JPH06265548A

JPH06265548A - 抗原と抗体の同時測定法

Info

Publication number: JPH06265548A
Application number: JP5269242A
Authority: JP
Inventors: Hubert Bayer; バイヤーヒューバート; Elke Faatz; ファーツエルケ; Michael Wiedmann; ヴィードマンミカエル
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1992-10-27
Filing date: 1993-10-27
Publication date: 1994-09-22
Also published as: AU4910893A; CA2109239A1; KR940009687A; EP0595211A1; DE4236189A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】陰性試料と陽性試料との識別を向上させた、病
原体の抗原とこの病原体に対する抗体を測定するための
イムノアッセイを提供する。【構成】ヘテロジーニアスイムノアッセイの原理に基づ
いて病原体の抗原および同じ病原体に対する少なくとも
１つの抗体を同時に測定する方法において、試料をレセ
プターＲ１〜Ｒ４と共にインキュベートする。ここでＲ
１とＲ３は測定すべき抗原と特異的に結合することがで
き、Ｒ２とＲ４は測定すべき抗体と特異的に結合するこ
とができる。Ｒ１とＲ２は固相への結合を仲介し、Ｒ３
とＲ４は同一の標識をもち、固相を液相から分離した
後、２つの相の一方において標識を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料をレセプターＲ１
〜Ｒ４と共にインキュベートし（ここで、Ｒ１とＲ３は
測定すべき抗原に特異的に結合することができ、Ｒ２と
Ｒ４は測定すべき抗体に特異的に結合することができ、
Ｒ１とＲ２は固相への結合を仲介し、Ｒ３とＲ４は同一
の標識をもつ）、液相から固相を分離し、そして２つの
相の一方に含まれる標識を測定することから成る、ヘテ
ロジーニアスイムノアッセイ（heterogeneous immunoas
say ）の原理に基づいて病原体の少なくとも１つの抗原
および同じ病原体に対する少なくとも１つの抗体を同時
に測定する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】多数の重要な臨床上のパラメーターが免
疫学的検出法により測定されている。イムノアッセイに
ついてはホモジーニアス法とヘテロジーニアス法が広く
選択される。多くの場合、サンドイッチ原理に基づいた
ヘテロジーニアス法またはそれから誘導された変法が用
いられる。試料溶液は一般に、測定すべき物質に結合す
ることができかつ標識をもつレセプター、および測定す
べき物質に特異的に結合することができかつ固相に結合
されているか又は固相への結合を仲介するレセプターと
インキュベートされる。この方法では、測定すべき物質
と標識レセプターの結合複合体が固相へのレセプター仲
介結合により固相上に形成される。固相から液相を分離
した後、２相のうちの一方において標識が検出される。

【０００３】病原体による感染を検査するためには、通
常、この病原体に対して特異的に誘導された抗体あるい
はこの病原体のある種の抗原が検出される。感染をでき
る限り確実に検出するために、抗体と抗原の測定が別個
に行われる。これらの試験法は比較的低い検出限界をも
っている。この試験法において検出限界より低い測定シ
グナルが得られる場合、この試料は陰性であると判定さ
れる。測定シグナルが検出限界より上にある場合、この
試料は陽性であると判定される。試料が陰性であるか陽
性であるかはっきりしない場合は、しばしば測定を繰り
返す必要がある。それにもかかわらず、少量の抗原また
は抗体しか含まない試料は、測定すべき個々の物質の検
出能の限界により陰性と誤って判定される。このことは
特に感染パラメーターの初期の検出にとって問題とな
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、陰性
試料と陽性試料との識別を向上させた、病原体の抗原と
この病原体に対する抗体を測定するためのイムノアッセ
イを開発することであった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】この目的は、試料を、病
原体の抗原（測定すべき抗体はこれに向けられたもので
ある）と同一でない測定すべき抗原に特異的に結合する
ことができかつ固相に結合されているか又は結合され得
る少なくとも１つのレセプターＲ１、測定すべき抗体に
特異的に結合することができかつ固相に結合されている
か又は結合し得る少なくとも１つのレセプターＲ２、病
原体の抗原（測定すべき抗体はこれに向けられたもので
ある）と同一でない測定すべき抗原に特異的に結合する
ことができかつ標識をもつ少なくとも１つのレセプター
Ｒ３、および測定すべき抗体に特異的に結合することが
できかつレセプターＲ３と同じ標識をもつ少なくとも１
つのレセプターＲ４とインキュベートし、液相から固相
を分離し、そして２つの相の一方において標識を測定す
ることから成る、ヘテロジーニアスイムノアッセイの原
理に基づいて病原体の少なくとも１つの抗原および同じ
病原体に対する少なくとも１つの抗体を同時に測定する
方法によって達成される。

