JP4097191B2

JP4097191B2 - Ｈｃｖ−特異的ペプチドおよびそれらの使用

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Publication number: JP4097191B2
Application number: JP2002330252A
Authority: JP
Inventors: ウード・クルプカ; ヴエルナー・シユテユーバー; マンフレート・ゲルケン; シユテフアン・ブルスト
Original assignee: デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date: 1990-11-03
Filing date: 2002-11-14
Publication date: 2008-06-11
Anticipated expiration: 2023-06-11
Also published as: DK0770679T4; JPH04330098A; ES2255068T3; ATE206717T1; ATE318309T1; JP2003192697A; EP0484787A3; DE59109271D1; CA2054798C; CA2054798A1; ES2255068T5; JP4097162B2; EP0770679B2; DK0484787T3; DE59109221D1; EP0770679A2; DK0770679T3; AU657497B2; EP0770679B1; AU8700291A

Description

【０００１】
本発明はＨＣＶ特異的抗体およびＨＣＶ抗原の免疫化学的測定のためのポリペプチドおよびこの方法に適した剤およびその使用に関する。
【０００２】
さらに、本発明はそれぞれについて単一のテストにより、それぞれ異なる病原体に対する複数の異なる抗体特異性を同時に検出するおよび／または同時に測定するための免疫化学的方法に関する。
【０００３】
非Ａ／非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、伝搬性疾病または臨床像群として、ウイルス関連であり、また様々な肝炎ウイルス例えば肝炎Ａウイルス（ＨＡＶ）、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）、肝炎Ｄウイルス（ＨＤＶ）および肝炎Ｅ（ＨＥＶ）などによる他のウイルス誘導臨床像からは区別できるものとされている。最後に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）による肝炎を診断することもできる。
【０００４】
疫学的研究に基づいて、伝搬経路に従い少くとも２タイプの非Ａ／非Ｂ肝炎を定義することができる：水および食物により伝搬される流行性肝炎ウイルス（経腸的に伝搬されるＮＡＮＢＶ）、および血液、針刺しまたは同様の経路により伝搬される輸出後肝炎ウイルス（血液により伝搬されるＮＡＮＢＶ）。これらの感染経路のほかに、特発的に発生するＮＡＮＢＶ（“市中感染ＮＡＮＢＶ(community acquired ＮＡＮＢＶ)”）として、前述の２タイプとは明白な関連がない伝搬の存在も知られている。ＮＡＮＢＨの原因となる作用体またはウイルスの正確な数は分っていないが最近、いわゆる肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）がこの病気の一原因病原体として確認された（WO 89/04 669）。
【０００５】
最近に至るまで、臨床診断は主として、抗原の血清学的測定および／またはそれらに対する抗体に基づいていており、それらテストはＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＤＶ、ＨＥＶ、ＣＭＶまたはＥＢＶという肝炎病原体群からのパラメータに対して特異的である。このいわゆる排除法においてはＮＡＮＢＨはすべての前記測定が陰性のときだけ診断された。
【０００６】
このほか、いわゆる代用マーカー例えばＧＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、ＡＬＴすなわちアラニンアミノ基転移酵素とも呼ばれる）または抗ＨＢｃ（肝炎Ｂコア特異的抗体）も用いられている。しかしながら、これらの助剤は信頼性ありとするほど感度、特異性いずれも十分でない。従って、輸血患者の約１０％に発生する輸血後肝炎症例のほんのわずかな一部を供血者検査によって回避することはできる。特異的テスト導入が緊要のことであることはＮＡＮＢＶが輸血後肝炎症例の約９０％にあたるとされていることから強調される。この疾病にともなう主たる問題は、２５〜５５％の感染者が慢性肝傷害にかかるということである。
【０００７】
ＨＣＶの発見により、ＨＣＶまたはＨＣＶ特異的抗体の特異的検出の基礎が提供された。ＨＣＶおよび、ＨＣＶゲノム部分の相当するｃＤＮＡ複製物の単離および確認はWO 89/04 669の主題となっており、そこではＨＣＶはフラビ（flavi）様ウイルスのファミリーに属するとされている。さらにそこには、ＨＣＶ抗原をＨＣＶ−特異的抗体検出に用いること、および患者血中抗原の診断測定のために抗体を産生させる（raise）することも記載されている。
【０００８】
しかしながら、遺伝子工学タンパク質、特に転写解読枠（open reading frame，ＯＲＦ）からのいわゆる非構造タンパク質（ＮＳＰ）が用いられるが、それらは免疫化学的検出方法における反応剤として使用される。
【０００９】
免疫化学的検出とは、本発明における意味あいにおいては、均一（溶液中）または不均一（固相使用）イン・ビトロ法として、体液、例えば血清、血漿、唾液、脳脊髄液または尿中の免疫グロブリンクラスＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）の抗原および／または抗体の測定を可能にするあらゆる方法を包含する。イムノアッセイとも呼ばれるこれらの方法の例は、酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノフルオレセンスアッセイ（ＩＦＡ）、ラジオイムノプレシピテーション（ＲＩＰＡ）、寒天ゲル拡散などである。
