK 500ng/ml、 250ng/ml、 125ng/ml、 62.5ng/ml. 各孔分别加入 ΙΟΟμΙ上述标准品、 0.01 mol/L PBS-T和待測样品， 37*C反应 60min, 用 PBS-T洗涤 4次，拍干.

加 HRP-兔抗 Vero细胞裂解蛋白 l_gG:用 PBS-Tt含 10%小牛血清及 0.03% proclin300 )将实施例 2制备的 HRP-兔抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG稀释成适当比例（ 1:500 ~ 1:1000 ) · 每孔加入 ΙΟΟμΙ 已稀释的 HRP-兔抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG, 振荡混匀，反应 60min，用 PBS-T洗涤 4次，拍干，

显色：每孔加入底物显色剂 A ( 0.1mol/L乙酸钠-柠檬酸緩冲液，含 0.0038 mol L过氧化氢， 2万单位 /L庆大審素， pH5.0 )，显色刑 B ( 0.02mol/L T s 盐酸緩冲液，含 0.0005mol/L二水合乙二胺四乙酸二钠， 0.0013mol/L TMB盐酸盐）， 37Ό反应 lOmin.

比色：每孔加入终止液（2mol/L H₂SO₄ ) 50 l，振荡混匀.于嗥标仪 450nm 波长读取各孔 OD值.

计算：将各浓度标准品及样品 OD值减去 0ng/ml标准品（即样品稀释液：

0.01mol/L PBS-T )的 OD值（消零），绘制标准曲线. 显示直线回归方程及 R²值. 参照标准曲线计算样品 Vero细胞 HCP含量.

实施例 7标准曲线的相关性

用实施例 1制备的 Vero细胞裂解蛋白标准品，自 4000ng/ml倍比稀释至 62.5ng/ml的不同浓度，按照实施例 6所述进行检测，以 Vero细孢裂解蛋白标准品浓度为纵坐标，将各浓度标准品 OD值减去 0ng/ml标准品（即样品稀释液： 0.01mol/L PBS-T )的 OD值（消零） X1000为橫坐标，绘制其曲线图为条近似的直线，参见图 5. 标准品浓度在 62.5 ~ 4000 ng/ml之间时，相关性成立 (R²≥0.99)，

实施例 8 —种 Vero细胞 HCP检测试剂盒

包被豚鼠抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG的反应板 96孔 xl块标准品 (实施例 1制备的纯化 Vero细抱裂解蛋白， 8000ng ml) 500μ1χ1瓶

HRP-兔抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG 50μ1χ1瓶酶秭释液 20mlxl瓶

20xPBS洗涤液 50m|xl瓶显色剂 A 7mlxl瓶显色刑 B 7m|xl瓶终止液（2mol/L H₂S0₄) 7m|xl瓶实施例 9 一种 Vero细胞 HCP检测试刑盒

包被兔抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG的反应板 96孔 xl块标准品 (实施例 1制备的纯化 Vero细胞裂解蛋白， 8000ng/ml) 500μΙχ1瓶

HRP-兔抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG 50μ|χ1瓶嗥稀释液 20mlxl瓶

20xPBS洗涤液 50m，xl瓶显色刑 A 7mlxl瓶显色剂 B 7m|xl瓶终止液（2mol/L H₂S0₄) 7mlxl瓶实旄例 10 Vero细胞 HCP检测试刑盒特异性试验

实施例 8所述试剂盒主要用来检测 Vero细肐疫苗生产中的中间产品中宿主细胞蛋白含量，这些中间产品可能含有的除宿主细胞蛋白外的其他成分不应产生对本检测的干扰，这些成分主要有：小牛血清、细胞培养液、 BSA、卵清蛋白、甲型肝炎病毒（HAV ) 、抗 HAV-IgG、胰皞、水解乳蛋白. 因此，以小牛血清、细胞培养液、 2%BSA、 2%卵清蛋白、 HAV ( 1: 4稀释， 2.7ug/ml )、抗 HAV-lgG ( 2 Ιϋ/mL ) 、 0.25%胰酵、 2%水解乳蛋白作为样品，采用实施例 8所述试剂盒，按照实施例 6所述进行检测，判断该检測方法的特异性。

结果参见图 6，图中 1) Vero细胞裂解蛋白标准品； 2) PBS-T; 3)细肐培养液； 4)小牛血清； 5) BSA ; 6 )卵清蛋白； 7 ) HAV ; 8 ) HAV-IgG; 9 ) 胰酶； 10)水解乳蛋白，结果表明本发明的检測试刑盒与小牛血清、细胞培养液、 BSA、卵清蛋白、 HAV、抗 HAV-IgG、胰嗥、水解乳蛋白无交叉反应，具有很高的特异性.