【０００６】イムノアッセイによる数種類の物質（すな
わち、数種類の抗体または抗原もしくは病原体の抗原と
組み合わせた他の病原体に対する抗体）の測定法はヨー
ロッパ特許出願明細書 EP-A 0 379 216 に記載されてい
る。測定すべき物質と特異的に結合する数種類のレセプ
ターＲ１が用いられる。レセプターＲ１は固相への結合
を仲介する。さらに、測定すべき数種類の物質と結合し
得る数種類のレセプターＲ２が用いられる。レセプター
Ｒ２は異なる標識か同一の標識のいずれかを含む。異な
る標識を用いる場合は、この方法を単一相で行うことが
でき、つまりレセプターＲ２を同時に加える。同一の標
識を用いる場合は、この方法を２相で行わねばならず、
すなわち種々のレセプターＲ２を連続的に加えて、それ
ぞれの標識を連続的に測定する。このヨーロッパ特許出
願明細書 EP-A 0 379 216 は、陰性試料と陽性試料との
良好な識別を可能にする、特定の病原体の抗原とこの特
定病原体に対する抗体の同時測定法は開示していない。

【０００７】本発明によれば、病原体の抗原とこの特定
病原体に対する抗体の同時測定法が可能である。なぜな
ら、これらのレセプターが、測定すべき抗原と特異的に
結合するが測定すべき抗体に対する抗原に向けられたも
のでないレセプターＲ１およびＲ３として用いられるか
らである。測定すべき抗体により結合される抗原とも特
異的に結合するレセプターを用いるならば、抗原と抗体
の相互中和が起こるだろう。

【０００８】本発明の方法は試料中の病原体の抗原とこ
の病原体に向けられた抗体の同時検出を可能にするの
で、抗原と抗体により生じる測定シグナルが加算され
る。抗原または抗体を別々に測定する際にはボーダーラ
インのシグナル（すなわち、検出限界に近いシグナル）
をもたらし、誤って陰性と判定されうる抗原および抗体
の含有量の少ない試料が、本発明方法を用いることによ
り陽性と判定されるだろう。従って、これにより時間の
かかる反復測定を回避することができる。さらに、感染
が生じた後、より早い時期に感染患者を見つけ出して、
早期に治療を開始することが可能である。当然のことと
して感染の初期には抗原だけが検出され得ると考えられ
るので、このことは驚くべきことであった。

【０００９】レセプターＲ１〜Ｒ４を選択するとき、こ
の方法が感染の早期検出を意図している場合は、初期の
抗原（すなわち、感染後ただちに存在する抗原）に向け
られたレセプター、または試料中に高力価で感染後ただ
ちに存在する抗体に向けられたレセプターを用いること
が重要である。この方法が本発明方法による陰性試料と
陽性試料の識別を向上させることだけを意図し、感染症
の早期検出を特に意図せず、その代わり例えば感染症の
モニターを意図する場合は、感染後期まで存在しない抗
原または抗体に向けられたレセプターＲ１〜Ｒ４を使用
することも可能である。かくして、レセプターの選択は
感染症のどの時期を測定しようとしているのかに左右さ
れる。本発明方法は特に感染症の早期検出に適してい
る。

【００１０】本発明方法はヘテロジーニアスイムノアッ
セイの原理に従って行われる。表面にレセプターＲ１と
Ｒ２が直接結合されているか又は結合され得る固相が用
いられる。固相としてはプラスチック、ガラス、紙担
体、セラミック、ラテックスおよび磁性粒子のような公
知の材料を用いることができる。固相は例えば反応チュ
ーブ、試薬担持ストリップまたは球体の形状で存在し得
る。好ましい態様において、固相は反応チューブの形で
存在し、そのチューブ壁の内面が少なくとも部分的にレ
セプターＲ１およびＲ２でコーティングされているか又
はコーティングされ得る。公知の材料が反応容器の材料
として適している。ポリスチレン、ポリスチレンのコポ
リマー、ポリカーボネート、ポリアクリレートおよびポ
リメタクリレートが好適である。

