JPH04233461A - 同時アッセイ法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般にイムノアッセイ
法に関する。さらに詳しくは、試料中の１または２以上
の分析対象物の同時検出のためのイムノアッセイ法およ
び生成物に関する。
法に関する。さらに詳しくは、試料中の１または２以上
の分析対象物の同時検出のためのイムノアッセイ法およ
び生成物に関する。
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】試料
中に存在するかもしれない目的物質または臨床的に重要
な物質の存在を決定するためのアッセイにおいて、種々
の手順、装置および試薬が用いられている。そのような
物質は一般に「分析対象物」と呼ばれ、その例としては
、抗体、抗原、薬物、ホルモンなどが挙げられる。試料
中で２以上の分析対象物を検出する場合は、通常、別々
のアッセイで各分析対象物を別々に検出する。そのよう
な検出法は、試験しようとする各分析対象物に対して厳
格な定性決定の保証が得られるので好ましいものとされ
ている。
中に存在するかもしれない目的物質または臨床的に重要
な物質の存在を決定するためのアッセイにおいて、種々
の手順、装置および試薬が用いられている。そのような
物質は一般に「分析対象物」と呼ばれ、その例としては
、抗体、抗原、薬物、ホルモンなどが挙げられる。試料
中で２以上の分析対象物を検出する場合は、通常、別々
のアッセイで各分析対象物を別々に検出する。そのよう
な検出法は、試験しようとする各分析対象物に対して厳
格な定性決定の保証が得られるので好ましいものとされ
ている。
【０００２】医学の進歩に伴って多くの疾患および臨床
条件に対して新たなマーカーが認識されるようになった
が、それとともに、これらマーカーの臨床試験に対する
要求がでてきた。研究所は、ますます増大する量の試験
を時宜よく提供しながらコストダウンを図らなければな
らないという問題に直面している。たとえば、血液銀行
では、献血された血液についてこれまでに試験されてき
た各種因子の存在または該因子への暴露を調べるための
パネルに加えて、ヒトＴ−白血病ウイルス１型（ＨＴＬ
Ｖ−１）、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）お
よびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が加わったことにより
、試験の要求が劇的に高まってきている。
条件に対して新たなマーカーが認識されるようになった
が、それとともに、これらマーカーの臨床試験に対する
要求がでてきた。研究所は、ますます増大する量の試験
を時宜よく提供しながらコストダウンを図らなければな
らないという問題に直面している。たとえば、血液銀行
では、献血された血液についてこれまでに試験されてき
た各種因子の存在または該因子への暴露を調べるための
パネルに加えて、ヒトＴ−白血病ウイルス１型（ＨＴＬ
Ｖ−１）、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）お
よびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が加わったことにより
、試験の要求が劇的に高まってきている。
【０００３】このような要求の結果として研究所にもた
らされる仕事の負担を減少させる解決法の一つは、アッ
セイを組み合わせる方法を見つけることである。しかし
ながら、個々のアッセイの性能標準を劣化することなく
複数のアッセイを組み合わせることは困難であり、さら
に重要なことに、製造および品質制御に付随する問題は
克服しがたいものがある。
らされる仕事の負担を減少させる解決法の一つは、アッ
セイを組み合わせる方法を見つけることである。しかし
ながら、個々のアッセイの性能標準を劣化することなく
複数のアッセイを組み合わせることは困難であり、さら
に重要なことに、製造および品質制御に付随する問題は
克服しがたいものがある。
【０００４】何人かの研究者は、試料中の２以上の分析
対象物を同時に検出するためのアッセイを開発もしくは
開発しようと試みている。そのようなアッセイ法は、試
料中の２以上の分析対象物を検出するのに要する時間が
著しく短縮されるために有利であり、また、そのような
アッセイを行うために要する技術時間、試薬および装置
が少なくてすむため各アッセイにかかるコストも少なく
てすむ。
対象物を同時に検出するためのアッセイを開発もしくは
開発しようと試みている。そのようなアッセイ法は、試
料中の２以上の分析対象物を検出するのに要する時間が
著しく短縮されるために有利であり、また、そのような
アッセイを行うために要する技術時間、試薬および装置
が少なくてすむため各アッセイにかかるコストも少なく
てすむ。
【０００５】たとえば、フリドレンダー（Ｆｒｉｄｌｅ
ｎｄｅｒ）らの米国特許第４，３１５，９０７号には不
均一特異結合アッセイシステム（標識試薬の遊離種から
結合種を分離させる）が教示されている。ザーラドニク
（Ｚａｈｒａｄｎｉｋ）らの米国特許第４，３７８，３
４４号およびＥＰ０２７００８号には、レセプタクル（
ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）およびインサートからなる各分
析対象物の存在の決定のための固相装置が教示されてい
る（各分析対象物の存在の決定は、該明細書の特許請求
の範囲に記載のアッセイ方法に従って行われる）。
ｎｄｅｒ）らの米国特許第４，３１５，９０７号には不
均一特異結合アッセイシステム（標識試薬の遊離種から
結合種を分離させる）が教示されている。ザーラドニク
（Ｚａｈｒａｄｎｉｋ）らの米国特許第４，３７８，３
４４号およびＥＰ０２７００８号には、レセプタクル（
ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）およびインサートからなる各分
析対象物の存在の決定のための固相装置が教示されてい
る（各分析対象物の存在の決定は、該明細書の特許請求
の範囲に記載のアッセイ方法に従って行われる）。
【０００６】英国特許第２１８８４１８号には、それぞ
れ上面に開口を有し該開口から突出が延びている反応ウ
エルを有するアッセイトレイ組み立て品が教示されてお
り、該反応ウエル中に導入した試料中に存在する２種以
上の特定物質を検出するために各ウエル側壁の内面およ
び各突出の外面を同時にインキュベートするようになっ
ている。
れ上面に開口を有し該開口から突出が延びている反応ウ
エルを有するアッセイトレイ組み立て品が教示されてお
り、該反応ウエル中に導入した試料中に存在する２種以
上の特定物質を検出するために各ウエル側壁の内面およ
び各突出の外面を同時にインキュベートするようになっ
ている。
【０００７】同時アッセイを開発するための重要な要因
は、同時に行おうとする２つのアッセイが同じ試料容量
、同一のインキュベーション時間および同一のカットオ
フ計算を有していなければならないということである。 そのような同時アッセイ法はまた、イムノアッセイの感
度、特異性および再現性を保証するために、製造業者お
よびアッセイを使用する研究所の両方の側で、各分析対
象物について別々に品質制御することができなければな
らない。
は、同時に行おうとする２つのアッセイが同じ試料容量
、同一のインキュベーション時間および同一のカットオ
フ計算を有していなければならないということである。 そのような同時アッセイ法はまた、イムノアッセイの感
度、特異性および再現性を保証するために、製造業者お
よびアッセイを使用する研究所の両方の側で、各分析対
象物について別々に品質制御することができなければな
らない。
【０００８】それゆえ、システム中に別々の固相を提供
することにより、２種以上の分析対象物を同時に検出す
ることができ、しかもなお検出しようとする各別の分析
対象物を個々に品質制御できるアッセイを提供すること
が有利である。そのようなアッセイ法は、他の公知のア
ッセイ法に改善をもたらすものである。というのは、１
または２以上の分析対象物の存在の同時決定は一つのウ
エルで行われ、固相成分の分離は必要でなく、該同時ア
ッセイにおいて検出しようとする個々の分析対象物につ
いて品質制御することができるからである。
することにより、２種以上の分析対象物を同時に検出す
ることができ、しかもなお検出しようとする各別の分析
対象物を個々に品質制御できるアッセイを提供すること
が有利である。そのようなアッセイ法は、他の公知のア
ッセイ法に改善をもたらすものである。というのは、１
または２以上の分析対象物の存在の同時決定は一つのウ
エルで行われ、固相成分の分離は必要でなく、該同時ア
ッセイにおいて検出しようとする個々の分析対象物につ
いて品質制御することができるからである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中に存在
する１または２以上の分析対象物を同時に検出するため
のアッセイ法に関する。一つの態様において、本発明の
アッセイ法は、 （ａ）試料を （ｉ）第一の分析対象物に特異的な第一結合成分を第一
固相に結合させてなる第一の分析対象物のための捕捉試
薬、および （ｉｉ）第二の分析対象物に特異的な第一結合成分を第
二固相に結合させてなる第二の分析対象物のための捕捉
試薬と同時に接触させて混合物を生成させ、（ｂ）該混
合物を、捕捉試薬／第一分析対象物複合体および捕捉試
薬／第二分析対象物複合体を生成するのに充分な時間お
よび条件下でインキュベートし、（ｃ）かくして生成し
た複合体を （ｉ）第一の分析対象物に特異的な結合ペアの成分をシ
グナル生成化合物で標識してなる第一の分析対象物のた
めの指示試薬、および （ｉｉ）第二の分析対象物に特異的な結合ペアの成分を
シグナル生成化合物で標識してなる第二の分析対象物の
ための指示試薬 と接触させて第二の混合物を生成させ、（ｄ）該第二の
混合物を、 （ｉ）捕捉試薬／第一分析対象物／指示試薬複合体およ
び（ｉｉ）捕捉試薬／第二分析対象物／指示試薬複合体
を生成するのに充分な時間および条件下でインキュベー
トし、ついで （ｅ）該第一固相および該第二固相のいずれかまたは両
方で生成した複合体に付随して生成したシグナルを検出
することにより試料中の１または２以上の分析対象物の
存在を決定する ことを特徴とする。
する１または２以上の分析対象物を同時に検出するため
のアッセイ法に関する。一つの態様において、本発明の
アッセイ法は、 （ａ）試料を （ｉ）第一の分析対象物に特異的な第一結合成分を第一
固相に結合させてなる第一の分析対象物のための捕捉試
