KR100368756B1

KR100368756B1 - 비형 간염 표면 항원에 대한 항체 진단 시약의 제조방법,이를 이용하여 수득되는 비형 간염 항원에 대한 항체 진단시약 및 비형 간염 바이러스 항체 진단 시약

Info

Publication number: KR100368756B1
Application number: KR10-2000-0004785A
Authority: KR
Inventors: 임국진; 오재훈; 손미진; 유승범; 이상익
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2000-02-01
Filing date: 2000-02-01
Publication date: 2003-01-24
Also published as: AR027304A1; WO2001057192A1; CN1281741C; CN1416463A; AU2001232374A1; MY137138A; EP1268749A1; EP1268749A4; KR20010077174A; EG22900A; US20030032008A1

Abstract

본 발명은 B형 간염 표면 항원에 대한 항체의 정량 또는 정성 시험방법으로서 샌드위치 면역 방법을 사용하는 B형 간염 표면 항원 진단 시약의 제조에서, 고정체에 고정되는 1차 항원과 표시물질과 접합되는 2차 항원을 서로 다른 B형 간염 표면 항원을 쌍으로 포함하는 B형 간염 표면 항원에 대한 항체 진단 시약을 제공함으로써 단일의 표면 항원을 사용함에 비하여 민감도와 특이도를 현저하게 향상 시키는 것에 관한 것이다.

Description

비형 간염 표면 항원에 대한 항체 진단 시약의 제조 방법, 이를 이용하여 수득되는 비형 간염 항원에 대한 항체 진단 시약 및 비형 간염 바이러스 항체 진단 시약 {Manufacturing method of hepatitis B surface antibody diagnotic reagent, hepatitis B surface antibody diagnotic reagent using the method and hepatitis B virus diagnotic reagent}

우리 몸의 생명현상 유지에 중추적인 역할을 하는 장기 중의 하나인 간의 손상에는 알코올 및 약물 등 여러 가지가 관련될 수 있으나, 가장 치명적인 요인 중의 하나는 바이러스에 의한 손상이다. 간에 손상을 일으키는 간염 바이러스에는 A형부터 E형까지 5종이 밝혀져 있으며, 그 중 B형 간염 바이러스(HBV, hepatitis B virus)에 의한 간세포의 손상은 바이러스의 지속적인 증식에 의하여 만성간염과 간경변으로 발전될 가능성이 많은 것으로 알려져 있다. 선진국들에 비하여 상대적으로 높은 B형 간염 발병률을 보이고 있는 우리 나라의 경우에는 전통적으로 아기와의 접촉이 많기 때문에 산모가 보균자일 경우 신생아가 보균자가 될 가능성은 90%에 달하며, 현재 보균자의 수는 전체 인구의 8 내지 12%에 이르고 있다(김현수, 양동온, 신동현, 김형원, 김세종 : B형 간염백신의 면역성에 관한 5년간 추적 관찰. 대한내과학잡지 41(2) : 164 내지 171, 1991, 국윤호, 박정규 : 간염백신 접종에 의한 항체 양전율. 감염 17(2) : 155 내지 162, 1985).

B형 간염 바이러스는 간염 특이항원인 오스트레일리아(Australia) 항원이 발견된 후, 1970년 Dane이 간염환자의 혈청에서 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg, hepatitis B virus surface antigen) 뿐만 아니라 완전한 HBV 입자를 발견하였다(서진혜, 박병채 : 간염 바이러스 (1), 생명과학 2(3) : 163 내지 174, 1992). HBV 유전자에서는 현재까지 6개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 존재함이 발견되었으며, 이에서 발현되는 단백질 중 24kd의 SHBs(S 부위), 31kd의 MBHs(Pre S₂+ S) 및 38kd의 LHBs(S₁+ Pre S₂+ S)는 HBV의 유전자를 갖지 않는 Dane 입자를 형성하고 있다. HBsAg 혈장에서 전기영동으로 확인하며 분자량이 p-24와 당화된 형태의 p-30으로 보여진다. 자연상태에서 이러한 HBsAg은 단일 단백질로 존재하지 않고 탄수화물과 지질을 함유하고 있는 복합단백질로 구성되어 있으며 분자량이 3백만 정도인 거대한 입자 형태로 되어 있으며 지름은 20㎚정도 이다. B형 간염 바이러스에 감염되었을 경우 HBcAg, HBsAg 및 HBeAg에 대한 항체가 생기는데, 그 중 HBsAg에 대한 항체만이 HBV의 재감염에 대한 방어력이 있는 것으로 확인되고 있다.