【００１１】レセプターＲ１およびＲ２による固相のコ
ーティングは直接、または間接的に行われる。固相への
レセプターの直接結合法は当業者に知られている。吸着
結合が好ましい。間接的結合は、レセプターＲ１および
Ｒ２が免疫学的反応の直前または途中においてのみ固相
に結合されることを意味する。この場合は、特異的結合
対Ｐ１／Ｐ２のパートナーＰ１が固相に結合される。特
異的結合対の他方のパートナーＰ２はレセプターＲ１お
よびＲ２のそれぞれにカップリングされる。

【００１２】特異的結合対Ｐ１による固相のコーティン
グは直接、または担体物質やスペーサーを介して行うこ
とができる。例えば、反応容器の内面に吸着される分子
量５０００００以上の可溶性タンパク質への結合が好ま
しい。反応容器の内面に官能基を介して共有結合でまた
は吸着的に結合され得るスペーサーによる結合も適して
いる。そのための方法および試薬は当業者に知られてい
る。好ましい態様では、DE-A-3640412.8に記載の方法に
従って製造された担体物質が固相として用いられる。別
の好ましい態様において、固相はセルロース／合成繊維
の混合物から作られた繊維フリースを過ヨウ素酸塩で処
理して活性化し、そして予め酸で処理した特異的結合パ
ートナーＰ１をコーティングした試薬担体である。この
ような試薬担体の製造方法はドイツ特許出願明細書 DE-
A-3543749 に記載されている。

【００１３】特異的結合対Ｐ１／Ｐ２としては例えば抗
原／抗体、ハプテン／抗体、レクチン／炭水化物、ビオ
チン／抗ビオチン抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン
／ストレプトアビジンが適している。ビオチンに結合し
得るパートナー、特にストレプトアビジンまたはアビジ
ンを固相に固定化することが好ましい。固相へ直接また
は間接的に結合されるレセプターＲ１およびＲ２の量比
は広範囲にわたって変化しうる。レセプターＲ１対Ｒ２
の好ましい量比は１０：１から１：１０の間である。そ
れぞれの特別な試験のための最適な量比Ｒ１：Ｒ２は、
固相へさまざまな量のＲ１とＲ２を結合させることによ
り容易に決定することができる。固相へレセプターＲ１
およびＲ２を結合させるために特異的結合対Ｐ１／Ｐ２
を用いる場合、結合されるレセプターＲ１およびＲ２の
量比は、両レセプターの結合親和性がだいたい等しいの
で、コーティングに用いられる溶液中のレセプターＲ１
およびＲ２の混合比にほぼ一致する。レセプターＲ１お
よびＲ２を直接結合させる場合は、直接結合されるレセ
プターＲ１およびＲ２の量比がコーティングに用いられ
る溶液中のレセプターＲ１：Ｒ２の混合比と相違しても
よく、その理由はこれらのレセプターがしばしば固相に
対して異なる親和性を有するからである。これを望む場
合は、固相に結合されたレセプターＲ１およびＲ２の正
確な量比が、当業者に知られた方法に従って、例えば測
定すべき抗原および抗体の結合能を測定することによ
り、その後決定され得る。量比Ｒ３：Ｒ４もレセプター
Ｒ１：Ｒ２について選択した量比に従って選択される。
レセプターＲ３：Ｒ４の量比も１０：１から１：１０の
間にある。この場合、量比Ｒ３：Ｒ４は量比Ｒ１：Ｒ２
と同一または類似していてもよいが、異なっていてもよ
い。最適な量比Ｒ３：Ｒ４は、さまざまな量のＲ３とＲ
４を混合することによって、それぞれの試験において容
易に決定することができる。

【００１４】測定すべき抗原の結合部位を有するレセプ
ターはレセプターＲ１として用いられる。測定すべき抗
原は、測定すべき抗体により認識されかつ結合される抗
原と相違するものでなければならない。レセプターＲ１
は、測定すべき抗体によって認識されるものと異なる病
原体の抗原決定基あるいは異なるエピトープを特異的に
認識すべきである。レセプターＲ１と測定すべき抗体は
同一の結合部位に対して強く交差反応しないことが必要
である。例えば肝炎ウイルスやＨＩＶのような公知の病
原体の抗原決定基は知られている。例えば、Ｂ型肝炎ウ
イルス感染を検査するためには、Ｂ型肝炎表面抗原（Ｈ
ＢｓＡｇ）に対するレセプターがレセプターＲ１として
用いられ、同時に抗Ｂ型肝炎コア抗体（＜ＨＢｃ＞Ａ
ｂ）が測定すべき抗体として検出される。ＨＩＶ感染を
検査するためには、例えばｐ２４タンパク質と結合する
レセプターＲ１が用いられ、一方、抗ｇｐ３２、ｇｐ４
１またはｇｐ１２０抗体が測定される。病原体の抗原決
定基が知られていない場合は、同一の結合部位について
測定すべき抗体と競合しない適当なレセプターＲ１が、
交差反応性を調べる既知の予備実験に基づいて当業者に
よって選択され得る。