薬、および （ｉｉ）第二の分析対象物に特異的な第一結合成分を第
二固相に結合させてなる第二の分析対象物のための捕捉
試薬と同時に接触させて混合物を生成させ、（ｂ）該混
合物を、捕捉試薬／第一分析対象物複合体および捕捉試
薬／第二分析対象物複合体を生成するのに充分な時間お
よび条件下でインキュベートし、（ｃ）かくして生成し
た複合体を （ｉ）第一の分析対象物に特異的な結合ペアの成分をシ
グナル生成化合物で標識してなる第一の分析対象物のた
めの指示試薬、および （ｉｉ）第二の分析対象物に特異的な結合ペアの成分を
シグナル生成化合物で標識してなる第二の分析対象物の
ための指示試薬 と接触させて第二の混合物を生成させ、（ｄ）該第二の
混合物を、 （ｉ）捕捉試薬／第一分析対象物／指示試薬複合体およ
び（ｉｉ）捕捉試薬／第二分析対象物／指示試薬複合体
を生成するのに充分な時間および条件下でインキュベー
トし、ついで （ｅ）該第一固相および該第二固相のいずれかまたは両
方で生成した複合体に付随して生成したシグナルを検出
することにより試料中の１または２以上の分析対象物の
存在を決定する ことを特徴とする。
【００１０】他の態様において、本発明のアッセイ法は
、 （ａ）試料を （ｉ）第一の分析対象物に特異的な第一結合成分を第一
固相に結合させてなる第一の分析対象物のための捕捉試
薬、 （ｉｉ）第二の分析対象物に特異的な第一結合成分を第
二固相に結合させてなる第二の分析対象物のための捕捉
試薬、および （ｉｉｉ）第一の分析対象物に特異的な結合ペアの成分
をシグナル生成化合物で標識してなる第一の分析対象物
のための指示試薬 と同時に接触させて混合物を生成させ、（ｂ）該混合物
を、捕捉試薬／第一分析対象物／指示試薬複合体および
捕捉試薬／第二分析対象物複合体を生成するのに充分な
時間および条件下でインキュベートし、（ｃ）かくして
生成した複合体を、第二の分析対象物に特異的な結合ペ
アの成分をシグナル生成化合物で標識してなる第二の分
析対象物のための指示試薬と接触させて第二の混合物を
生成させ、 （ｄ）該第二の混合物を、捕捉試薬／第二分析対象物／
指示試薬複合体を生成するのに充分な時間および条件下
でインキュベートし、ついで （ｅ）該第一固相および該第二固相のいずれかまたは両
方で生成した複合体に付随して生成したシグナルを検出
することにより試料中の１または２以上の分析対象物の
存在を決定する ことを特徴とする。
、 （ａ）試料を （ｉ）第一の分析対象物に特異的な第一結合成分を第一
固相に結合させてなる第一の分析対象物のための捕捉試
薬、 （ｉｉ）第二の分析対象物に特異的な第一結合成分を第
二固相に結合させてなる第二の分析対象物のための捕捉
試薬、および （ｉｉｉ）第一の分析対象物に特異的な結合ペアの成分
をシグナル生成化合物で標識してなる第一の分析対象物
のための指示試薬 と同時に接触させて混合物を生成させ、（ｂ）該混合物
を、捕捉試薬／第一分析対象物／指示試薬複合体および
捕捉試薬／第二分析対象物複合体を生成するのに充分な
時間および条件下でインキュベートし、（ｃ）かくして
生成した複合体を、第二の分析対象物に特異的な結合ペ
アの成分をシグナル生成化合物で標識してなる第二の分
析対象物のための指示試薬と接触させて第二の混合物を
生成させ、 （ｄ）該第二の混合物を、捕捉試薬／第二分析対象物／
指示試薬複合体を生成するのに充分な時間および条件下
でインキュベートし、ついで （ｅ）該第一固相および該第二固相のいずれかまたは両
方で生成した複合体に付随して生成したシグナルを検出
することにより試料中の１または２以上の分析対象物の
存在を決定する ことを特徴とする。
【００１１】以下、本発明をさらに詳しく説明する。本
発明のアッセイはイムノアッセイとして行うのが好まし
いが、本発明は免疫反応アッセイに限られるものではな
い。特異的結合成分を用いたいかなるアッセイも行うこ
とができる。本明細書において「特異的結合成分」とは
、特異的結合ペア（すなわち、化学的または物理的手段
により一方の分子が第二の分子に特異的に結合している
２つの異なる分子）の成分をいう。それゆえ、通常のイ
ムノアッセイにおける抗原と抗体の特異的結合ペアに加
えて、他の特異的結合ペア、たとえば、ビオチンとアビ
ジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、
エフェクター分子とレセプター分子、酵素コファクター
と酵素、酵素インヒビターと酵素なども用いることがで
きる。さらに、特異的結合ペアには、もともとの特異的
結合成分の類似体である成分、たとえば分析対象物類似
体も含まれる。免疫反応特異的結合成分の例としては、
抗原、抗原断片；抗体および抗体断片（モノクローナル
およびポリクローナルの両方を含む）；およびそれらの
複合体（組換えＤＮＡ法により生成したものを含む）な
どが挙げられる。
発明のアッセイはイムノアッセイとして行うのが好まし
いが、本発明は免疫反応アッセイに限られるものではな
い。特異的結合成分を用いたいかなるアッセイも行うこ
とができる。本明細書において「特異的結合成分」とは
、特異的結合ペア（すなわち、化学的または物理的手段
により一方の分子が第二の分子に特異的に結合している
２つの異なる分子）の成分をいう。それゆえ、通常のイ
ムノアッセイにおける抗原と抗体の特異的結合ペアに加
えて、他の特異的結合ペア、たとえば、ビオチンとアビ
ジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、
エフェクター分子とレセプター分子、酵素コファクター
と酵素、酵素インヒビターと酵素なども用いることがで
きる。さらに、特異的結合ペアには、もともとの特異的
結合成分の類似体である成分、たとえば分析対象物類似
体も含まれる。免疫反応特異的結合成分の例としては、
抗原、抗原断片；抗体および抗体断片（モノクローナル
およびポリクローナルの両方を含む）；およびそれらの
複合体（組換えＤＮＡ法により生成したものを含む）な
どが挙げられる。
【００１２】本明細書において「分析対象物」とは、試
料中に存在する検出すべき物質をいう。分析対象物は、
特異的結合成分（たとえば、抗体など）が天然に存在す
るか、または特異的結合成分を調製することのできる物
質であればいかなるものであってもよい。それゆえ、分
析対象物は、アッセイ中の１または２以上の特異的結合
成分に結合することのできる物質である。「分析対象物
」には、あらゆる抗原性物質、ハプテン、抗体、および
それらの組み合わせが含まれる。特異的結合ペアの成分
として、分析対象物は、天然に存在する特異的結合パー
トナー（ペア）を用い、たとえば、ビタミンＢ１２の決
定のための捕捉および／または指示試薬において内因子
タンパク質を使用したり、炭水化物の決定のための捕捉
および／または指示試薬においてレクチンを使用したり
することにより検出することができる。分析対象物の例
としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン
、ステロイド、ビタミン、薬物（治療目的で投与される
ものおよび不法目的で投与されるものを含む）、細菌、
ウイルス、および以上の物質の代謝産物または以上の物
質に対する抗体などが挙げられる。試料は、血清、血漿
、脳脊髄液、尿などの生物学的流体であってよい。試料
はまた、培養液の上澄み液、または細胞懸濁液であって
もよい。行おうとするアッセイの種類により、非生物学
的流体試料を用いることもできる。
料中に存在する検出すべき物質をいう。分析対象物は、
特異的結合成分（たとえば、抗体など）が天然に存在す
るか、または特異的結合成分を調製することのできる物
質であればいかなるものであってもよい。それゆえ、分
析対象物は、アッセイ中の１または２以上の特異的結合
成分に結合することのできる物質である。「分析対象物
」には、あらゆる抗原性物質、ハプテン、抗体、および
それらの組み合わせが含まれる。特異的結合ペアの成分
として、分析対象物は、天然に存在する特異的結合パー
トナー（ペア）を用い、たとえば、ビタミンＢ１２の決
定のための捕捉および／または指示試薬において内因子
タンパク質を使用したり、炭水化物の決定のための捕捉
および／または指示試薬においてレクチンを使用したり
することにより検出することができる。分析対象物の例
としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン
、ステロイド、ビタミン、薬物（治療目的で投与される
ものおよび不法目的で投与されるものを含む）、細菌、
ウイルス、および以上の物質の代謝産物または以上の物
質に対する抗体などが挙げられる。試料は、血清、血漿
、脳脊髄液、尿などの生物学的流体であってよい。試料
はまた、培養液の上澄み液、または細胞懸濁液であって
もよい。行おうとするアッセイの種類により、非生物学
的流体試料を用いることもできる。
【００１３】指示試薬は、各分析対象物の特異的結合成
分に標識を結合させたものである。各指示試薬は、試料
中の分析対象物の量と相関したレベルの検出可能なシグ
ナルを生成する。好ましい態様においては、各指示試薬
（異なる分析対象物の特異的結合成分を含む）は、同じ
シグナル生成化合物（標識）（検出可能なシグナルを生
成し得る）に結合している。一般に、指示試薬は、固相
物質上に捕捉させた後に検出または測定される。本発明
では、指示試薬により生成される全シグナルが、試料中
の１または２以上の分析対象物の存在を示す。本発明を
行うに際して、異なるシグナル生成化合物を利用するこ
とも考えられる。それゆえ、たとえば、各指示試薬に対
して異なる蛍光化合物をシグナル生成化合物として利用
し、異なる波長で読み取りを行うことにより検出を決定
することもできる。
分に標識を結合させたものである。各指示試薬は、試料
中の分析対象物の量と相関したレベルの検出可能なシグ
ナルを生成する。好ましい態様においては、各指示試薬
（異なる分析対象物の特異的結合成分を含む）は、同じ
シグナル生成化合物（標識）（検出可能なシグナルを生
成し得る）に結合している。一般に、指示試薬は、固相
物質上に捕捉させた後に検出または測定される。本発明
では、指示試薬により生成される全シグナルが、試料中
の１または２以上の分析対象物の存在を示す。本発明を
行うに際して、異なるシグナル生成化合物を利用するこ
とも考えられる。それゆえ、たとえば、各指示試薬に対
して異なる蛍光化合物をシグナル生成化合物として利用
し、異なる波長で読み取りを行うことにより検出を決定
することもできる。
【００１４】特異的結合ペアの成分が抗原または抗体の
いずれかであるのに加えて、指示試薬の特異的結合成分
