JP2002519639A - マルチエピトープ分析と抗原及び抗体組み合わせ測定による結合アッセイの改良 - Google Patents
マルチエピトープ分析と抗原及び抗体組み合わせ測定による結合アッセイの改良Info
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Abstract
(57)【要約】
（ａ）非多孔性支持体及び少なくとも２つの空間的に分離された試験領域を含む固相を提供する工程であって、これら試験領域は各々異なる固定化分析物特異的受容体を含む工程、（ｂ）サンプルを固相、及びシグナル発生基を担持するか、又はシグナル発生基に結合することが可能である第２の分析物特異的受容体と接触させる工程、並びに（ｃ）固相上のシグナル発生基を測定することによって分析物の存在又は／及び量を検出する工程を含む、サンプル中の分析物の検出方法が記載される。
Description
【０００１】 本発明は、分析物が、その分析物に結合することが可能である異なる試薬を用
いて検出されるサンプルにおいて、１種類又は数種類の分析物を検出するための
方法に関する。さらに、本発明は分析物を検出するための固相に関し、この固相
は非多孔性支持体及び空間的に分離された試験領域を含み、それにより試験領域
の各々が異なる試薬を含む。また、本発明は、抗原及びこの抗原を特異的に指向
する抗体の同時測定方法、並びにこの方法を実施するための固相にも関する。
いて検出されるサンプルにおいて、１種類又は数種類の分析物を検出するための
方法に関する。さらに、本発明は分析物を検出するための固相に関し、この固相
は非多孔性支持体及び空間的に分離された試験領域を含み、それにより試験領域
の各々が異なる試薬を含む。また、本発明は、抗原及びこの抗原を特異的に指向
する抗体の同時測定方法、並びにこの方法を実施するための固相にも関する。
【０００２】 多くの分析物を免疫学的検出法によって測定することができる。このような免
疫学的検出法は、特定の試薬に特異的に結合する分析物の能力、例えば、抗原−
抗体相互作用を利用する。免疫学的測定は幾つかの基本的な試験形式、例えば、
サンドイッチ試験形式、間接試験形式、逆滴定形式又はブリッジ形式で行うこと
ができる。
疫学的検出法は、特定の試薬に特異的に結合する分析物の能力、例えば、抗原−
抗体相互作用を利用する。免疫学的測定は幾つかの基本的な試験形式、例えば、
サンドイッチ試験形式、間接試験形式、逆滴定形式又はブリッジ形式で行うこと
ができる。
【０００３】 感染性疾患、例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ又はＨＣＶのようなウイルスの感染の信
頼性の高い検出が、できる限り早期に感染者における疾患の診断を可能とする上
で特に関心の高いものである。ＨＩＶ、ＨＢＶ又はＨＣＶに対する抗体の免疫学
的測定は、一般には、間接試験形式で、又はブリッジ形式によって行われる。抗
体は、通常、病原体のコア及びエンベロープ領域に由来するエピトープを含む様
々なタンパク質又はペプチドの混合物を用いて検出する。この混合物は支持体、
すなわち、固相に固定される。ＨＩＶ陽性としての分類が個人にとって大きな意
味を持ち、偽陽性の結果が致命的な結末をもたらす可能性があるため、この免疫
学的測定を用いて定型的な試験で得られた陽性結果の全ては、現時点では、確認
試験でチェックしなければならない。通常、ウェスタンブロットが確認試験とし
て用いられ、この試験においてはウイルス溶解物の個々のタンパク質成分を多孔
性支持体上にブロットする。しかしながら、ＨＣＶの場合、ウイルスを培養する
ことが非常に困難である。したがって、この場合には、ウイルス溶解物を用いる
ウェスタンブロットは確認試験としては用いられず、むしろ組換えタンパク質又
はペプチドを試験試薬として用いる免疫ドットブロットであるＲＩＢＡ（組換え
免疫ブロット法）を行う。
頼性の高い検出が、できる限り早期に感染者における疾患の診断を可能とする上
で特に関心の高いものである。ＨＩＶ、ＨＢＶ又はＨＣＶに対する抗体の免疫学
的測定は、一般には、間接試験形式で、又はブリッジ形式によって行われる。抗
体は、通常、病原体のコア及びエンベロープ領域に由来するエピトープを含む様
々なタンパク質又はペプチドの混合物を用いて検出する。この混合物は支持体、
すなわち、固相に固定される。ＨＩＶ陽性としての分類が個人にとって大きな意
味を持ち、偽陽性の結果が致命的な結末をもたらす可能性があるため、この免疫
学的測定を用いて定型的な試験で得られた陽性結果の全ては、現時点では、確認
試験でチェックしなければならない。通常、ウェスタンブロットが確認試験とし
て用いられ、この試験においてはウイルス溶解物の個々のタンパク質成分を多孔
性支持体上にブロットする。しかしながら、ＨＣＶの場合、ウイルスを培養する
ことが非常に困難である。したがって、この場合には、ウイルス溶解物を用いる
ウェスタンブロットは確認試験としては用いられず、むしろ組換えタンパク質又
はペプチドを試験試薬として用いる免疫ドットブロットであるＲＩＢＡ（組換え
免疫ブロット法）を行う。
【０００４】 現在用いられている定型的な試験の主な不利益は、分析物に応じて５〜１０種
類以上の抗原の混合物を検出に用いることである。これらの定型的な試験は継続
的に改善されつつあるが、確認試験を完全に省略することは未だに可能となって
はいない。例えば、おおよそ５種類の異なる抗原の混合物が、検出用にビオチニ
ル化されており、またジゴキシゲニンで標識されている Enzymun(登録商標)HIV
試験（Boehringer Mannheim）において用いられている。この試験は十分に機能
するが、このように多数の異なる抗原を含む抗原混合物の使用は、固相に固定も
しくは結合した個々の抗原がもはやその試験に最適の濃度で存在していない可能
性があることを意味する。このような多くの成分の混合物では、固相の結合許容
量はもはや全ての抗原を最適濃度で結合するのに十分ではない。さらに、試験領
域をコーティングするとき、抗原混合物を用いることで固相上の結合部位につい
て様々な抗原の間で競合が生じ、その異なる割合が異なる拡散速度及び異なる立
体効果につながる。直接コーティングにおいては、例えば、疎水性抗原がプラス
チック表面に優先的に結合し、より親水性の抗原が同時に置き換えられる。これ
は、一方では再現性に乏しい結果につながり、他方では特定の抗原エピトープの
濃度が有意な検出が不可能なほど低くなる。
類以上の抗原の混合物を検出に用いることである。これらの定型的な試験は継続
的に改善されつつあるが、確認試験を完全に省略することは未だに可能となって
はいない。例えば、おおよそ５種類の異なる抗原の混合物が、検出用にビオチニ
ル化されており、またジゴキシゲニンで標識されている Enzymun(登録商標)HIV
試験（Boehringer Mannheim）において用いられている。この試験は十分に機能
するが、このように多数の異なる抗原を含む抗原混合物の使用は、固相に固定も
しくは結合した個々の抗原がもはやその試験に最適の濃度で存在していない可能
性があることを意味する。このような多くの成分の混合物では、固相の結合許容
量はもはや全ての抗原を最適濃度で結合するのに十分ではない。さらに、試験領
域をコーティングするとき、抗原混合物を用いることで固相上の結合部位につい
て様々な抗原の間で競合が生じ、その異なる割合が異なる拡散速度及び異なる立
体効果につながる。直接コーティングにおいては、例えば、疎水性抗原がプラス
チック表面に優先的に結合し、より親水性の抗原が同時に置き換えられる。これ
は、一方では再現性に乏しい結果につながり、他方では特定の抗原エピトープの
濃度が有意な検出が不可能なほど低くなる。
【０００５】 定型試験における抗原混合物の使用のさらなる不利益は、異なる抗原の混合物
によって非特異的結合の増大の危険性がかなり増大することであり、これは次に
、偽陽性結果の増加につながり得る。結果として、従来用いられる定型的試験の
カットオフ限界は比較的高いレベルで設定しなければならず、したがって、感度
が失われる。非特異的結合による偽陽性結果の数が、特にウェスタンブロットに
おいて、ウイルス溶解物中に存在する外来タンパク質のためにかなり増加し、し
たがって、陽性結果には少なくとも２つの反応性バンドが必要とされる。
によって非特異的結合の増大の危険性がかなり増大することであり、これは次に
、偽陽性結果の増加につながり得る。結果として、従来用いられる定型的試験の
カットオフ限界は比較的高いレベルで設定しなければならず、したがって、感度
が失われる。非特異的結合による偽陽性結果の数が、特にウェスタンブロットに
おいて、ウイルス溶解物中に存在する外来タンパク質のためにかなり増加し、し
たがって、陽性結果には少なくとも２つの反応性バンドが必要とされる。
【０００６】 これらの検出法の感度をさらに改善する試みがなされている。EP 0 461 462 A
1 には、間接試験の概念を援用した、ウイルスの抗体を検出するための免疫アッ
セイが記載されている。EP 0 461 462 A1 に記載される免疫ドットブロットにお
いては、従来のウイルス溶解物の代わりに精製組換えタンパク質を多孔性支持体
上の別々の試験領域に塗布して試験形式を得ており、これは精製タンパク質を用
いるためウェスタンブロットよりも感度が高い。
1 には、間接試験の概念を援用した、ウイルスの抗体を検出するための免疫アッ
セイが記載されている。EP 0 461 462 A1 に記載される免疫ドットブロットにお
いては、従来のウイルス溶解物の代わりに精製組換えタンパク質を多孔性支持体
上の別々の試験領域に塗布して試験形式を得ており、これは精製タンパク質を用
いるためウェスタンブロットよりも感度が高い。
【０００７】 EP 0 627 625 A1 は、ブリッジ概念によるサンプル中のウイルス抗体の検出方
法に関する。この方法もＲＩＢＡ（組換え免疫ブロットアッセイ）であり、数種
類の抗原が多孔性材料製の固相上に空間的に分離されて塗布されている；多孔性
材料製の固相を用いる必要があることが指摘されている。
法に関する。この方法もＲＩＢＡ（組換え免疫ブロットアッセイ）であり、数種
類の抗原が多孔性材料製の固相上に空間的に分離されて塗布されている；多孔性
材料製の固相を用いる必要があることが指摘されている。
【０００８】 EP 0 445 423 A2 は、ＨＣＶ抗原の幾つかのエピトープを援用したＨＣＶ抗体
の検出方法に関する。EP 0 445 423 A2 においては、抗体の測定について免疫ド
ットアッセイも記述されており、特定の改善された抗原を用いることによってよ
り高い感度が達成されている。
の検出方法に関する。EP 0 445 423 A2 においては、抗体の測定について免疫ド
ットアッセイも記述されており、特定の改善された抗原を用いることによってよ
り高い感度が達成されている。
【０００９】 しかしながら、多孔性支持体が用いられるため、従来技術において記載される
これらの方法において予め決定された量の試薬の規定の塗布を達成することは困
難である。特に、個々に塗布した試験スポットが混じり合う危険性が存在する。
これらの不都合は塗布したスポットがより小さくなるに従ってより深刻となり、
したがって、これらの方法は、特には、小型化された試験システムに適するもの