따라서, 현재까지 B형 간염 바이러스에 대한 예방백신은 백신투여에 의한 HBsAgdp 대한 항체형성을 목표로 두고 추진하여 왔다. B형 간염에 대한 면역확인은 이 HBsAg에 대한 항체의 유무로 판단 되고 있다. 일반적으로 HBsAg에 대한 항체가 10mIU이상일 경우 HBV에 대한 면역력이 있다고 판단 한다. 10mIU이하인 경우 백신재접종이 권고 된다.

HBsAg에 대한 항체를 진단하는 시약은 여러 회사에서 생산하고 있다. 그 반응 원리는 표면 항원이 고정된 플레이트(plate) 혹은 비드(bead)등의 고정체에 혈장을 반응케 하여 HBsAg이 부착되게 하는 샌드위치(sandwich)법을 사용하고 있다. 이때 표시되는 방법에 따라 ELISA(효소 면역 측정법), RIA(방사능 면역 측정법) 등으로 나누어진다. 현재 사용되고 있는 대부분의 HBsAg 항체 진단시약에서는 혈장에서 정제한 HBsAg을 사용하고 있다. 그러나 혈장에서 정제한 HBsAg은 순수 표면 항원 단백질로 구성된 것이 아닌 탄수화물과 지질의 복합체로 구성되어 있어, 단백질에 대한 항체가 아닌 기타 구성성분에 대한 항체 혹은 친화 물질에 의하여 HBsAg 항체에 대한 위 양성이 생길 수 있다. 이러한 위 양성을 낮추기 위해서 낮은 농도의 2차 표시 항원을 사용하는데 이러면 민감도가 떨어지게 된다. 혹은 낮은 민감도를 극복하기 위하여 바이오틴을 2차 HBsAg에 공유결합시키고 고추냉이 과산화 효소 표지된 항바이오틴에 대한 항체를 사용하는 경우도 있다(에보트사, 미국).

본 발명은 HBsAg 항체 진단시약을 제조 하는 방법에 관한 내용으로서, HBsAg을 혈장에서 얻은 것 또는 재조합 방법으로 만들어지는 것 등의 원 유래 호스트(host)가 다른 두 종류의 HBsAg을 1차 항원과 2차 항원의 쌍으로 사용하거나 또는 정제 방법이 서로 다른 HBsAg을 1차 항원과 2차 항원의 쌍으로 사용하여 민감도 및 특이도를 향상시키는 방법에 관한 것이다.

통상적으로 사용되는 B형 간염 항체진단시약은 B형 간염 바이러스 표면 항원을 이용하여 감지하는 방법을 사용한다. 이때 사용되는 B형 간염 바이러스 표면 항원은 사람 혈장에서 유래되는 항원 또는 재조합 항원을 사용한다(D.H.Ostrow, et al, Quantitation of hepatitis B surface antibody by an automated microparticle enzyme immunoassay, Journal of Virological Methods, 32(1991) 265 내지 276). 그런데 B형 간염 바이러스 표면 항원은 세포막 단백질로서, 그 자연 구조를 유지 하기 위해서는 순수한 단백질로 존재할 수 없고, 지질과 탄수화물을 다량 함유하고 있다. 또한 입자 구조를 가지고 있기 때문에 순수 단백질로 분리하기에는 거의 불가능한 일이다. 즉, B형 간염 항체 진단시약에 사용되는 B형 간염 표면 항원은 그 단백질 외에 많은 불순물을 포함하는 것을 피할 수 없다. B형 간염 바이러스 표면 항원을 다른 유래를 사용하거나 정제방법을 달리한 종류로 조합하여 사용하면 이러한 불순물에 의한 비특이 반응을 줄일 수 있다.