はまた、他のあらゆる特異的結合ペアの成分、たとえば
ビオチンかアビジン、炭水化物かレクチン、相補的ヌク
レオチド配列、エフェクター分子かレセプター分子、酵
素コファクターか酵素、酵素インヒビターか酵素、であ
ってもよい。免疫反応性特異的結合成分の例としては、
抗体、抗原、またはサンドイッチアッセイにおけるよう
に分析対象物に結合し得る抗体／抗原複合体、競合アッ
セイにおけるように捕捉試薬に結合し得る抗体／抗原複
合体、または間接アッセイにおけるように補助特異的結
合成分に結合し得る抗体／抗原複合体などが挙げられる
。抗体を用いる場合は、該抗体は、モノクローナル抗体
、ポリクローナル抗体、抗体断片、組換え抗体、それら
の混合物、抗体と他の特異的結合成分との混合物であっ
てよい。そのような抗体の調製法および特異的結合成分
として使用するのに適していることの詳細は、当該技術
分野でよく知られている。
いずれかであるのに加えて、指示試薬の特異的結合成分
はまた、他のあらゆる特異的結合ペアの成分、たとえば
ビオチンかアビジン、炭水化物かレクチン、相補的ヌク
レオチド配列、エフェクター分子かレセプター分子、酵
素コファクターか酵素、酵素インヒビターか酵素、であ
ってもよい。免疫反応性特異的結合成分の例としては、
抗体、抗原、またはサンドイッチアッセイにおけるよう
に分析対象物に結合し得る抗体／抗原複合体、競合アッ
セイにおけるように捕捉試薬に結合し得る抗体／抗原複
合体、または間接アッセイにおけるように補助特異的結
合成分に結合し得る抗体／抗原複合体などが挙げられる
。抗体を用いる場合は、該抗体は、モノクローナル抗体
、ポリクローナル抗体、抗体断片、組換え抗体、それら
の混合物、抗体と他の特異的結合成分との混合物であっ
てよい。そのような抗体の調製法および特異的結合成分
として使用するのに適していることの詳細は、当該技術
分野でよく知られている。
【００１５】指示試薬のシグナル生成化合物（標識）は
、外部手段により検出可能な測定可能シグナルを生成す
ることができる。種々のシグナル生成化合物（標識）の
例としては、色原体、酵素などの触媒、フルオレセイン
やローダミンなどの発光化合物、化学発光化合物、放射
性元素、および直接視覚標識などが挙げられる。特定の
標識を選択することは重要ではないが、それ自体単独か
または１または２以上の他の物質と組み合わせてシグナ
ルを生成させることができる。標識かまたは特異的結合
成分のいずれかを変えることにより、種々の指示試薬を
生成させることができる。
、外部手段により検出可能な測定可能シグナルを生成す
ることができる。種々のシグナル生成化合物（標識）の
例としては、色原体、酵素などの触媒、フルオレセイン
やローダミンなどの発光化合物、化学発光化合物、放射
性元素、および直接視覚標識などが挙げられる。特定の
標識を選択することは重要ではないが、それ自体単独か
または１または２以上の他の物質と組み合わせてシグナ
ルを生成させることができる。標識かまたは特異的結合
成分のいずれかを変えることにより、種々の指示試薬を
生成させることができる。
【００１６】本発明の捕捉試薬は、各目的分析対象物の
特異的結合成分を別々の異なる固相に結合させたもので
ある。この結合は、たとえば、吸着または共有カップリ
ングにより特異的結合成分を固相上にコーティングする
ことにより行うことができる。コーティング法および他
の公知の結合手段は、当該技術分野で知られている。
特異的結合成分を別々の異なる固相に結合させたもので
ある。この結合は、たとえば、吸着または共有カップリ
ングにより特異的結合成分を固相上にコーティングする
ことにより行うことができる。コーティング法および他
の公知の結合手段は、当該技術分野で知られている。
【００１７】捕捉試薬の特異的結合成分は、他の分子に
特異的に結合し得る分子であればいかなるものであって
もよい。捕捉試薬の特異的結合成分は、抗体、抗原、ま
たは抗体／抗原複合体などの免疫反応性化合物であって
よい。抗体を用いる場合は、モノクローナル抗体、ポリ
クローナル抗体、抗体断片、組換え抗体、それらの混合
物、または抗体と他の特異的結合成分との混合物であっ
てよい。
特異的に結合し得る分子であればいかなるものであって
もよい。捕捉試薬の特異的結合成分は、抗体、抗原、ま
たは抗体／抗原複合体などの免疫反応性化合物であって
よい。抗体を用いる場合は、モノクローナル抗体、ポリ
クローナル抗体、抗体断片、組換え抗体、それらの混合
物、または抗体と他の特異的結合成分との混合物であっ
てよい。
【００１８】固相物質は、当業者により選択される。そ
れゆえ、ウエル、ビーズなどを利用することができる。 ポリスチレンウエルおよびポリスチレンビーズを利用す
るのが好ましい。両方の固相ともシグナルの定量中も存
在しているので、シグナルの検出のため固相を分離する
必要がなくなることが考えられる。第一の分析対象物の
ための捕捉試薬は第一固相に固定化させ、第二の分析対
象物のための捕捉試薬は第二固相に固定化させる。第二
固相は、第一固相とは異なる形状であるのが好ましい。 それゆえ、たとえば、選択した第一固相がポリスチレン
ウエルであるならば、アッセイに使用する第二固相はポ
リスチレンビーズであってよい。
れゆえ、ウエル、ビーズなどを利用することができる。 ポリスチレンウエルおよびポリスチレンビーズを利用す
るのが好ましい。両方の固相ともシグナルの定量中も存
在しているので、シグナルの検出のため固相を分離する
必要がなくなることが考えられる。第一の分析対象物の
ための捕捉試薬は第一固相に固定化させ、第二の分析対
象物のための捕捉試薬は第二固相に固定化させる。第二
固相は、第一固相とは異なる形状であるのが好ましい。 それゆえ、たとえば、選択した第一固相がポリスチレン
ウエルであるならば、アッセイに使用する第二固相はポ
リスチレンビーズであってよい。
【００１９】本発明を実施するに際しては、目的分析対
象物を含有していると思われる試料を、第一分析対象物
の第一特異的結合成分を結合させた第一固相、および第
二分析対象物の第一特異的結合成分を結合させた第二固
相と同時に接触させて、混合物を生成させる。これら特
異的結合成分は捕捉試薬として働き、分析対象物を両方
の固相に結合させる。特異的結合成分が免疫反応物であ
る場合は、各目的分析対象物に特異的な抗体、抗原、ま
たはそれらの複合体であってよい。特異的結合成分が抗
体である場合は、モノクローナル抗体、ポリクローナル
抗体、抗体断片、組換え抗体、それらの混合物、または
抗体と他の特異的結合成分との混合物であってよい。こ
の混合物を、結合反応が起こるのに充分な時間および条
件下でインキュベートすると、このインキュベーション
の結果、第一分析対象物が試料中に存在する場合には第
一分析対象物の捕捉試薬／第一分析対象物複合体が、第
二分析対象物が試料中に存在する場合には第二分析対象
物の捕捉試薬／第二分析対象物複合体がそれぞれ生成す
る。
象物を含有していると思われる試料を、第一分析対象物
の第一特異的結合成分を結合させた第一固相、および第
二分析対象物の第一特異的結合成分を結合させた第二固
相と同時に接触させて、混合物を生成させる。これら特
異的結合成分は捕捉試薬として働き、分析対象物を両方
の固相に結合させる。特異的結合成分が免疫反応物であ
る場合は、各目的分析対象物に特異的な抗体、抗原、ま
たはそれらの複合体であってよい。特異的結合成分が抗
体である場合は、モノクローナル抗体、ポリクローナル
抗体、抗体断片、組換え抗体、それらの混合物、または
抗体と他の特異的結合成分との混合物であってよい。こ
の混合物を、結合反応が起こるのに充分な時間および条
件下でインキュベートすると、このインキュベーション
の結果、第一分析対象物が試料中に存在する場合には第
一分析対象物の捕捉試薬／第一分析対象物複合体が、第
二分析対象物が試料中に存在する場合には第二分析対象
物の捕捉試薬／第二分析対象物複合体がそれぞれ生成す
る。
【００２０】ついで、各分析対象物に対する指示試薬を
該複合体と接触させる。第一の分析対象物に対する指示
試薬は、目的の第一分析対象物の特異的結合成分をシグ
ナル生成化合物で標識したものである。第二の分析対象
物に対する指示試薬は、目的の第二分析対象物の特異的
結合成分を第一分析対象物に対する指示試薬の場合と同
じシグナル生成化合物で標識したものである。かくして
、第二の混合物を生成させる。この第二の混合物を、捕
捉試薬／第一分析対象物／指示試薬複合体および／また
は捕捉試薬／第二分析対象物／指示試薬複合体を生成す
るのに充分な時間および条件下でインキュベートする。 いずれかの分析対象物の存在は、該第一固相または第二
固相のいずれかまたは両方で生成する複合体に付随して
生成したシグナルを検出することにより決定する。 指示試薬においてシグナル生成化合物（標識）として酵
素を用いている場合は、シグナルは視覚により検出する
かまたは分光光度計で測定する。標識はまた、シグナル
を生成させるために使用した標識の種類に従って、蛍光
、化学発光、放射能エネルギー放出等を測定することに
より検出することもできる。
該複合体と接触させる。第一の分析対象物に対する指示
試薬は、目的の第一分析対象物の特異的結合成分をシグ
ナル生成化合物で標識したものである。第二の分析対象
物に対する指示試薬は、目的の第二分析対象物の特異的
結合成分を第一分析対象物に対する指示試薬の場合と同
じシグナル生成化合物で標識したものである。かくして
、第二の混合物を生成させる。この第二の混合物を、捕
捉試薬／第一分析対象物／指示試薬複合体および／また
は捕捉試薬／第二分析対象物／指示試薬複合体を生成す
るのに充分な時間および条件下でインキュベートする。 いずれかの分析対象物の存在は、該第一固相または第二
固相のいずれかまたは両方で生成する複合体に付随して
生成したシグナルを検出することにより決定する。 指示試薬においてシグナル生成化合物（標識）として酵
素を用いている場合は、シグナルは視覚により検出する
かまたは分光光度計で測定する。標識はまた、シグナル
を生成させるために使用した標識の種類に従って、蛍光
、化学発光、放射能エネルギー放出等を測定することに
より検出することもできる。
【００２１】本発明の他の態様では、いずれかの目的分
析対象物を含有していると思われる試料を、第一分析対
象物の第一特異的結合成分を結合させた第一固相、第二
分析対象物の第一特異的結合成分を結合させた第二固相
、および第一分析対象物に対する特異的結合成分をシグ
ナル生成化合物で標識してなる第一分析対象物に対する
指示試薬と同時に接触させて混合物を生成させる。特異
的結合成分は、分析対象物を固相に結合させる捕捉試薬
として働く。特異的結合成分が免疫反応物である場合は
