JPH08511104A - イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 検体の捕捉される抗体を捕捉される抗体に特異的なプローブで検出する改良ウエスタンブロット法。捕捉試薬としては、検出しようとする抗体に特異的なライゼート、組換え蛋白質または合成ペプチドのいずれでも使える。本法を実行するための検査キットも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 イムノアッセイ 発明の背景 本発明は、検体中の特異的結合対メンバー、好ましくは抗体の存在を決定する 方法に関する。より詳しくは、改良ウエスタンブロット法により検体中の特異的 結合対メンバーの検出に関する。 ヒトの免疫系は、感染に応答して様々な抗原に対する抗体を生成する。抗体の 数および生成された各抗体の量は、抗体（免疫）応答を開始させる感染因子およ び特定の抗原によって決まる。感染因子に対する免疫応答を検出することは、ｉ ｎ ｖｉｔｒｏ診断における重要な方法である。この方法は、提供された単位血 液中のこれらの感染因子に対する抗体を検出する際、また急性および慢性の感染 を診断するためにこれらの因子が存在するかどうか体液を検査する際に特に有用 である。このような検査は、典型的には問題の因子に対する抗体を含んでいる疑 いがある体液などの検体を、問題の因子から得た既知の抗原に接触させることか ら始まる。抗原は通常、固相材料上に固 定して、検体から分離しやすく、またその後の処理がしやすいようになっている 。固相と検体をインキュベートした後に、結合していない物質を取り除き、次い で検出可能で測定可能な標識物質で標識した特異的抗ヒト免疫グロブリン（いわ ゆる結合体）と２番目のインキュベーションを行って結合した抗体を検出するの がふつうである。インキュベートした後に、結合していない物質を取り除き、結 合した標識複合体を検出可能な信号を測定して検出する。これら最初の検査（い わゆるスクリーニング検査）で使用する抗原としては、精製ライゼートまたは組 換え蛋白質を使用できる。 ただし、これらのスクリーニング検査では非特異的反応性があることがわかっ ている。たとえば、Ｊ．Ｅ．ＭｅｎｅｔｏｖｅらによるＬａｎｃｅｔ１２１３号 （１９８７年１１月２１日）、Ｄ．ＢａｒｎｅｓによるＳｃｉｅｎｃｅ２３８巻 ８８４〜８８５頁（１９８７年）、Ａ．ＰｕｃｋｅｔｔらによるＬａｎｃｅｔ７ １４号（１９８８年３月２６日）を参照されたい。非特異性の一部は、これら感 染因子のライゼートに存在する正常なヒト抗原との免疫反応性に起因する。正常 ヒト抗原（細胞蛋白質不純物）は、感染因子を増殖させるのに使用する 組織培養細胞やその他の培養基に由来し、これらが部分的精製ライゼートの主要 成分となっている。たとえば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の主要表面抗原 であるｇｐ１２０、ならびにＨＩＶ貫膜抗原ｇｐ４１は、ウイルス精製中に容易 に失われてしまう。Ｈ．ＧｅｌｄｅｒｂｌｏｏｄらによるＶｉｒｏｌｏｇｙ１５ ６巻１７１〜１７６頁（１９８７年）を参照されたい。したがって、これらのＨ ＩＶエンベロープ抗原はウイルスライゼート中には十分に現れないことが多い。 たとえばＨＩＶスクリーニング検査などのスクリーニング検査では非特異的反応 が生じることがわかっているので、これらスクリーニング検査で得られた反応結 果の確証を得るために、たいていは確認検査が必要になる。 このような確認検査を行うためのプロトコルでは、典型的にはスクリーニング 検査を繰り返し行って検体が反応することを確かめてから、この繰り返し反応し た検体を対象にウエスタンブロット（ＷＢ）検査を行って反応性を確認する。ウ エスタンブロット検査で反応ありとみなすには、通常は複数の抗原に対して反応 性を示す必要がある。したがって、「真に」抗体陽性である試料を確認するには 、単一の抗原に対する反応性がある だけでは十分でない。ＷＢ検査でも反応性を示す検体のみが、調べている感染因 子について陽性であることが確認されたとみなされる。 標準的なウエスタンブロット検査については、Ｇｏｒｄｏｎらが米国特許第４ ，４５２，９０１号明細書で述べている。この検査では、まず最初に還元条件下 でＳＤＳ−ＰＡＧＥによってウイルスライゼートの抗原をサイズ別に分離する。 それからゲル中の抗原の不可視バンドを電気泳動によってニトロセルロースシー ト上に転移させる（トランスブロットする）。このシートをバンドに対して垂直 にカットしてストリップを作る。このストリップを個々の検体と反応させ、抗グ ロブリン結合体および適当な酵素標識を使って反応性抗体を検出する。その結果 生じた発色反応から、抗原に対して検体が血清陽性であるその抗原を表す染色バ ンドのパターンができる。したがって、ＷＢ検査は個々の抗体に反応性を有する ウイルスライゼート中の抗原を視覚的に分離できるという点で、スクリーニング 検査よりも優れている。さらに、バンド間領域における非ウイルス反応も確認し たり無視したりすることができる。 ＷＢ検査は従来のスクリーニング検査よりも詳述した優れ た点はあるものの、ＷＢ検査にも欠点がある。たとえば、Ｇ．Ｂｉｂｅｒｆｅｌ ｄらによるＬａｎｃｅｔｉｉ巻２８９〜２９０頁（１９８６年）、Ｃ．Ｌ．Ｖａ ｎ ｄｅ ＰｏｅｌらによるＬａｎｃｅｔｉｉ巻７５２〜７５４頁（１９８６年 ）、Ａ．Ｍ．ＣｏｕｒｏｕｃｅらによるＬａｎｃｅｔｉｉ巻９２１〜９２２頁（ １９８６年）を参照されたい。ＷＢ検査など従来からの免疫ブロット法は、ウイ ルスライゼートの抗原性濃度が変化しうるので再現性がない。さらに、ＷＢ検査 は感度、特にＨＩＶエンベロープ（ＥＮＶ）抗原に関して感度がないと報告され ている。たとえば、Ａ．ＳａａｈらによるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２５９巻 １６０５〜１６１０頁（１９８７年）、Ｐ．Ｐ．ＭｏｒｔｉｍｅｒらによるＬａ ｎｃｅｔ ３３７巻２８６〜８７頁（１９９１年）、Ｆ．ＳｉｍｏｎらによるＬａ ｎｃｅｔ ３４０巻１５４１〜１５４２頁（１９９２年）を参照されたい。ＷＢ検 査では、検体の抗体が固定化された蛋白質または固相マトリックスのいずれかと 非特異的に反応すると、多くの非特異的反応や偽陽性の高い値が生じる。さらに 、部分的に開裂された、あるいは開裂されていないウイルス前駆体蛋白質のいず れかに一部起因する反応性の余分なバンド、ならび に軽微な反応バンドが、調節蛋白質が存在するために見られることもある。たと えば、Ｓ．Ｚｏｌｌａ−ＰａｚｎｅｒらによるＮｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３２０巻１８〜１９頁（１９８９年）を参照されたい。さらに、抗ヒトグロブリ ンなど、マトリックス材料自体と非特異的にしか結合しない結合体ではバックグ ラウンド信号が大きくなることもある。