ではない。加えて、紙片の取り扱いを自動化することは困難であり、したがって
、それを定型的な試験として使用することは思いもよらない。
これらの方法において予め決定された量の試薬の規定の塗布を達成することは困
難である。特に、個々に塗布した試験スポットが混じり合う危険性が存在する。
これらの不都合は塗布したスポットがより小さくなるに従ってより深刻となり、
したがって、これらの方法は、特には、小型化された試験システムに適するもの
ではない。加えて、紙片の取り扱いを自動化することは困難であり、したがって
、それを定型的な試験として使用することは思いもよらない。
【００１０】 したがって、本発明の目的の１つは、従来技術の不都合を少なくとも部分的に
排除することができる方法を提供することであった。
排除することができる方法を提供することであった。
【００１１】 この目的は、本発明に従い、サンプル中の分析物の検出方法であって、 （ａ）非多孔性支持体及び少なくとも２つの空間的に分離された試験領域を含む
固相を提供する(該試験領域は各々異なる固定化分析物特異的受容体を含む)工程
、 （ｂ）該サンプルを該固相、及びシグナル発生基を担持するか、又はシグナル発
生基に結合することが可能である少なくとも１種類の遊離分析物特異的受容体と
接触させる工程、並びに （ｃ）試験領域上のシグナル発生基を測定することによって分析物の存在又は／
及び量を検出する工程、 を含む方法によって達成される。
固相を提供する(該試験領域は各々異なる固定化分析物特異的受容体を含む)工程
、 （ｂ）該サンプルを該固相、及びシグナル発生基を担持するか、又はシグナル発
生基に結合することが可能である少なくとも１種類の遊離分析物特異的受容体と
接触させる工程、並びに （ｃ）試験領域上のシグナル発生基を測定することによって分析物の存在又は／
及び量を検出する工程、 を含む方法によって達成される。
【００１２】 固定化分析物特異的受容体は１種類もしくは数種類の受容体を介して固相に直
接又は間接的に結合させることができる。これは、例えば、吸着性又は共有結合
性相互作用によって結合させることができるが、好ましくは特異的高親和性相互
作用、例えば、ストレプトアビジンもしくはアビジン／ビオチン又は抗体−抗原
相互作用によって結合させることができる。
接又は間接的に結合させることができる。これは、例えば、吸着性又は共有結合
性相互作用によって結合させることができるが、好ましくは特異的高親和性相互
作用、例えば、ストレプトアビジンもしくはアビジン／ビオチン又は抗体−抗原
相互作用によって結合させることができる。
【００１３】 遊離分析物特異的受容体はそれ自体がシグナル発生基を担持するか、又はシグ
ナル発生基に結合することが可能である。この場合、検出試薬は数種類の成分を
含んでなる。
ナル発生基に結合することが可能である。この場合、検出試薬は数種類の成分を
含んでなる。
【００１４】 分析物は均一又は不均一集団、例えば、不均一抗体集団、抗原混合物又は異な
っていてもよい抗原及び抗体の混合物であってもよく、これらの抗原及び抗体は
１種類もしくは数種類の病原体から誘導され、又はそれらによって誘発されるも
のである。不均一分析物集団の場合、個々の試験領域は測定しようとする分析物
の部分集団に結合する。試験領域に固定されている分析物特異的受容体の各々は
異なり、すなわち、本発明に従い、好ましくは、抗原のような不均一分析物の異
なるエピトープ、抗原サブタイプのような異なる分析物サブタイプ又は／及び異
なる抗原又は／及び抗体のような異なるタイプの分析物に結合する。
っていてもよい抗原及び抗体の混合物であってもよく、これらの抗原及び抗体は
１種類もしくは数種類の病原体から誘導され、又はそれらによって誘発されるも
のである。不均一分析物集団の場合、個々の試験領域は測定しようとする分析物
の部分集団に結合する。試験領域に固定されている分析物特異的受容体の各々は
異なり、すなわち、本発明に従い、好ましくは、抗原のような不均一分析物の異
なるエピトープ、抗原サブタイプのような異なる分析物サブタイプ又は／及び異
なる抗原又は／及び抗体のような異なるタイプの分析物に結合する。
【００１５】 驚くべきことに、様々な試薬、例えば、様々な抗原を個々のスポットとして塗
布する、すなわち、個別に別々の試験領域に塗布するパネル試験を用いることに
より、抗体試験のような検出試験の感度を大幅に改善できることが見出された。
本発明によるマルチエピトープ分析、すなわち、分析物又はＨＩＶのような病原
体の幾つかの部分集団の同時分離検出は検出試験の感度及び信頼性を大幅に改善
することができる。
布する、すなわち、個別に別々の試験領域に塗布するパネル試験を用いることに
より、抗体試験のような検出試験の感度を大幅に改善できることが見出された。
本発明によるマルチエピトープ分析、すなわち、分析物又はＨＩＶのような病原
体の幾つかの部分集団の同時分離検出は検出試験の感度及び信頼性を大幅に改善
することができる。
【００１６】 陽性試験結果が１つもしくは幾つかの、場合によっては少なくとも２つの試験
領域で得られる場合、これはサンプル中の分析物の存在を示すものとして評価さ
れる。
領域で得られる場合、これはサンプル中の分析物の存在を示すものとして評価さ
れる。
【００１７】 本発明による非多孔性支持体の使用は規定の領域に試薬を塗布することを可能
にする。これは、試験形式の小型化に特に重要なものである。したがって、試験
領域は好ましくは０．０１〜１ｍｍ、より好ましくは０．１〜０．５ｍｍ、最も
好ましくは０．１〜０．２ｍｍの直径を有する。
にする。これは、試験形式の小型化に特に重要なものである。したがって、試験
領域は好ましくは０．０１〜１ｍｍ、より好ましくは０．１〜０．５ｍｍ、最も
好ましくは０．１〜０．２ｍｍの直径を有する。
【００１８】 好ましくは、幾つかの試験領域を有する固相が用いられ、これはアレイシステ
ムとも呼ばれる。このようなアレイシステムは、例えば、Ekins 及び Chu（Clin
. Chem. 37 (1995) 1955-1967）並びに米国特許第 5,432,099 号、第 5,516,635
号及び第 5,126,276 号に記載されている。
ムとも呼ばれる。このようなアレイシステムは、例えば、Ekins 及び Chu（Clin
. Chem. 37 (1995) 1955-1967）並びに米国特許第 5,432,099 号、第 5,516,635
号及び第 5,126,276 号に記載されている。
【００１９】 本発明に従って用いられる固相は、検出法に用いることができる非多孔性支持
体を含む。この非多孔性支持体はいかなる非多孔性材料を含んでなるものであっ
てもよい。この支持体は、好ましくは、プラスチック、ガラス、金属又は金属酸
化物表面を有し、特に好ましくは、ポリスチレン表面を有する。空間的に分離さ
れた領域（試験領域）がこの支持体上に配置される。固定化固相受容体のような
試薬をこれらの試験領域に塗布する。これらの試薬は公知の方法により、例えば
、直接吸着性結合、共有結合性カップリング又は高親和性結合対、例えば、スト
レプトアビジン／ビオチン、抗原／抗体もしくは糖／レクチンによるカップリン
グによって試験領域に固定化される。
体を含む。この非多孔性支持体はいかなる非多孔性材料を含んでなるものであっ
てもよい。この支持体は、好ましくは、プラスチック、ガラス、金属又は金属酸
化物表面を有し、特に好ましくは、ポリスチレン表面を有する。空間的に分離さ
れた領域（試験領域）がこの支持体上に配置される。固定化固相受容体のような
試薬をこれらの試験領域に塗布する。これらの試薬は公知の方法により、例えば
、直接吸着性結合、共有結合性カップリング又は高親和性結合対、例えば、スト
レプトアビジン／ビオチン、抗原／抗体もしくは糖／レクチンによるカップリン
グによって試験領域に固定化される。
【００２０】 空間的に分離された試験領域には異なる試薬を別々にロードすることが特に有
利である。様々な試験領域の個別の塗布により、各々の試薬、例えば、個別の抗
原の各々について選択されるべき、例えば特別なバッファ組成物の形態の、最適
固相濃度及び最適コーティング条件が可能となる。結果として、個別の分析物特
異的受容体の各々、例えば、個別の抗原の各々をその領域の最大結合許容量まで
コートすることが可能となり、これに対して、従来公知の試験においては各々の
受容体、例えば、各々の抗原が利用可能な結合許容量の一部のみを利用して結合
されていた。さらに、様々な試薬を別々に塗布する結果として、固相上の結合部
位についての個々の試薬、例えば、抗原間での競合が存在しない。したがって、
各々の試験領域が１タイプの固定化分析物特異的受容体のみを含むように、測定
しようとする分析物に対して特異的に結合し得る試薬を試験領域当たり１種類の
み結合させることが好ましい。この試薬は、最適均一結合相を形成するため、不
活性希釈分子で任意に希釈することができる。不活性希釈分子は、固相とは結合
するが分析物又は他のサンプル成分とは相互作用しない分子である。適切な希釈
分子は、例えば、WO 92/10757 及び EP 0 664 452 A2 に記載されている。
利である。様々な試験領域の個別の塗布により、各々の試薬、例えば、個別の抗
原の各々について選択されるべき、例えば特別なバッファ組成物の形態の、最適
固相濃度及び最適コーティング条件が可能となる。結果として、個別の分析物特
異的受容体の各々、例えば、個別の抗原の各々をその領域の最大結合許容量まで
コートすることが可能となり、これに対して、従来公知の試験においては各々の
受容体、例えば、各々の抗原が利用可能な結合許容量の一部のみを利用して結合
されていた。さらに、様々な試薬を別々に塗布する結果として、固相上の結合部
位についての個々の試薬、例えば、抗原間での競合が存在しない。したがって、
各々の試験領域が１タイプの固定化分析物特異的受容体のみを含むように、測定
しようとする分析物に対して特異的に結合し得る試薬を試験領域当たり１種類の
み結合させることが好ましい。この試薬は、最適均一結合相を形成するため、不
活性希釈分子で任意に希釈することができる。不活性希釈分子は、固相とは結合
するが分析物又は他のサンプル成分とは相互作用しない分子である。適切な希釈
分子は、例えば、WO 92/10757 及び EP 0 664 452 A2 に記載されている。
【００２１】 分析物、例えば、抗原に結合することが可能な単一の試薬のみが結合する試験
領域において非特異的結合が大幅に減少することが見出された。したがって、例
えば、異なる抗原が個々のスポットとして塗布されたとき、測定可能な非特異的
結合は観察されず、これに対して、数種類の抗原の混合物が塗布されている試験
スポットは明確に測定可能な非特異的結合を示す。
領域において非特異的結合が大幅に減少することが見出された。したがって、例
えば、異なる抗原が個々のスポットとして塗布されたとき、測定可能な非特異的
結合は観察されず、これに対して、数種類の抗原の混合物が塗布されている試験
スポットは明確に測定可能な非特異的結合を示す。
【００２２】 本発明による方法においては、分析物は、適切なマーカー基、例えば、蛍光マ
ーカー基、化学発光マーカー基、放射性標識、酵素標識、着色標識及びゾル粒子
を用いることによって公知の方法で検出される。あるいは、固相が適切であるな
らば、検出媒体の成分と試験領域との相互作用を、それぞれの領域の層厚を測定