、各目的分析対象物に特異的な抗体、抗原、またはそれ
らの混合物であってよい。特異的結合成分が抗体である
場合は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗
体断片、組換え抗体、並びにそれらの混合物、または抗
体と他の特異的結合成分との混合物であってよい。指示
試薬は、目的第一分析対象物の特異的結合成分をシグナ
ル生成化合物で標識したものである。この混合物を、結
合反応が起こるのに充分な時間および条件下でインキュ
ベートすると、該第一または第二分析対象物が試料中に
存在するならば、第一分析対象物の捕捉試薬／第一分析
対象物／指示試薬複合体および／または第二分析対象物
の捕捉試薬／第二分析対象物／指示試薬複合体が生成す
る。
析対象物を含有していると思われる試料を、第一分析対
象物の第一特異的結合成分を結合させた第一固相、第二
分析対象物の第一特異的結合成分を結合させた第二固相
、および第一分析対象物に対する特異的結合成分をシグ
ナル生成化合物で標識してなる第一分析対象物に対する
指示試薬と同時に接触させて混合物を生成させる。特異
的結合成分は、分析対象物を固相に結合させる捕捉試薬
として働く。特異的結合成分が免疫反応物である場合は
、各目的分析対象物に特異的な抗体、抗原、またはそれ
らの混合物であってよい。特異的結合成分が抗体である
場合は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗
体断片、組換え抗体、並びにそれらの混合物、または抗
体と他の特異的結合成分との混合物であってよい。指示
試薬は、目的第一分析対象物の特異的結合成分をシグナ
ル生成化合物で標識したものである。この混合物を、結
合反応が起こるのに充分な時間および条件下でインキュ
ベートすると、該第一または第二分析対象物が試料中に
存在するならば、第一分析対象物の捕捉試薬／第一分析
対象物／指示試薬複合体および／または第二分析対象物
の捕捉試薬／第二分析対象物／指示試薬複合体が生成す
る。
【００２２】ついで、かくして生成した複合体に、目的
第二分析対象物の特異的結合成分を上記第一分析対象物
に対する指示試薬と同じシグナル生成化合物で標識して
なる第二指示試薬を接触させ、この第二混合物を、捕捉
試薬／第二分析対象物／指示試薬複合体を生成するのに
充分な時間および条件下でインキュベートする。いずれ
かの分析対象物の存在は、該第一固相および第二固相の
いずれかまたは両方に付随して生成するシグナルを検出
することにより決定する。指示試薬においてシグナル生
成化合物（標識）として酵素を用いる場合は、シグナル
は視覚により検出するかまたは分光光度計により測定す
ることができる。標識はまた、使用した標識の種類に従
って、蛍光、化学発光、放射能エネルギー放出等を測定
することにより検出することもできる。
第二分析対象物の特異的結合成分を上記第一分析対象物
に対する指示試薬と同じシグナル生成化合物で標識して
なる第二指示試薬を接触させ、この第二混合物を、捕捉
試薬／第二分析対象物／指示試薬複合体を生成するのに
充分な時間および条件下でインキュベートする。いずれ
かの分析対象物の存在は、該第一固相および第二固相の
いずれかまたは両方に付随して生成するシグナルを検出
することにより決定する。指示試薬においてシグナル生
成化合物（標識）として酵素を用いる場合は、シグナル
は視覚により検出するかまたは分光光度計により測定す
ることができる。標識はまた、使用した標識の種類に従
って、蛍光、化学発光、放射能エネルギー放出等を測定
することにより検出することもできる。
【００２３】信頼性のある結果を得るため、本発明のア
ッセイ中に陽性コントロールおよび陰性コントロールを
用いることができる。捕捉試薬を結合していないブラン
クビーズおよびブランクウエルを陰性試薬コントロール
として用いることができる。陽性コントロールには、別
々に試験する各分析対象物に対する陽性コントロール、
およびアッセイで検出すべきすべての分析対象物の存在
を決定する組み合わせ陽性コントロールが含まれる。
ッセイ中に陽性コントロールおよび陰性コントロールを
用いることができる。捕捉試薬を結合していないブラン
クビーズおよびブランクウエルを陰性試薬コントロール
として用いることができる。陽性コントロールには、別
々に試験する各分析対象物に対する陽性コントロール、
およびアッセイで検出すべきすべての分析対象物の存在
を決定する組み合わせ陽性コントロールが含まれる。
【００２４】本発明のアッセイを開発するに際して認識
された重要な要因には、異なる分析対象物のための異な
るアッセイに使用するのに必要な異なる量の試料、異な
るインキュベーション時間および異なるカットオフ計算
が含まれていた。これら要因を下記表１にまとめてある
。表中、「ＨＢｓＡｇ」はＢ型肝炎表面抗原であり、「
抗ＨＢｃ」は抗Ｂ型肝炎コア抗体である。
された重要な要因には、異なる分析対象物のための異な
るアッセイに使用するのに必要な異なる量の試料、異な
るインキュベーション時間および異なるカットオフ計算
が含まれていた。これら要因を下記表１にまとめてある
。表中、「ＨＢｓＡｇ」はＢ型肝炎表面抗原であり、「
抗ＨＢｃ」は抗Ｂ型肝炎コア抗体である。
【００２５】
【表１】
表１
現在用いられている 試料容量 イン
キュベー カットオフイムノアッセイ試験＊
（μｌ） ション時間（分） 計算
ＨＢｓＡｇ １
５０−２００μｌ ７５／３０
Ｎ．Ｃ．＊＊＋０．０２５抗ＨＢｃ
１００μｌ １２０
／３０ ０．４Ｎ．Ｃ．＋０．６ｐ．
Ｃ．＊＊＊ＨＩＶ−１（現在 １μｌ
／４００μｌ ６０／１２０／３０ Ｎ
．Ｃ．＋０．１５Ｐ．Ｃ．用いられているもの）
ＨＴＬＶ−１ ５μｌ／２００
μｌ ３０／３０／３０ ４．５×Ｎ
．Ｃ．ＨＣＶ ５
μｌ／２００μｌ ６０／３０／３０
Ｎ．Ｃ．＋０．２５Ｐ．Ｃ．（注）＊；アボット・ラ
ボラトリーズ（アボットパーク、イリノイ州）により開
発され市場に売り出されている試験に基づく。 ＊＊：陰性コントロール、＊＊＊：陽性コントロール
キュベー カットオフイムノアッセイ試験＊
（μｌ） ション時間（分） 計算
ＨＢｓＡｇ １
５０−２００μｌ ７５／３０
Ｎ．Ｃ．＊＊＋０．０２５抗ＨＢｃ
１００μｌ １２０
／３０ ０．４Ｎ．Ｃ．＋０．６ｐ．
Ｃ．＊＊＊ＨＩＶ−１（現在 １μｌ
／４００μｌ ６０／１２０／３０ Ｎ
．Ｃ．＋０．１５Ｐ．Ｃ．用いられているもの）
ＨＴＬＶ−１ ５μｌ／２００
μｌ ３０／３０／３０ ４．５×Ｎ
．Ｃ．ＨＣＶ ５
μｌ／２００μｌ ６０／３０／３０
Ｎ．Ｃ．＋０．２５Ｐ．Ｃ．（注）＊；アボット・ラ
ボラトリーズ（アボットパーク、イリノイ州）により開
発され市場に売り出されている試験に基づく。 ＊＊：陰性コントロール、＊＊＊：陽性コントロール
【
００２６】１または２以上の分析対象物を試験するため
の本発明のアッセイにおいて、標準容量の試料を用いる
ことができることがわかった。たとえば、ＨＢｓＡｇの
ためのアッセイに利用される伝統的な試料容量は≧１５
０μｌであり、ＨＩＶ−１抗体（Ａｂ）のためのアッセ
イに使用される試料容量はわずか１〜１０μｌであった
。このＨＩＶ−１のための低い試料容量は、アッセイに
抗ヒト結合体を使用することによるものであった。しか
しながら、特定抗原をコーティングした固相および特定
抗原複合体を使用した本発明のアッセイにより、ＨＩＶ
試料容量を≧１５０μｌまで増大させることができるこ
とがわかった。さらに、ＨＢｓＡｇのカットオフ計算は
陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）＋０．０２５であり、一
方、ＨＩＶ Ａｂのカットオフ計算はＮ．Ｃ．＋０．１
０であった。しかしながら、反応トレイを震盪すること
による動的インキュベーションにより、ＨＢｓＡｇのカ
ットオフをＮ．Ｃ．＋０．１０まで増大させることがで
きることがわかった。この震盪運動（８００〜１０００
ｒｐｍで使用した場合）はアッセイの動力学を増大させ
、感度を損なうことなくカットオフをＮ．Ｃ．＋０．１
０に増大させることができた。また、ＨＢｓＡｇの個々
のアッセイインキュベーション時間（７５分および３０
分であった）は、試験性能を損なうことなく９０分／３
０分／３０分の共通のプロトコールに組み入れることが
できることがわかった。
００２６】１または２以上の分析対象物を試験するため
の本発明のアッセイにおいて、標準容量の試料を用いる
ことができることがわかった。たとえば、ＨＢｓＡｇの
ためのアッセイに利用される伝統的な試料容量は≧１５
０μｌであり、ＨＩＶ−１抗体（Ａｂ）のためのアッセ
イに使用される試料容量はわずか１〜１０μｌであった
。このＨＩＶ−１のための低い試料容量は、アッセイに
抗ヒト結合体を使用することによるものであった。しか
しながら、特定抗原をコーティングした固相および特定
抗原複合体を使用した本発明のアッセイにより、ＨＩＶ
試料容量を≧１５０μｌまで増大させることができるこ
とがわかった。さらに、ＨＢｓＡｇのカットオフ計算は
陰性コントロール（Ｎ．Ｃ．）＋０．０２５であり、一
方、ＨＩＶ Ａｂのカットオフ計算はＮ．Ｃ．＋０．１
０であった。しかしながら、反応トレイを震盪すること
による動的インキュベーションにより、ＨＢｓＡｇのカ
ットオフをＮ．Ｃ．＋０．１０まで増大させることがで
きることがわかった。この震盪運動（８００〜１０００
ｒｐｍで使用した場合）はアッセイの動力学を増大させ
、感度を損なうことなくカットオフをＮ．Ｃ．＋０．１
０に増大させることができた。また、ＨＢｓＡｇの個々
のアッセイインキュベーション時間（７５分および３０
分であった）は、試験性能を損なうことなく９０分／３
０分／３０分の共通のプロトコールに組み入れることが
できることがわかった。
【００２７】製造および品質制御の問題は、各アッセイ
に対する固相を反応ウエル中で分離させることにより解
決することができた。たとえば、一つの態様においては
、ＨＢｓＡｇ用に選択した固相を反応ウエル自体の内壁
とし、一方、ＨＩＶ−１用に選択した固相をポリスチレ
ンビーズとした。別々の固相とすることにより、固相の
コーティングを各分析対象物に対して最適化することが
でき、さらに重要なことに、各固相を別々に品質制御す
ることができた。シグナル生成化合物として酵素を用い
る場合は、反応ウエル中の固相ビーズに伴う分光光度計
リーダー中の吸光度値を読み取ることにより発色を検出
する。発色（シグナル生成化合物により生成されるシグ
ナル）は、反応ウエルまたはビーズのいずれか、または
その両方から生じる。それゆえ、このアッセイ態様は、