このような非特異的信号があると、使用 可能な結合体の濃度によって検出が制限されるので、大部分の抗グロブリン検査 法の感度が実際上制限されてしまう。結合体の有用濃度がバックグラウンド信号 によって制限されるわけである。同様に、抗グロブリン結合体、そして特に単一 特異性抗体を使用すると、最適信号よりも低くなり、結合体があらゆるクラスの グロブリンを同等の親和性で検出することができなくなりうる。さらに、ＷＢ検 査は抗体の異なる特異性を判別できないので、この技術は全般的な抗グロブリン 検出法に限定される。ウイルスライゼートの代わりに組換え蛋白質を利用すると 、こうしたライゼートを使用した場合の問題点を防ぐことができる。ただし、新 しい不純物および変性した抗原性フラグメントが存在するためにまた別の問題が 生じることがある。たとえば、共通の所有権を有 し、引用により本明細書に含まれるものとする米国特許第５，１２０，６６２号 明細書を参照。 標準的なＷＢ技術の改善がこれまで試みられてきている。たとえば、英国特許 出願公開第２１９３３１５号明細書は、レトロウイルスに対する抗体を検出する 方法では偽陽性や偽陰性が生じることを明らかにし、信号生成系が２成分から成 る系で性能を改善できるような改良ＷＢブロット法について述べている。さらに 、欧州特許出願公開第２９６３９８号明細書は、金属コロイド標識したプロテイ ンＡを使って固定化試料抗体を検出する改良ＷＢ法について明らかにしている。 欧州特許第３９７１２９号明細書はさらに、単一固相担体上に複数の抗原または 抗体あるいはその両者を同時に転移することを含むＷＢイムノアッセイを開示し ている。 単一のアッセイで複数の抗原を使用することも述べられている。ＬｉｎらはＪ ．Ｖｉｒｏｌ． ５９巻５２２〜５２４頁（１９８６年）で、同一のウエスタンブ ロット検査でエプスタイン−バールウイルスと別のヘルペスウイルスの抗原を確 認できる二重抗体プローブ技法について述べている。単一のウエスタンブロット 検査で複数の検出方法を利用することも可能であ る。ＬｅｅらはＪ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１０６巻２７〜３０頁（１９ ８８年）で、プローブ抗体、酵素結合発色抗体および酵素基質を連続的に使用し て、単一のウエスタンブロット検査で２種類以上のインターフェロンを検出する 技法について述べている。異なる酵素結合発色抗体の混合液を使用する複数種類 のプローブ抗体を同時に適用してから異なる基質を次々と適用することで、同じ 結果を得ることができる。 Ｇｏｒｄｏｎらによる欧州特許第００６３８１０号明細書（１９８２年３月１ １日発行）では、固相担体に結合した抗原または抗体あるいは両者を含んで成る 免疫アッセイ装置およびキットについて記載している。ここで述べられている固 相担体を使用すると、１回の操作で多数の抗体抗原反応を同時に行うことが可能 である。Ｇｏｒｄｏｎらは、ピペットまたは注射器を使って固相担体表面に抗原 または抗体の溶液を１回または連続的に適用することを述べている。好ましい実 施態様では、抗原は抗原溶液少量を加えて作成したマイクロドットとして適用す る。 Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓの国際公開第８７／０３９６５号明細書（１９８７年７月 ２日公開）では、複数の同時アッセイ用の検 査ストリップについて述べている。検査ストリップはニトロセルロースに抗体を 付着させ、それをストリップにカットし、不活性物質で裏打ちしたものである。 担体シートを抗原ペプチド溶液に浸してから、そのシートをカットしてストリッ プを作成することについても説明している。 米国特許第５，０６１，６１９号明細書では、抗原−標識抗体複合体を使って 単一の特異的に固定化した抗体を検出することについて記載している。ただし、 標識抗体−抗原複合体の形成が問題の抗体が複合体に結合するのを妨げることが ないように、抗原が十分な大きさ（すなわち高分子）でなければならない。した がってここに述べられている方法の利用は、反復エピトープを有する高分子抗原 だけときわめて限られてしまう。さらに、これは大部分の抗体特異アッセイには ことさら適したものというわけではなく、特に小型抗原を使用したりオリゴペプ チドを基礎とするもの、及び／または非反復エピトープを使用するものには適し ていない。 したがって、特にウイルス感染の領域では、異なる抗体集団を特異的かつ高感 度で検出するための手段を提供する必要がある。現在利用できる技術で空隙を埋 めようと試みられてきては いるが、様々な試みがなされてはいるものの完璧に成功しているものはまだない 。発明の要約 本発明は、検体中に存在する疑いのある１ないし複数の特異的抗体を検出する ための方法を提供し、その方法は、（ａ）検体を１つ以上の抗原を含有するマト リックスに抗原／抗体複合体を形成するに十分な条件下で十分な時間にわたり接 触させ、ここでその抗原は当該マトリックス上で互いに空間的、物理的に分離さ れており、（ｂ）ステップ（ａ）で形成される抗原／抗体複合体を指示試薬に接 触させ、ここでその指示試薬は、検出可能で測定可能な信号を生成することので きる信号生成化合物に結合した、抗体に特異的なプローブを含んで成り、さらに （ｃ）検体中に抗体が存在することを示すものとしての測定可能な信号を検出す ることから成る。抗原およびプローブは、それぞれライゼート、組換え蛋白質ま たは合成ペプチドを含んで成ることができる。ＨＩＶ特異抗体を検出するための 好ましい実施態様では、抗原はＨＩＶ−１ｐ２４、ＨＩＶ−１ｇｐ４１、ＨＩＶ −１ｐ４１、ＨＩＶ−２ｇｐ３６およびＨＩＶ−２ｐ３６から成る群から選択す ることができる。本発明は、ＨＩＶ に対する抗体の検出だけでなく、あらゆるレトロウイルスまたは肝親和性ウイル スに対する抗体の検出にも有用である。後者の場合、本発明は特にＨＢＶおよび ＨＣＶに対する抗体の検出と同定に有用である。別の実施態様では、各抗原を検 出できる各指示試薬を異なる信号生成化合物で標識してこの方法で使用し、また これらの信号生成化合物は発光化合物、化学発光化合物、酵素、比色化合物また は色原体化合物から成る群から選択できると考えている。信号生成化合物はさら に、ビオチン／抗ビオチン、ビオチン／ステプトアビジン、フルオレセイン／抗 フルオレセインのようなハプテン／抗ハプテン結合対を含んで成ることができる 。 検体中の１ないし複数の抗体を検出するための検査キットも提供される。検査 キットは、（ａ）検出しようとする抗体に特異な捕捉抗原、および（ｂ）検出可 能で測定可能な信号を生成することのできる信号生成化合物に結合した、検出し ようとする抗体に特異なプローブを含む指示試薬から成る。抗原は、ライゼート 、組換え蛋白質または合成ペプチドでもよい。