본 특허의 발명의 요지는 다음과 같다. 마이크로-웰 플레이트(Micro-well plate), 멤브레인(membrane) 또는 마이크로-파티클(Micro-particle)과 같은 고정체에 정제된 B형 간염 바이러스 항원(1차 항원)을 고정시켜 B형 간염 특히 항체를 잡는데 사용한다. 이 고정체에 고정된 항체를 잡는 데는 고정체에 고정된 항원과는 유래가 다르거나 정제 방법을 달리한 표면 항원(2차 항원)을 사용한다. 2차 항원은 표시물질을 접합하여 사용한다. 이 표시물질을 이용하여 B형 간염 항체 농도를 알 수 있다. 여기서 사용하는 표시물질은 방사능물질, 알칼라인 포스파타제 또는 고추 냉이 과산화 효소와 같은 효소, 콜로이달 골드, 마이크로 파티클(micro particle)등의 색소(dye) 또는 형광 물질 등을 사용할 수 있다. 이러한 방법을 이용하여 보다 특이하게 B형 간염 항체를 진단할 수 있으며, 또한 민감도를 크게 높일 수 있다.

이하 본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하겠다. 그러나 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

시험예 1. 혈장에서 B형 간염 바이러스 표면 항원 정제

얼음조 내에서 B형 간염 표면 항원 양성인 혈액 140㎖에 59㎖ 표화 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)를 서서히 첨가하면서 1시간 동안 저어 주었다. 이 용액을 원심분리기에서 12000rpm으로 20분간 원심분리하고, 상층액 200㎖을 얼음조 위의 500㎖ 유리 비이커에 옮긴 후, 80㎖의 포화 암모니움 설페이트를 천천히 가해주고, 2시간 동안 교반시켰다. 상층액을 제거하고, 30㎖의 인산염 생리수(PBS)로 용해시켰다. 이 용액을 PBS로 평형시킨 2ℓ의 세파로스 씨엘-4비(sepharose CL-4B ; 스웨덴 소재 파마시아사 제품) 젤이 들어 있는 컬럼에 통과시켰고, 40㎖씩 분획으로 용액을 나누어 받았다. 컬럼에서 용출된 각 분획의 항원가를 엘지 에이취에스에리자(대한민국 소재 엘지생활건강사 제품)로 측정하여 항원이 있는 분획을 모았다. 이렇게 모은 용액에 최종농도가 25%가 되도록 염화세슘(CsCl)을 첨가하여 녹인 후, 45000rpm에서 48시간 초고속 원심분리를 하였다. 항원이 있는 부분을 모은 다음 1ℓ의 PBS에서 3회 투석(dialysis)을 한 후, 냉동 보관 하였다.

시험예 2. 재조합 효모로부터 B형 간염 바이러스 표면 항원 정제

B형 간염 바이러스 항원을 발현하는 재조합 효모(대한민국 특허 제 177307 호) 70g에 세포파쇄용액((0.5M NaCl, 10mM EDTA, 0.1M 인산염, 0.5% 트리톤 엑스-100(Triton X-100), pH 7.0))을 넣고 현탁한 후, 유리알과 함께 세포 파쇄기((Bead Beater ; 미합중국 소재 바이오스펙 프러덕트사(Biospec Product) 제품))으로 효모 세포를 파쇄하였다. 이 용액에 5N 염산(HCl)을 첨가하여 pH 3.8로 맞춘 후, 원심분리하여 맑은 상층액을 얻을 수 있었다. 이 용액을 pH 7.0으로 적정한 후, 실리카 분말(Aerosil-380)을 첨가하고, 저온실에서 12시간 교반하여 표면 항원을 고정시켰다. 표면 항원이 고정된 실리카를 원심분리로 회수하고, PBS로 2회 세착하여 흡착되지 않은 불순물을 제거하였다. 50mM 탄산염 완충용액 pH 9.5 상태에서 3시간 동안 교반하여 실리카로부터 B형 간염 표면 항원을 탈착시키고, 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이후 DEAE-크로마토그래피와 젤여과 크로마토그래피를 수행하는 과정을 거쳐 재조합 효모로부터 B형 간염 표면 항원을 정제하여 분석(assay)에 사용하였다.