【００１５】病原体の異なる抗原と特異的に結合し得る
異なるレセプターの混合物もレセプターＲ１として用い
ることができる。ＨＩＶ感染の試験では、例えば抗原決
定基ｐ２４およびｇｐ３２および／またはｇｐ４１のレ
セプターが用いられる。この場合、例えば抗ｇｐ１２０
抗体が測定すべき抗体として選択される。Ｂ型肝炎ウイ
ルス感染の試験の場合は、例えばＨＢｓＡｇとＨＢｃＡ
ｇの２つのレセプターの混合物がレセプターＲ１として
用いられ、一方、測定すべき抗体はＨＢｃＡｇの他のエ
ピトープまたはＨＢｅＡｇに対して向けられる。

【００１６】測定すべき抗原と結合し得るすべてのサブ
クラスの完全な抗体をレセプターＲ１として用いること
ができる。もちろん、完全な抗体の代わりにＦａｂ、Ｆ
ａｂ’またはＦ（ａｂ’）₂フラグメントのようなそれ
らのフラグメントも使用可能である。抗体はポリクロー
ナルでも、モノクローナルでもよい。測定すべき抗体と
の交差反応性は存在すべきでないので、高度に精製され
た特異的なポリクローナル抗体を用いることが有利であ
る。モノクローナル抗体を使用することが最も好まし
い。

【００１７】本発明方法の好ましい態様において、特異
的結合対Ｐ１／Ｐ２のパートナーＰ２はレセプターＲ１
にカップリングされる。固相への固定化はパートナーＰ
１と結合するパートナーＰ２を介して行われる。パート
ナーＰ１としてはＦＩＴＣ、ｐ−ニトロフェノール、サ
ポニン、ジゴキシン、特に好ましくはビオチンのような
ハプテンを用いることが好ましい。レセプターＲ２にパ
ートナーＰ２をカップリングさせる方法は当業者に知ら
れている。

【００１８】レセプターＲ２としては、測定すべき抗体
または抗体類と特異的に結合する抗原が用いられる。病
原体の完全なまたは精製した部分、例えば抗原、原生動
物の抗原またはウイルスの抗原が当該抗原として用いら
れる。抗原は天然物質、組換え物質、あるいは化学的に
合成されたまたは修飾されたタンパク質もしくは炭水化
物から成るものであり得る。従って、例えばＨＩＶ抗体
の検査では、ｐ２４、ｇｐ４１、ｇｐ３２またはｇｐ１
２０のような異なる抗原決定基がレセプターＲ２として
用いられる。肝炎の検査では、ウイルス抗原ＨＢｃＡ
ｇ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＡＶなどが用いられ
る。上に記載したように、レセプターＲ２の選択は用い
るレセプターＲ１に依存している。

【００１９】レセプターＲ１に関して述べたように、病
原体の異なる抗原決定基に対して向けられた異なる抗体
と特異的に結合し得る種々のレセプターの混合物も同様
にレセプターＲ２として用いることができる。例えば、
ＨＩＶ感染の検査には、ウイルス抗原ｇｐ３２、ｇｐ４
１およびｇｐ１２０の混合物が用いられる。この場合、
レセプターＲ１は例えばｐ２４に対して誘導されたもの
であろう。

【００２０】レセプターＲ２は固相へ直接または間接的
に結合される。本発明方法の好ましい態様において、特
異的結合対Ｐ１／Ｐ２のパートナーＰ２がレセプターＲ
２にカップリングされる。特定の試験では、レセプター
Ｒ１にカップリングされるものと同じ物質がパートナー
Ｐ２としてレセプターＲ２にカップリングされよう。種
々の物質からのパートナーＰ２の選択およびカップリン
グは、レセプターＲ１に関して記載したように行う。