同じ固相上で免疫化学反応が組合わされるわけではない
ので組合わせ試験としてよりも同時試験として特徴付け
られる。それゆえ、このアッセイ態様は、ＨＩＶ−１の
みに対する試料の反応性やＨＢｓＡｇのみに対する試料
の反応性などの特定分析対象物の反応を同定するもので
はない。しかしながら、これら陽性試料の血液銀行集団
中での普及は低いので、この集団中に存在すると予測さ
れる数百の試料当たり１または２の真の陽性試料は、さ
らに試験することにより同定することができる。 それゆえ、このアッセイ態様は、試験を促進し、各実験
研究者の効率および処理量を倍増させる。
に対する固相を反応ウエル中で分離させることにより解
決することができた。たとえば、一つの態様においては
、ＨＢｓＡｇ用に選択した固相を反応ウエル自体の内壁
とし、一方、ＨＩＶ−１用に選択した固相をポリスチレ
ンビーズとした。別々の固相とすることにより、固相の
コーティングを各分析対象物に対して最適化することが
でき、さらに重要なことに、各固相を別々に品質制御す
ることができた。シグナル生成化合物として酵素を用い
る場合は、反応ウエル中の固相ビーズに伴う分光光度計
リーダー中の吸光度値を読み取ることにより発色を検出
する。発色（シグナル生成化合物により生成されるシグ
ナル）は、反応ウエルまたはビーズのいずれか、または
その両方から生じる。それゆえ、このアッセイ態様は、
同じ固相上で免疫化学反応が組合わされるわけではない
ので組合わせ試験としてよりも同時試験として特徴付け
られる。それゆえ、このアッセイ態様は、ＨＩＶ−１の
みに対する試料の反応性やＨＢｓＡｇのみに対する試料
の反応性などの特定分析対象物の反応を同定するもので
はない。しかしながら、これら陽性試料の血液銀行集団
中での普及は低いので、この集団中に存在すると予測さ
れる数百の試料当たり１または２の真の陽性試料は、さ
らに試験することにより同定することができる。 それゆえ、このアッセイ態様は、試験を促進し、各実験
研究者の効率および処理量を倍増させる。
【００２８】
【実施例】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。 実施例１ （ＨＣＶ抗原のトレイコーティング法）組換えＨＣＶ抗
原をコーティング緩衝液（リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］
、０．０１Ｍ、ｐＨ７．２）中に１３３ｎｇ／ｍｌまで
希釈し、周囲室温（２２〜２５℃）にて最大５分間、充
分に混合した。この希釈抗原溶液（３００μｌ）をポリ
スチレントレイの各ウエルに加えた。ついで、このトレ
イを、オービタルシェーカー上、周囲室温（２０±５℃
）で少なくとも約１時間震盪することにより動的にイン
キュベートした。ついで、希釈抗原溶液を吸引し、洗浄
緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．２および０．０
５％ポリソルベート−２０を含有）をトレイの各ウエル
に加え、オービタルシェーカー上、周囲室温で少なくと
も約１時間動的にインキュベートした。
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。 実施例１ （ＨＣＶ抗原のトレイコーティング法）組換えＨＣＶ抗
原をコーティング緩衝液（リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］
、０．０１Ｍ、ｐＨ７．２）中に１３３ｎｇ／ｍｌまで
希釈し、周囲室温（２２〜２５℃）にて最大５分間、充
分に混合した。この希釈抗原溶液（３００μｌ）をポリ
スチレントレイの各ウエルに加えた。ついで、このトレ
イを、オービタルシェーカー上、周囲室温（２０±５℃
）で少なくとも約１時間震盪することにより動的にイン
キュベートした。ついで、希釈抗原溶液を吸引し、洗浄
緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．２および０．０
５％ポリソルベート−２０を含有）をトレイの各ウエル
に加え、オービタルシェーカー上、周囲室温で少なくと
も約１時間動的にインキュベートした。
【００２９】洗浄緩衝液を吸引し、オーバーコーティン
グ緩衝液（トリス−リン酸緩衝食塩水（ＥＤＴＡ、ＥＧ
ＴＡおよびショ糖を保存剤として含有）、１０％トリト
ンＸ−１００Ｒ界面活性剤［ポリオキシエチレンエーテ
ル、シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ州より
入手可能］、１０％ウシ血清、および２０％ヤギ血清か
らなる）をトレイの各ウエルに加えた。ついで、トレイ
を４０℃で３０分間インキュベートした。このインキュ
ベーション後、オーバーコーティング緩衝液を各ウエル
から除き、ラミナーフローフード中、周囲室温にて約５
時間〜約２０時間乾燥させた。ついで、このトレイを使
用するときまで周囲室温で貯蔵した。
グ緩衝液（トリス−リン酸緩衝食塩水（ＥＤＴＡ、ＥＧ
ＴＡおよびショ糖を保存剤として含有）、１０％トリト
ンＸ−１００Ｒ界面活性剤［ポリオキシエチレンエーテ
ル、シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ州より
入手可能］、１０％ウシ血清、および２０％ヤギ血清か
らなる）をトレイの各ウエルに加えた。ついで、トレイ
を４０℃で３０分間インキュベートした。このインキュ
ベーション後、オーバーコーティング緩衝液を各ウエル
から除き、ラミナーフローフード中、周囲室温にて約５
時間〜約２０時間乾燥させた。ついで、このトレイを使
用するときまで周囲室温で貯蔵した。
【００３０】実施例２
（ＨＣＶ／ＨＴＬＶ−１の同時アッセイ）試験管中で１
０μｌの試料またはコントロールを試料希釈液（４００
μｌ）に加えることにより試料またはコントロールを希
釈した。この希釈試料または希釈コントロール（２００
μｌ）を、実施例１で調製したトレイのウエルに移した
。 ＨＴＬＶ−１抗原（アボット・ラボラトリーズ、アボッ
トパーク、イリノイ州、６００６４より入手可能）をコ
ーティングした一つのポリスチレンビーズを各ウエルに
加えた。これらウエルに蓋をし、トレイを軽くたたくこ
とにより混合し、４０±２℃で１時間±５分間インキュ
ベートした。各ビーズ／ウエルから流体を吸引し、蒸留
水または脱イオン水を用いて各ビーズ／ウエルを３回洗
浄した。ついで、ヒトＩｇＧに向けられた西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗体（キルケガール・アンド・
ペリー（Ｋｉｒｋｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）、
ガイセルスバーグ、メリーランド州２０８７９より入手
）を含有する希釈結合体（２００μｌ）を各ビーズ／ウ
エルに加えた。
０μｌの試料またはコントロールを試料希釈液（４００
μｌ）に加えることにより試料またはコントロールを希
釈した。この希釈試料または希釈コントロール（２００
μｌ）を、実施例１で調製したトレイのウエルに移した
。 ＨＴＬＶ−１抗原（アボット・ラボラトリーズ、アボッ
トパーク、イリノイ州、６００６４より入手可能）をコ
ーティングした一つのポリスチレンビーズを各ウエルに
加えた。これらウエルに蓋をし、トレイを軽くたたくこ
とにより混合し、４０±２℃で１時間±５分間インキュ
ベートした。各ビーズ／ウエルから流体を吸引し、蒸留
水または脱イオン水を用いて各ビーズ／ウエルを３回洗
浄した。ついで、ヒトＩｇＧに向けられた西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗体（キルケガール・アンド・
ペリー（Ｋｉｒｋｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ）、
ガイセルスバーグ、メリーランド州２０８７９より入手
）を含有する希釈結合体（２００μｌ）を各ビーズ／ウ
エルに加えた。
【００３１】各ビーズ／ウエルに蓋をし、トレイを軽く
たたくことにより混合した。このビーズ／ウエルを４０
±２℃で３０分間±２分間インキュベートした。各ビー
ズ／ウエルから流体を吸引し、各ビーズ／ウエルを蒸留
水または脱イオン水を用いて３回洗浄した。ついで、ｏ
−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質（３００μｌ）を
各ウエル／ビーズに加えた。これらビーズ／ウエルに蓋
をし、周囲室温で３０分間±２分間インキュベートした
。 １Ｎ硫酸（３００μｌ）を各ビーズ／ウエルに加えて発
色を停止させた。アボットコマンダーＲパラレルプロセ
シングセンター（アボット・ラボラトリーズ、アボット
パーク、イリノイ州、６００６４より入手可能）（各ビ
ーズ／ウエルの４６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ４６
０）を分光光度的に測定する）を用い、各ビーズ／ウエ
ルの吸光度を読み取った。
たたくことにより混合した。このビーズ／ウエルを４０
±２℃で３０分間±２分間インキュベートした。各ビー
ズ／ウエルから流体を吸引し、各ビーズ／ウエルを蒸留
水または脱イオン水を用いて３回洗浄した。ついで、ｏ
−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質（３００μｌ）を
各ウエル／ビーズに加えた。これらビーズ／ウエルに蓋
をし、周囲室温で３０分間±２分間インキュベートした
。 １Ｎ硫酸（３００μｌ）を各ビーズ／ウエルに加えて発
色を停止させた。アボットコマンダーＲパラレルプロセ
シングセンター（アボット・ラボラトリーズ、アボット
パーク、イリノイ州、６００６４より入手可能）（各ビ
ーズ／ウエルの４６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ４６
０）を分光光度的に測定する）を用い、各ビーズ／ウエ
ルの吸光度を読み取った。
【００３２】ついで、カットオフ値を確立し、試料の値
が該カットオフ値よりも小さいか、または該カットオフ
値よりも大きいかまたは等しいかを決定することにより
、各試料の吸光度読み取りを計算した。カットオフ値よ
りも小さい試料はＨＣＶおよびＨＴＬＶ−１の両方に対
して非反応性とし、またカットオフ値に等しいかまたは
カットオフ値よりも大きい試料はＨＣＶまたはＨＴＬＶ
−１のいずれかまたはその両方に反応性であるとした。 それゆえ、カットオフは下記式に従って計算した。 カットオフ＝（０．２５×陽性コントロールの平均ＯＤ
４６０）＋陰性コントロールの平均ＯＤ４６０