시험예 3. 고추 냉이 과산화 효소(horse radish peroxide, HRP) 접합 B형 간염 표면 항원 제조

상기 시험예 2에서 정제된 재조합 B형 간염 표면 항원 용액 40㎖을 센트리프렙(Centriprep ; 미합중국 소재 아미콘사 제품)에 넣고 원심분리(3000rpm, 10분)를 반복하여 1㎖로 농축하였다. 단백질 농도를 상용화된 비씨에이 테스트 키트(BCA test kit)를 이용하여 측정하고, 최종 농도가 10㎎/㎖이 되도록 PBS로 희석하였다.

10㎎/㎖ 항원 용액을 4℃에서 1ℓ의 0.01M 탄산나트륨 완충용액(sodium carbonatebuffer, pH 9.6)으로 1일간 투석하였다. 투석시 3회 buffer 교환을 하였다. HRP 5㎎을 정량하여 0.5㎖의 증류수에 용해시켰다. HRP를 산화시키기 위해 100㎕의 42㎎/㎖ NaIO₄를 0.5㎖의 10㎎/㎖ HRP 용액에 넣고, 튜브는 호일로 감싼 상태에서 상온에서 30분간 교반(shaking)하면서 반응시켰다. 산화 반응을 끝내기 위해 60㎕의 1M 글리세롤(glycerol)을 위 용액에 넣고, 튜브는 호일로 감싼 상태에서 상온에서 1시간동안 교반하면서 반응시켰다. 접합 반응을 위해 상기 용액을 4℃에서 1ℓ의 0.01M 탄산나트륨 완충용액(sodium carbonate buffer, pH 9.6)으로 1일간 투석하였다. 투석시 3회 buffer 교환을 해주었다. 투석 후, 산화 HRP 용액은 새 튜브로 옮기고 여기에 상기의 250㎕의 10㎎/㎖ 항원용액을 첨가한 후, 튜브는 호일로 감싼 상태에서 상온에서 3시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 3시간 동안 4㎎/㎖의 NaBH₄용액을 준비하였다(4㎎의 NaBH₄를 무게로 측정하여 1㎖의 탈이온수(D.W. ; deionized water)에 녹였다). HRP-항원 접합체를 안정화 시키기 위해 40.8㎕의 4㎎/㎖ NaBH₄를 넣어주고 튜브는 호일로 감싼 상태에서 4℃에서 2시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 효소 표지 항체를 접합되지 않은 효소와 분리하기 위하여 접합체를 정제하기 전알 세파로스 씨엘-6비 컬럼(1㎝ * 45㎝)(sepharose CL-6B column ; 스웨덴 소재 파마시아사 제품)을 PBS로 평형시켰다. 접합체 용액을 위 컬럼에 통과시키고, 완충제는 PBS를 사용하고, 유속(flow rate)은 약 0.4㎖/min이고, 분획(fraction)은 분(min)당 1개씩 모았다. 분획별 단백질 농도 그래프를 작성하고, 그래프 중 첫 번째 피크(peak)에 해당하는 분획을 취합하였다.분획풀(fraction pool)의 단백질 농도를 상용화된 비씨에이 테스트 키트(BCA test kit)를 이용하여 측정하고, 최종 농도 1%의 BSA를 첨가하여 -20℃에 보관하였다.