【００２１】レセプターＲ３として用いられるレセプタ
ーはレセプターＲ１と類似し、測定すべき抗原の結合部
位をもつが、測定すべき抗体と特異的に結合する抗原に
向けられたものではない。レセプターＲ１として用いた
ものと同じ抗体をレセプターＲ３として用いることもで
きる。個々の試験において、レセプターＲ３として用い
る抗体は、実施すべき測定、つまり検査すべき感染に応
じて、レセプターＲ１として用いた抗体と同一であって
も、これと異なっていてもよい。例えば、完全な抗体を
レセプターＲ１として用い、抗体フラグメントをレセプ
ターＲ３として用いることができ、両方とも同一の抗原
に特異的に結合する。レセプターＲ１とＲ３は同一抗原
に特異的に結合しなければならない。しかし、その際そ
れらは同一抗原の異なるエピトープに結合し得る。レセ
プターＲ１とＲ３は同一抗原の同じエピトープについて
競合しないことが好ましい。Ｒ１およびＲ３としてモノ
クローナル抗体を用いるとき、この条件は容易に満たさ
れよう。レセプターＲ１のときと同様に、種々のレセプ
ターの混合物もレセプターＲ３として用いることができ
る。

【００２２】レセプターＲ３はさらに標識をもつ。本発
明方法に適したラベリング法が数多く知られている。例
えば、¹²⁵Ｉ、¹²¹Ｉ、⁵¹Ｃｒ、³⁵Ｓおよび³Ｈのような
放射活性アイソトープ、ペルオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵
素、蛍光または化学発光物質、もしくは他の方法で検出
し得る物質を使用することができる。レセプターＲ３は
また、直接標識のほかに、試験の間にレセプターＲ３と
結合し得る標識成分をこのレセプターに結合させること
により間接標識をもつこともできる。例えば、レセプタ
ーＲ３のＦｃ部分と結合する標識抗体が用いられる。ハ
プテン抗体結合によるカップリングが好ましい。この場
合、ジゴキシンのようなハプテンがレセプターにカップ
リングされる。抗ジゴキシン抗体−ペルオキシダーゼ結
合体のような標識した抗ハプテン抗体がハプテンと結合
する。

【００２３】測定すべき抗体と特異的に結合することが
でき、かつレセプターＲ３と同じ標識をもつレセプター
がレセプターＲ４として用いられる。Ｒ３において規定
されたものと同じ検出可能な物質を標識として用いるべ
きである。レセプターＲ２として用いられる同一の抗原
をレセプターＲ４として用いることができる。レセプタ
ーＲ２の場合のように、種々のレセプターの混合物もレ
セプターＲ４として用いられよう。

【００２４】本方法の変法において、測定すべき抗体を
特異的に認識する抗体またはそのフラグメントがレセプ
ターとして用いられる。この変法には２つの可能性があ
る。第一の可能性は、測定すべき抗体のみを特異的に認
識し、レセプターＲ１およびＲ３と結合しない抗体をレ
セプターＲ４として用いることである。これは、例えば
ヒト抗体を特異的に認識する抗体をレセプターＲ４とし
て用い、そしてヒト由来でない抗体（例えばマウス抗
体）をレセプターＲ１およびＲ３として用いることによ
り達成される。

【００２５】第二の変法では、測定すべき抗体およびレ
セプターＲ３を特異的に認識するがレセプターＲ１を認
識しない抗体がレセプターＲ４として用いられる。例え
ば、抗体のＦｃ部分と特異的に結合する抗体、好ましく
はＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントをレセプターＲ４
として用いる。この場合、もはやＦｃ部分を含まない抗
体フラグメントをレセプターＲ１として用いる。レセプ
ターＲ３としては、この場合、完全な抗体を用いる必要
がある。従って、レセプターＲ３はこれに直接カップリ
ングされた標識をもたないが、その代わり標識をもって
いるレセプターＲ４への結合を介して標識を受け取る。
かくして、レセプターＲ３は間接標識をもつ。

【００２６】レセプターＲ３がレセプターＲ４の結合に
よってインキュベーション中に架橋されないように、レ
セプターＲ４として１価の抗体フラグメント、例えばＦ
ａｂまたはＦａｂ’フラグメントを用いることが好まし
い。最初に、試料をレセプターＲ１、Ｒ２およびＲ３と
インキュベートすることが好ましい。固相に結合した複
合体が形成された後に過剰のレセプターを予め除去し、
次にレセプターＲ４とインキュベートし、その後標識を
測定する。