好ましい方式では、ライゼートは ＨＩＶ−１ｐ２４、ＨＩＶ−１ｇｐ４１、ＨＩＶ＝１ｐ４１、ＨＩＶ−２ｐ３６ およびＨＩＶ−２ ｐ３６から成る群から選択される抗原を含有するＨＩＶライゼートとすることが できる。さらに、ＨＣＶ抗体検出の場合には、構造的ゲノム領域および非構造的 ゲノム領域を表す抗原が好ましい。たとえば、コア、３３ｃ、ｃ−１００、Ｅ１ ／Ｅ２およびＮＳ５領域であるＨＣＶ抗原が好ましい。指示試薬の信号生成化合 物は、発光化合物、化学発光化合物、酵素または色原体化合物でよい。信号生成 化合物はさらに、ビオチン／抗ビオチン、ビオチン／ステプトアビジン、フルオ レセイン／抗フルオレセインのようなハプテン／抗ハプテン結合対を含んで成る ことができる。図面の簡単な説明 図１および図２は、この発明（「本発明」）の方法を従来の技術の方法（「標 準的方法」）と比較するフローダイアグラムである。 図３、図４、図５、および図６では、本発明の方法で得られたブロットの写真 である。発明の詳細な説明 既知のスクリーニングおよびＷＢ確認検査の問題点を回避するためのアッセイ システムを設計した。本発明は、感染の血清 検出および感染の確認に適した免疫ブロットシステムの新しい応用法である。感 染因子、組換えＤＮＡ源または合成ペプチドのいずれかから高度に精製された診 断的に重要な抗原を固相担体に固定化し、抗原が空間的、物理的に分離されてい るようにする。これらの抗原の１つまたは複数に対する抗体を含有している疑い のある検体をこうして調製したマトリックスに接触させ、抗原／抗体複合体を形 成するに十分な条件下で十分な時間だけインキューベートさせる。患者の試料は あらかじめ希釈してからマトリックスに接触させることができる。マトリックス に結合する抗原／抗体複合体であれば何であれ、検出可能で測定可能な信号を生 成することのできる信号生成化合物に結合した、抗原などの抗体に結合する特異 的プローブを含んで成る１ないし複数の指示試薬を、連続的にまたは単一の反応 ステップで、抗原／抗体／指示試薬複合体を形成するに十分な条件下で十分な時 間だけマトリックスに接触させることによって検出される。検出される信号は、 特異的に結合する抗体を示すものである。この反応手順（「本発明」）を図１に 示し、現在使われている方法（「標準的方法」）と比較する。 抗原マトリックスは、従来からのＷＢ法により、あるいは固 相（固相担体）上に抗原を直接付着させることにより作製できる。プローブは、 信号生成化合物（以下で説明）で直接標識するか、あるいはその後に第２の結合 薬と反応することで検出できる部分（すなわち抗ビオチンの付いたビオチン標識 、ステプトアビジンが付いたビオチン標識）で標識することによって作製できる 。ビオチン／抗ビオチン系をアッセイに使用するというのは、公開された欧州特 許出願第０１６０９００号明細書（１９８５年１１月１３日公開）の主題である 。抗原は、ウイルスライゼートの作製と同時に自然に発生することができ、組換 え抗原または合成ペプチドも使用できる。便宜のために、抗原の命名“ｇｐ”と はグリコシル化された抗原調製物（糖蛋白）を指し、“ｐ”とは非グリコシル化 蛋白質を指すものとする。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）などの細菌宿主は非グリコシ ル化蛋白を産生するが、酵母などの宿主はグリコシル化蛋白を産生できることは 、当業界公知である。したがって、ｐ４１という名称はＥ．ｃｏｌｉなどの細菌 宿主で組換えにより作製された抗原であることを示し、ＨＩＶ−２ｐ３６という 名称はＥ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主で作製された抗原調製物であることを示す。 同様に、捕捉相およびプローブ相で異なる入手源からの 抗原を使用することも考えられている。たとえば、固定化（捕捉）抗原をウイル スライゼートから得て、プローブは組換えＤＮＡ技術または合成オリゴペプチド から作製するということができる。 さらに、抗原マトリックスは、複数起源の抗原で作製してもよい。たとえば、 ＨＢＶおよびＨＣＶの抗原など肝親和性ウイルスを同一の固相上で検査すること ができる。この方法を図２に示す。信号の特異度は、固定化抗原ではなくプロー ブによって決まる。本発明のこの実施態様では、様々な標識戦略を様々なプロー ブ抗原と組み合わせて使用することができ、それによって抗体の「ファミリー」 を検出できるようにしている。 ここでいう「特異的結合メンバー」とは、特異的結合対のメンバーのことであ る。すなわち、２つの分子のうち１つが化学的または物理的手段によりもう１つ の分子に特異的に結合しているような２つの分子のことである。したがって、一 般のイムノアッセイの抗原および抗体特異的結合対に加えて、ビオチンとアビジ ン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子とレセプ ター分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素などの他の特異的結合対を含むこと ができる。さらに、 特異的結合対には、本来の特異的結合メンバーの類似体であるメンバー、たとえ ば分析物類似体を含むことができる。免疫反応性特異的結合メンバーとしては、 抗原、抗原フラグメント、モノクロナールとポリクロナールの双方の抗体および 抗体フラグメント、また組換えＤＮＡ法により作製したものも含めたその複合体 などがある。 ここでいう「分析物」とは、検体中に存在しうる検出すべき物質のことである 。分析物は、それに対して自然に発生する特異的結合メンバー（たとえば抗体） が存在する物質、あるいはそれに対して特異的結合メンバーを作製できるような 物質であれば何でもよい。したがって、分析物とはアッセイにおいて１ないし複 数の特異的結合メンバーと結合することのできる物質である。「分析物」には、 あらゆる抗原性物質、ハプテン、抗体、およびそれらの組合わせも含まれる。分 析物は、特異的結合対のメンバーとして、ビタミンＢ₁₂測定用の捕捉試薬または 指示試薬あるいはその両者中で内因子蛋白質を使用する、あるいは炭水化物測定 用の捕捉試薬または指示試薬あるいはその両者中でレクチンを使用するなど、自 然に存在する特異的結合パートナー（対）を利用して検出することができる。分 析物とし ては、蛋白、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的 で投与される薬剤や禁止されている目的で投与する薬剤、細菌、ウイルス、およ び上記の物質の代謝物または上記物質に対する抗体がある。 検体は哺乳動物の生体液でよく、たとえば全血あるいは全血成分、すなわち赤 血球、リンパ球またはリンパ球分画を含む白血球、血小板、血清、血漿など、腹 水、唾液、糞便、脳脊髄液、尿、喀痰、気管吸引液、その他の生体構成分で問題 の分析物を含んでいるか、もしくは含んでいる疑いのあるものである。検体は、 培養液上清、あるいは培養細胞の懸濁液でもよい。