することにより、例えば、プラズモン共鳴分光法によって測定することもできる
。
ーカー基、化学発光マーカー基、放射性標識、酵素標識、着色標識及びゾル粒子
を用いることによって公知の方法で検出される。あるいは、固相が適切であるな
らば、検出媒体の成分と試験領域との相互作用を、それぞれの領域の層厚を測定
することにより、例えば、プラズモン共鳴分光法によって測定することもできる
。
【００２３】 さらに、固相の分離された試験領域と不活性領域とを区別するため、それらは
、分析物特異的コーティング基と同時に検出することができ、かつそれと相互作
用することがない検出可能な分析物非特異的マーカー基を含んでいてもよい。こ
のような分析物非特異的マーカー基の例は、蛍光が分析物特異的マーカー基の蛍
光波長とは異なる波長の蛍光マーカー基である。この分析物非特異的マーカー基
は、好ましくは、固相受容体と同様に、高親和性結合対、例えば、ストレプトア
ビジン／ビオチンによって固定化される。
、分析物特異的コーティング基と同時に検出することができ、かつそれと相互作
用することがない検出可能な分析物非特異的マーカー基を含んでいてもよい。こ
のような分析物非特異的マーカー基の例は、蛍光が分析物特異的マーカー基の蛍
光波長とは異なる波長の蛍光マーカー基である。この分析物非特異的マーカー基
は、好ましくは、固相受容体と同様に、高親和性結合対、例えば、ストレプトア
ビジン／ビオチンによって固定化される。
【００２４】 万能検出試薬を用いることにより感度をさらに高めることができる。その前に
、分析物分子に結合し、かつ標識、例えば、酵素、蛍光標識又は蛍光ラテックス
粒子を担持する別々の検出試薬を分析物分子の各々に用いることができる。しか
しながら、数種類の標識検出試薬の組み合わせはしばしば非常に高濃度の標識を
生じ、したがって、非特異的結合が大幅に増加する。この問題は万能検出試薬を
用いることにより解決することができる。本発明によると、蛍光標識ラテックス
粒子が万能検出試薬として好ましく用いられる。この場合、それ自体はシグナル
発生基を担持しない分析物特異的第１受容体を用いて分析物分子に特異的に結合
させる。万能第２標識受容体、すなわち、分析物とは独立に幾つかの、好ましく
は全ての第１受容体に結合する受容体がこの分析物特異的第１受容体に結合する
。この第２受容体は、マーカー基に官能基を介して吸着的もしくは共有結合的に
、又は高親和性結合対、例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、抗原／抗体も
しくは糖／レクチンによってカップリングすることが可能である。
、分析物分子に結合し、かつ標識、例えば、酵素、蛍光標識又は蛍光ラテックス
粒子を担持する別々の検出試薬を分析物分子の各々に用いることができる。しか
しながら、数種類の標識検出試薬の組み合わせはしばしば非常に高濃度の標識を
生じ、したがって、非特異的結合が大幅に増加する。この問題は万能検出試薬を
用いることにより解決することができる。本発明によると、蛍光標識ラテックス
粒子が万能検出試薬として好ましく用いられる。この場合、それ自体はシグナル
発生基を担持しない分析物特異的第１受容体を用いて分析物分子に特異的に結合
させる。万能第２標識受容体、すなわち、分析物とは独立に幾つかの、好ましく
は全ての第１受容体に結合する受容体がこの分析物特異的第１受容体に結合する
。この第２受容体は、マーカー基に官能基を介して吸着的もしくは共有結合的に
、又は高親和性結合対、例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、抗原／抗体も
しくは糖／レクチンによってカップリングすることが可能である。
【００２５】 例えば一工程反応として行われるブリッジ試験のさらなる不利益は、最適シグ
ナルを得るため、固相受容体（例えば、ビオチニル化ＨＩＶ−ｇｐ４１）及び遊
離検出受容体（例えば、ジゴキシゲニル化ＨＩＶ−ｇｐ４１）を１：１の比で提
供しなければならないことである。これは、個々の固相受容体の濃度が固相の限
られた結合許容量のためにしばしば最適以下であり、したがって検出受容体に好
ましいものではないこともあり得るため、不都合である。
ナルを得るため、固相受容体（例えば、ビオチニル化ＨＩＶ−ｇｐ４１）及び遊
離検出受容体（例えば、ジゴキシゲニル化ＨＩＶ−ｇｐ４１）を１：１の比で提
供しなければならないことである。これは、個々の固相受容体の濃度が固相の限
られた結合許容量のためにしばしば最適以下であり、したがって検出受容体に好
ましいものではないこともあり得るため、不都合である。
【００２６】 本発明による方法は、固相受容体が既に最適濃度で固相に結合した状態にする
。さらに、ジゴキシゲニン又はビオチンとの受容体コンジュゲートは酵素標識受
容体とは対照的に非特異的結合の傾向が無視できるものであるため、検出受容体
も最適濃度で供給することができる。これらの試薬を過剰に用いることが可能で
あって、受容体の添加における不正確さが試験精度に影響を与えることがない。
。さらに、ジゴキシゲニン又はビオチンとの受容体コンジュゲートは酵素標識受
容体とは対照的に非特異的結合の傾向が無視できるものであるため、検出受容体
も最適濃度で供給することができる。これらの試薬を過剰に用いることが可能で
あって、受容体の添加における不正確さが試験精度に影響を与えることがない。
【００２７】 測定しようとする分析物が試験領域に固定化された試薬、例えば、固相受容体
に特異的に結合することで、サンプル中の分析物の存在又は／及び量を測定する
ことが可能となる。分析物に特異的に結合することが可能である異なる試薬を各
々含む異なる試験領域を組み合わせて評価することで、特には偽陽性結果が減少
することにより、及び真の陽性結果の明確な認識が可能となることにより、検出
法の感度が大幅に改善される。本発明による方法は、特異性に関して強い要求が
なされる定量試験、例えば、感染（例えば、ＨＩＶ）の試験における非特異的結
合の検出又は排除に特に興味深いものである。
に特異的に結合することで、サンプル中の分析物の存在又は／及び量を測定する
ことが可能となる。分析物に特異的に結合することが可能である異なる試薬を各
々含む異なる試験領域を組み合わせて評価することで、特には偽陽性結果が減少
することにより、及び真の陽性結果の明確な認識が可能となることにより、検出
法の感度が大幅に改善される。本発明による方法は、特異性に関して強い要求が
なされる定量試験、例えば、感染（例えば、ＨＩＶ）の試験における非特異的結
合の検出又は排除に特に興味深いものである。
【００２８】 本発明によるアレイ、すなわち、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも
３つ、最も好ましくは少なくとも５つから１０００まで、より好ましくは１００
までの空間的に分離された試験領域を有する固相を使用することで、これらの試
験領域のうちの少なくとも１つを、それが対照領域を表すように設計することが
可能となる。したがって、本発明による方法は、好ましくは、少なくとも１つ、
より好ましくは２つ、最も好ましくは少なくとも５つの対照領域をさらに有する
固相の使用を含む。固相に対照スポットを組み込むことで、干渉によって生じる
偽結果を容易に、かつ迅速に検出することが可能となる。特異的試験領域に加え
て、サンプル特異的なバックグランドを測定し、したがって、サンプル特異的な
カットオフを規定することも可能である。試験アレイの使用及び対照スポットの
使用はカットオフ限界を低下させる。カットオフ値は、試験手順において陽性及
び陰性値を区別するのに用いられる閾値である。このようなカットオフ値は感染
性疾患に関連する試験手順に特に重要である。本発明による方法は、大幅に減少
した確率誤差で陽性−陰性の区別を可能にする。
３つ、最も好ましくは少なくとも５つから１０００まで、より好ましくは１００
までの空間的に分離された試験領域を有する固相を使用することで、これらの試
験領域のうちの少なくとも１つを、それが対照領域を表すように設計することが
可能となる。したがって、本発明による方法は、好ましくは、少なくとも１つ、
より好ましくは２つ、最も好ましくは少なくとも５つの対照領域をさらに有する
固相の使用を含む。固相に対照スポットを組み込むことで、干渉によって生じる
偽結果を容易に、かつ迅速に検出することが可能となる。特異的試験領域に加え
て、サンプル特異的なバックグランドを測定し、したがって、サンプル特異的な
カットオフを規定することも可能である。試験アレイの使用及び対照スポットの
使用はカットオフ限界を低下させる。カットオフ値は、試験手順において陽性及
び陰性値を区別するのに用いられる閾値である。このようなカットオフ値は感染
性疾患に関連する試験手順に特に重要である。本発明による方法は、大幅に減少
した確率誤差で陽性−陰性の区別を可能にする。
【００２９】 各々が異なる分析物分子の測定が可能である幾つかの試験領域が用いられる場
合には、それがしばしば、感度を保持しながらも試験特異性の増大（すなわち、
陽性及び陰性値の正確な区別）を得るために試験領域に特異的なカットオフ値を
定義するのに好都合であることが立証されている。
合には、それがしばしば、感度を保持しながらも試験特異性の増大（すなわち、
陽性及び陰性値の正確な区別）を得るために試験領域に特異的なカットオフ値を
定義するのに好都合であることが立証されている。
【００３０】 本発明による方法はあらゆる検出方法、例えば、免疫アッセイ、核酸ハイブリ
ダイゼーションアッセイ、糖−レクチンアッセイ及び類似の方法に用いることが
できる。また本発明による方法は、サンプル中のあらゆる分析物の検出にも基本
的に適する。分析物は、その分析物に結合することが可能な１種類もしくは数種
類の試薬、すなわち、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、ハプテン及び核酸か
ら好ましく選択される受容体との特異的相互作用によって特に好ましく検出され
る。
ダイゼーションアッセイ、糖−レクチンアッセイ及び類似の方法に用いることが
できる。また本発明による方法は、サンプル中のあらゆる分析物の検出にも基本
的に適する。分析物は、その分析物に結合することが可能な１種類もしくは数種
類の試薬、すなわち、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、ハプテン及び核酸か
ら好ましく選択される受容体との特異的相互作用によって特に好ましく検出され
る。
【００３１】 本発明による方法の主な利点は主として単一の分析物についての試験の感度を
改善することではあるが、試験領域が適切に選択される場合には、数種類の分析
物を同時に高感度で測定することも可能である。
改善することではあるが、試験領域が適切に選択される場合には、数種類の分析
物を同時に高感度で測定することも可能である。
【００３２】 本発明のさらなる主題は、サンプル中の分析物を検出するための固相であって
、非多孔性担体及び少なくとも２つの空間的に分離された試験領域を含むことを
特徴とし、該試験領域が測定しようとする分析物に特異的に結合することが可能
な種々の試薬を各々含有するものである。
、非多孔性担体及び少なくとも２つの空間的に分離された試験領域を含むことを