시험예 4. B형 간염 표면 항원 항체 분석용 96-플레이트 제작

EIA(Enzyme Immuno Assay)용 96웰 플레이트(96 well plate ; 미합중국 소재 Nunc사 제품)에 상기 시험예 1에서 정제한 혈장 유래 B형 간염 표면 항원용액 100㎕씩 분주하였다. 이때 최종 단백질 농도가 0.5㎍/㎖로 0.1M 탄산나트륨 완충용액(pH 9.5)에 희석하여 사용하였다. 밀봉 테이프로 밀봉 후, 저온실에 밤새 방치하여 항원이 웰에 고정되게 하였다. 이후 밀봉 테이프를 제거하고 항원용액을 제거하였다. 1% BSA를 함유한 PBS를 각 웰 당 250㎕ 씩 분주하고, 상온에서 2시간 방치하였다. 웰에 있는 용액을 제거하고, 상온에서 1시간 동안 방치하여 수분을 건조시킨 후, 제습제와 함께 밀봉용기에 넣어 4℃의 저온 냉장고에 보관하고, 필요시 t용하였다.

시험예 5. B형 간염 표면 항원 항체 분석

시험예 1과 시험예 2의 방법으로 얻어진 혈장 항원과 재조합 항원을 시험예 4와 같은 방법으로 96웰 플레이트에 단백질을 고정시켜 분석에 사용할 플레이트를 제조하고 시험예 3과 같은 방법으로 고추 냉이 과산화 효소를 재조합 항원과 혈장 항원에 접합시켜 분석에 사용하였다. 플레이트 종류와 효소 표지 항원 종류에 따라 4개 조합으로 항체 진단 실험을 하였다(A조 : 재조합 항원 플레이트와 재조합 항원 효소 접합체, B조 : 재조합 항원 플레이트와 혈장 항원 효소 접합체, C조 : 혈장 항원 플레이트와 재조합 항원 효소 접합체 및 D조 : 혈장 항원 플레이트와 혈장 항원효소 접합체).

제조된 플레이트의 각 웰이 항체 음성 혈장 샘플과 항체 양성 혈장 샘플을 100㎕ 씩 첨가하고 콘쥬게이트(conjugate)용액 25㎕ 씩 첨가한 후, 프레임을 가볍게 쳐서 잘 혼합한 다음 37℃ 반응기에 넣고 60분간 반응시켰다. 트윈20(Tween20)을 함유한 PBS로 300㎕ 씩 5회 웰을 세정하고 기질용액(테트라메틸 벤지딘 100㎍/㎖, 과산화수소 0.006%, 구연산 인산염 완충용액 pH 4.5)을 100㎕ 씩 첨가하였다. 30분간 암소에서 발색시킨 후, 반응정지액(2N 황산) 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 96웰 플레이트 리더(96 well plate reader ; 미합중국 소재 Molecular Devices사 제품)로 620nm를 보조파장(reference wavelength)으로 하고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

조 합	A조	B조	C조	D조
음성 혈장	0.129	0.012	0.019	0.032
양성 혈장	1.984	0.832	1.360	0.751
양성/음성	15.03	69.33	71.57	23.46

상기 표 1에 나타난 결과를 살펴보면, 동종의 HBsAg을 사용한 조합에서는 높은 비특이 반응이 일어났으며 다른 HBsAg을 조합한 B, C조에서는 낮은 비특이 반응과 높은 양성수치/음성수치를 보이고 있음을 확인할 수 있었다.

시험예 6. 상용화된 제품과의 민감도 비교 시험

상용화된 B형 표면 항원 항체 진단 시약 4종(비교예 1 내지 비교예 4)을 구입하여 상기 시험예 5에서 사용한 C조(실시예)와 민감도 비교 실험을 하였다. 하기 표 2에서 비교예 1은 미합중국 소재 에보트사 제품 Ausab EIA이고, 비교예 2는 독일 소재 Dade Bering사의 제품 인지그노스트 안티 에치비에스 마이크로이고, 비교예 3은 대한민국 소재 녹십자사의 제품 제네디아 안티 에취비에스 엘리자 3.0이며, 비교예 4는 대한민국 소재 동아제약사의 제품 동아안티에취비에스 에리자를 사용하였다.