本発明に従ってＨＩＶ抗原分 析物またはＨＩＶ抗体分析物がないか体液を定量分析できる哺乳動物としては、 ヒトおよび霊長類があるが、これら問題の分析物を含有している疑いのある他の 哺乳動物も入る。非生体液試料も利用できることを想定している。 指示試薬は、各分析物の特異的結合メンバーに結合する信号生成化合物（標識 ）を含んで成る。指示試薬は、検体中の分析物の量に比例したレベルで検出可能 かつ測定可能な信号を生成する。各指示試薬は、異なる分析物の特異的結合メン バーを含んで成るが、検出可能な信号を生成できる同一の信号生成化合 物（標識）または異なる信号生成化合物（標識）のいずれかに結合している。一 般に、指示試薬は固相材料上に捕捉された後に検出または測定される。本発明の 実施にあたっては、様々な信号生成化合物を利用できるようにすることを想定し ている。したがって、たとえば信号生成化合物として様々な蛍光化合物を指示薬 それぞれについて１つずつ利用できるようにし、異なる波長で読み取ることによ って検出を行うことができる。あるいは、アクリジニウム化合物またはフェナン トリンジウム化合物などの短寿命化学発光化合物と、ジオキセタンなどの長寿命 化学発光化合物とを利用して、異なる分析物について異なる時期に信号を発生さ せることができる。異なる時期に信号を生成することのできる２つ以上の化学発 光化合物を利用することを詳しく述べた方法は、同時係属中の米国特許出願番号 ６３６，０３８号明細書の主題であり、これは本出願と共通の所有権を有しまた 引用により本明細書に含まれるものとする。アクリジニウムおよびフェナントリ ジニウム化合物については、たとえば欧州特許出願第０２７３１１５号明細書（ １９８８年７月６日公開）に述べられている。 指示試薬の特異的結合メンバーは、特異的結合対の抗原また は抗体メンバーのいずれかであるのに加えて、特異的結合対のメンバーであるこ ともできる。すなわち、ビオチンまたはアビジン、炭水化物またはレクチン、相 補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子またはレセプター分子、酵素補因子ま たは酵素、酵素阻害剤または酵素などのいずれかでありうる。免疫反応性特異的 結合メンバーは、抗体、抗原、あるいは抗体／抗原複合体など、サンドイッチア ッセイにおけるように分析物、競合アッセイにおけるように捕捉試薬、あるいは 間接アッセイにおけるように補助的特異的結合メンバーのいずれかに結合するこ とのできるものでありうる。抗体を使用する場合は、モノクロナール抗体、ポリ クロナール抗体、抗体フラグメント、組換え抗体、抗イディオタイプ抗体、キメ ラ抗体、その混合物、あるいは抗体と他の特異的結合メンバーの混合物のいずれ でもよい。このような抗体の調製方法および特異的結合メンバーとして使用する のに適切かどうかは、当業界公知である。 指示試薬の信号生成化合物（標識）は、外部の手段によって検出可能な測定可 能信号を生成することができる。信号生成化合物（標識）としては、色原体、酵 素などの触媒、たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ およびＢ −ガラクトシダーゼなど、またフルオレセインやローダミンなどの発光化合物、 アクリジウム化合物、フェナントリジニウム化合物、ジオキセタン化合物などの 化学発光化合物、放射性元素、金属（たとえば金、銀、ニッケル、鉄など）など の比色化合物、ならびに直接可視標識など多様なものが考えられている。どの標 識を選ぶかは重要ではないが、それ自体であるいは１ないし複数の追加物質と結 合して信号を生成できるものにする。標識または特異的結合メンバーのいずれか を変化させることによって、多様な指示試薬を作製することができる。 本発明の捕捉試薬は、固相に付着させてあって標識していない問題の分析物そ れぞれについての特異的結合メンバーを含んでいる。最も好ましい実施態様では 、特異的結合対の抗体メンバーは、検出しようとする分析物であり、特異的結合 対メンバーの抗原メンバーが捕捉試薬である。捕捉試薬は、アッセイを実施する 前に固相材料に直接または間接的に結合させることができ、これによって検体か ら固定化複合体を分離できるようになる。このように付着させるには、たとえば 捕捉試薬特異的結合メンバーを吸着または共有結合によって固相に被覆させる。 被覆法やその他の既知の付着手段は、当業界で公知である。 捕捉試薬の特異的結合メンバーは、別の１分子と特異的に結合できる分子であ れば何でもよい。捕捉試薬の特異的結合メンバーは、抗体、抗原、または抗体／ 抗原複合体などの免疫反応性化合物でありうる。抗体を使用する場合は、モノク ロナール抗体、ポリクロナール抗体、抗体フラグメント、組換え抗体、その混合 物、あるいは抗体と他の特異的結合メンバーの混合物のいずれでもよい。 分析できる抗原または抗原のエピトープの数を限定するのは固相担体のサイズ だけであり、その多様性や組成には制限がない。たとえば、１ないし複数のウイ ルスライゼート、組換え蛋白またはペプチドあるいはその両者に由来する抗原を 、単一のアッセイで組み合わせることができる。単離源が異なるがサイズが似て いる抗原であれば、異なるゲルから１つの固相担体上の異なる別個の領域（部位 ）に転移させることができるので可能である。還元感受抗原または還元依存抗原 は、別々の調製用ゲルで分離すると取り扱いやすい。さらに、各抗原、使用する 信号生成化合物、およびプローブ抗原の量は、アッセイの選択性と感受性を最適 にするのに当業者によってコントロールしバランスをとることができる。 １つの感染因子の希望する数の抗原、または複数感染因子の抗原の組み合わせ 、あるいは１つの感染因子の希望する数の免疫グロブリン、または複数感染因子 の免疫グロブリンの組み合わせを、単一の固相担体に載せて、１回の検査手順で 分析することができる。本発明を利用して、通常は地域流行性だが病理条件は多 様でありうる抗原を検出したり抗体濃度をモニターすることができ、あるいはあ る病理条件に限られる抗体または抗原を検出して定量することができる。ここに 示す様式は複合アッセイでも容易に利用できるようになっており、それによって ＨＴＬＶ−１、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、等々の抗原 または抗体、細菌性抗原または抗体、真菌やその他の微生物の抗原および抗体な ど複数の抗原または抗体を同時に検出することができる。このような組み合わせ のどれを利用するかは、日常的に使用する者が決めることができる。 固相は、検出抗体が接近できるよう十分多孔性であり、かつ抗原に結合するの に十分な表面親和性を有する適当な多孔材料を含んで成るというのも本発明の想 定するところであり、また本発明の対象範囲に入っている。一般に微小多孔構造 が好ましいが、水和状態ゲル構造材料も使用できる。このような有用な 固相担体としては、以下のものが挙げられる。