特徴とし、該試験領域が測定しようとする分析物に特異的に結合することが可能
な種々の試薬を各々含有するものである。
【００３３】 これらの試験領域は、好ましくは、分析物の種々のエピトープもしくは／及び
サブタイプに、又は／ならびに種々のタイプの分析物に結合する種々の試薬を含
む。
サブタイプに、又は／ならびに種々のタイプの分析物に結合する種々の試薬を含
む。
【００３４】 固相上に最大数の可能な試験領域を提供するため、小型化した試験フォーマッ
トが好ましく用いられる。個々の試験領域間の距離は、塗布された試薬が混じり
合わないように選択される。これは、通常、試験領域の縁の間の距離が０．０５
〜５ｍｍである場合に防止することができる。好ましくは、試験領域の間に、分
析物にも他のサンプル成分にも結合し得ない不活性表面が存在する。
トが好ましく用いられる。個々の試験領域間の距離は、塗布された試薬が混じり
合わないように選択される。これは、通常、試験領域の縁の間の距離が０．０５
〜５ｍｍである場合に防止することができる。好ましくは、試験領域の間に、分
析物にも他のサンプル成分にも結合し得ない不活性表面が存在する。
【００３５】 本発明による固相はあらゆる検出方法、例えば、免疫アッセイ、核酸ハイブリ
ダイゼーションアッセイ、糖−レクチンアッセイ等において用いることができる
。これは、抗体又は／及び抗原を検出するための免疫アッセイにおいて好ましく
用いられる。
ダイゼーションアッセイ、糖−レクチンアッセイ等において用いることができる
。これは、抗体又は／及び抗原を検出するための免疫アッセイにおいて好ましく
用いられる。
【００３６】 本発明は、さらに、サンプル中の分析物を検出するための試験キットであって
、本発明による固相及び標識した検出試薬を含む試験キットに関する。標識検出
試薬は当業者に公知であり、一般には、マーカー基及び分析物の検出を可能にす
る特異的結合が可能な基を含む。適切なマーカー基は、例えば、蛍光、化学発光
、酵素、放射性又は粒子（ゾル）マーカー基である。特異的に結合し得る基は、
例えば、形成される分析物複合体に結合可能であるか、又は、競合試験フォーマ
ットの場合には、その検出系の他の成分と結合可能な基であり得る。この試験キ
ットは、好ましくは、分析物に対して特異的である検出受容体に結合し得る万能
結合体、特には蛍光標識ラテックス粒子、を検出試薬として含む。
、本発明による固相及び標識した検出試薬を含む試験キットに関する。標識検出
試薬は当業者に公知であり、一般には、マーカー基及び分析物の検出を可能にす
る特異的結合が可能な基を含む。適切なマーカー基は、例えば、蛍光、化学発光
、酵素、放射性又は粒子（ゾル）マーカー基である。特異的に結合し得る基は、
例えば、形成される分析物複合体に結合可能であるか、又は、競合試験フォーマ
ットの場合には、その検出系の他の成分と結合可能な基であり得る。この試験キ
ットは、好ましくは、分析物に対して特異的である検出受容体に結合し得る万能
結合体、特には蛍光標識ラテックス粒子、を検出試薬として含む。
【００３７】 従来の定型的試験のさらなる問題は、抗原及びこの抗原を特異的に指向する抗
体を１回の測定で同時に測定することが不可能であることである。このため、抗
原ｐ２４、及び他のＨＩＶ抗原に対する抗体は、例えば、いわゆるＨＩＶ組み合
わせ試験において同時に測定する。このような試験においては、他のＨＩＶ抗原
、例えば、ｇｐ４１又はｇｐ１２０に対する抗体を測定することのみが可能であ
り、これに対してｐ２４に対する抗体を測定することは不可能である。
体を１回の測定で同時に測定することが不可能であることである。このため、抗
原ｐ２４、及び他のＨＩＶ抗原に対する抗体は、例えば、いわゆるＨＩＶ組み合
わせ試験において同時に測定する。このような試験においては、他のＨＩＶ抗原
、例えば、ｇｐ４１又はｇｐ１２０に対する抗体を測定することのみが可能であ
り、これに対してｐ２４に対する抗体を測定することは不可能である。
【００３８】 US-PS-5,627,026 には生物学的サンプル中の抗体及び抗原の検出方法が記載さ
れている。例えば、ＦｅＬＶ抗原及びＦＩＶ抗体を測定するためのアッセイが記
載されている。しかしながら、US-PS-5,627,026 の方法によると、抗原が測定さ
れるとき、同じ試験においては他の抗原を指向する抗体を検出することのみが可
能である。
れている。例えば、ＦｅＬＶ抗原及びＦＩＶ抗体を測定するためのアッセイが記
載されている。しかしながら、US-PS-5,627,026 の方法によると、抗原が測定さ
れるとき、同じ試験においては他の抗原を指向する抗体を検出することのみが可
能である。
【００３９】 したがって、本発明のさらなる目的は、サンプル中の抗原及びこの抗原を特異
的に指向する抗体を同時に測定するための方法を提供することであった。この目
的は、 （ａ）測定しようとする抗原に結合し得る固定化受容体が第１試験領域に塗布さ
れており、かつ測定しようとする抗体に結合し得る固定化受容体がそれらから空
間的に分離されている第２試験領域に塗布されている固相を得る工程、 （ｂ）サンプルを、該固相、及びシグナル発生基を担持するか、又はシグナル発
生基に結合可能である遊離分析物特異的受容体と接触させる工程、並びに （ｃ）該固相上のシグナル発生基を測定することにより、抗原及び抗体の存在又
は／及びそれらの量を検出する工程、 を含む方法によって達成される。
的に指向する抗体を同時に測定するための方法を提供することであった。この目
的は、 （ａ）測定しようとする抗原に結合し得る固定化受容体が第１試験領域に塗布さ
れており、かつ測定しようとする抗体に結合し得る固定化受容体がそれらから空
間的に分離されている第２試験領域に塗布されている固相を得る工程、 （ｂ）サンプルを、該固相、及びシグナル発生基を担持するか、又はシグナル発
生基に結合可能である遊離分析物特異的受容体と接触させる工程、並びに （ｃ）該固相上のシグナル発生基を測定することにより、抗原及び抗体の存在又
は／及びそれらの量を検出する工程、 を含む方法によって達成される。
【００４０】 抗原は、好ましくは、サンドイッチ試験を用いて検出し、抗体は、好ましくは
、架橋概念、逆滴定概念又は間接試験フォーマットを用いて検出する。
、架橋概念、逆滴定概念又は間接試験フォーマットを用いて検出する。
【００４１】 抗体は、好ましくは、逆滴定を用いて検出する。これの利点は、サンドイッチ
試験を抗原の同時検出に用いたときに検出分子間に干渉が生じないことであり、
これは、この場合、同じ検出試薬を抗原の検出及び抗体の検出に用いることがで
きるためである。抗原、例えば、ＨＩＶ−ｐ２４を検出するためのサンドイッチ
試験の場合、この抗原を指向する抗体を、例えば、試験領域に固定化する。次に
、この抗原を指向する第２の直接標識抗体又は間接標識抗体、例えば、ジゴキシ
ゲニル化抗ｐ２４抗体を、検出に用いられる遊離受容体として用いることができ
る。逆滴定を用いてこの抗原を指向する対応抗体、例えば抗ｐ２４抗体、を検出
するために、その抗体に結合し得る抗原、例えば、ｐ２４又はそれらのフラグメ
ントを別の試験領域に固定化する。固定化された抗原への結合についてサンプル
中の、例えば天然抗ｐ２４抗体である、分析物と競合する、この抗原を指向する
第２の標識抗体、例えば、ジゴキシゲニル化抗ｐ２４抗体も検出試薬として用い
る。したがって、ジゴキシゲニル化抗ｐ２４抗体のような同じ検出試薬を、ｐ２
４抗原及びそれを指向する抗ｐ２４抗体の好ましい同時検出に用いることができ
る。
試験を抗原の同時検出に用いたときに検出分子間に干渉が生じないことであり、
これは、この場合、同じ検出試薬を抗原の検出及び抗体の検出に用いることがで
きるためである。抗原、例えば、ＨＩＶ−ｐ２４を検出するためのサンドイッチ
試験の場合、この抗原を指向する抗体を、例えば、試験領域に固定化する。次に
、この抗原を指向する第２の直接標識抗体又は間接標識抗体、例えば、ジゴキシ
ゲニル化抗ｐ２４抗体を、検出に用いられる遊離受容体として用いることができ
る。逆滴定を用いてこの抗原を指向する対応抗体、例えば抗ｐ２４抗体、を検出
するために、その抗体に結合し得る抗原、例えば、ｐ２４又はそれらのフラグメ
ントを別の試験領域に固定化する。固定化された抗原への結合についてサンプル
中の、例えば天然抗ｐ２４抗体である、分析物と競合する、この抗原を指向する
第２の標識抗体、例えば、ジゴキシゲニル化抗ｐ２４抗体も検出試薬として用い
る。したがって、ジゴキシゲニル化抗ｐ２４抗体のような同じ検出試薬を、ｐ２
４抗原及びそれを指向する抗ｐ２４抗体の好ましい同時検出に用いることができ
る。
【００４２】 抗原をサンドイッチ試験によって検出し、かつ抗体を架橋試験又は間接試験に
よって平行して検出する場合には、検出試薬間の相互作用を防止するのに特別な
試験試薬を用いなければならない。抗体、例えば、抗ｐ２４抗体を検出するため
の間接試験の場合、検出しようとする抗体が特異的である抗原、例えば、ｐ２４
を、例えば、試験領域に固定化する。次に、検出しようとする抗体は認識するが
固定化された抗原は認識しない標識抗体、例えば、ジゴキシゲニル化抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体を抗体の検出に用いる。抗原の検出をサンドイッチ・フォーマットで同時
に行う場合、エピトープ結合部位が既知である１種類もしくは数種類の抗体、好
ましくはモノクローナル抗体を検出側に用いることができる。検出抗体に結合可
能であるエピトープを含む本来の、又は組換え抗原は、別のところで望ましくな
い反応が生じうるため、間接試験フォーマット又は架橋フォーマットにおいて抗
体の検出に同時に用いることはできない。その代わりに、検出抗体（１種類もし
くは複数種類）が結合するエピトープ結合部位を含まない予め決定された組換え
抗原又はペプチド抗原を用いることが必要である。
よって平行して検出する場合には、検出試薬間の相互作用を防止するのに特別な
試験試薬を用いなければならない。抗体、例えば、抗ｐ２４抗体を検出するため
の間接試験の場合、検出しようとする抗体が特異的である抗原、例えば、ｐ２４
を、例えば、試験領域に固定化する。次に、検出しようとする抗体は認識するが
固定化された抗原は認識しない標識抗体、例えば、ジゴキシゲニル化抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体を抗体の検出に用いる。抗原の検出をサンドイッチ・フォーマットで同時
に行う場合、エピトープ結合部位が既知である１種類もしくは数種類の抗体、好
ましくはモノクローナル抗体を検出側に用いることができる。検出抗体に結合可
能であるエピトープを含む本来の、又は組換え抗原は、別のところで望ましくな
い反応が生じうるため、間接試験フォーマット又は架橋フォーマットにおいて抗
体の検出に同時に用いることはできない。その代わりに、検出抗体（１種類もし
くは複数種類）が結合するエピトープ結合部位を含まない予め決定された組換え
抗原又はペプチド抗原を用いることが必要である。
【００４３】 本発明によるアレイ系を用いるマルチエピトープ分析は、特定の抗原及びこの
特定の抗原を指向する抗体についての抗原及び抗体試験を組み合わせて実施する
ことを可能にする。この手順は、従来技術の公知法では存在する、抗原の最初の