【００１０】
例えば、WO 89/04 669は、ＨＩＶ特異的抗体(抗−ＨＣＶ)の検出のために、ＥＬＩＳＡ法にそこに記載されている抗原Ｃ−１００−３を用いている。ＮＳＰ３／４領域からの構築物（コンストラクト）Ｃ−１００−３（これは酵母細胞中で遺伝子工学により発現される）は３６３アミノ酸より成り、その配列は図１に示されているが、図中のナンバリングシステムは前記特許のそれに対応している。
【００１１】
しかしながら、ヒト起源の検体中の抗−ＨＣＶを測定するためのＥＬＩＳＡ法で達成し得る最高感度は、慢性ＮＡＮＢ患者の場合で約８０％そして急性ＮＡＮＢ患者の場合で約３０％と推定される。患者（ヒト）からの血液についてのこれらの知見はＮＡＮＢＶ感染チンパンジーについての対応する研究によって支持されている。
【００１２】
それらの研究において、Ｃ−１００−３構築物に基づく抗−ＨＣＶの陽性検出は、ＡＬＴ増加が生じてから約６〜１８週間までは成功せず、そしてその後にＮＡＮＢＶ接種してから３〜１０週間後に病気の徴候として認めることができる。すなわち、チンパンジーが感染してから９〜２６週間が、Ｃ−１００−３構築物を用いた従来のイムノアッセイによりＨＣＶ特異的抗体を検出できるまでの総時間であることがわかる。
【００１３】
WO 90/11 089に更に、抗−ＨＣＶ検出に使用できるＨＣＶアミノ酸配列を記載している。しかしながら、特定のタンパクセクションの診断上の関連については全く記述がなく、また免疫優性(immunodominant)エピトープの例も存在しない。
【００１４】
文献に開示された方法で抗−ＨＣＶを検出する上での基本的問題は誤って陽性および誤って陰性に反応する検体がなおも存在することである。誤って陽性となる検体は健常供血者群の４０％にも到ることがある(WEINER A., et al. Lancet 1990, Vol. 336, p. 695）。従って、特異的かつ鋭敏なＨＣＶテストがないということは、誤って反応するわずかとはいえない割合の検体が献血センターにおいて間違って捨てられていること、そして同時に実際には抗−ＨＣＶ−陽性である患者がなおも信頼性をもって確認されないということを意味している。
【００１５】
これらの欠点を除くために、他のグループはＣ−１００−３のＯＲＦ領域(WO 89/04 669より。図１）の特定配列を選びそしてそれらをイムノアッセイに用いている（ペプチドＳＰ４２、１１７、６７および６５。図２）。ＮＡＮＢ感染チンパンジーの研究の際には、診断上の価値を向上させることはできなかった。逆にそこでなされた所見からは、記載ペプチドはいずれも信頼性あるＩｇＧまたはＩｇＭ測定の基礎として役立てるには不適切であるという結論となる。何故ならば感度が不十分であり、また抗体検出までに少くとも７〜１７週間という診断ギャップは従来の検出方法と比較しても時間短縮が無いことを意味しているからである。さらにまた、特にＳＰ４２は２０〜４０週間にわたる診断ギャップがあり診断テストに適していないことが分った（SAFFORD J., et al. Int. Symp. on Viral Hepatitis and Liver Disease 1990 Houston, USA)。
【００１６】
しかしながら、ＳＰ６７と称されるポリペプチドは、このペプチドについてはわずか抗ＨＣＶ−陽性検体の８６％の確認しか可能でなかったが免疫優性であるとされている。（DAWSON, G.J., et al. Int. Congress of Virology 1990, Berlin, FRG)。
【００１７】
合成的に製造されたコアペプチドを用いて改良できたとされている（OKAMOTO H., et al. Japan. J. Exp. Med. 1990, Vol 60, No. 4, p. 223〜233）。これはＨＯＰＰおよびＷＯＯＤ（Proc. Nat. Acad. Sci. 1981, Vol. 78, p. 3824〜3828）により特定された物理化学的予想基準を用いてコアアミノ酸配列１〜１２０の全部で３つの潜在的抗体結合部位からある配列を選択することより成る(OKAMOTO, H. et al., Japan. J. Exp. Med. 1990, Vol. 60, No. 3, p. 167〜177）。このペプチドは図３に示されているがNo.３９からNo.７４までの番号の３６アミノ酸より成っている。
【００１８】
抗−Ｃ−１００テストとは対照的に、このコアペプチドに基づくＥＬＩＳＡを用いて一部の抗−ＨＣＶ−陽性血清中のＨＣＶ抗体を検出することができた。この知見は、ＨＣＶＲＮＡ検出にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた比較研究によって確認された。
【００１９】
６０６名の供血者に対する検査で認められた２６の抗−コアＨＣＶ−陽性検体（４.３％）から、まさにわずか１０例（１.６５％）しかＰＣＲによっては確認し得ないことが明白となっている。逆に１６名の供血者（２.１５％）はこのペプチドに対し誤って陽性に反応した。すなわち、前記コアペプチドは場合によっては抗−Ｃ−１００テストよりも抗−ＨＣＶ検出法に適しているとされているが、従来のコアペプチドは一般に相当な干渉されやすさを伴う。
【００２０】
従って、本発明はＨＩＶ感染症をなるべく早くかつ高い特異性をもって検出できるテストを開発するという目的に基づいたものである。
【００２１】
今般、驚くべきことに、Ｃ−１００−３のＯＲＦ領域および／またはＨＣＶコア領域のアミノ末端領域の区域からのある種のポリペプチドがＨＣＶ−特異的抗体の検出に特に適していること、そして従来のペプチドに比べて感度が顕著に増大すると共に望ましくない誤った陽性反応による干渉の受けやすさが著しく低下することを見出した。
【００２２】
さらにまた、本発明によるペプチドを用いた免疫化学的検出方法においては、高い抗原濃度、従って高いエピトープ密度、が達成されることを見出した。これは特に、干渉する異物が存在しないために、高度に濃縮された患者検体の検査が可能な場合に可能である。
【００２３】
さらに、本発明によるペプチドが初期および後期ＨＣＶ抗体の免疫優性エピトープを有し、従って縦断的検査（longitudinal investigation）の特に有利に用いることができるということも全く驚くべきことであった。