实施例 11 Vero细胞 HCP检测试剂盒精密性试验

采用实施例 8所述试剂盒，按照实施例 6所述的方法在同一块板条上測^ 1000ng/ml标准品 10孔的 OD Onm值，重复试验三次，计算批内变异系数 ( CV% )平均为 6.0%.

表 10测定 1000n /ml标准品 OD450nm值

实施例 12 疫苗样品检测及重复性试验：

参考中国专利号 ZL 0210685.9 中的描述中的描述生产甲型肝炎灭活疫苗样品 4批，采用实施例 8所述试剂盒，按照实施例 6所述方法进行检测 6次， Vero细胞 HCP含量结果如表 11所示. 平均 CV=6.2%，重复性良好.

表 11 疫苗样品 Vero细胞 HCP含量

实施例 13检测疫苗样品中总蛋白与检测 Vero细胞 HCP的比较

对上述四批疫苗样品用 Lowry法对总蛋白进行检测，并且将结果与 Vero 细胞甲型肝炎灭活样品 Vero细胞 HCP检测结杲进行对照. 证明本发明作为以 Vero细胞生产甲型肝炎灭活疫苗的质量标准检测之一，较以疫苗蛋白总量进行间接庸量控制目的更明确，提高了疫苗样品的质量标准.对疫苗的安全性更有保障。

表 12 两种检測结果比较

NO.l批 NO.2批 ΝΟ·3批 NO.4批疫苗样品疫苗样品疫苗样品疫苗样品总蛋白

3.3 2.4 2.2 1.5 ( ug/ml )

Vero细胞

382 395 289 234 HCP ( ng/ml )

实施例 14 回收率试验

采用实施例 8所迷试刑盒，按照实施例 6所述步骤，以 N0.3批疫苗样品 (对倍稀释后）稀释 HCP标准品，与用 PBS-T稀释的标准品同时检测， HCP 在疫苗样品中的回收率平均为 96% (参见表 13、 14).表明疫苗样品基质对本方法测定 HCP的特异性无任何干扰.

表 13 Vero细胞裂解蛋白（HCP )标准品及疫苗样品（对倍稀释）測定结果

表 14: 回收率检测

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范囷内还包括功能等同的方法和组分. 实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进. 所迷改进也落入所附权利要求书的范闺之内. 上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims

权利要求

l. Vero细胞裂解蛋白的制备方法，包括下述步猱:

a) Vero细胞培养、收获；

b) Vero细胞破碎裂解；

cc)) VVeerroo细细孢孢裂裂解解蛋蛋白白的的纯纯化化；；

dd)) 浓浓缩缩处处理理，，即即得得 VVeerroo细细胞胞裂裂解解蛋蛋白白，，

22.. 根根据据权权利利要要求求 11所所述述的的方方法法，，其其特特征征在在于于所所述述细细胞胞破破碎碎裂裂解解包包括括细细^^ 化化学学裂裂解解、、渗渗透透破破碎碎、、反反复复冻冻融融、、细细胞胞晦晦裂裂解解、、

3. 根据权利要求 2所述的方法，其特征在于所述细胞破碎裂解为超声波破碎，

4. 根据权利要求 1所述的方法，其特征在于其特征在于所述纯化包括粗纯化和精纯化步猱，粗纯化方法选自等电点沉淀法、盐析法或有机溶剂抽提法中之一；精纯化选自层析法，包括分子筛层析法、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法、金属离子整合层析法或共价层析法.

5. 根据权利要求 4所述的方法，其特征在于所述粗纯化方法为有机溶剂抽提法.