出現とその後の抗体の出現との間の診断の時間的隔たりを埋め、非常に早期の段
階でサンプルを陽性又は陰性に分類することを可能にする。通常、患者からのサ
ンプルが採取されるところでは、最も早期に検出可能な陽性サンプルの検出によ
って試験の感度が決定される。感染の間、この感染を示す様々なマーカー、例え
ば、抗原又はこれらの抗原を指向する抗体が異なる時間経過で生じる。
特定の抗原を指向する抗体についての抗原及び抗体試験を組み合わせて実施する
ことを可能にする。この手順は、従来技術の公知法では存在する、抗原の最初の
出現とその後の抗体の出現との間の診断の時間的隔たりを埋め、非常に早期の段
階でサンプルを陽性又は陰性に分類することを可能にする。通常、患者からのサ
ンプルが採取されるところでは、最も早期に検出可能な陽性サンプルの検出によ
って試験の感度が決定される。感染の間、この感染を示す様々なマーカー、例え
ば、抗原又はこれらの抗原を指向する抗体が異なる時間経過で生じる。
【００４４】 アレイ配置を用いる本発明によるマルチエピトープ法は、空間的に分離された
個々の試験領域の配置により、抗原及び抗体試験の間の特異的な区別をも可能に
する。本発明による方法の利点は特にＨＩＶ試験において理解される。本発明に
よる方法の好ましい例は、ＨＩＶ抗原及びそれを指向する抗体、例えば、ｐ２４
抗原及び対応する抗ｐ２４抗体の同時検出である。ＨＩＶ感染においては、ｐ２
４抗原がまず現れる。これらは抗原試験では検出することができるが、抗体試験
では検出することができない。抗原が出現した後、これらの抗原に対する抗体が
形成される。しかしながら、従来の組み合わせ試験においては、ｐ２４抗原試験
を抗ｐ２４抗体試験と組み合わせることは不可能であり、そうではなくてｐ２４
抗原試験を抗ｇｐ４１抗体試験と組み合わせる。しかしながら、抗ｇｐ４１抗体
の形成は抗ｐ２４抗体の形成後にのみ生じるため、従来の方法では抗ｇｐ４１抗
体が形成されるまでの期間に偽陰性結果が得られる可能性がある。対照的に、本
発明による方法は、抗ｐ２４抗体も測定できるためより信頼性が高い。
個々の試験領域の配置により、抗原及び抗体試験の間の特異的な区別をも可能に
する。本発明による方法の利点は特にＨＩＶ試験において理解される。本発明に
よる方法の好ましい例は、ＨＩＶ抗原及びそれを指向する抗体、例えば、ｐ２４
抗原及び対応する抗ｐ２４抗体の同時検出である。ＨＩＶ感染においては、ｐ２
４抗原がまず現れる。これらは抗原試験では検出することができるが、抗体試験
では検出することができない。抗原が出現した後、これらの抗原に対する抗体が
形成される。しかしながら、従来の組み合わせ試験においては、ｐ２４抗原試験
を抗ｐ２４抗体試験と組み合わせることは不可能であり、そうではなくてｐ２４
抗原試験を抗ｇｐ４１抗体試験と組み合わせる。しかしながら、抗ｇｐ４１抗体
の形成は抗ｐ２４抗体の形成後にのみ生じるため、従来の方法では抗ｇｐ４１抗
体が形成されるまでの期間に偽陰性結果が得られる可能性がある。対照的に、本
発明による方法は、抗ｐ２４抗体も測定できるためより信頼性が高い。
【００４５】 本発明によると、抗原を検出しようとする第１試験領域の結合性コーティング
は、検出しようとする抗原のエピトープに特異的である固定化抗体を含んでなる
。好ましいアレイ構造の結果として、検出しようとする抗原の異なるサブタイプ
に特異的である数種類の抗体を別々の試験領域に塗布することが可能である。こ
れらの抗体は分析しようとする抗原に従って選択される。ウイルスの感染につい
てスクリーニングする場合、抗ＨＩＶ Ｉ抗体、抗ＨＩＶ II抗体、抗ＨＢＶ抗
体又は／及び抗ＨＣＶ抗体が好ましく試験される。同様に、抗体を検出しようと
する他の試験領域の結合性コーティングは、好ましくは、検出しようとする抗体
に特異的である抗原を含む。この場合もやはり、基本的には、それぞれの試験に
適するあらゆる抗原を用いることができる；ＨＩＶ Ｉ、ＨＩＶ II、ＨＢＶ又
は／及びＨＣＶに由来する抗原又はそれらのエピトープが好ましく用いられる。
は、検出しようとする抗原のエピトープに特異的である固定化抗体を含んでなる
。好ましいアレイ構造の結果として、検出しようとする抗原の異なるサブタイプ
に特異的である数種類の抗体を別々の試験領域に塗布することが可能である。こ
れらの抗体は分析しようとする抗原に従って選択される。ウイルスの感染につい
てスクリーニングする場合、抗ＨＩＶ Ｉ抗体、抗ＨＩＶ II抗体、抗ＨＢＶ抗
体又は／及び抗ＨＣＶ抗体が好ましく試験される。同様に、抗体を検出しようと
する他の試験領域の結合性コーティングは、好ましくは、検出しようとする抗体
に特異的である抗原を含む。この場合もやはり、基本的には、それぞれの試験に
適するあらゆる抗原を用いることができる；ＨＩＶ Ｉ、ＨＩＶ II、ＨＢＶ又
は／及びＨＣＶに由来する抗原又はそれらのエピトープが好ましく用いられる。
【００４６】 非多孔性固相を用いることで、本発明による方法を用いて特に良好な結果を得
ることができる。非多孔性固相は試験試薬の塗布に特に有利であり、個々の試験
領域を互いに混同させることなしに限定された塗布を可能にする。加えて、非多
孔性試験相の使用は試験フォーマットの小型化を可能にする。小型化された試験
フォーマットは単一の非多孔性固相上に複数の試験領域を設けることを可能にす
る。
ることができる。非多孔性固相は試験試薬の塗布に特に有利であり、個々の試験
領域を互いに混同させることなしに限定された塗布を可能にする。加えて、非多
孔性試験相の使用は試験フォーマットの小型化を可能にする。小型化された試験
フォーマットは単一の非多孔性固相上に複数の試験領域を設けることを可能にす
る。
【００４７】 試験領域への抗原又は抗体の結合は、好ましくは、分析物を指向する標識抗体
を用いて検出する。抗原をサンドイッチ・フォーマットで検出する場合には、こ
の抗原を指向する標識抗体を用いる。同じ標識抗体が競合性フォーマット、例え
ば、逆滴定における分析物抗体の検出にも用いられる。したがって、個々の試験
領域の空間的に分離された評価によって、互いに干渉する２つの検出方法を用い
ることなしに、単一の検出試薬を用いて抗原及びこの抗原に特異的な抗体を検出
することが可能になる。抗体を標識するのに適する標識物質は当業者に公知であ
り、これには、例えば、蛍光基、化学発光基、放射性標識、酵素標識、着色標識
及びゾル粒子が含まれる。万能検出試薬、特には、例えば検出受容体に結合し得
る、蛍光標識ラテックス粒子の使用が好ましい。
を用いて検出する。抗原をサンドイッチ・フォーマットで検出する場合には、こ
の抗原を指向する標識抗体を用いる。同じ標識抗体が競合性フォーマット、例え
ば、逆滴定における分析物抗体の検出にも用いられる。したがって、個々の試験
領域の空間的に分離された評価によって、互いに干渉する２つの検出方法を用い
ることなしに、単一の検出試薬を用いて抗原及びこの抗原に特異的な抗体を検出
することが可能になる。抗体を標識するのに適する標識物質は当業者に公知であ
り、これには、例えば、蛍光基、化学発光基、放射性標識、酵素標識、着色標識
及びゾル粒子が含まれる。万能検出試薬、特には、例えば検出受容体に結合し得
る、蛍光標識ラテックス粒子の使用が好ましい。
【００４８】 個々の試験領域上の特異的に結合し得るコーティングが別々に塗布される場合
、本発明による方法を用いて特に良好な結果が得られる。これにより、個々の試
験領域の結合許容量を最適に利用することが可能となり、かつ最適結合許容量を
有するコーティングを調製することが可能となる。また、コーティングの結合許
容量をさらに改善するため、結合試薬を希釈分子で任意に希釈してもよい。適切
な希釈分子は、測定しようとする分析物に結合せず、かつ他のサンプル成分と相
互作用したり非特異的に結合することもない分子であり、後者は偽陽性結果につ
ながる可能性がある（W092/10757、EP 0 664 452 A2 を参照）。個々の試験領域
のコーティングは、特異的に結合することが可能である単一の型の分子から特に
好ましく形成される。この場合、分析物に特異的に結合し得る種々の試薬を異な
る試験スポットに塗布する。このようにして、本発明による方法の感度をさらに
高めることができる。
、本発明による方法を用いて特に良好な結果が得られる。これにより、個々の試
験領域の結合許容量を最適に利用することが可能となり、かつ最適結合許容量を
有するコーティングを調製することが可能となる。また、コーティングの結合許
容量をさらに改善するため、結合試薬を希釈分子で任意に希釈してもよい。適切
な希釈分子は、測定しようとする分析物に結合せず、かつ他のサンプル成分と相
互作用したり非特異的に結合することもない分子であり、後者は偽陽性結果につ
ながる可能性がある（W092/10757、EP 0 664 452 A2 を参照）。個々の試験領域
のコーティングは、特異的に結合することが可能である単一の型の分子から特に
好ましく形成される。この場合、分析物に特異的に結合し得る種々の試薬を異な
る試験スポットに塗布する。このようにして、本発明による方法の感度をさらに
高めることができる。
【００４９】 本発明のさらなる主題は、抗原及びこの抗原を特異的に指向する抗体を同時に
検出するための固相であって、少なくとも１つの第１試験領域及び少なくとも１
つの第２試験領域を含み、該第１試験領域が抗原に特異的に結合し得るコーティ
ングを有し、かつ該第２試験領域が該抗原を指向する抗体に特異的に結合し得る
コーティングを有し、それによりコーティングが均一であり、かつ各々が結合能
力を有する単一の種類の試薬のみを含むことを特徴とする固相である。これらの
コーティングは試験領域に均一に塗布され、すなわち、これらは均質である。結
合能力を有する試薬に加えて、試験領域は、検出しようとする分析物とも他のサ
ンプル成分とも相互作用することができない不活性希釈分子を含んでいてもよい
。
検出するための固相であって、少なくとも１つの第１試験領域及び少なくとも１
つの第２試験領域を含み、該第１試験領域が抗原に特異的に結合し得るコーティ
ングを有し、かつ該第２試験領域が該抗原を指向する抗体に特異的に結合し得る
コーティングを有し、それによりコーティングが均一であり、かつ各々が結合能
力を有する単一の種類の試薬のみを含むことを特徴とする固相である。これらの
コーティングは試験領域に均一に塗布され、すなわち、これらは均質である。結
合能力を有する試薬に加えて、試験領域は、検出しようとする分析物とも他のサ
ンプル成分とも相互作用することができない不活性希釈分子を含んでいてもよい
。
【００５０】 基本的にはあらゆる支持体材料を用いることが可能ではあるが、本発明による
固相の試験領域は、好ましくは、非多孔性支持体に適用される。非多孔性表面を
用いることで、特には、試験フォーマットの小型化及び複数の試験領域の同時測
定が可能となる。
固相の試験領域は、好ましくは、非多孔性支持体に適用される。非多孔性表面を
用いることで、特には、試験フォーマットの小型化及び複数の試験領域の同時測
定が可能となる。
【００５１】 本発明による固相は、抗原及びこの抗原を特異的に指向する抗体を同時検出す
るための免疫アッセイにおける使用に特に適する。このようにして、免疫学的試
験の感度及び信頼性をさらに改善することができる。
るための免疫アッセイにおける使用に特に適する。このようにして、免疫学的試