【００２４】
従って、本発明はＨＣＶ感染に対する抗体と特異的に反応するペプチドまたはペプチド混合物、Ｃ−１００−３のＯＲＦ領域および／またはアミノ−末端ＨＣＶコア領域の一部を含むそれらのアミノ酸配列に関する。
【００２５】
ペプチドおよびポリペプチドという用語は、本発明の範囲において、約８０ＡＡ以上のペプチドに等しいものとして用いられる。
【００２６】
本発明によるペプチドは好ましくは、Ｃ−１００−３として記されるＨＣＶゲノムセクションのＡＡ１２１〜ＡＡ１７５（式Ｉ）およびＡＡ３３７〜ＡＡ３６３（式II）のアミノ酸配列より成り、以下の配列を有している：
【００２７】
【化３】

【００２８】
好ましいペプチドは次のとおりである：
【化４】

【００２９】
【化５】

【００３０】
特に式Ｉのカルボキシル−およびアミノ−末端領域からの配列は、ＨＣＶ感染の後期抗体検出に有益であることがわかった（例えばペプチド４０８１、４０５６、４０５５および次の４０６０）：
【００３１】
【化６】

驚くべきことに、式IIのアミノ酸またはその一部を含む、Ｃ−１００−３のＯＲＦ領域のカルボキシル−末端領域（例えば４０９１）は、後期抗体の検出に特に適していることが分った。
【００３２】
さらにまた、式Ｉの中央領域は抗−ＨＣＶの初期確認に関係している。この関連で好ましいのは前記ポリペプチド４０７１および４０７２、およびペプチド４０５４、４０５３および４０５２である。
【００３３】
さらにまた、三つのエピトープが式Ｉのペプチドにおいてつきとめられたが、そのうちの一つ（Ｓ）は後期抗体を認識し、そして他方（Ｆ１およびＦ２）は初期抗体を認識する。好ましいペプチドの例は以下のアミノ酸配列のうちの一つを有している：
ＡＡ_a1−ＤＲＥＶＬＹＲ−ＢＡ_b1 （Ｓ）
ＡＡ_a2−ＱＨＬＰＹＩＥ−ＢＡ_b2 （Ｆ１）
ＡＡ_a3−ＫＱＫＡＬＧＬ−ＢＡ_b3 （Ｆ２）
式中ＡＡおよびＢＡは任意の所望のアミノ酸であり、またａ１〜ａ３およびｂ１〜ｂ３は、各々相互にの独立的に、０より大きい、または０に等しい整数である。
【００３４】
アミノ−末端配列を式Ｉのカルボキシル−末端アミノ酸配列および式IIの配列と共に選ぶのが有利である。約１３０〜１６０の式Ｉの中央アミノ酸配列はそれらとは別個に用いることができる。
【００３５】
さらに、本発明によるペプチドは、アミノ−末端ＨＣＶコア領域の一部、好ましくはコアとして記されるＨＣＶゲノムセクションのＡＡ１〜ＡＡ３５のアミノ酸配列より成り、次の配列を有する：
MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVY III
【００３６】
【化７】

【００３７】
ペプチドＳＰ１０およびＳＰ２３が特に好ましい。
【００３８】
コア領域の本発明ペプチドを用いれば、感染の急性期からの初期抗体と後期抗体との両者を確認することができるが、これによってこれらペプチドに基づく検出感度は従来技術に比べ相当向上する。もう一つの利点はペプチドの高特異性であり、これによって一般に、誤った陽性反応を示す検体数は少くなる。
【００３９】
一般的に、初期および後期ＨＣＶ抗体に特異的なペプチド、連結ペプチドまたはペプチド混合物を用いるのが有利である。何故ならば、両タイプの結合部位があるので感染初期からの検体と感染後期からの検体との両者を確認できるからである。さらにまた、ＨＣＶ−特異的ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ抗体による血清転化を信頼性よく確認でき、また一般に陽性および陰性検体を、極めて高い正確さをもって弁別することができる。さらに、一般的に、遺伝子工学によるタンパク質調製に必要な発現系、あるいはウイルス増殖のためには不可避である他の宿主細胞汚染による干渉もない。さらに一般に、ヒト起源の血清、クエン酸加、ヘパリン加またはＥＤＴＡ血漿中のＨＣＶ−特異的抗体の信頼し得る測定が保証され、また検体を約５６℃で約６０分間不活性化すれば一般に誤った陽性結果を与えることはない。最後に、本発明によるこれらペプチドを用いて調製された特異的抗体を用いれば、細胞不含患者血中の対応抗原の免疫化学的測定によって診断ギャップをさらにうめることができる。
【００４０】
本発明の主題によれば、好ましくは、回復期のまた慢性感染患者からのＨＣＶ−特異的抗体および／または感染急性期からのＨＣＶ抗体を確認する一連の新規ペプチドが記載され、また無差別ではあるが極めて鋭敏にかつ干渉をほとんど受けることなく抗−ＨＣＶ抗体を検出するためのスクリーニングテストの基礎として適当なポリペプチドおよびポリペプチド混合物が記載されている。
【００４１】
さらに、本発明は、Ｃ−１００−３のＯＲＦ領域またはコア領域の前述のペプチドの少くとも一つに対してバイオスペシフィック（biospecific）アフィニティを有する抗体に関する。
【００４２】
細胞不含患者血中の対応抗原を本発明による抗体で免疫化学的に測定することにより内生抗体が出現する前であってもＨＣＶの存在を確認することができる。
【００４３】
さらに本発明は、本発明によるペプチドを抗原として用いたＨＣＶ抗体を検出および／または測定するための免疫化学的方法に関する。
【００４４】
さらに本発明は、各場合について、初期抗体に対して特異的に反応する一以上のペプチドと後期抗体に対して特異的に反応する一以上のペプチドとを別々の混合物として検体と反応させることより成る、感染初期と後期の鑑別診断方法に関する。
【００４５】
さらに本発明は、前記ペプチドを哺乳動物、特にヒト、において産生させるのに用いることに関する。
【００４６】
さらに本発明は、前述の抗体を診断および治療目的に用いることに関する。
【００４７】
従って本発明は、本発明の抗体またはペプチドの少くとも一つを単独でまたは他のペプチドまたは抗体と共に含む剤に関する。
【００４８】