6.根据权利要求 5所述的方法，其特征在于所迷有机溶剂抽提法为破碎后的细胞液加入与等体积的三氯甲烷，振摇 20~30分钟，以 4000rpm的速度 2~8Ό离心 20~25分钟，吸取上层蛋白水相。

7. 根据权利要求 5或 6所述的方法，粗纯化步骤为破碎后的细胞液入与等体积的三氯甲烷，振摇 20分钟，以 4000rpm的速度 2~8*C离心 20分钟，吸取上层蛋白水相.

8. 根据权利要求 4所述的方法，其特征在于，所述精纯化的方法为将麵纯化后样品用 MWCO=100KD膜超滤，经疏水柱纯化、分子筛层析，收集所需的目的蛋白，所述目的蛋白的收集蛋白峰范围与疫苗生成工艺中病毒及其成分收集绛相同.

9. 根据权利要求 8所述的方法，其特征在于所述病毒及其成分为曱型肝炎病毒及其成分.

10、根据权利要求 8所述的方法，其特征车于所述疏水柱纯化为 Phenyl

Sepharose 6FF疏水纯化，上样緩冲液流速为 30 ~ 60cm/h，后以 pH值 6.0—？.5 的 1.0 mol L PB溶液淋洗 3CV， pH6.0 - 7.5 的 0.02 mol/L PB溶液线性洗脱 5CV,收集电导值低于 48 mS/cm的洗脱液，所述分子筛层析为 Sepharose 4 ¥ Flow型分子筛凝胶层析，用 pH7.4 0.01 mol/L PBS溶液以 45cm/h的流速¾ 行洗脱，收集第二洗脫峰.

11、权利要求 1-10任一项方法所制备的 Vero细胞裂解蛋白 .

12、根据权利要求 11所迷的 Vero细胞裂解蛋白，其特征在于所述的 Vero 细胞裂解蛋白为蛋白混合物，其分子量范围包括 11KD、 17-34KD, 55KD、

72KD-170KD.

13、抗权利要求 11或 12所述 Vero细胞裂解蛋白的抗体.

14、根据权利要求 13所述的抗体，其为豚鼠抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG或兔抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG.

15. 权利要求 11或 12所述的 Vero细胞裂解蛋白在制备 Vero细胞 HCP 检测试剂中的用途，

16. Vero细胞 HCP检测试剂盒，其包含固相、位于固相中的抗体、标物偶联抗体、蛋白标准品，其中所述抗体为抗 Vero细胞裂解蛋白抗体，所述蛋白标准品为 Vero细胞裂解蛋白，所述 Vero细胞裂解蛋白根据权利要求 1-10 任一項所述方法制备.

17. 根据权利要求 16所述的 Vero细胞 HCP检测试剂盒，其进一步包食生物素修饰的抗体、标记物偶联的抗生物素蛋白.

18. 根据权利要求 16所述的 Vero细肐 HCP检测试剂盒，其进一步包令 2，4 -二硝基苯紛修饰的抗体、标记物偶联的抗 2，4 -二硝基苯盼蛋白，

19、根据权利要求 16、 17或 18所述 Vero细胞 HCP检测试剂盒，其特征在于所述抗 Vero细胞裂解蛋白抗体为豚鼠抗 Vero细胞裂解蛋白 IgG或兔抗

Vero细胞裂解蛋白 IgG.

20、根据权利要求 16、 17或 18所述 Vero细胞 HCP检测试剂盒，其特征在于所述标记物偶联抗体中标记物为酶、核素或荧光素中之一.

21、根据权利要求 16、 17或 18所述 Vero细胞 HCP检测试剂盒，其特^ 在于所述蘇选自过氧化物酶、 P-D-半乳糖苷嗥、碱性磷酸晦或 6-磷酸葡糖胧,; 氢酶中之一.

22、根据权利要求 16、 17或 18所述 Vero细胞 HCP检测试剂盒，其特征在于所述核素选自 ³H、 ¹⁸⁸Re或¹³¹1中之一.

23、根据权利要求 20所述 Vero细胞 HCP检测试剂盒，其特征在于所述荧光素选自异疏酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫酸罗丹明或 3价镧系螯合物中之一.

24、根据权利要求 16、 17或 18所述 Vero细胞 HCP检测试剂盒，其特征在于所述固相可为 ELISA试验平板或蛋白芯片栽体.