天然高分子炭水化物およびそれを 合成的に修飾、架橋または置換した誘導体、たとえば寒天、アガロース、架橋ア ルギン酸、置換したあるいは架橋したグアールガム、セルロースエステル、特に 硝酸やカルボン酸とのエステル、混合セルロースエステル、およびセルロースエ ステル；架橋または修飾したゼラチンを含む蛋白質および誘導体などの窒素含有 天然ポリマー；ラテックスやゴムなどの天然炭化水素ポリマー；適切な多孔構造 を持つように調製された合成ポリマー、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン 、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポ リビニルアセテートおよびその部分的水解誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメ タクリレートなどのビニルポリマー、上記の縮合重合体のコポリマーおよびター ポリマー、たとえばポリエステル、ポリアミド、および他のポリマー、たとえば ポリウレタンまたはポリエポキシド；アルカリ土類金属およびマグネシウムの硫 酸塩または炭酸塩、たとえば硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、 アルカリのケイ酸塩、またアルカリ土類金属、アルミニウム、マグネシウムなど 多孔性無機材料；アルミニウムまたはシリコンの酸化物または水和 物、たとえば粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、ま たはガラス（これらの物質は上記の高分子材料といっしょにフィルターとして使 うことができる）；上記のクラスの物質の混合物やコポリマー、たとえば既存の 天然ポリマー上で合成ポリマーの重合を開始させることによって得られるグラフ ト共重合体。これらの物質はすべて、フィルム、シート、プレートなど適当な形 で使用することができ、また紙、ガラス、プラスチックフィルム、ビーズなどの 粒子または織物など適当な内部キャリヤーに被覆または結合させたり、ラミネー トさせたりしてもよい。 ニトロセルロースの多孔構造は、モノクロナール抗体を含む多様な試薬にとっ て、優れた吸収特性および吸着特性をもたらす。ナイロンおよびＰＶＤＦも似た ような特性を持っており、やはり適している。 上述のような多孔性固相担体は、厚さ約０．０１〜０．５ｍｍであり、より好 ましくは厚さ約０．１ｍｍのシート形式である。細孔は幅広いサイズから選べる が、約０．０２５〜１５ミクロンが好ましく、特に約０．１５〜１５ミクロンが 特に好ましい。このような固相担体の表面は、抗原または抗体がこの 固相担体に共有結合するように化学的処理によって活性化しておくことができる 。ただし、一般に抗原または抗体が不可逆的に結合するのは多孔性材料上への吸 着によるが、それをもたらす疎水性の力についてはよくわかっていない。 たとえば、固相担体上にヤギ抗ヒトＩｇＧを内部対照として含めて固相担体上 での陽性反応それぞれを検証することを含めた手順対照が、検体が加えられたこ と、その後のインキュベーション段階で使用する試薬すべてが正しく加えられて きちんと機能したことを示す。固相担体上で生じる反応を解釈するための陽性手 順コントロールを備えることが推奨される。たとえばカゼイン酸水解物など不活 性物質で被覆した参照スポットを固相担体上に設けておくことも推奨される。 本発明のアッセイには陽性対照および陰性対照を入れて、信頼性のある結果が 得られるよう確保することができる。捕捉試薬をいっさい付着させてないブラン ク固相を、陰性試薬対照として利用することができる。陽性対照としては、各分 析物用の陽性対照を入れてその対照を別々に調べることもできれば、複合陽性対 照を用意してアッセイで検出すべき分析物すべての存在をそこで測定することも できる。同様に、このような対照を 抗体の定量の一助として利用することもできる。 先に述べたように、ウイルス複製ができる細胞系で培養した不活性ウイルス全 体の代わりに、組換え技術を使って作製した抗原をアッセイで使用することもで きる。ウイルスライゼート試薬には、製造方法に危険性がつきまとうという欠点 もある。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生きているウイルスの培養、ならびに単離と不活 性化処理では、作業実施者が感染性ウイルスに曝露されうるからである。組換え 技術で作製した蛋白質（抗原）をアッセイ法での抗原試薬として使用すると、こ うした問題を解決できる。組換え蛋白質は非感染性なので、この主の蛋白質の作 製や単離はウイルス全体を培養するよりも安全である。同様に、組換え法により 得られた純粋なウイルス蛋白質を使用すると、汚染蛋白質からくる非特異的反応 に起因する偽陽性反応の一部がなくなるはずである。さらに、試薬を標準化する ことで、アッセイの特異度と予測値が向上するはずである。組換え蛋白質は、Ｅ ．ｃｏｌｉ や酵母など多様な微生物系で作製することができる。当業者にとって 、グリコシル化蛋白質が酵母系で産生され、非グリコシル化蛋白質はＥ．ｃｏｌ ｉ で産生されることは公知である。 たとえばＨＩＶｇｐ４１またはＨＩＶｇｐ４１の一部の発現は、診断用アッセ イにおける組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）由来のＨＩＶエンベロープ配列の活用を実 証している。Ｗｏｏｄらによる「ＲＮＡ腫瘍ウイルスに関するコールドスプリン グハーバーシンポジウム（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏ ｓｉｕｍ ｏｎ ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ ）」（ニューヨーク州コ ールロスプリングハーバーにて、１９８５年５月２２〜２６日）、Ｃｈａｎｇら によるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３巻９０５〜９０９頁（１９８５年）、Ｃｒ ｏｗｌらによるＣｅｌｌ４１巻９７９〜９８６頁（１９８５年）、Ｃａｂｒａｄ ｉｌｌａらによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３巻１２８〜１３３頁（１９８６ 年）を参照。Ｅ．ｃｏｌｉまたはその他の生物で発現されるウイルス蛋白質を診 断用アッセイで利用できる可能性があることは一般に知られているが、これらの 試薬を利用し、しかも細胞培養由来の天然のウイルス蛋白質に比べて特異度およ び感度が勝るとも劣らないイムノアッセイを開発することはこれまで難しい作業 であった。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＩＶｇａｇ蛋白質の発現から、ｒＤ ＮＡ技術により産生されるＨＩＶｇａｇ蛋白質に 診断的価値があるらしいことが示唆されている。