前記免疫反応性ペプチドは合成または遺伝子工学により、好ましくは当業者に知られた方法による合成により製造できる。ペプチドの化学合成は例えばＢＡＲＡＮＩ，Ｇ．およびＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ，Ｒ．Ｂ．が“The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology", Vol. 2, Academic Press 1980, ed. Erhard Gross, Johannes Meyenhoferに記載しているとおり、特にポリペプチドとして、またはオーバーラップまたは非オーバーラップアミノ酸配列を有するいくつかの小ペプチドの混合物として行うことができる。
【００４９】
遺伝子工学により製造されたポリペプチドはその融合部分が後で除去されてしまう融合タンパク質を含む。さらに、適切な場合には例えばグリコシル化、アセチル化またはホスホリル化により修飾されたポリペプチドが包含される。
【００５０】
これらのアミノ酸配列はポリペプチドとしておよびオーバーラップまたは非オーバーラップアミノ酸配列を有するいくつかの小ペプチドの混合物として合成することができる。
【００５１】
さらにまた、個々のペプチドの混合物の方が、前記構造の単一ペプチドよりも、免疫化学的抗−ＨＣＶ検出にとって良い診断特性を有することがあることも見出した。Ｃ−１００−３のＯＲＦ領域およびコア領域のペプチドの混合物を用いるのが特に有利である。
【００５２】
従って本発明は、さらに、本発明ペプチドの一以上を含むペプチドの混合物に関する。
【００５３】
別の態様においては、二以上の前記ペプチド、好ましくは２〜１０、特に２〜４個のペプチドをブリッジを用いまたは用いずに連結する。それらペプチドの長さは好ましくは６〜１５個のアミノ酸である。二以上のペプチドのポリマー体を当業者に知られた方法により製造しそして担体例えばタンパク質またはラテックス粒子に結合することさえもできる。すなわち、担体またはブリッジとして特に適しているのは例えばヒト血清アルブミンおよび／またはポリリジンである。それらペプチドを１〜４０、好ましくは１〜２０、特に１〜１０個のアミノ酸で延長することにより修飾することも同じく可能である。付加的領域および構造は、ペプチド全体の物理化学的挙動に対し有益な効果をもつことがあるが、ペプチドまたはその部分の免疫反応性は維持されるべきである。
【００５４】
従って本発明はさらにブリッジを用いてまたは用いないで相互に連結され、あるいは担体に結合され得るペプチドに関する。
【００５５】
このタイプの修飾は、一般的に、固相への受動吸着または共有結合特性を有益に変え、カプリング方法に有利な効果を有し、あるいは該ペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生させる場合に抗原としてより強力に働く。
【００５６】
すなわち例えば本発明はさらに次式
ＡＡ_n−ＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫ−ＢＡ_m
（式中ＡＡおよびＢＡは任意の所望のアミノ酸であり、そしてｎおよびｍは各々相互に独立的に０〜約６０、特に１〜４０の整数である）で示されるペプチドに関する。
【００５７】
しばしば、様々な方法で、例えばペプチドを相互にまたは担体に連結させるために一以上のアミノ酸、好ましくはシステインをアミノ−末端またはカルボキシル−末端に結合することにより、チオグリコール酸アミド化により、例えばアンモニウムまたはメチルアミンなどでカルボキシル−末端アミド化することにより、ペプチドを誘導体化するのが有利である。このタイプの修飾はポリペプチド上の正味荷電を変えそしてペプチドの物理化学的特性を改善しあるいは固体担体、担体タンパク質または別のペプチドへのペプチドの共有結合を容易にすることがある。さらに当業者は、本発明ペプチドがそれら自体の間であるいはそれら自体を用いて遺伝子工学または合成により複数の免疫関連エピトープが一つのペプチド上に局在するように調製され得ることも知っている。
【００５８】
すなわち、本発明はさらに一以上のアミノ酸の置換、付加または欠失により修飾された本発明によるアミノ酸配列を有するペプチドに関する。
【００５９】
一般に、このタイプの修飾はペプチドの免疫反応性を直接変化させることはないが、ペプチドの免疫学的性質を向上させることは完全に可能である。すなわち、例えば、メチオニンは自然酸化しやすいが、これはノルロイシン置換によりポリペプチドの抗原特性を本質的に変えることなく防ぐことができる。
【００６０】
当業者は、所与のアミノ酸配列を様々な利点を伴い得る広範にわたる様々な改変例えば欠失、挿入または置換に付すことができることを知っている。このタイプの修飾は例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ；Ａｌａ、Ｓｅｒ；Ａｌａ、Ｔｈｒ；Ａｌａ、Ｖａｌ；Ａｌａ、Ｐｒｏ；Ａｌａ、Ｇｌｕ；Ｌｅｕ、Ｇｌｎ；Ｇｌｙ、Ｐｈｅ；Ｉｌｅ、ＳｅｒおよびＩｌｅ、Ｍｅｔなどの組合せに関する。
【００６１】
同じく、ポリペプチドの吸着特性を約２〜２０個の疎水性アミノ酸より成る疎水性配列、例えばＰｈｅＡｌａＰｈｅＡｌａＰｈｅなどの付加の形で向上させることも有利なことがある。
【００６２】
さらに本発明は、本発明ペプチドの少なくとも一つをコードするＤＮＡ配列に関する。
【００６３】
さらに本発明は、その特異的部分において本発明によるＤＮＡ配列の少なくとも一つと相補的である少なくとも一つの核酸プローブが用いられるハイブリダイゼーション反応を特異的段階として用いるＨＣＶの検出および／または測定のための分析方法に関する。免疫化学的検出は一般に均一（溶液中）または不均一（固相使用）方法として抗原および／または抗体の測定を可能にする方法を含む。イムノアッセイとも称されるこれらの例は酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノフルオレセンスアッセイ（ＩＦＡ）、ラジオイムノプレシピテーションアッセイ（ＲＩＰＡ）または寒天ゲル拡散アッセイなどである。
【００６４】
これら数多くの極めて多様な方法は、特定の態様ごとに、検出に用いたマーカーまたは測定原理（例えば光度測定、放射性測定、視認、または凝集、散乱光またはプレシピテーション挙動）、および固相について相違している。当業者は結合および遊離検体抗体または抗原の分離は広く用いられてはいるが例えばいわゆる均一アッセイでは絶対必要というわけではないことを知っている。不均一イムノアッセイ、特に不均一ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００６５】