験の感度及び信頼性をさらに改善することができる。
【００５２】 また、本発明は、抗原及びこの抗原を特異的に指向する抗体を同時に検出する
ための試験キットであって、本発明による固相並びに試験領域上に結合した抗原
及び抗体を検出するための標識検出試薬を含むキットにも関する。適切な検出試
薬は、例えば、標識抗体であり、その標識は上述の基から選択することができる
。
ための試験キットであって、本発明による固相並びに試験領域上に結合した抗原
及び抗体を検出するための標識検出試薬を含むキットにも関する。適切な検出試
薬は、例えば、標識抗体であり、その標識は上述の基から選択することができる
。
【００５３】 従来利用可能な定型的試験のさらなる問題は、試験、例えば、ＨＩＶ試験に必
要な全ての抗原及び抗体を混合し、この混合物に最適であるカットオフ限界値を
その検出方法のために決定することである。しかしながら、全てのパラメータに
共通のカットオフ限界値を用いることは、そのカットオフ限界値が最悪成分の非
特異的結合によって決定され、かつそれに拘束されることを意味する。したがっ
て、本発明のさらなる主題は、サンプル中の分析物の検出方法であって、 （ａ）支持体及び少なくとも２つの空間的に分離された試験領域を含み、該試験
領域が各々異なる固定化分析物特異的受容体を含有する固相を提供する工程、 （ｂ）該サンプルを該固相、及びシグナル発生基を担持するか、又はシグナル発
生基に結合し得る少なくとも１種類の遊離分析物特異的受容体と接触させる工程
、並びに （ｃ）該試験領域上のシグナル発生基を測定することにより該分析物の存在又は
／及びそれらの量を検出し、それにより予め決定された試験領域に特有の閾値を
上回るシグナルを陽性と分類し、かつ予め決定された試験領域に特有の閾値を下
回るシグナルを陰性と分類する工程、 を含む方法である。
要な全ての抗原及び抗体を混合し、この混合物に最適であるカットオフ限界値を
その検出方法のために決定することである。しかしながら、全てのパラメータに
共通のカットオフ限界値を用いることは、そのカットオフ限界値が最悪成分の非
特異的結合によって決定され、かつそれに拘束されることを意味する。したがっ
て、本発明のさらなる主題は、サンプル中の分析物の検出方法であって、 （ａ）支持体及び少なくとも２つの空間的に分離された試験領域を含み、該試験
領域が各々異なる固定化分析物特異的受容体を含有する固相を提供する工程、 （ｂ）該サンプルを該固相、及びシグナル発生基を担持するか、又はシグナル発
生基に結合し得る少なくとも１種類の遊離分析物特異的受容体と接触させる工程
、並びに （ｃ）該試験領域上のシグナル発生基を測定することにより該分析物の存在又は
／及びそれらの量を検出し、それにより予め決定された試験領域に特有の閾値を
上回るシグナルを陽性と分類し、かつ予め決定された試験領域に特有の閾値を下
回るシグナルを陰性と分類する工程、 を含む方法である。
【００５４】 個々の試験領域の各々について予め決定された試験領域に特有の閾値を用いる
ことで、検出方法の特異性が、感度は高レベルで変化しないままで、大幅に改善
される。この閾値、すなわち、カットオフ値は以下のパラメータから決定する：
サンプルのシグナル、サンプルのバックグランド及び陰性対照のバックグランド
。カットオフ値（ＣＯＩ）の通常の計算を、例えば、以下の式に従って行う： ＣＯＩ＝シグナルサンプル−バックグランドサンプル／ｎ×バックグランド 陰性対照 ｎの標準値は、例えば、２である。係数ｎ、したがってカットオフ値は偽陽性
サンプルが観察される特定の試験領域で増大する可能性があり、そのためｎは２
〜１００、好ましくは２〜１０の数であり得る。
ことで、検出方法の特異性が、感度は高レベルで変化しないままで、大幅に改善
される。この閾値、すなわち、カットオフ値は以下のパラメータから決定する：
サンプルのシグナル、サンプルのバックグランド及び陰性対照のバックグランド
。カットオフ値（ＣＯＩ）の通常の計算を、例えば、以下の式に従って行う： ＣＯＩ＝シグナルサンプル−バックグランドサンプル／ｎ×バックグランド 陰性対照 ｎの標準値は、例えば、２である。係数ｎ、したがってカットオフ値は偽陽性
サンプルが観察される特定の試験領域で増大する可能性があり、そのためｎは２
〜１００、好ましくは２〜１０の数であり得る。
【００５５】 この閾値は、好ましくは、各々の試験領域について個別に決定する。これは、
様々な試験領域に異なる閾値、すなわちカットオフ値が指定されることを意味し
、特には、少なくとも２つの試験領域について閾値が別々に指定される。この方
法の好ましい実施形態では上述の特徴が用いられる。
様々な試験領域に異なる閾値、すなわちカットオフ値が指定されることを意味し
、特には、少なくとも２つの試験領域について閾値が別々に指定される。この方
法の好ましい実施形態では上述の特徴が用いられる。
【００５６】 以下の実施例により本発明をさらに明らかにする。
【００５７】実施例 １．マイクロスポット技術及び幾つかの抗原特異的試験領域を用いる抗ＨＩＶ抗
体の試験 マイクロスポットは小型化された超感度技術であり、これは単一の測定プロセ
スにおける異なるパラメータの同時決定に理想的である。抗ＨＩＶ抗体を決定す
るため、異なるＨＩＶ検出抗原をインクジェット法によりポリスチレン支持体上
の試験領域（スポット）にいわゆるアレーの状態に各々個別に塗布した。この試
験手順においては、サンプルバッファで１：１の比に希釈した３０μｌのサンプ
ルを試験領域を備える支持体上にピペットでのせ、室温で振盪しながら２０分間
インキュベートする。サンプルを吸引して洗浄バッファで洗浄した後、全てのジ
ゴキシゲニン標識ＨＩＶ抗原の混合物を含む３０μｌの試薬溶液１を添加し、そ
れを再度室温で振盪しながら２０分間インキュベートする。試薬溶液１を吸引し
て洗浄バッファで洗浄した後、検出試薬を含む３０μｌの試薬溶液２を添加する
。抗ジゴキシゲニン抗体を共有結合的にコートした粒径１００ｎｍの蛍光ラテッ
クス粒子を万能検出試薬として用いる。
体の試験 マイクロスポットは小型化された超感度技術であり、これは単一の測定プロセ
スにおける異なるパラメータの同時決定に理想的である。抗ＨＩＶ抗体を決定す
るため、異なるＨＩＶ検出抗原をインクジェット法によりポリスチレン支持体上
の試験領域（スポット）にいわゆるアレーの状態に各々個別に塗布した。この試
験手順においては、サンプルバッファで１：１の比に希釈した３０μｌのサンプ
ルを試験領域を備える支持体上にピペットでのせ、室温で振盪しながら２０分間
インキュベートする。サンプルを吸引して洗浄バッファで洗浄した後、全てのジ
ゴキシゲニン標識ＨＩＶ抗原の混合物を含む３０μｌの試薬溶液１を添加し、そ
れを再度室温で振盪しながら２０分間インキュベートする。試薬溶液１を吸引し
て洗浄バッファで洗浄した後、検出試薬を含む３０μｌの試薬溶液２を添加する
。抗ジゴキシゲニン抗体を共有結合的にコートした粒径１００ｎｍの蛍光ラテッ
クス粒子を万能検出試薬として用いる。
【００５８】 この検出試薬を再度室温で振盪しながら２０分間インキュベートした後、吸引
し、洗浄して吸引乾燥する。次に、試験領域に波長６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレー
ザーを照射し、波長６７０ｎｍの蛍光をＣＣＤカメラで測定する。
し、洗浄して吸引乾燥する。次に、試験領域に波長６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレー
ザーを照射し、波長６７０ｎｍの蛍光をＣＣＤカメラで測定する。
【００５９】 この固相は以下の固定化抗原を含む特異的な試験領域を有する： − 組換えｐ２４ポリペプチド − 組換え逆転写酵素（ＲＴ） − ｇｐ４１ペプチド１ − ｇｐ４１ペプチド２。
【００６０】 以下の添加物を含む５０ｍＭトリスバッファｐＨ７．６をサンプルバッファと
して用いる：０．０５％ Tween 20、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
０．１％ウシＩｇＧ、０．０１％メチルイソチアゾロン、３％ペプトン。
して用いる：０．０５％ Tween 20、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
０．１％ウシＩｇＧ、０．０１％メチルイソチアゾロン、３％ペプトン。
【００６１】 以下の試験特異的抗原を含む上記サンプルバッファを試薬溶液１として用いた
： − ジゴキシゲニン標識組換えｐ２４ − ジゴキシゲニン標識組換え逆転写酵素 − ジゴキシゲニン標識ｇｐ４１ペプチド１ − ジゴキシゲニン標識ｇｐ４１ペプチド２。
： − ジゴキシゲニン標識組換えｐ２４ − ジゴキシゲニン標識組換え逆転写酵素 − ジゴキシゲニン標識ｇｐ４１ペプチド１ − ジゴキシゲニン標識ｇｐ４１ペプチド２。
【００６２】 以下の添加物を含む５０ｍＭトリスバッファｐＨ８．０を試薬溶液２として用
いた：０．０５％ Tween 20、０．９％ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、０．１％ナ
トリウムアジド及びモノクローナル抗ジゴキシゲニン抗体でコートした０．０１
％の蛍光標識ラテックス粒子。
いた：０．０５％ Tween 20、０．９％ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、０．１％ナ
トリウムアジド及びモノクローナル抗ジゴキシゲニン抗体でコートした０．０１
％の蛍光標識ラテックス粒子。
【００６３】２．マイクロスポット形式での抗ＨＩＶ抗体試験と従来の方法との比較 この実験においては、いわゆる血清変換サンプルを測定した。これらのサンプ
ルは、血清がＨＩＶ陰性からＨＩＶ陽性に転換した様々な人物に由来する経時回
収物である。試験方法がより高感度であるほどＨＩＶ特異的抗体のシグナルをよ
り早期に検出することができる。これらのサンプルを本発明による方法（マイク
ロスポット）を用いて、公知の方法（Boehringer Mannheim からの Enzymun（登
録商標））と比較して測定した。これに用いたＨＩＶ特異的物質は両試験システ
ムにおいて同一であり、したがって、これらは主として別々の個々のスポット分
析においてのみ異なっていた。これらの２つの方法のカットオフ指数（カットオ
フ指数＝シグナルサンプル−シグナルバックグランド／２×シグナル陰性対照）
を以下の表に示し、さらにウェスタンブロットのデータと比較する。
ルは、血清がＨＩＶ陰性からＨＩＶ陽性に転換した様々な人物に由来する経時回
収物である。試験方法がより高感度であるほどＨＩＶ特異的抗体のシグナルをよ
り早期に検出することができる。これらのサンプルを本発明による方法（マイク
ロスポット）を用いて、公知の方法（Boehringer Mannheim からの Enzymun（登
録商標））と比較して測定した。これに用いたＨＩＶ特異的物質は両試験システ
ムにおいて同一であり、したがって、これらは主として別々の個々のスポット分
析においてのみ異なっていた。これらの２つの方法のカットオフ指数（カットオ
フ指数＝シグナルサンプル−シグナルバックグランド／２×シグナル陰性対照）
を以下の表に示し、さらにウェスタンブロットのデータと比較する。
【００６４】
【表１】 １Boston Biomedica Inc.