【００２７】試料溶液はすべてのレセプターと同時にイ
ンキュベートすることができる。Ｒ３とＲ４が直接標識
されておりかつレセプターＲ１とＲ２が固相に直接結合
されている場合は、同時インキュベーションが好まし
い。レセプターＲ１とＲ２が固相に間接的に結合される
場合は、初めにこれら２つのレセプターと固相をプレイ
ンキュベートする。続いて、試料をレセプターＲ３およ
びＲ４と共にインキュベートする。その他の変法も可能
で、それらは当業者に知られている。簡便な手法のため
に自動アナライザによる測定の実施が可能である。この
方法は迅速な診断にも適している。感染パラメーターの
抗原および抗体の同時検出の結果、この危険パラメータ
ーを含む血液試料を、より精密な診断の必要性なしに、
すぐに取り除くことが可能である。他方、検査では、危
険因子が存在するか否かを前もって調べるために迅速な
試験が用いられ、そしてこれがその事例である場合は、
これに続いてより精密な診断（例えばＤＮＡテスト）を
行うことができる。従って、本発明によれば、疾患の特
定の指標が存在するか否かをきわめて迅速に調べること
が可能である。

【００２８】本発明方法を用いると、病原体の少なくと
も１つの抗原および同一病原体に結合し得る少なくとも
１つの抗体を同時に検出することができる。これに関し
て、血液中において抗原および抗体価を検出し得るあら
ゆる病原体、特に肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢ
Ｖおよび他のヒトウイルスのようなウイルス、原核生物
および真核生物病原体、並びに原生動物が病原体または
感染パラメーターとして考慮される。

【００２９】本発明はまた、レセプターＲ１およびＲ２
が表面に結合されているか又は特異的結合対Ｐ１／Ｐ２
の相互作用により結合され得る固相、それぞれの場合に
上で定義したような少なくとも１つのレセプターＲ１、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４、所望により、ヘテロジーニアス
イムノアッセイを行うための慣用補助剤（例えば緩衝
剤、界面活性剤、干渉を除く物質、安定剤）、並びに、
所望により、ＡＢＴＳ（登録商標）のような標識（例え
ば酵素−基質）測定用の薬剤を含む、病原体の抗原およ
び同じ病原体に対する少なくとも１つの抗体を測定する
ための試薬に関するものである。

【００３０】本発明を以下の実施例により詳しく説明す
ることにする。

【００３１】

【実施例】実施例１ＨＩＶ−Ａｇ／抗ＨＩＶ試験ＨＩＶ抗原（ｐ２４抗原）と抗ＨＩＶ抗体（抗ｇｐ３
２、抗ｇｐ４１および抗ｇｐ１２０）を偽２段階イムノ
アッセイで測定した。試薬１： − ４０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０ − １重量％のノニデット（Nonidet:登録商標）Ｐ４０試薬２： − ４０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０ − ０．９重量％のＮａＣｌ − ０．２重量％のウシ血清アルブミン − １００ｎｇ／ｍｌずつの１種または数種のビオチニ
ル化ＨＩＶ抗原（ｇｐ３２、ｇｐ４１またはｇｐ１２
０）５０ｎｇ／ｍｌずつの１種または数種のジゴキシン標識
ＨＩＶ抗原（ｇｐ３２、ｇｐ４１またはｇｐ１２０） − １５０ｎｇ／ｍｌのビオチニル化抗ＨＩＶｐ２４抗
体 − ７５ｎｇ／ｍｌのジゴキシン標識抗ＨＩＶｐ２４抗
体 − １５０ｍＵ／ｍｌの抗ジゴキシン抗体−ペルオキシ
ダーゼ結合体この方法では次の抗原を用いた： − 化学的に合成したペプチド − ＨＩＶＩｇｐ１２０（Ｖ３ループ）（EP-A 0
311 219） − ＨＩＶ II ｇｐ４１（Gnann, J.W. et al., Sc
ience 237,1987, 1346） − ＨＩＶ III ｇｐ３２（EP-A 0 379 216）抗体として精製したヒトポリクローナル抗ｐ２４抗体
（Innogenetics社）を用いた。