同じく当業者は、“確認テスト(confirmatory test)”という用語が、ドット(dot)法と称されるテストが名前により抗原の固定の仕方を説明しているにすぎないのと同様、イムノアッセイの使用を説明しているにすぎないことを知っている。
【００６６】
抗体検出においては、検体を記載のペプチド配列とある時点で接触させて特定の方法の特定の段階で抗原−抗体複合体を形成しあるいは競合および阻合テストにあっては適当な標識試薬の添加によりその形成を防ぐことが免疫化学的検出方法の前提要件である。
【００６７】
直接法では、抗体を固相に結合したペプチドと、あるいは標識されたペプチドと、あるいは両者と接触させることができ、基本となる方法が、１−、２−または多−段階法として、同一のまたは異なるペプチド（またはペプチド混合物）を固相上におよび検出用液状試薬としておよび特異的ないわゆる捕獲抗体（例えば抗ＩｇＭ）またはアフィニティー試薬（例えばプロテインＡ）との組合せで用いた免疫測定テストデザイン（二重抗原サンドイッチ）または第二抗体テストの原理に基づくかどうかは重要でない。
【００６８】
ペプチドは固相に対して、共有結合的に、吸着により、または特異的抗体または同様のアフィニティー法を用いて、例えばビオチン／アビジン複合体を介して、しかし好ましくは吸着により結合させることができる。
【００６９】
固相用担体材料として適しているのはプラスチック例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミドおよびその他の合成ポリマー、天然ポリマー例えばセルロースおよび誘導体化された天然ポリマー例えばセルロースアセテートおよびニトロセルロース、およびガラス（特にガラス繊維など）などである。ポリスチレンが担体材料として適している。
【００７０】
担体はビーズ、ロッド、チューブおよびマイクロタイター(microtiter)プレートの形態、あるいは懸濁液例えばラテックス粒子の形態とすることができる。シート様構造物、例えば紙片、小プレートおよび膜も同じく適している。担体表面は水性溶液に対して透過性があるもの、ないものいずれであってもよい。
【００７１】
好ましい担体はビーズ、チューブ、ウエル、微粒子、紙片および膜である。特に好ましい担体はマイクロタイタープレート、ラテックス粒子、ポリスチレンビーズまたは磁力に従いやすい粒子である。
【００７２】
担体をコーティングするためのペプチド濃度は一般に約０.０１〜２０μｇ／ml、好ましくは０.０１〜１０μｇ／ml、特に好ましくは２〜１０μｇ／mlである。その高純度および強度の抗原性により、例えば０.０１〜２.０μｇ／ml、好ましくは０.１〜０.５μｇ／mlという少量の使用を可能にする合成により製造されたポリペプチドを用いるのが特に有利である。担体の結合能は、特にポリスチレンを用いる場合、一般的に飽和してしまうことはないので通常、複数の異なるポリペプチド、殊に２〜５種、特に３〜４種の異なるポリペプチドでコートすることができるが、このことは特に有利である。
【００７３】
ペプチドを検出のための標識誘導体として用いる場合には、適切なカップリング法は当業者に知られたすべてのものである。さらにまた、多段階法例えば、抗体が標識を有している予め形成されたペプチド−抗体複合体、高アフィニティー系例えばビオチン／アビジン（これらの反応剤の一方の標識）などをアレンジすることもできる。
【００７４】
使用できるマーカー例は放射性同位元素、蛍光または化学発光色素である。さらに、例えば発色原、発光原または蛍光原基質系により、または第１酵素により活性化される第２酵素を用いたその後の増幅系により検出される酵素をマーカーとして用いることもできる。
【００７５】
マーカーとして好ましく用いられるのは酵素、特にアルカリ性ホスファターゼおよび／または西洋ワサビペルオキシダーゼまたは化学発光原例えばアクリジニウムエステルである。
【００７６】
標識は、前記マーカーについて従来技術に記載されている方法により行われる。
【００７７】
抗体をペルオキシダーゼで標識する場合はNAKANE et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22, 1084〜1090の過沃素酸塩法を用いることができ、またはパートナーをヘテロ二官能性試薬により連結するISHIKAWA et al. 1983, J. Immunoassey 4, 209〜327の方法を用いることができる。
【００７８】
これらの方法のほかに、ペプチドを、ペプチド−特異的抗体により誘発された物理化学的変化例えば沈殿、凝集または光散乱などを自動的にまたは視覚的に測定するために、適当な表面例えばラテックスまたは赤血球の感作に用いることもできる。さらにペプチドを誘導体化することなく前述の方法と同様これら測定原理の阻害に用いることができることも知られている。
【００７９】
本発明によるペプチドまたはそれらの誘導体を用いて調製されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いる免疫診断法を抗原検出に用いることができる。この検出法に適した態様は当業者に知られていて、特定の段階で抗体−抗原複合体を形成するか、または競合法において標識抗原の添加により複合体形成を阻害することより成る。
【００８０】
抗原テストを確立するための固相、マーカーまたは測定プリンシプルとして適しているのは相当する抗体測定について記載されているすべての可能性であるが、競合原理および二重抗体サンドイッチ法が免疫化学的方法として特に好ましい。この脈絡においては、方法が１−、２−または３−段階法として設計されるかどうかは重要でない。すなわち多段階法は、未標識検出抗体であってそれらに対する適切に標識された別の抗体を用いて測定されるものを使用して行うことができる。例えば血清アルブミンまたはスカシガイヘモシアニンにカップリングさせることによって可能であるが（B. S. Schaffhausen, Hybridoma Technologie, the Biosciences and Medicine, ed. T. A. Springer, Plenum Press NY, London, 1985)、ペプチドをそれらの免疫原性が改善されるように修飾しておくことは抗体の産生(raising)に有利である。