【００６５】 この比較は、各々最適抗原濃度を有する個々のスポットに分割することで、公
知試験と比較して、感度が大幅に改善されることを示す。５つの血清変換パネル
のうち、７回目の回収がより早期に陽性として検出された。パネルに応じて、こ
れは3〜７日早いＨＩＶ感染の検出に相当する。ウェスタンブロットとの比較に
おいてもやはり感度の大幅な増加があり、６回目の回収でより早期に検出された
。
知試験と比較して、感度が大幅に改善されることを示す。５つの血清変換パネル
のうち、７回目の回収がより早期に陽性として検出された。パネルに応じて、こ
れは3〜７日早いＨＩＶ感染の検出に相当する。ウェスタンブロットとの比較に
おいてもやはり感度の大幅な増加があり、６回目の回収でより早期に検出された
。
【００６６】３．マイクロスポット形式におけるＨＩＶ ｐ２４抗原並びに抗ｇｐ４１及び抗
ＲＴ抗体の組み合わせた測定と従来の方法との比較 感度を評価するため、いわゆる血清変換サンプルを再度測定した。これらを本
発明による方法（マイクロスポット）を用いて測定し、得られたデータを現時点
で最良の利用可能な抗ＨＩＶ試験（血清変換パネルの製造者、例えば、BBI Comp
any のデータシートを参照）又は Boehringer Mannheim からの Enzymun（登録
商標）組み合わせ試験（ｐ２４抗原と抗ＨＩＶ抗体との組み合わせた測定）と比
較した。
ＲＴ抗体の組み合わせた測定と従来の方法との比較 感度を評価するため、いわゆる血清変換サンプルを再度測定した。これらを本
発明による方法（マイクロスポット）を用いて測定し、得られたデータを現時点
で最良の利用可能な抗ＨＩＶ試験（血清変換パネルの製造者、例えば、BBI Comp
any のデータシートを参照）又は Boehringer Mannheim からの Enzymun（登録
商標）組み合わせ試験（ｐ２４抗原と抗ＨＩＶ抗体との組み合わせた測定）と比
較した。
【００６７】 以下の試験領域（個々の試験スポット）（実施例１に従って調製）をマイクロ
スポット試験形式に用いた： − ＨＩＶサブタイプＢのｐ２４抗原を測定するためのモノクローナル抗ｐ２４
抗体Ａ − ＨＩＶサブタイプＢ及びＯのｐ２４抗原を測定するためのモノクローナル抗
ｐ２４抗体Ｂ − ｇｐ４１に対する抗体を測定するためのｇｐ４１ペプチド１ − ｇｐ４１に対する抗体を測定するためのｇｐ４１ペプチド２ − ＲＴに対する抗体を測定するための組換え逆転写酵素（ＲＴ） マイクロスポット試験において用いたＨＩＶ特異的物質は Enzymun（登録商標
）試験において用いた物質に匹敵し、そのためマイクロスポット試験と Enzymun
（登録商標）法との主な相違は別々の個々のスポット分析のみであった。これら
の２つの方法のカットオフ指数（測定は実施例２を参照）を以下の表に示し、さ
らに従来最も高感度の抗ＨＩＶ試験と比較する。
スポット試験形式に用いた： − ＨＩＶサブタイプＢのｐ２４抗原を測定するためのモノクローナル抗ｐ２４
抗体Ａ − ＨＩＶサブタイプＢ及びＯのｐ２４抗原を測定するためのモノクローナル抗
ｐ２４抗体Ｂ − ｇｐ４１に対する抗体を測定するためのｇｐ４１ペプチド１ − ｇｐ４１に対する抗体を測定するためのｇｐ４１ペプチド２ − ＲＴに対する抗体を測定するための組換え逆転写酵素（ＲＴ） マイクロスポット試験において用いたＨＩＶ特異的物質は Enzymun（登録商標
）試験において用いた物質に匹敵し、そのためマイクロスポット試験と Enzymun
（登録商標）法との主な相違は別々の個々のスポット分析のみであった。これら
の２つの方法のカットオフ指数（測定は実施例２を参照）を以下の表に示し、さ
らに従来最も高感度の抗ＨＩＶ試験と比較する。
【００６８】
【表２】 ｘｘ BBI Boston Biomedica Inc.
【００６９】 この比較は、マイクロスポット試験形式によるｐ２４抗原及びＨＩＶ抗体の組
み合わせた測定が、従来の方法と比較して、大幅に改善され得ることを示す。し
たがって、組み合わせマイクロスポット試験は、全ての抗原及び抗体が混合形態
で存在する Enzymun（登録商標）「コンビ試験（combi-test）」よりも数段高感
度である。５つの試験した血清変換パネルにおいて、より高感度の抗体試験と比
較して９つのサンプルがより早期に陽性として検出され、Enzymun（登録商標）
「コンビ試験」と比較して６つのサンプルがより早期に陽性として検出された。
み合わせた測定が、従来の方法と比較して、大幅に改善され得ることを示す。し
たがって、組み合わせマイクロスポット試験は、全ての抗原及び抗体が混合形態
で存在する Enzymun（登録商標）「コンビ試験（combi-test）」よりも数段高感
度である。５つの試験した血清変換パネルにおいて、より高感度の抗体試験と比
較して９つのサンプルがより早期に陽性として検出され、Enzymun（登録商標）
「コンビ試験」と比較して６つのサンプルがより早期に陽性として検出された。
【００７０】４．逆滴定法によるｐ２４抗原及び抗ｐ２４抗体の組み合わせた測定 ｐ２４抗原の測定及びｐ２４に対する抗体の測定を同じアレイシステムにおい
て組み合わせるため、ｐ２４抗原試験をサンドイッチ形式で行い、抗ｐ２４抗体
試験を逆滴定形式で行った。
て組み合わせるため、ｐ２４抗原試験をサンドイッチ形式で行い、抗ｐ２４抗体
試験を逆滴定形式で行った。
【００７１】 個々のスポットの各々に以下のｐ２４特異的試薬を含むアレイを調製した（実
施例１を参照）： （ａ）ｐ２４抗原及び抗ｐ２４抗体試験を含むパネル： （ｉ）ｐ２４抗原試験： 試験領域１：モノクローナル抗ｐ２４抗体Ａ Ｆａｂ’フラグメント、ビオ
チニル化（１００μｇ／ｍｌ） 試験領域２：モノクローナル抗ｐ２４抗体Ｂ Ｆａｂ’フラグメント、ビオ
チニル化（１００μｇ／ｍｌ） （ii）逆滴定法を用いる抗ｐ２４試験： 試験領域３：ビオチニル化ｐ２４抗原（０．３μｇ／ｍｌ） （ｂ）ブリッジ法を用いる抗ｐ２４抗体試験を含む参照パネル： − ビオチニル化ｐ２４抗原（１４μｇ／ｍｌ） この試験手順においては、サンプルバッファで１：１の比に希釈した３０μｌ
のサンプルをピペットで各々のパネルに添加し、３７℃のインキュベーション温
度で振盪しながら４５分間インキュベートした。サンプルを吸引して洗浄バッフ
ァで洗浄した後、全てのジゴキシゲニン標識ＨＩＶ抗原及びＨＩＶ抗体の混合物
を含む３０μｌの試薬溶液１を添加し、３７℃で振盪しながら１０分間インキュ
ベートした。以下のｐ２４特異的試薬を用いた： （ａ）ｐ２４抗原及び抗ｐ２４抗体試験を含むパネル： − モノクローナル抗ｐ２４抗体Ｄ Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジゴキ
シゲニル化（５００ｎｇ／ｍｌ） − モノクローナル抗ｐ２４抗体Ｅ Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジゴキ
シゲニル化（５００ｎｇ／ｍｌ） （ｂ）ブリッジ法を用いる抗ｐ２４抗体試験を含む参照パネル： − ジゴキシゲニル化ｐ２４抗原（３０ｎｇ／ｍｌ） 試薬溶液１を吸引して洗浄バッファで洗浄した後、検出試薬（実施例１を参照
）を含む３０μｌの試薬溶液２を添加した。この検出試薬を３７℃で振盪しなが
ら５分間インキュベートした後、吸引し、洗浄して乾燥させた。
施例１を参照）： （ａ）ｐ２４抗原及び抗ｐ２４抗体試験を含むパネル： （ｉ）ｐ２４抗原試験： 試験領域１：モノクローナル抗ｐ２４抗体Ａ Ｆａｂ’フラグメント、ビオ
チニル化（１００μｇ／ｍｌ） 試験領域２：モノクローナル抗ｐ２４抗体Ｂ Ｆａｂ’フラグメント、ビオ
チニル化（１００μｇ／ｍｌ） （ii）逆滴定法を用いる抗ｐ２４試験： 試験領域３：ビオチニル化ｐ２４抗原（０．３μｇ／ｍｌ） （ｂ）ブリッジ法を用いる抗ｐ２４抗体試験を含む参照パネル： − ビオチニル化ｐ２４抗原（１４μｇ／ｍｌ） この試験手順においては、サンプルバッファで１：１の比に希釈した３０μｌ
のサンプルをピペットで各々のパネルに添加し、３７℃のインキュベーション温
度で振盪しながら４５分間インキュベートした。サンプルを吸引して洗浄バッフ
ァで洗浄した後、全てのジゴキシゲニン標識ＨＩＶ抗原及びＨＩＶ抗体の混合物
を含む３０μｌの試薬溶液１を添加し、３７℃で振盪しながら１０分間インキュ
ベートした。以下のｐ２４特異的試薬を用いた： （ａ）ｐ２４抗原及び抗ｐ２４抗体試験を含むパネル： − モノクローナル抗ｐ２４抗体Ｄ Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジゴキ
シゲニル化（５００ｎｇ／ｍｌ） − モノクローナル抗ｐ２４抗体Ｅ Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジゴキ
シゲニル化（５００ｎｇ／ｍｌ） （ｂ）ブリッジ法を用いる抗ｐ２４抗体試験を含む参照パネル： − ジゴキシゲニル化ｐ２４抗原（３０ｎｇ／ｍｌ） 試薬溶液１を吸引して洗浄バッファで洗浄した後、検出試薬（実施例１を参照
）を含む３０μｌの試薬溶液２を添加した。この検出試薬を３７℃で振盪しなが
ら５分間インキュベートした後、吸引し、洗浄して乾燥させた。
【００７２】 試験領域にＨｅ−Ｎｅレーザーを波長６３３ｎｍで照射し、共焦点レーザー・
スキャナーを用いて波長６７０ｎｍで蛍光を測定した。
スキャナーを用いて波長６７０ｎｍで蛍光を測定した。
【００７３】 １１個のＨＩＶ陰性サンプル及び１９個のＨＩＶ陽性サンプルを両者のパネル
を用いて比較しながら測定した：両者の試験形式のカットオフ指数（ＣＯＩ）を
以下の表に示す。
を用いて比較しながら測定した：両者の試験形式のカットオフ指数（ＣＯＩ）を
以下の表に示す。
【００７４】
【表３】 ＊ＣＯＩ＝シグナルサンプル−シグナルバックグランド／０．７×シグナル陰性 対照 ； ＣＯＩ＞１．０＝陰性＊＊ ＣＯＩ＝シグナルサンプル−シグナルバックグランド／２×シグナル陰性対 照 ； ＣＯＩ＞１．０＝陽性
【００７５】 逆滴定法を用いて、全ての陰性サンプルに加えて全ての陽性サンプルが正確に
検出された。相互に干渉しないｐ２４抗原及び抗ｐ２４抗体試験の組み合わせは
、血清変換サンプルのより早期の検出及び偽陰性検出の信頼性のさらなる増加を
可能にする。
検出された。相互に干渉しないｐ２４抗原及び抗ｐ２４抗体試験の組み合わせは
、血清変換サンプルのより早期の検出及び偽陰性検出の信頼性のさらなる増加を
可能にする。
【００７６】５．試験領域に特有のカットオフの算出による試験特異性の改善 従来利用可能な定型的試験においては、測定に必要とされる全ての抗原及び抗
体を混合し、この混合物について最適カットオフ限界を決定する。これは「最悪
」試験成分の非特異的結合によって決定される。対照的に、本発明によるマイク
ロスポット技術では試験領域に特有のカットオフを算出することが可能となり、
これは各々の試験成分に特有である。
体を混合し、この混合物について最適カットオフ限界を決定する。これは「最悪
」試験成分の非特異的結合によって決定される。対照的に、本発明によるマイク
ロスポット技術では試験領域に特有のカットオフを算出することが可能となり、
これは各々の試験成分に特有である。
【００７７】 等しいカットオフ値の計算（ＣＯＩ＝シグナルサンプル−バックグランドサン プル ／２×バックグランド陰性対照）を個々の試験領域に用いる場合、１２６４
のサンプルにおいてＨＩＶ組み合わせ試験（実施例３）を用いて以下の特異性を
達成することが可能であった： − ｐ２４抗原： １００％ − 抗ＨＩＶ抗体試験： ９９．５２％（６つの偽陽性の決定） 偽陽性の決定はｇｐ４１ペプチド２及び逆転写酵素の２つの試験領域において