Ｗｏｏｄらによる「ＲＮＡ腫瘍 ウイルスに関するコールドスプリングハーバーシンポジウム（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉ ｒｕｓｅｓ ）」（ニューヨーク州コールロスプリングハーバーにて、１９８５年 ５月２２〜２６日）、ＤｏｗｂｅｎｋｏらによるＰＮＡＳ ＵＳＡ８２巻７７４ ８〜７７５２頁（１９８５年）、ＧｈｒａｙｅｂらによるＤＮＡ５巻９３０９９ 頁（１９８６年）、ＳｔｅｉｍｅｒらによるＶｉｒｏｌｏｇｙ１５０巻２８３〜 ２９０頁（１９８６年）を参照されたい。 本発明では、アッセイ試薬として組換え技術を使って産生したＨＩＶエンベロ ープ蛋白質を使用することを考えている。ＨＩＶゲノムのクローニングおよびＥ ．ｃｏｌｉ におけるＨＩＶエンベロープとコア蛋白質の発現、ｇｐ４１およびｐ ２４の精製と特性解明の方法は、当業者に公知である。簡単にいうと、ＨＩＶ感 染ＨＴ−９細胞を収集し、細胞ＤＮＡ全体を単離し、消化させる。コア蛋白およ びエンベロープ糖蛋白質をコードするＤＮＡセグメントを、既知の組換え技術を 使って細菌発現ベクトルにさらにサブクローニングする。さらに、捕捉試薬およ び指示試薬として組換え抗原を使用してＨＩＶ−１抗体を検出すると、異なる免 疫グロブリンクラスの抗ＨＩＶ−１抗体を検出できる。これらの免疫グロブリン クラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭがある。Ａｂｂｏｔｔ ＨＩ ＶＡＢ（登録商標）ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２（ｒＤＮＡ）ＥＩＡアッセイを使用 した抗ＨＩＶ−１ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡの検出については、Ｊ．Ｌ．Ｇａｌｌ ａｒｄａらによる「第５回ＡＩＤＳ年次フォーラム：肝炎および他の血液伝染疾 患（５ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｆｏｒｕｍ ｏｎ ＡＩＤＳ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｏｒｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ）」（ジョ ージア州アトラントにて、１９９２年３月２９日から４月１日）に要約として述 べられている。 産生源が異種である組換え抗原をアッセイで利用でき、またそれが偽陽性結果 をさらに大いに減らすことに役立つということも、本発明で考えられており、ま た本発明の対象範囲に入る。たとえば、ＨＩＶ−１ｐ４１などＥ．ｃｏｌｉで作 製した組換え抗原を捕捉試薬として使用すれば、Ｅ．ｃｏｌｉ以外の適当な産生 源、たとえば適当な酵母宿主やＢ． ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ など他の適当な宿主で産生した組換え抗原（ＨＩＶ−１ｐ ４１またはＨＩＶ−１ｇｐ４１）を使うことができる。組換え抗原を含め、異種 の抗原産生源をアッセイで使用することは、欧州特許第０３１３９８６号明細書 （１９８９年５月３日発行）の主題である。 さらに、本発明では組換え技術で作製した抗原を好んで利用しているが、組換 え技術で産生した抗原の代わりに合成蛋白質を使用することも、本発明の対象範 囲に十分入る。したがって、多様な長さの様々な合成ペプチドを使用することが できる。抗原を固相に付着させた後で、このようにして作製した固相を不活化ウ シ血清アルブミン、不活化ウマ血清または魚ゼラチンなどの蛋白質被覆で「ブロ ック」することができる。ブロッキングにより、結合層上にあるかもしれない非 特異的結合部位はマスクされる。分析物／信号生成系／プローブによって適当な ブロッキング条件は変わるが、当業者であれば決定できる。たいていは、約３７ ℃で約１時間インキュベートしている間にブロッキングができる。 本発明は、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ（米国イリノイ州アボット パーク）から入手できるＡｂｂｏｔｔ Ｍａｔｒｉｘ^TMＡｎａｌｙｚｅｒが提供するような自動化手段に適応させること もできる。一般に、この自動化法では、抗原は不活性プラスチックで裏打ちされ たニトロセルロースシート上に空気室モート（ｍｏａｔ）で分離されたドットの 列に、個別に固定化される。こうした抗原がドットされたニトロセルロースカー ドを個々の反応カートリッジに収納してから、検体に存在するかもしれない特異 的検体を検出するのに十分な条件下で十分な時間だけ、２２〜３７℃で検体とイ ンキュベートする。感度を最大にするように最適化したビオチン−抗ビオチン（ ＢＡＢ）増幅免疫検出系を、定量的に測定可能な信号を与える結合信号生成系と して利用して、検体に存在する固相担体上に固定化した抗原に対する特異的抗体 を同時に検出する。検査カードが入ったこれらの反応カートリッジをアナライザ ーで処理することで、インキュベーションと洗浄を半自動化する。発色反応の強 度を、反射密度（Ｄｒ）を測定する反射率計で自動的に定量し、結果をディジタ ル形式で印刷出力する。検体から得たＤｒ値を正常陰性集団から得たＤｒ値と比 較して結果を出す。カートリッジ上のバーコードを使って陽性検体を確認する。 Ａｂｂｏｔｔ Ｍａｔｒｉｘ^TMアッセイシステムは半自動化さ れているので、取扱い時間もアッセイ時間も削減される。抗原捕捉および抗体結 合を利用したアッセイシステムは、米国特許第５，１２０，６６２号明細書の主 題である。 本発明に関して実施例を述べるが、実施例は本発明の精神と範囲を具体的に示 すための例を挙げたにすぎず、本発明の精神と範囲を制限するものではない。 実施例 実施例では一貫して以下の略語を使用する。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、 ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＡＰＳ（ペルオキソ硫酸アンモニウム）、 ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ ’−テトラメチルエチレンジアミン）、ＭＷ（分子量）、ＴＢＳ（トリス緩衝生 理食塩水）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、ＮＣ（陰性対照）、Ｐ Ｃ（陽性対象）、ＷＢ（ウエスタンブロット）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド ）、ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）、μｌ（マイクロリットル ）。 ［実施例１］ＨＩＶ抗原マトリックスの作製 ウイルスライゼートは、いずれも０．１％ＳＤＳを含有する ３％アクリルアミド積載ゲルと１０％分離ゲルを使って、ＬａｅｍｍｌｉらがＮ ａｔｕｒｅ ２２７巻６８０〜６８５頁（１９７０年）に述べているように、ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥスラブゲル電気泳動法により分離した。 ３８０μｌのＨＩＶ−１ウイルスライゼートを等容積の非還元試料緩衝液（３ ８０μｌの６３ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、１５％［ｖ／ｖ］グリセロール、３ ．３８％ＳＤＳおよび０．００２５％ブロモフェノールブルー）で希釈し、５５ μｌのＨＩＶ−２ウイルスライゼートを等容積の還元試料緩衝液（５５μｌの６ ３ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、１５％グリセロール、３．３８％ＳＤＳ、５％２ −メルカプトエタノールおよび０．００２５％ブロモフェノールブルー）で希釈 した。ライゼート試料緩衝液混合液を９５℃で５分間煮沸し、ゲルに注ぎ、６０ ｍＡの一定電流で２時間半にわたり電気泳動した。分子量がわかっているあらか じめ染色した低分子量のＭＷマーカーを同じゲルで泳動させ、これを使ってＨＩ Ｖ−１およびＨＩＶ−２のライゼート蛋白の分子量を評価した。 ＴｏｗｂｉｎらがＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６巻４３ ５０〜４３５４頁（１９７９年）で述べてい るＷＢ技法の修正法を使って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロース／Ｐ ＶＤＦ／ナイロンマトリックスに抗原を転移させて分離抗原マトリックスを得た 。抗原をマトリックスに転移させた後、１５４ｍＭＮａＣｌおよび５％（ｗ／ｖ ）ＢＳＡを含有するトリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）に浸して、余分な蛋 白質結合部位をブロックした。 実施例２ 試料の処置 ０．１％ＮａＮ₃および１ｍＭＥＤＴＡを含有するトリス緩衝液（２０ｍＭ、ｐ Ｈ８．３）で希釈してから、室温で抗原マトリックスと１晩インキュベートした 。１晩インキュベートした後、マトリックスをＰＢＳですすいでから、特異的抗 体結合プローブと、あるいは標準的方法では標識したヤギ抗ヒトＩｇＧと反応さ せた。 実施例３ 特異的抗体結合プローブの作製 ＨＩＶ−１蛋白質ｐ２４およびｇｐ４１ならびにＨＩＶ−２蛋白質ｇｐ３６を 示す組換え抗原を、当業者に公知の標準的な技法を用いてＥ．ｃｏｌｉＢｌｕｅ ＸＬ−１で発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉＢｌｕｅＸＬ−１は、たとえばＳｔｒａｔ ａｇｅ ｎｅ Ｃｏｒｐ．（米国カリフォルニア州ラホラ）からＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの製品名で市販されている。それからこれらの蛋 白質（以下、ＨＩＶ−１ｐ２４、ＨＩＶ−１ｐ４１、およびＨＩＶ−２ｐ３６） を、ＮａｋａｎｅらがＪ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２２巻１０ ８４〜１０９１頁（１９７４年）に述べた方法を使って、西洋ワサビペルオキシ ダーゼ（ＨＲＰＯ）に個別に結合させた。結合反応の後で、結果としてできた酵 素−蛋白質混合 ムを使ってカラムクロマトグラフィーで精製した。 実施例４ ＨＲＰＯ検出 （ａ）比色分析 ＨＲＰＯ基質を以下のようにして調製した。メタノールに溶解した４−クロロ −１−ナフトールを酢酸緩衝液（５ＯｍＭ、ｐＨ５．０）で希釈するか、あるい はその代わりにＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）に溶解したＡＥＣを酢酸緩衝液 で希釈した。検出手順に入る直前にこれらの基質溶液に過酸化物を加えた。溶液 を吸引して反応を停止させた。それから脱塩水で膜をすすいだ。インスタントフ ィルム（Ｐｌａｒｏｉｄ Ｃｏｒｐ （米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）から入手可能）を使って発色したマト リックスの写真を撮った。 （ｂ）化学発光 ルミノール−過酸化物増強混合液（Ａｍｅｒｓｈａｍ（ドイツ、ブラウンシュ バイク）からＥＣＬ蛋白質検出キットとして入手可能）を、製造業者の指示に従 って使用した。化学発光信号は、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ Ｃｏｒｐ（米国ニ ューヨーク州ロチェスターから入手可能）を使って検出した。マトリックスをル ミノールに浸してインキュベートしてから、余分な基質をマトリックスから排出 した後、Ｘ線フィルムに直接接触させて露出させた。 実施例５ 検出 （ａ）標準的方法 実施例１および実施例２に述べたようにして処理した抗原／抗体マトリックス を、１０％ＮＣＳ（ウシ新生仔血清）を含有するＴＢＳで１：１２５０希釈した ビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｐｉｅｒｅｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ^TM、Ｐ ｉｅｒｃｅ Ｉｎｃ．（米国イリノイ州ロックフォード）から入手可能）と室温 で２時間インキュベートした。マトリック ら、ペルオキシダーゼで標識し、ＴＢＳで１：５００希釈したストレプトアビジ ン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｉｎｃ．（米国イリノイ州ロックフォード）から入手可能） と１５分間インキュベートした。ＴＢＳで洗浄してから、ＡＥＣおよびＨ₂Ｏ₂か ら成る基質溶液を使って結合しているＨＲＰＯを検出した。 （ｂ）本発明の方法 実施例１および実施例２で述べたように処理した抗原／抗体マトリックスを、 １０μｇ／ｍｌの濃度で結合希釈液（１０％ＮＣＳ含有ＴＢＳ）で希釈したＨＲ ＰＯ標識した抗原と室温で２時間インキュベートした。ＴＢＳで洗浄した後、実 施例５（ａ）で示したように結合しているＨＲＰＯを検出した。 実施例６ ＨＩＶ−１ライゼート 分離抗原マトリックスを作製するために実施例１で述べたようにして作製した ＨＩＶ−１ライゼートならびに実施例２で述べたようにして作製した試料を使っ て、実施例４および実施例５に概略を述べた方法にしたがって、また以下のよう にして１１件の実験を同時に行った。これらの実験の結果を図３に示す。