【００８１】
最後に、本発明はさらに固相および乾燥状態で一部あるいは全部の必要試薬を含む免疫診断要素を用いる場合にも適用でき、そしてこの場合にも本発明の新規ペプチドは固相側または検出試薬中またはその両方に含まれそして抗体測定、抗原検出またはその他の被分析物質(analyte)との組合せが行われる。
【００８２】
本発明の新規ペプチドの予想外の利点の一つは、それらによってＨＣＶ抗体の信頼性ある測定が可能となる点である。さらにこれらのペプチドを用いれば急性感染期からの初期抗体も確認されるが、これによりこれらペプチドに基づく検出感度が従来技術に比べ相当に向上し、さらにはこれら抗体タイプ（初期または後期抗体）に対する適宜の結合部位を有するペプチドを二つの異なるテスト方法に相互に別々に用いれば一方における急性期と他方における慢性または回復期との間の鑑別が可能となる。最後に、本発明によって得られるもう一つの利点は本発明のペプチドの特異性が高い点であり、これによって誤って陽性反応を示す検体数は最小に抑えられることになる。
【００８３】
一方においては献血センターにおけるウイルス安全対策上、そして他方においてはコスト上の理由から、いわゆる組合せテストが開発されそして１９８９年来利用可能となっているが、これにより抗−ＨＩＶ１および／または抗−ＨＩＶ２の同時非鑑別検出ができる(K. Koerner et al., Lab. Med. 14, 159〜161, 1990)この開発が可能となったのは、それら二つのＨＩＶサブタイプが相互に大きな類似性を示しさらにそれらが同じウイルスクラスに属するためである。すなわち、かかる抗−ＨＩＶ 1/2組合せテストにおける抗−ＨＩＶ１測定も抗−ＨＩＶ１とＨＩＶ２抗原との交叉反応に基づいている(M. Busch et al., Transfusion 30/2, 184〜187, 1990)が、同じくやはり逆に抗−ＨＩＶ２検出は抗−ＨＩＶ２およびＨＩＶ１抗原の間で生じる反応によって高められる。これに基づいて、二つの抗体特異性を有する組合せ検出の確立は、関連のあるまたは構造類似の抗原を用いる場合には相対的に簡単であることがわかる。非Ａ非Ｂ肝炎の病原体、いわゆる肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）の検出は本発明による抗−ＨＣＶ測定の確立のための必要条件であった。それに伴ってスクリーニングテストの性能面では改良されるが、最新の抗−ＨＣＶテストについても、一方において抗−ＨＩＶ組合せテストおよび他方において抗−ＨＣＶ個別テストによる個々の供血者の検査には相当な努力と相当な付加的コストが伴うという問題が生じる。
【００８４】
抗−ＨＣＶ測定についての今日までのすべての商業ベースの態様および大部分の抗−ＨＩＶ組合せテストは遺伝子工学によるＨＣＶまたはＨＩＶポリペプチドに基づいている。しかしながら、やはり今日にいたるも、ＨＣＶ（フラボウイルス）およびＨＩＶ（レトロウイルス）の場合のように異なるウイルスクラス関係が存在することから、類似抗原を使用できないときは複数の異なる抗原を含む唯一のテスト混合物中の複数の異なる抗体特異性を一回の免疫化学的検出で同時に測定することには成功を収めていない。本発明の意味において、異なる抗体特異性とは、相互の交叉反応性が極めて低いか全くない抗体を意味する。複数のウイルス抗原に対する全部で三つの抗体特異性を検出するためのこのタイプのテストは、感度の点でもまた相互に干渉しあう相互作用の結果干渉の受けやすさ（特異性）の点でも、特定の個別のテストの対応特性よりも劣る傾向にあるとされていた。
【００８５】
今般驚くべきことに、それぞれ異なる病原体の異なるエピトープを担体に固定すればそれぞれ異なる病原体に対する複数の異なる抗体または異なる抗体特異性を単一テストで免疫化学的に検出できることも見出された。
【００８６】
さらにまた、本発明方法により認められる感度は少なくとも個別テストの感度には相当する。すなわち、例えば、本発明方法の場合に抗−ＨＩＶ 1/2および抗−ＨＣＶについて測定される感度特徴は少なくとも個別テストのそれらに相当する。
【００８７】
従って、望ましくない誤った陽性反応による干渉の受けやすさが本発明方法により低下するということも全く驚くべきことであった。すなわち、例えば本発明による抗−ＨＩＶ／抗−ＨＣＶの特異性をテストしたところ、得られた特異性は二つの個別テストの全体によって与えられるものよりも高かった。その結果、間違って捨てられる供血数は全体として減少させることができる。
【００８８】
従って本発明はさらに、特定の病原体の一以上のエピトープを担体に固定しそして該病原体の検出および／または測定を単一のテストで行うことより成る、それぞれ異なる病原体に対する複数の異なる抗体特異性を検出および／または測定するための免疫化学的方法にも関する。
【００８９】
ある種の課題、例えば縦断的検査のためには、異なる病原体の非鑑別同時測定を行うのが望ましいことがある。これは、様々な抗体間の区別をすることなくイエスの応答またはノーの応答（すべての抗体特異性について陰性）だけが得られることを意味する。
【００９０】
さらに、適切な場合には同時抗体検出の鑑別測定も望ましい。これは、本発明の範囲内において、例えば免疫測定テストにあっては、異なるウイルス特異的標識を有する抗原、例えばペルオキシダーゼを有するＨＩＶ１抗原、アルカリ性ホスファターゼを有するＨＩＶ２抗原およびβ−ガラクトシダーゼを有するＨＣＶ抗原を用いることにより、直接可能である。次に、同時結合した抗体特異性を順次または同時に測定することは、異なる酵素基質を用いることにより可能である。
【００９１】
別の形の鑑別法は、一つの抗体特異性を対応抗原を特異的に検体に添加することにより阻害することである。
【００９２】
すなわち本発明はさらに、検出および／または測定が鑑別的または非鑑別的に、好ましくは非鑑別的に、行われる、異なる抗体特異性を同時検出および／または同時測定するための免疫化学的方法に関する。
【００９３】