【００３２】抗原および抗体は Leary et al., PNAS, 8
0 (1983), 4045に記載されるようにビオチンまたはジゴ
キシンで標識した。試験はヨーロッパ特許出願明細書 E
P-A 0 379 216 に記載されるようなストレプトアビジン
サーモ−ＢＳＡポリスチレンチューブ内で行った。
ストレプトアビジンサーモ−ＢＳＡポリスチレンチ
ューブ内で１００μｌのヒト血清または血漿を２００μ
ｌの試薬１と３７℃、６０分間インキュベートした。次
に、７００μｌの試薬２を加え、３７℃で１２０分間イ
ンキュベートした。その後これを水道水で３回洗い、試
験反応のために１ｍｌのＡＢＴＳ（登録商標）基質溶液
を加えた。３７℃で６０分間インキュベートした後、４
２２ｎｍで吸光度を測定した。

【００３３】抗ＨＩＶ試験はそれぞれのＨＩＶ抗原およ
び全部のＨＩＶ抗原の組合せを用いて行った。これを行
う場合、抗体が同一のウイルスに向けられたものか、数
種のウイルスまたはそれらの抗原に向けられたものかに
かかわりなく、そして検出される抗原が１種のウイルス
株に属するか、数種のウイルス株に属するかにかかわり
なく、ストレプトアビジンサーモ−ＢＳＡ結合体ポ
リスチレンチューブを用いた試験法が、数種のそれぞれ
の抗体または抗体集団および抗原の同時測定に適してい
ることが判明した（表１）。

【００３４】

【表１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ミカエルヴィードマンドイツ連邦共和国Ｄ−82377 ペンツバークインデアオー 11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヘテロジーニアスイムノアッセイの原理
に基づいて病原体の少なくとも１つの抗原および同じ病
原体に対する少なくとも１つの抗体を同時に測定する方
法であって、(I) 病原体の抗原と同一でない測定すべ
き抗原に特異的に結合することができ、かつ固相に結合
されているか又は結合され得る少なくとも１つのレセプ
ターＲ１、(II) 測定すべき抗体に特異的に結合するこ
とができ、かつ固相に結合されているか又は結合され得
る少なくとも１つのレセプターＲ２、(III) 病原体の抗
原（測定すべき抗体はこれに向けられたものである）と
同一でない測定すべき抗原に特異的に結合することがで
き、かつ標識をもつ少なくとも１つのレセプターＲ３、
(IV) 測定すべき抗体に特異的に結合することができ、
かつレセプターＲ３と同じ標識をもつ少なくとも１つの
レセプターＲ４、と共に試料をインキュベートし、液相
から固相を分離し、そして２つの相の一方において標識
を測定することから成る、上記方法。
【請求項２】レセプターＲ１およびＲ３のそれぞれが
測定すべき病原体の異なる抗原に特異的に結合すること
ができる異なるレセプターの混合物である、請求項１記
載の方法。
【請求項３】レセプターＲ２およびＲ４のそれぞれが
測定すべき抗体に特異的に結合することができる異なる
レセプターの混合物である、請求項１または２記載の方
法。
【請求項４】特異的結合対Ｐ１／Ｐ２のパートナーＰ
２がレセプターＲ１およびＲ２にカップリングされ、特
異的結合対のパートナーＰ１が固相に結合され、そして
レセプターＲ１およびＲ２がＰ１とＰ２との特異的結合
により固相に結合される、請求項１−３のいずれか１つ
に記載の方法。
【請求項５】レセプターＲ３およびＲ４が間接標識を
もつ、請求項１−４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】病原体の少なくとも１つの抗原および同
じ病原体に対する少なくとも１つの抗体を測定するため
の試薬であって、(I) レセプターＲ１およびＲ２が表
面に結合されているか又は結合され得る固相、(II) 病
原体の抗原と同一でない測定すべき抗原に特異的に結合
することができ、かつ固相に結合されているか又は結合
され得る少なくとも１つのレセプターＲ１、(III) 測定
すべき抗体に特異的に結合することができ、かつ固相に
結合されているか又は結合され得る少なくとも１つのレ
セプターＲ２、(IV) 病原体の抗原（測定すべき抗体は
これに向けられたものである）と同一でない測定すべき
抗原に特異的に結合することができ、かつ標識をもつ少
なくとも１つのレセプターＲ３、(V) 測定すべき抗体
に特異的に結合することができ、かつレセプターＲ３と
同じ標識をもつ少なくとも１つのレセプターＲ４、およ
び(VI) 任意の他の慣用補助剤を含む、上記試薬。