が該カットオフ値よりも小さいか、または該カットオフ
値よりも大きいかまたは等しいかを決定することにより
、各試料の吸光度読み取りを計算した。カットオフ値よ
りも小さい試料はＨＣＶおよびＨＴＬＶ−１の両方に対
して非反応性とし、またカットオフ値に等しいかまたは
カットオフ値よりも大きい試料はＨＣＶまたはＨＴＬＶ
−１のいずれかまたはその両方に反応性であるとした。 それゆえ、カットオフは下記式に従って計算した。 カットオフ＝（０．２５×陽性コントロールの平均ＯＤ
４６０）＋陰性コントロールの平均ＯＤ４６０
【００３
３】実施例３ （ＨＣＶ／ＨＴＬＶ−１同時アッセイの再現性）前以て
ＨＢｓＡｇ、抗ＨＣＶ抗体、抗ＨＴＬＶ−１抗体および
抗ＨＩＶ抗体に対して陰性と試験された再石灰プールヒ
ト血漿からなる陰性コントロール、およびＨＣＶに対す
る抗体について陽性と試験された再石灰プールヒト血漿
からなる陽性コントロールを、実施例２の方法に従い、
２つの異なる日に試験した。各日に５つの別々のアッセ
イを行った。得られた吸光度データからアッセイ内変動
およびアッセイ間変動を決定した。そのデータを表２に
まとめて示す。
３】実施例３ （ＨＣＶ／ＨＴＬＶ−１同時アッセイの再現性）前以て
ＨＢｓＡｇ、抗ＨＣＶ抗体、抗ＨＴＬＶ−１抗体および
抗ＨＩＶ抗体に対して陰性と試験された再石灰プールヒ
ト血漿からなる陰性コントロール、およびＨＣＶに対す
る抗体について陽性と試験された再石灰プールヒト血漿
からなる陽性コントロールを、実施例２の方法に従い、
２つの異なる日に試験した。各日に５つの別々のアッセ
イを行った。得られた吸光度データからアッセイ内変動
およびアッセイ間変動を決定した。そのデータを表２に
まとめて示す。
【表２】
【００３４】実施例４
（個々の試験および本発明アッセイの比較）ＨＣＶおよ
びＨＴＬＶ−１の存在について本発明のアッセイおよび
個々の試験を比較した。ＨＣＶおよびＨＴＬＶ−１につ
いて試料を下記のようにして個々にアッセイし、これら
結果を本発明のアッセイにより得られた結果と比較した
。 ＨＴＬＶ−１抗原（アボット・ラボラトリーズ、アボッ
トパーク、イリノイ州、６００６４より入手可能）をコ
ーティングした１／４”ビーズおよびＨＣＶ上の幾つか
の別個のエピトープを示す２種の精製組換えタンパク質
（アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノ
イ州、６００６４より入手可能）をコーティングした１
／４”ビーズを別々に用いてこれらマーカーの存在を決
定し、実施例２のビーズ／ウエルアッセイを用いて同試
料中のＨＣＶ／ＨＴＬＶ−１の存在を決定した。アボッ
トコマンダーＲパラレルプロセシングセンターへ生成物
を挿入した後、下記手順により個々のビーズを試験した
。
びＨＴＬＶ−１の存在について本発明のアッセイおよび
個々の試験を比較した。ＨＣＶおよびＨＴＬＶ−１につ
いて試料を下記のようにして個々にアッセイし、これら
結果を本発明のアッセイにより得られた結果と比較した
。 ＨＴＬＶ−１抗原（アボット・ラボラトリーズ、アボッ
トパーク、イリノイ州、６００６４より入手可能）をコ
ーティングした１／４”ビーズおよびＨＣＶ上の幾つか
の別個のエピトープを示す２種の精製組換えタンパク質
（アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノ
イ州、６００６４より入手可能）をコーティングした１
／４”ビーズを別々に用いてこれらマーカーの存在を決
定し、実施例２のビーズ／ウエルアッセイを用いて同試
料中のＨＣＶ／ＨＴＬＶ−１の存在を決定した。アボッ
トコマンダーＲパラレルプロセシングセンターへ生成物
を挿入した後、下記手順により個々のビーズを試験した
。
【００３５】１０μｌの各コントロールまたは試料を個
々の試験管の底に入れた。試料希釈液（４００μｌ）を
各試験管に加え、試験管を混合した。ついで、各希釈試
料またはコントロール（２００μｌ）をポリスチレント
レイのウエル中に移した。適当な抗原でコーティングし
た一つのビーズを各ウエルに加えた。ウエルをカバーシ
ールで蓋をし、トレイを軽くたたいてビーズを覆いウエ
ル中に捕捉された空気の泡を除いた。ウエルを４０±２
℃で１時間±５分間インキュベートした。このインキュ
ベーションの後、シールをウエルから除き、液体を各ウ
エルから吸引し、各ビーズを全部で１２〜１８ｍｌの蒸
留水または脱イオン水で洗浄した。
々の試験管の底に入れた。試料希釈液（４００μｌ）を
各試験管に加え、試験管を混合した。ついで、各希釈試
料またはコントロール（２００μｌ）をポリスチレント
レイのウエル中に移した。適当な抗原でコーティングし
た一つのビーズを各ウエルに加えた。ウエルをカバーシ
ールで蓋をし、トレイを軽くたたいてビーズを覆いウエ
ル中に捕捉された空気の泡を除いた。ウエルを４０±２
℃で１時間±５分間インキュベートした。このインキュ
ベーションの後、シールをウエルから除き、液体を各ウ
エルから吸引し、各ビーズを全部で１２〜１８ｍｌの蒸
留水または脱イオン水で洗浄した。
【００３６】ついで、アッセイしようとしている分析対
象物に特異的な希釈結合体（２００μｌ）を、ビーズを
入れた各ウエル中にピペットで入れた。カバーシールを
トレイの各ウエルに適用し、トレイを軽くたたくことに
より空気の泡を除いた。ウエルを４０±２℃で３０±２
分間インキュベートした。このインキュベーションの後
、カバーシールを除き、各ウエル中に存在する液体を除
き、全部で１２〜１８ｍｌの蒸留水または脱イオン水で
洗浄した。ついで、新たに調製したＯＰＤ溶液（３００
μｌ）を第一列目のブランクトレイ（ブランクビーズを
含有）に加え、ついで、コーティングビーズを含有する
各ウエルにＯＰＤ溶液を加えた。ウエルをカバーシール
で覆い、周囲室温で３０±２分間インキュベートした。 １Ｎ硫酸（３００μｌ）を各ウエルに加えて発色反応を
停止させた。
象物に特異的な希釈結合体（２００μｌ）を、ビーズを
入れた各ウエル中にピペットで入れた。カバーシールを
トレイの各ウエルに適用し、トレイを軽くたたくことに
より空気の泡を除いた。ウエルを４０±２℃で３０±２
分間インキュベートした。このインキュベーションの後
、カバーシールを除き、各ウエル中に存在する液体を除
き、全部で１２〜１８ｍｌの蒸留水または脱イオン水で
洗浄した。ついで、新たに調製したＯＰＤ溶液（３００
μｌ）を第一列目のブランクトレイ（ブランクビーズを
含有）に加え、ついで、コーティングビーズを含有する
各ウエルにＯＰＤ溶液を加えた。ウエルをカバーシール
で覆い、周囲室温で３０±２分間インキュベートした。 １Ｎ硫酸（３００μｌ）を各ウエルに加えて発色反応を
停止させた。
【００３７】ブランク、コントロールおよび試料の吸光
度の読み取り（ＯＤ４６０）を測定した。ＨＣＶのカッ
トオフはつぎの式により計算した：（０．２５×陰性コ
ントロールの平均ＯＤ４６０）。吸光度がカットオフ未
満である場合は、試料はＨＣＶに対して非反応性である
とした。ＯＤ４６０がカットオフに等しいかまたはカッ
トオフ以上である場合は、試料はＨＣＶに対して反応性
であるとした。ＨＴＬＶ−１のカットオフは、つぎの式
により計算した：４．５×陰性コントロールの平均ＯＤ
４６０。吸光度の読み取りがカットオフ未満である場合
は、試料はＨＴＬＶ−１に対して非反応性であるとした
。また、吸光度の読み取りがカットオフに等しいかまた
はカットオフ以上である場合は、試料はＨＴＬＶ−１に
対して反応性であるとした。
度の読み取り（ＯＤ４６０）を測定した。ＨＣＶのカッ
トオフはつぎの式により計算した：（０．２５×陰性コ
ントロールの平均ＯＤ４６０）。吸光度がカットオフ未
満である場合は、試料はＨＣＶに対して非反応性である
とした。ＯＤ４６０がカットオフに等しいかまたはカッ
トオフ以上である場合は、試料はＨＣＶに対して反応性
であるとした。ＨＴＬＶ−１のカットオフは、つぎの式
により計算した：４．５×陰性コントロールの平均ＯＤ
４６０。吸光度の読み取りがカットオフ未満である場合
は、試料はＨＴＬＶ−１に対して非反応性であるとした
。また、吸光度の読み取りがカットオフに等しいかまた
はカットオフ以上である場合は、試料はＨＴＬＶ−１に
対して反応性であるとした。
【００３８】ＨＣＶ反応性であると思われる２９人の患
者について、本明細書に記載したようにしてＨＣＶ、Ｈ
ＴＬＶ−１について個々に試験し、ＨＣＶ／ＨＴＬＶ−
１についても本発明のアッセイ法により試験した。陰性
コントロールおよび陽性コントロールについてのＯＤ４
６０読み取り並びに２９人の患者についての試料／カッ
トオフ比（Ｓ／ＣＯ）を表３にまとめて示す。カットオ
フは下記式に従って計算した。 ＨＴＬＶ−１のカットオフ：４．４×ＮＣｘＨＣＶのカ
ットオフ：０．２５×ＰＣ＋ＮＣｘＨＴＬＶ−１／ＨＣ
Ｖのカットオフ：０．２５×ＰＣ＋ＮＣｘ
者について、本明細書に記載したようにしてＨＣＶ、Ｈ
ＴＬＶ−１について個々に試験し、ＨＣＶ／ＨＴＬＶ−
１についても本発明のアッセイ法により試験した。陰性
コントロールおよび陽性コントロールについてのＯＤ４
６０読み取り並びに２９人の患者についての試料／カッ
トオフ比（Ｓ／ＣＯ）を表３にまとめて示す。カットオ
フは下記式に従って計算した。 ＨＴＬＶ−１のカットオフ：４．４×ＮＣｘＨＣＶのカ
ットオフ：０．２５×ＰＣ＋ＮＣｘＨＴＬＶ−１／ＨＣ
Ｖのカットオフ：０．２５×ＰＣ＋ＮＣｘ
【表３】
【００３９】ウエスタンブロット分析によりＨＴＬＶ−
１について陽性と確認された１５人の患者を、上記と同
様にして試験した。そのデータ（Ｓ／ＣＯ比で示す）を
表４に示す。
１について陽性と確認された１５人の患者を、上記と同
様にして試験した。そのデータ（Ｓ／ＣＯ比で示す）を
表４に示す。
【表４】
表３および表４に示すデータは、本発明のアッセイ法を
用いた場合のＨＣＶおよびＨＴＬＶ−１の両方に対する
全感度を示している。本発明のアッセイ法を用いて得ら
れた結果は、別々に決定するための１／４”ビーズを利
用した個々のアッセイで得られた結果と同じであった。
用いた場合のＨＣＶおよびＨＴＬＶ−１の両方に対する
全感度を示している。本発明のアッセイ法を用いて得ら
れた結果は、別々に決定するための１／４”ビーズを利
用した個々のアッセイで得られた結果と同じであった。
【００４０】血液銀行から入手した５０の新たな血漿ま
たは血清試料について、上記方法により試験した。かく
して得られたデータによれば、個々の１／４”ビーズア
ッセイにより試験した場合にはＨＴＬＶ−１と反応性の
試料はなかった。個々の１／４”ビーズアッセイにより
試験した場合に、これら５０の試料のうち４つの試料が