本発明による異なる病原体は、異なる特異性を有する抗体および一般に極めて低いまたはゼロの交叉反応性の対象となっている病原体を意味する。これらの例は、ＨＩＶ１＋２、ＨＣＶ、ＨＴＬＶＩ＋II、ＨＢＶまたはトレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、好ましくはＨＩＶおよびＨＣＶである。
【００９４】
対応抗体に対する高密度または高濃度の結合部位（エピトープ）を有する前記病原体の、特にＨＩＶ１、ＨＩＶ２およびＨＣＶの、抗原を担体に固定するのが特に有利である。このようにすれば、例えば、血清転化を確認でき、一般に高い正確さをもって陽性および陰性検体を弁別でき、遺伝子工学によるタンパク質調製に必要な発現系による干渉は一般に起こり得ず、ウイルス増殖上不可避である他の宿主細胞汚染は一般には存在せず、ヒト起源の血清、クエン酸加、ヘパリン加およびＥＤＴＡ血漿における異なる特異性を有するＨＩＶ−およびＨＣＶ−特異的抗体の一般に信頼し得る測定が保証され、また５６℃で６０分間検体を不活性化させれば誤った陽性結果を生じることはない。
【００９５】
好ましいものとして用いられるのは（特にＨＩＶ１および／またはＨＩＶ２およびＨＣＶの）ポリペプチド（それらは高感度抗ＨＩＶ／抗−ＨＣＶ検出に適している）、そしてさらに、組合せ抗体検出のスクリーニングテストの基礎として適したポリペプチド混合物より成る単一エピトープおよび／またはそれらの組合せである。
【００９６】
すなわち、本発明はＨＩＶ１および／またはＨＩＶ２およびＨＣＶのポリペプチド混合物にも関する。
【００９７】
以下のポリペプチドが特に好ましい：
１．HIV 1 (Ratner et al., Nature 1985, 313, 277〜284のナンバリングシステム)：
IV トランスメンブレンタンパク質(gp 41)：AA 580−AA 630
V エンベロープタンパク質（gp 120)：AA 490−AA 540
VI コアタンパク質（p 24)：AA 240−AA 390
２．HIV 2 (Gyader et al., Nature 1987, 326, 662〜669のナンバリングシステム)：
VII トランスメンブレンタンパク質(gp 36)：AA 570−AA 620
VIII エンベロープタンパク質 (gp 110)：AA 480−AA 530
IX コアタンパク質 (p 26)：AA 230−AA 380
３．HCV(WO 89/04669およびWO 90/11089のナンバリングシステム)：
X 非構造タンパク質４(NSP 4)：AA 121−AA 175
XI 非構造タンパク質３(NSP 3)：AA 1−AA 265
XII 構造タンパク質 (コア)：AA 1−AA 80
【００９８】
（特に非鑑別抗−ＨＩＶ／抗−ＨＣＶスクリーニングテストにとって）特に好ましいのは前記ポリペプチドの混合物であり、その一部を例示として記すが、考えられる可能性をそれらに限定するものではない：

【００９９】
一般に前記ペプチド混合物を用いれば診断用途に対するよりよい免疫学的性質が得られる。
【０１００】
ＨＩＶ１、ＨＩＶ２およびＨＣＶの以下のペプチドは特に適していることが判明した：
【化８】

【０１０１】
同様に、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２またはＨＣＶの異なるタンパク質領域からのさらなるペプチドも、これらのポリペプチドに免疫関連がある限り、一体化することができる。逆に、例えばＨＩＶ１およびＨＣＶペプチドの混合物を用いて抗−ＨＩＶ１／抗−ＨＣＶだけを同時測定するが例えば抗−ＨＢＶ／抗−ＨＩＶ１／抗−ＨＣＶは測定しないために、対応ペプチドを省くことにより非鑑別検出において特定の抗体を排除することも、例えば疫学的課題の上からは、有利なこともある。さらに、ＨＣＶとは同一でないペプチド、例えばまさにＨＩＶを、ＨＣＶペプチドについて前述した方法を同様にして誘導体化と修飾することもできる。
【０１０２】
本発明方法の大きな利点の一つは、異なる病原体に対する複数の抗体を単一のテストで検出ができ、しかもなお個別テストで達成し得るのと同じ高さの特異性または感度が達成される点である。
【０１０３】
下記の実施例は本発明の諸態様を記載したものであるが、本発明をそれらに限定するものではない。
【０１０４】
実施例１
ペプチド溶液の調製、およびこれらペプチドまたはペプチド混合物によるマイクロタイタープレートのコーティング
１〜１０mg／mlのペプチドを含む蒸留水中の５０％酢酸中の本発明ペプチド貯蔵溶液から０.１０Ｍ重炭酸ナトリウム（pH９.６）中の連続２倍希釈液を調製した、すなわちペプチド濃度が５０、２０、１２.５、６.２５、３.１２、１.５６、０.７８、０.３９、０.２、０.１、０.０５および０.０１μg／mlである一連の希釈液を得た。個別ペプチドの混合物についても手順は同様とし、０.１Ｍ重炭酸ナトリウムに希釈することにより、前述の通りの全体的最終濃度ではあるがいくつかのペプチドの混合物の場合にあってはそれらを等濃度で（１：１混合物の場合）または相互に対し様々な割合で含むものを得るために、前記貯蔵溶液を付加的に例えば１０：１または１：４というように様々な割合で混合した。
【０１０５】
それぞれについて、１００μlの希釈液をマイクロタイタープレート、タイプＢ（Nunc．Roskilde、デンマーク、により供給されたもの）の１６ウエルに入れた。希釈液を入れたテストプレートを２０℃で１８時間放置し、次いでウエル内の溶液を吸引により除去し、そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学的食塩水（ＰＢＳ、pH７.４）中の１０ｇ／リットル牛血清アルブミンの溶液３００μｌを用いて充填および吸引除去により３〜４回洗浄し、そしてそれらテストプレートを次いでシリカゲル上、２０℃で乾燥した。
【０１０６】
実施例２
ＩｇＧクラスのヒト免疫グロブリン（ｈ−ＩｇＧ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、および検出用ＴＭＢ基質の調製