のみ生じたため、これらの試験領域のカットオフ限界は以下の閾値に増加した： ｇｐ４１ペプチド２：ＣＯＩ＝シグナルサンプル−バックグランドサンプル／５
×バックグランド陰性対照 ＲＴ： ＣＯＩ＝シグナルサンプル−バックグランドサンプル／３
×バックグランド陰性対照 このようにして、ＨＩＶ試験の特異性を９９．５２％から９９．９２％に改善
することが可能であった（ただ１つの偽陽性の決定）。高感度ｐ２４抗原試験の
カットオフ指数は変わらなかったため、試験の感度も影響を受けないままであっ
た。したがって、高い感度を変えることなく、特異性の大幅な改善を達成するこ
とが可能であった。
のサンプルにおいてＨＩＶ組み合わせ試験（実施例３）を用いて以下の特異性を
達成することが可能であった： − ｐ２４抗原： １００％ − 抗ＨＩＶ抗体試験： ９９．５２％（６つの偽陽性の決定） 偽陽性の決定はｇｐ４１ペプチド２及び逆転写酵素の２つの試験領域において
のみ生じたため、これらの試験領域のカットオフ限界は以下の閾値に増加した： ｇｐ４１ペプチド２：ＣＯＩ＝シグナルサンプル−バックグランドサンプル／５
×バックグランド陰性対照 ＲＴ： ＣＯＩ＝シグナルサンプル−バックグランドサンプル／３
×バックグランド陰性対照 このようにして、ＨＩＶ試験の特異性を９９．５２％から９９．９２％に改善
することが可能であった（ただ１つの偽陽性の決定）。高感度ｐ２４抗原試験の
カットオフ指数は変わらなかったため、試験の感度も影響を受けないままであっ
た。したがって、高い感度を変えることなく、特異性の大幅な改善を達成するこ
とが可能であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ Ｆターム(参考） 2G045 DA77 FA12 FB01 FB03 FB07 FB08 FB12 FB13 GC15
Claims (43)
- 【請求項１】 サンプル中の分析物の検出方法であって、 （ａ）非多孔性支持体及び少なくとも２つの空間的に分離された試験領域を含む
固相を提供する工程であって、該試験領域は各々異なる固定化分析物特異的受容
体を含む工程、 （ｂ）該サンプルを該固相、及びシグナル発生基を担持するか、又はシグナル発
生基に結合することが可能である少なくとも１種類の遊離分析物特異的受容体と
接触させる工程、並びに （ｃ）試験領域上のシグナル発生基を測定することによって分析物の存在又は／
及び量を検出する工程、 を含む、上記方法。 - 【請求項２】 検出しようとする分析物が均一又は不均一集団である請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】 分析物が不均一抗体集団、抗原混合物又は異なっていてもよ
い抗原及び抗体の混合物である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 試験領域が０．０１ないし１ｍｍの直径を有する、請求項１
〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 固相を、空間的に分離された試験領域上に異なる分析物特異
的受容体を別々に直接特異的に塗布することによって調製する、請求項１〜４の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 試験領域上へのコーティングが、各々の場合において、単一
の型の結合性分子を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 分析物特異的受容体を含まない少なくとも１つの対照領域を
さらに含む固相を用いる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 分析物及びこれに結合する試薬から形成される複合体の検出
に万能検出試薬、特に標識ラテックス粒子を用いる、請求項１〜７のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項９】 サンプル中の分析物を検出するための固相であって、 非多孔性支持体及び少なくとも２つの空間的に分離された試験領域を含み、該
試験領域が測定しようとする分析物に特異的に結合する異なる試薬を各々有する
固相。 - 【請求項１０】 試験領域が、分析物の異なるエピトープ又は／及びサブタ
イプ又は／及び異なるタイプの分析物に結合する異なる試薬を各々含む、請求項
９に記載の固相。 - 【請求項１１】 多孔性支持体がポリスチレン製である請求項９又は１０に
記載の固相。 - 【請求項１２】 試験領域が０．０１ないし１ｍｍの直径を有する、請求項
９〜１１のいずれか１項に記載の固相。 - 【請求項１３】 免疫アッセイにおける請求項９〜１２のいずれか１項に記
載の固相の使用。 - 【請求項１４】 サンプル中の分析物を検出するための試験キットであって
、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の固相に加えて標識検出試薬を含む試験
キット。 - 【請求項１５】 標識ラテックス粒子を万能検出試薬として含む、請求項１
４に記載の試験キット。 - 【請求項１６】 サンプル中の抗原及びこの抗原を特異的に指向する抗体を
同時に測定するための方法であって、 （ａ）測定しようとする抗原に結合し得る固定化受容体が第１試験領域に塗布さ
れており、かつ測定しようとする抗体に結合し得る固定化受容体が第１試験領域
から空間的に分離されている第２試験領域に塗布されている固相を提供する工程
、 （ｂ）サンプルを該固相、及びシグナル発生基を担持するか、又はシグナル発生
基に結合可能である遊離分析物特異的受容体と接触させる工程、並びに （ｃ）該固相上のシグナル発生基を測定することにより、抗原及び抗体の存在又
は／及び量を検出する工程、 を含む、上記方法。 - 【請求項１７】 サンドイッチ試験を用いて抗原を検出する、請求項１６に
記載の方法。 - 【請求項１８】 逆滴定法を用いて抗体を検出する、請求項１６又は１７に
記載の方法。 - 【請求項１９】 ブリッジ法を用いて抗体を検出する、請求項１６又は１７
に記載の方法。 - 【請求項２０】 間接試験フォーマットを用いて抗体を検出する、請求項１
６又は１７に記載の方法。 - 【請求項２１】 結合可能である第１試験領域のコーティングが検出しよう
とする抗原のエピトープに特異的な固定化抗体から形成される、請求項１６〜２
０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２２】 検出しようとする抗原の異なるサブタイプに特異的な抗体
を別々の試験領域に塗布する、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 抗体がウイルス抗体、特には抗ＨＩＶ Ｉ抗体、抗ＨＩＶ
II抗体、抗ＨＢＶ抗体及び抗ＨＣＶ抗体から選択される、請求項２１又は２２に
記載の方法。 - 【請求項２４】 結合可能である第２試験領域のコーティングが検出しよう
とする抗体に特異的な抗原を含んでなる、請求項１６〜２３のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項２５】 抗原がＨＩＶ Ｉ、ＨＩＶ II、ＨＢＶ及びＨＣＶを含む群
から選択される、請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２６】 測定しようとする抗原がＨＩＶ ｐ２４であり、測定しよ
うとする抗体が抗ｐ２４である、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の方法
。 - 【請求項２７】 非多孔性固相を用いる、請求項１６〜２６のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項２８】 分析物を指向する標識抗体を用いて検出を行う、請求項１
６〜２７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２９】 標識が蛍光基、化学発光基、放射性標識、酵素標識、着色
標識及びゾル粒子から選択される、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３０】 万能検出試薬、特に標識ラテックス粒子を用いて検出を行
う、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３１】 固相を、個々の試験領域に結合可能な特異的コーティング
を直接、別々に塗布することによって調製する、請求項１６〜３０のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項３２】 試験領域へのコーティングが、各々の場合において、結合
可能である単一の型の分子を含んでなる、請求項１６〜３１のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項３３】 サンプル中の抗原及びこの抗原を特異的に指向する抗体を
同時に測定するための固相であって、少なくとも１つの第１試験領域及び少なく
とも１つの第２試験領域を含み、 該第１試験領域が抗原に特異的に結合し得るコーティングを有し、かつ該第２
試験領域が該抗原を指向する抗体と特異的に結合し得るコーティングを有するこ
とを特徴とする固相。 - 【請求項３４】 コーティングが均一であり、かつ結合可能である単一の型
の試薬のみを含む、請求項３３に記載の固相。 - 【請求項３５】 試験領域を非多孔性支持体上に塗布する、請求項３３又は
３４に記載の固相。 - 【請求項３６】 非多孔性支持体がポリスチレン製である請求項３５に記載
の固相。 - 【請求項３７】 個々の試験領域が０．０１ないし１ｍｍの直径を有する、
請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の固相。 - 【請求項３８】 抗原及びこの抗原を特異的に指向する抗体を同時に検出す
るための免疫アッセイにおける、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の固相
の使用。 - 【請求項３９】 抗原及びこの抗原を特異的に指向する抗体を同時に測定す
るための試験キットであって、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の固相及
び標識検出試薬を含む試験キット。 - 【請求項４０】 万能検出試薬を含む、請求項３９に記載の試験キット。
- 【請求項４１】 サンプル中の分析物の検出方法であって、 （ａ）支持体及び少なくとも２つの空間的に分離された試験領域を含み、該試験
領域が各々異なる固定化分析物特異的受容体を含有する固相を提供する工程、 （ｂ）該サンプルを該固相、及びシグナル発生基を担持するか、又はシグナル発
生基に結合し得る少なくとも１種類の遊離分析物特異的受容体と接触させる工程
、並びに （ｃ）該試験領域上のシグナル発生基を測定することにより該分析物の存在又は
／及び量を検出し、それにより予め決定された試験領域に特有の閾値を上回るシ
グナルを陽性と分類し、かつ予め決定された試験領域に特有の閾値を下回る場合
には陰性と分類する工程、 を含む、上記方法。 - 【請求項４２】 試験領域のカットオフ値を各々個別に決定する、請求項４
１に記載の方法。 - 【請求項４３】 少なくとも２つの試験領域に対してカットオフ値を異なる
ように設定する、請求項４１又は４２に記載の方法。
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