ＨＣＶについて「＋／−」（確定できない）と試験され
た。再試験したところ、これら４つの試料は非反応性と
試験された。これら５０の試料を本発明のアッセイ法に
試験した場合は、５０のすべての試料が非反応性と試験
された。
たは血清試料について、上記方法により試験した。かく
して得られたデータによれば、個々の１／４”ビーズア
ッセイにより試験した場合にはＨＴＬＶ−１と反応性の
試料はなかった。個々の１／４”ビーズアッセイにより
試験した場合に、これら５０の試料のうち４つの試料が
ＨＣＶについて「＋／−」（確定できない）と試験され
た。再試験したところ、これら４つの試料は非反応性と
試験された。これら５０の試料を本発明のアッセイ法に
試験した場合は、５０のすべての試料が非反応性と試験
された。
【００４１】同様にして、他の５０の正常な血清試料に
ついても本発明の方法により試験した。ＨＴＬＶ−１の
ための個々の１／４”ビーズアッセイで１つの試料が確
定できずと試験され、この試料を再試験したところ非反
応性であった。また、ＨＣＶのための個々の１／４”ビ
ーズアッセイで試験した場合に２つの試料が確定できな
かった。再試験したところ、これら２つの試料は非反応
性と試験された。本発明のアッセイによれば、５０のす
べての試料が非反応性であった。
ついても本発明の方法により試験した。ＨＴＬＶ−１の
ための個々の１／４”ビーズアッセイで１つの試料が確
定できずと試験され、この試料を再試験したところ非反
応性であった。また、ＨＣＶのための個々の１／４”ビ
ーズアッセイで試験した場合に２つの試料が確定できな
かった。再試験したところ、これら２つの試料は非反応
性と試験された。本発明のアッセイによれば、５０のす
べての試料が非反応性であった。
【００４２】実施例５
（抗ＨＢｓ抗体のトレイコーティング法）１５ｍＭ Ｅ
ＤＡＣ／０．２Ｍプロピルアミン溶液（２００μｌ）を
、コーティングしようとする各トレイの各ウエルに加え
た。 ついで、抗ＨＢｓモノクローナル抗体の１５μｇ／ｍｌ
溶液（２００μｌ）を各トレイの各ウエルに加えた。各
トレイを２００ｒｐｍにて周囲室温で７０分間回転させ
た。ついで、コーティング溶液を吸引し、ＰＢＳ／０．
１％ツイーンＲ（ポリオキシエチレンソルビタン、シグ
マ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ州より入手可能
）洗浄溶液（８００μｌ）を各ウエルに加えた。各ウエ
ルを４０℃で３０分間インキュベートした。インキュベ
ーション後、この洗浄溶液を各ウエルから吸引し、０．
１Ｍクエン酸／３％ＢＳＡ／５％ショ糖オーバーコーテ
ィング溶液（５００μｌ）を各ウエルに加えた。ウエル
を周囲室温にて６０分間インキュベートした。このイン
キュベーション後、オーバーコーティング溶液を各ウエ
ルから吸引した。ついで、ウエルを４０℃で３０分間乾
燥させ、使用するときまで周囲室温で貯蔵した。
ＤＡＣ／０．２Ｍプロピルアミン溶液（２００μｌ）を
、コーティングしようとする各トレイの各ウエルに加え
た。 ついで、抗ＨＢｓモノクローナル抗体の１５μｇ／ｍｌ
溶液（２００μｌ）を各トレイの各ウエルに加えた。各
トレイを２００ｒｐｍにて周囲室温で７０分間回転させ
た。ついで、コーティング溶液を吸引し、ＰＢＳ／０．
１％ツイーンＲ（ポリオキシエチレンソルビタン、シグ
マ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ州より入手可能
）洗浄溶液（８００μｌ）を各ウエルに加えた。各ウエ
ルを４０℃で３０分間インキュベートした。インキュベ
ーション後、この洗浄溶液を各ウエルから吸引し、０．
１Ｍクエン酸／３％ＢＳＡ／５％ショ糖オーバーコーテ
ィング溶液（５００μｌ）を各ウエルに加えた。ウエル
を周囲室温にて６０分間インキュベートした。このイン
キュベーション後、オーバーコーティング溶液を各ウエ
ルから吸引した。ついで、ウエルを４０℃で３０分間乾
燥させ、使用するときまで周囲室温で貯蔵した。
【００４３】実施例６
（ＨＢｓＡｇおよびＨＩＶ−１／２抗体の同時アッセイ
）試料（１５０μｌ）およびＨＩＶ試料希釈液／ＨＢｓ
Ａｂ酵素結合体（５０μｌ）（ヤギ抗ＨＢｓ抗体：西洋
ワサビペルオキシダーゼ［ＨＲＰＯ］、ＪＭ１０３［溶
解細胞からの大腸菌溶解液および大腸菌タンパク質］お
よびＣＫＳ溶解液［シチジアンモノリン酸−ＫＤＯシン
セターゼ］を含有）を、実施例５により調製したアッセ
イウエルに加えた。ついで、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−
２の抗原（「ＨＩＶ−１／２」）（アボット・ラボラト
リーズ、アボットパーク、イリノイ州、６００６４から
入手可能）を含有する抗原調製物でコーティングしたビ
ーズをウエルに加えた。この混合物を４０℃で９０分間
インキュベートし、吸引し、蒸留水で２回洗浄した。試
料中にＨＢｓＡｇ分析対象物が存在しているときは、抗
体：抗原：抗体−酵素複合体が反応ウエル上に生成した
。
）試料（１５０μｌ）およびＨＩＶ試料希釈液／ＨＢｓ
Ａｂ酵素結合体（５０μｌ）（ヤギ抗ＨＢｓ抗体：西洋
ワサビペルオキシダーゼ［ＨＲＰＯ］、ＪＭ１０３［溶
解細胞からの大腸菌溶解液および大腸菌タンパク質］お
よびＣＫＳ溶解液［シチジアンモノリン酸−ＫＤＯシン
セターゼ］を含有）を、実施例５により調製したアッセ
イウエルに加えた。ついで、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−
２の抗原（「ＨＩＶ−１／２」）（アボット・ラボラト
リーズ、アボットパーク、イリノイ州、６００６４から
入手可能）を含有する抗原調製物でコーティングしたビ
ーズをウエルに加えた。この混合物を４０℃で９０分間
インキュベートし、吸引し、蒸留水で２回洗浄した。試
料中にＨＢｓＡｇ分析対象物が存在しているときは、抗
体：抗原：抗体−酵素複合体が反応ウエル上に生成した
。
【００４４】ついで、ＨＩＶ抗原−酵素結合体（２００
μｌ）をウエルに加えた。この混合物を３０分間インキ
ュベートし、上記と同様にして洗浄した。試料中にＨＩ
Ｖ−１Ａｂ分析対象物が存在しているときは、抗原：抗
体：抗原−酵素結合体がビーズ上に生成した。ついで、
ＯＰＤ（３００μｌ）を加え、ビーズ／ウエルを周囲室
温でインキュベートすることにより３０分間発色させた
。 １Ｎ硫酸（３００μｌ）を加えて反応を停止させ、ＯＤ
４６０を測定することにより吸光度の読み取りを行った
。 この試験は、アボットコマンダーＲパラレルプロセシン
グセンター（アボット・ラボラトリーズ、アボットパー
ク、イリノイ州、６００６４から入手可能）上で処理お
よび読み取りを行った。
μｌ）をウエルに加えた。この混合物を３０分間インキ
ュベートし、上記と同様にして洗浄した。試料中にＨＩ
Ｖ−１Ａｂ分析対象物が存在しているときは、抗原：抗
体：抗原−酵素結合体がビーズ上に生成した。ついで、
ＯＰＤ（３００μｌ）を加え、ビーズ／ウエルを周囲室
温でインキュベートすることにより３０分間発色させた
。 １Ｎ硫酸（３００μｌ）を加えて反応を停止させ、ＯＤ
４６０を測定することにより吸光度の読み取りを行った
。 この試験は、アボットコマンダーＲパラレルプロセシン
グセンター（アボット・ラボラトリーズ、アボットパー
ク、イリノイ州、６００６４から入手可能）上で処理お
よび読み取りを行った。
【００４５】実施例７
（ＨＢｓＡｇに対する正常クエン酸処理血漿集団の試験
）９５８の正常クエン酸処理血漿試料を試験するため、
実施例６に記載の方法を用いた。本発明の方法を用いた
場合、９５８の試料のうち４つの試料（０．４２％）が
最初反応性とされた。本発明の方法で再試験したところ
、上記４つの反応性試料のうち２つの試料が反応性とさ
れた（０．２１％）。ついで、繰り返し反応性であった
試料をウエスタンブロット確認法により試験したところ
、ＨＩＶ抗体について陰性であることがわかった。本発
明の方法により繰り返し反応性であるとされたすべての
試料について、アウスザイムＲＩＶ抗体中和法（アボッ
ト・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州、６
００６４）による試験を行ったところ、繰り返し反応性
であった２つの試料は陽性であることが確認された。
）９５８の正常クエン酸処理血漿試料を試験するため、
実施例６に記載の方法を用いた。本発明の方法を用いた
場合、９５８の試料のうち４つの試料（０．４２％）が
最初反応性とされた。本発明の方法で再試験したところ
、上記４つの反応性試料のうち２つの試料が反応性とさ
れた（０．２１％）。ついで、繰り返し反応性であった
試料をウエスタンブロット確認法により試験したところ
、ＨＩＶ抗体について陰性であることがわかった。本発
明の方法により繰り返し反応性であるとされたすべての
試料について、アウスザイムＲＩＶ抗体中和法（アボッ
ト・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州、６
００６４）による試験を行ったところ、繰り返し反応性
であった２つの試料は陽性であることが確認された。
【００４６】実施例８
（ＨＢｓＡｇに対する正常クエン酸処理血漿集団の試験
）実施例５で調製した異なるロットのウエルおよびＨＩ
Ｖ−１およびＨＩＶ−２抗原（アボット・ラボラトリー
ズ、アボットパーク、イリノイ州、６００６４より入手
可能）を含有する抗原調製物をコーティングしたビーズ
を用い、実施例７に記載の方法を行った。実施例６に記
載の方法に従い、１３９８の正常クエン酸処理血漿試料
をアッセイした。最初、これら１３９８のうち６つの試
料（０．４３％）が本発明の方法により反応性であると
試験されることがわかった。これら６つの試料のうち３
つの試料は、本発明の方法で再試験した後にも繰り返し
反応性であった（０．２１％）。ついで、繰り返し反応
性の試料をＨＩＶに対するウエスタンブロット確認法に
より試験したところ陰性であった。これら３つの試料の
うち２つの試料は、アウスザイムＲＩＶ抗体中和法（ア
ボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州
、６００６４より入手可能）での試験によりＨＢｓＡｇ
に対して陽性であると確認されることがわかった。
）実施例５で調製した異なるロットのウエルおよびＨＩ
Ｖ−１およびＨＩＶ−２抗原（アボット・ラボラトリー
ズ、アボットパーク、イリノイ州、６００６４より入手
可能）を含有する抗原調製物をコーティングしたビーズ
を用い、実施例７に記載の方法を行った。実施例６に記
載の方法に従い、１３９８の正常クエン酸処理血漿試料