민감도 실험의 항체는 WHO 표준 항체로 WHO standard 1, 2.5, 5, 10, 50, 100mIU에서 흡광도를 비교시험하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

제 품	0	1	2.5	5	10	50	100(mIL/㎖)
비교예 1	0.003	0.006	0.014	0.032	0.079	0.517	0.867
비교예 2	0.024	0.035	0.063	0.104	0.205	0.545	1.224
비교예 3	0.011	0.017	0.024	0.045	0.061	0.282	0.566
비교예 4	0.042	0.052	0.076	0.091	0.137	0.580	1.093
실시예	0.005	0.043	0.130	0.252	0.446	1.717	2.216

일반적인 제품의 판정 기준(Cut-off)은 음성 수치에 0.05 내지 0.07을 더하는 것으로 되어 있다.

상기 표 2에 나타난 결과를 살펴보면, 비교예 1은 10, 비교예 2는 5, 비교예 3은 10, 비교예 4는 10mIU 이상을 양성으로 판정하는데 비해, 본 발명에 따른 실시예는 2.5mIU 이상을 양성으로 판정하는 높은 민감도를 보였다. 따라서, 본 발명은 높은 민감도를 갖는 B형 간염 항원에 대한 항체 진단 시약 및 B형 간염 바이러스 항체 진단 시약을 제조할 수 있는 효과를 제공한다.

상기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해서만 제공되며 어떠한 방법으로든 청구된 청구범위나 본 발명의 범주를 제한하도록 해석되어서는 안된다. 본 발명의 참뜻과 본질을 벗어나지 않은 적당한 변화 및 변경이 원하고 추구되는 특허의 보호범주 내에서 고려된다.

Claims

B형 간염 표면 항원에 대한 항체의 정량 또는 정성 시험방법으로서 샌드위치 면역방법을 사용하는 B형 간염 표면 항원 진단 시약의 제조에 있어서,

고정체에 고정되는 1차 항원과 표시물질과 접합되는 2차 항원을 서로 다른 B형 간염 표면 항원을 쌍으로 포함시키는 것을 특징으로 하는 B형 간염 표면 항원에 대한 항체 진단 시약의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 B형 간염 표면 항원으로서 혈장에서 얻은 표면 항원과 재조합 표면 항원을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 B형 간염 표면 항원에 대한 항체 진단 시약의 제조방법.
제 2 항에 있어서,

상기 재조합 표면 항원이 효모 유래 또는 동물 세포유래의 표면 항원을 포함함을 특징으로 하는 상기 B형 간염 표면 항원에 대한 항체 진단 시약의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 B형 간염 표면 항원이 정제방법을 서로 달리하여 얻어지는 표면 항원을 포함함을 특징으로 하는 상기 B형 간염 표면 항원에 대한 항체 진단 시약의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 고정체에 고정되는 1차 항원이 혈장 유래 표면 항원이고, 표시물질과 접합되는 2차 항원이 재조합 표면 항원임을 특징으로 하는 상기 B형 간염 표면 항원에 대한 항체 진단 시약의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 고정체에 고정되는 1차 항원이 재조합 표면 항원이고, 표시물질과 접합되는 2차 항원이 혈장 유래 표면 항원임을 특징으로 하는 상기 B형 간염 표면 항원에 대한 항체 진단 시약의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 표시물질이 효소, 방사능물질, 미세입자, 색소들을 포함하여 이루어지는 그룹 중에서 선택된 것을 사용함을 특징으로 하는 상기 B형 간염 표면 항원에 대한 항체 진단 시약의 제조방법.
제 1 항의 방법을 이용하여 제조되는 B형 간염 항원에 대한 항체 진단 시약.
제 1 항의 방법을 이용하여 제조되는 B형 간염 바이러스 항체 진단 시약.