マトリ ックス番号１、３、５、９はＨＩＶ−１陰性試料と 反応させ、マトリックス２、４、６、８、１０、１１はＨＩＶ−１陽性患者（Ｗ ＨＯ基準）から得た試料と反応させた。マトリックス１から４までの結合してい る抗体の検出は、前記のようにヤギ抗ヒトＩｇＧを使った実施例５（ａ）で述べ た標準的検出方法で行った。結合抗体の特異的検出は、マトリックス５から８に ついては実施例３で述べたようにして作製したＨＩＶ−１ｇｐ４１の抗原プロー ブを使って、またマトリックス９から１１までは実施例３で述べたＨＩＶ−１ｐ ２４抗原を使って、実施例５（ｂ）で述べたように実施した。図３を見るとわか るように、この実験の結果から標準的な方法（マトリックス１および３）に比べ て特異的プローブ方法（マトリックス５から９）ではほとんど検出可能なバック グラウンドがないという本発明の予想しなかった性質が明らかになった。標準的 な方法では区別なくあらゆる集団を示しているのとは異なり、マトリックス６か ら８および１０と１１ではプローブに特異的に反応する抗体のみが検出されてい ることから、本発明の方法の特異度が高いことが実証される。 実施例７ ＨＩＶ−２ライゼート 抗原マトリックスを作製するのに実施例１で述べたようにし て作製したＨＩＶ−２ライゼートを使用し、またＨＩＶ−２感染患者から陽性試 料を得た点を除いては、実施例６と同じことを再び行った。マトリックス番号１ 、５および９はＨＩＶ−２陰性試料と反応させ、マトリックス２から４、６から ８、１０から１２はＨＩＶ−２陽性試料と反応させた。マトリックス１は標準的 検査の陰性対照であり、マトリックス６は本発明の方法の陰性対照であった。マ トリックス７および８は、前記のようにビオチン増強系を使って定量分析した。 マトリックス１から４の結合抗体の検出は、前記のようにヤギ抗ヒトＩｇＧを使 って実施例５（ａ）で述べた標準的方法を利用して行った。この実験の結果を図 ４に示す。ここでもまた、結果から本発明のほうが標準的方法よりも特異度が優 れていることが判明した。標準的方法で調べたマトリックス１（陰性対照）では 、非特異的バンドがあるのに加えて可視バックグラウウンド信号も高い。本発明 の方法で調べたマトリックス（５から１２）は、ほぼまったくバックグラウンド なしに抗ＨＩＶ−２抗体に対する特異性だけを示している。 実施例８ ＨＲＰＯまたは化学発光標識による検出 実施例１で述べたようにして作製したＨＩＶ−１およびＨＩ Ｖ−２のライゼート、ならびに実施例２で述べたようにして作製した検体を使っ て、３つのマトリックスを作製した。マトリックス１および２は実施例６で述べ たようにしてＨＩＶ−１陽性試料と反応させた。マトリックス３は実施例７で述 べたようにしてＨＩＶ−２陽性試料と反応させた。マトリックス１および２は、 実施例３および４で述べたようにして作製したｐ４１−ＨＲＰＯプローブを使っ て特異的プローブ検出を行い、実施例５（ｂ）で述べたようにして検出した。マ トリックス３は実施例５（ａ）で述べた標準的方法を使って調べた。比色分析結 果を図５に示す。図５を見てわかるように、この結果でも本発明の方法が特異度 が高いことを実証している。 次に、同じ３つのマトリックスを使用したが、今度は実施例４（ｂ）で述べた 化学発光法を使って調べた。結果を図６に示す。図６を見てわかるように、マト リックス１および２については実施例４（ｂ）および実施例５（ｂ）で述べた本 発明の方法を使用し、マトリックス３については実施例４（ｂ）および実施例５ （ａ）で述べた標準的方法を使用した。マトリックス４および５は陰性系対照で あった。この結果から、本発明の方法を用いると強い特異的信号が生成されるが 、標準的方法では バックグラウンドが高いために特異的結合信号を判別できないことが実証された 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミカエル，ゲルト ドイツ連邦共和国、65195・ビーズバーデ ン、ルーンシユトラーセ・21 (72)発明者 ズツテルランド，ラナルト ドイツ連邦共和国、65193・ビーズバーデ ン、クライネ・バインベルクシユトラー セ・１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．検体中の１ないし複数の特異的抗体を検出する方法であって、 （ａ）検体を１つ以上の抗原を含有する固相マトリックスに、抗原／抗体複合 体を形成するに十分な条件下で十分な時間にわたり接触させ、ここでその抗原は 当該マトリックス上で互いに空間的、物理的に分離されており、 （ｂ）ステップ（ａ）の抗原／抗体複合体を指示試薬に接触させ、ここでその 指示試薬は、検出可能で測定可能な信号を生成することのできる信号生成化合物 に結合する、検出しようとする抗体に特異的なプローブを含み、 （ｃ）検体中に抗体が存在することを検出するために生成された信号を検出す ること を含む方法。 ２．抗原をライゼート、組換え蛋白質、および合成ペプチドから成る群から選択 する、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．当該ライゼートが、ＨＩＶ−１ｐ２４、ＨＩＶ−１ｇｐ４１、ＨＩＶ−１ｐ ４１、ＨＩＶ−２ｇｐ３６およびＨＩＶ− ２ｐ３６から成る群から選択される抗原を含むＨＩＶライゼートである、請求の 範囲第２項に記載の方法。 ４．当該プローブを、ライゼート、組換え蛋白質および合成ペプチドまたはその 組み合わせから成る群から選択する、請求の範囲第１項に記載の方法。 ５．当該抗原それぞれを検出できる当該指示試薬それぞれが、異なる信号生成化 合物で標識されている、請求の範囲第１項に記載の方法。 ６．当該信号生成化合物を、発光化合物、化学発光化合物、酵素、比色化合物ま たは色原体化合物から成る群から選択する、請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．当該信号生成化合物がさらに、ビオチン／抗ビオチン、ビオチン／ステプト アビジン、およびフルオレセイン／抗フルオレセインから成る群から選択される ハプテン−抗ハプテン結合対を含む、請求の範囲第６項に記載の方法。 ８．検体中の１ないし複数の抗体を検出するための検査キットであって、 （ａ）検出しようとする抗体に特異的な捕捉抗原と、 （ｂ）検出可能で測定可能な信号を生成することができる信 号生成化合物に結合している、検出しようとする抗体に特異的なプローブを含む 指示試薬とを含有する検査キット。 ９．当該抗原をライゼート、組換え蛋白質および合成ペプチドから成る群から選 択し、当該ライゼートはＨＩＶ−１ｐ２４、ＨＩＶ−１ｇｐ４１、ＨＩＶ−１ｐ ４１、ＨＩＶ−２ｇｐ３６およびＨＩＶ−２ｐ３６から成る群から選択される抗 原を含むＨＩＶライゼートである、請求の範囲第８項に記載の検査キット。 １０．当該信号生成化合物を、発光化合物、化学発光化合物、酵素、比色化合物 および色原体化合物から成る群から選択する、請求の範囲第８項に記載の検査キ ット。