をアッセイした。最初、これら１３９８のうち６つの試
料（０．４３％）が本発明の方法により反応性であると
試験されることがわかった。これら６つの試料のうち３
つの試料は、本発明の方法で再試験した後にも繰り返し
反応性であった（０．２１％）。ついで、繰り返し反応
性の試料をＨＩＶに対するウエスタンブロット確認法に
より試験したところ陰性であった。これら３つの試料の
うち２つの試料は、アウスザイムＲＩＶ抗体中和法（ア
ボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州
、６００６４より入手可能）での試験によりＨＢｓＡｇ
に対して陽性であると確認されることがわかった。
【００４７】実施例９（ＨＩＶ−１感度パネルの試験）
ＨＩＶ−１血清変換パネルを用い、実施例７に記載の方
法を行った。これから得られた結果を、現在利用可能で
連邦政府によって承認された試験（アボット・ラボラト
リーズ、アボットパーク、イリノイ州、６００６４より
入手可能）を用いたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ
）によって得られた結果と比較した。これらの結果を下
記表５に示す。
ＨＩＶ−１血清変換パネルを用い、実施例７に記載の方
法を行った。これから得られた結果を、現在利用可能で
連邦政府によって承認された試験（アボット・ラボラト
リーズ、アボットパーク、イリノイ州、６００６４より
入手可能）を用いたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ
）によって得られた結果と比較した。これらの結果を下
記表５に示す。
【表５】
表５に示すデータは、本発明の方法が現在用いられてい
るＥＩＡ法よりも感度が優れていることを示している。 というのは、本発明の方法はパネル成員Ｎｏ．３で陽性
の反応を検出したが、この反応は現在用いられているＥ
ＩＡ法ではパネル成員中で検出されなかったものである
からである。本発明の方法の感度が優れているのは、本
発明の方法ではさらにＩｇＭをも検出することができる
ことによるという仮説が立てられる。
るＥＩＡ法よりも感度が優れていることを示している。 というのは、本発明の方法はパネル成員Ｎｏ．３で陽性
の反応を検出したが、この反応は現在用いられているＥ
ＩＡ法ではパネル成員中で検出されなかったものである
からである。本発明の方法の感度が優れているのは、本
発明の方法ではさらにＩｇＭをも検出することができる
ことによるという仮説が立てられる。
【００４８】実施例１０
（ＨＢｓＡｇ感度パネル）陰性および陽性コントロール
、および既知量のＨＢｓＡｇ抗原および抗体を用い、実
施例７に記載の方法を行った。アウスザイムＲＩＶ試験
（アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノ
イ州、６００６４）の結果を利用した。これらのデータ
を表６に示す。
、および既知量のＨＢｓＡｇ抗原および抗体を用い、実
施例７に記載の方法を行った。アウスザイムＲＩＶ試験
（アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノ
イ州、６００６４）の結果を利用した。これらのデータ
を表６に示す。
【表６】
表６に示すデータは、本発明の方法がアウスザイムＲＩ
Ｖ試験に比べてＨＢｓＡｇのＡＤおよびＡＹサブタイプ
に対する感度が優れていることを示している。この感度
の上昇は、現在利用されている方法に対する本発明の方
法の利点である。
Ｖ試験に比べてＨＢｓＡｇのＡＤおよびＡＹサブタイプ
に対する感度が優れていることを示している。この感度
の上昇は、現在利用されている方法に対する本発明の方
法の利点である。
Claims (10)
- 【請求項１】 試料中に存在する１または２以上の分
析対象物の存在を同時に検出するためのアッセイ法であ
って、 （ａ）試料を （ｉ）第一の分析対象物に特異的な第一結合成分を第一
固相に結合させてなる第一の分析対象物のための捕捉試
薬、および （ｉｉ）第二の分析対象物に特異的な第一結合成分を第
二固相に結合させてなる第二の分析対象物のための捕捉
試薬と同時に接触させて混合物を生成させ、（ｂ）該混
合物を、捕捉試薬／第一分析対象物複合体および／また
は捕捉試薬／第二分析対象物複合体を生成するのに充分
な時間および条件下でインキュベートし、（ｃ）かくし
て生成した複合体を （ｉ）第一の分析対象物に特異的な結合ペアの成分をシ
グナル生成化合物で標識してなる第一の分析対象物のた
めの指示試薬、および （ｉｉ）第二の分析対象物に特異的な結合ペアの成分を
シグナル生成化合物で標識してなる第二の分析対象物の
ための指示試薬 と接触させて第二の混合物を生成させ、（ｄ）該第二の
混合物を、捕捉試薬／第一分析対象物／指示試薬複合体
および／または捕捉試薬／第二分析対象物／指示試薬複
合体を生成するのに充分な時間および条件下でインキュ
ベートし、ついで （ｅ）該第一固相および該第二固相のいずれかまたは両
方で生成した複合体に付随して生成したシグナルを検出
することにより試料中の１または２以上の分析対象物の
存在を決定する ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 第一の分析対象物のための指示試薬中
のシグナル生成化合物および第二の分析対象物のための
指示試薬中のシグナル生成化合物が、酵素、発光化合物
、化学発光化合物および放射性元素よりなる群から選ば
れたものである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 第一の分析対象物が抗ＨＣＶ抗体であ
り、該第一の分析対象物に特異的な第一結合成分がＨＣ
Ｖ抗原である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 第二の分析対象物がＨＴＬＶ−１抗原
であり、該第二の分析対象物に特異的な第一結合成分が
ＨＴＬＶ−１抗体である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 試料中に存在する１または２以上の分
析対象物の存在を同時に検出するためのアッセイ法であ
って、 （ａ）試料を （ｉ）第一の分析対象物に特異的な第一結合成分を第一
固相に結合させてなる第一の分析対象物のための捕捉試
薬、 （ｉｉ）第二の分析対象物に特異的な第一結合成分を第
二固相に結合させてなる第二の分析対象物のための捕捉
試薬、および （ｉｉｉ）第一の分析対象物に特異的な結合ペアの成分
をシグナル生成化合物で標識してなる第一の分析対象物
のための指示試薬 と同時に接触させて混合物を生成させ、（ｂ）該混合物
を、捕捉試薬／第一分析対象物／指示試薬複合体および
捕捉試薬／第二分析対象物複合体を生成するのに充分な
時間および条件下でインキュベートし、（ｃ）かくして
生成した複合体を、第二の分析対象物に特異的な結合ペ
アの成分をシグナル生成化合物で標識してなる第二の分
析対象物のための指示試薬と接触させて第二の混合物を
生成させ、 （ｄ）該第二の混合物を、捕捉試薬／第二分析対象物／
指示試薬複合体を生成するのに充分な時間および条件下
でインキュベートし、ついで （ｅ）該第一固相および該第二固相のいずれかまたは両
方で生成した複合体に付随 して生成したシグナルを検出することにより試料中の第
一分析対象物および／または第二分析対象物の存在を決
定する ことを特徴とする方法。 - 【請求項６】 第一の分析対象物のための指示試薬中
のシグナル生成化合物および第二の分析対象物のための
指示試薬中のシグナル生成化合物が、酵素、発光化合物
、化学発光化合物および放射性元素よりなる群から選ば
れたものである、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 第一の分析対象物がＢ型肝炎表面抗原
であり、該第一の分析対象物に特異的な第一結合成分が
抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体である、請求項５に記載の方法
。 - 【請求項８】 第二の分析対象物がＨＩＶ抗体であり
、該第二の分析対象物に特異的な第一結合成分がＨＩＶ
抗原である、請求項５に記載の方法。 - 【請求項９】 （ａ）第一の分析対象物に特異的な第
一結合成分を第一固相に結合させてなる第一の分析対象
物のための捕捉試薬、 （ｂ）第二の分析対象物に特異的な第一結合成分を第二
固相に結合させてなる第二の分析対象物のための捕捉試
薬、 （ｃ）第一の分析対象物に特異的な結合ペアの成分をシ
グナル生成化合物で標識してなる第一の分析対象物のた
めの指示試薬、および （ｄ）第二の分析対象物に特異的な結合ペアの成分をシ
グナル生成化合物で標識してなる第二の分析対象物のた
めの指示試薬 からなることを特徴とする、試料中の１または２以上の
分析対象物を同時に検出するためのキット。 - 【請求項１０】 第一の分析対象物のための指示試薬
中のシグナル生成化合物および第二の分析対象物のため
の指示試薬中のシグナル生成化合物が、酵素、発光化合
物、化学発光化合物および放射性元素よりなる群から選
ばれたものである、請求項９に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US57482190A | 1990-08-29 | 1990-08-29 | |
| US574821 | 1990-08-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04233461A true JPH04233461A (ja) | 1992-08-21 |
Family
ID=24297787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3218409A Pending JPH04233461A (ja) | 1990-08-29 | 1991-08-29 | 同時アッセイ法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0473065A3 (ja) |
| JP (1) | JPH04233461A (ja) |
| KR (1) | KR920004839A (ja) |
| AU (1) | AU645835B2 (ja) |
| CA (1) | CA2049864A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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