KOEHLERおよびMILSTEINのモノクローナル抗体調製法（Nature 256, 495, 1975）によりｈ−ＩｇＧに対する抗体を調製し、同じ抗原特異性を有する異なるモノクローナル抗体をSTAEHLI et al. (J. of Immunological Methods 32、 297〜304、 1980）により記載された方法により確認した。ゲルクロマトグラフィーおよびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、pH７.４）に対する透析による精製後、モノクローナル抗体画分含有プール（タンパク質４mg／ml）を次いでTANAMORI et al. (J. Immunol. Meth. 62、 123〜131、 1983）により記載されている方法によりＮ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド（ＧＭＢＳ）（Behring Diagnostics社より入手）と反応させた。
【０１０７】
塩酸２−イミノチオラン（Sigma社により供給された。カタログ番号Ｉ６２５６）をKING et al. (Biochem. 17、 1499〜1506、 1978）により記載された方法により、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）(Boehringer Mannheim社より入手。カタログ番号４１３４７０）と反応させた。ＩｇＧ−ＰＯＤ接合体はＧＭＢＳ−ＩｇＧ接合体とイミノチオラン−ＰＯＤ接合体からTANAMORI et al. (supra)により記載された方法により調製した。
【０１０８】
得られたＩｇＧ−ＰＯＤ接合体溶液のタンパク質含量は３６０μg／mlであった。ＰＯＤ対ＩｇＧ比は２.８として測定された。その溶液を次に、５０ml／リットル牛胎児血清（ＦＣＳ）、５ｇ／リットルポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（^RTween２０）のＰＢＳ溶液を用いて５００ng／ml ＩｇＧ−ＰＯＤまで希釈しそして抗−ＩｇＧ／ＰＯＤ接合体と呼んだ。ＥＬＩＳＡに用いるために、次に０.５％ ^RTween２０を含有するｔｒｉｓ緩衝液（pH７.４）への希釈を（１：１００〜１：２０,０００希釈範囲で）様々に行って、０.１Ｍ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１,３−プロパンジオール（ｔｒｉｓ）、０.１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および０.１％ ^RTween（pH８.４）を含む接合体緩衝液中で均一に１：２６最終希釈液を調製した。従来技術に従って調製されたウサギポリクローナル抗体は使用の為に同じく１＋２５の希釈液が得られるように調節した。
【０１０９】
抗−ＩｇＧ／ＰＯＤ接合体の検出には、二つの貯蔵溶液から調製された過酸化水素およびテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を含む基質調製物または基質系を用いた。
【０１１０】
貯蔵溶液１：二塩酸ＴＭＢを撹拌しながら、５ｇ／リットル、すなわち１６mmol／リットル濃度で二重蒸留水に溶解しそして５規定塩酸でpH１.５に調節した。ペニシリンＧをこの溶液に撹拌しながら２００mg／リットル、すなわち０.５６mmol／リットルの最終濃度として添加した。
【０１１１】
貯蔵溶液２：１.４mlの氷酢酸、１.５mlの１規定ＮａＯＨおよび、２５０mgすなわち３mmolのＨ₂Ｏ₂（尿素／過酸化水素アダクトとして）を９００mlの二重蒸留水に添加した。溶解完了後、その混合物を二重蒸留水で１リットルとした。
【０１１２】
ＴＭＢ基質調製物：１容量部の貯蔵溶液１と１０容量部の貯蔵溶液２とを混合した。
【０１１３】
実施例３
従来技術
例として用いたのは市販のＥＬＩＳＡテストキット（ＨＰ１）であるが、このキットではＷＯ８９／０４６６９に記載されそして遺伝子工学により酵母で調製されるＣ−１００−３構築物が抗原として用いられている。ヒトの血清および血漿を検査するための手順は製造元の包装への差し込みに示されたものとした。例えば検体希釈は１：１１とし、血清のインキュベーションは１時間行い、抗ヒトＩｇＧ／ＰＯＤ接合体のインキュベーションは１時間行い、そしてＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を基質とする酵素基質系を用い、４９２nmで光度測定を行い、そして限界を設定した（０.４０Ｅの閾値を陰性コントロールの平均値に加える）。
【０１１４】
Ｃ−１００構築物のほかにコア領域およびＮＳＰ３領域（Ｃ３３Ｃ）からの付加的エピトープを含むもう一つの市販のＥＬＩＳＡ（ＨＰ２）に対して全く同様の手順を用いた。すなわち、ヒトの検体の検査にオリジナルテストキットを前述の如く製造元により説明された手順に関するすべての説明を順守して用いた。
【０１１５】
これに対し、前記二種類の市販品を用いてチンパンジーの血清または血漿中のＨＣＶ−特異的抗体を測定するための手順ではヒトＩｇＧに対するウサギで調製されたポリクローナル抗体を検出に用いた。このために、ウサギ抗血清のＩｇＧ画分を実施例２に記載のとおり精製し、透析しそしてペルオキシターゼ（ＰＯＤ）で標識した。予備テストで確認されたヒトＩｇＧに対する抗体の交叉反応をチンパンジーＩｇＧに信頼性よく適応させる（fashion over）ために、その最終濃度をモノクローナル抗−ＩｇＧ／ＰＯＤ接合体濃度の４倍に調節した。
【０１１６】
すべてのチンパンジーの初期値が高い値を示したので表１４〜１６に記載の如く限界設定を改める必要があった（表１４〜１６参照）。
【０１１７】
ＨＩＶ１およびＨＩＶ２抗体の非鑑別測定のための比較用抗−ＨＩＶ１＋２組合せテストは、合成的に調製されたＨＩＶ１およびＨＩＶ２のペプチドに基づく市販品（ＨＰ３）である。このテストの手順も製造元の包装への差し込みのそれとしたところ、例えば検体希釈は１：２とし、血清のインキュベーションは３０分間とし、接合体（抗−ヒトＩｇＧ／ＰＯＤ）のインキュベーションは３０分間とし、そしてテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を基質とする酵素基質系を用い、４５０nmで光度測定を行い、そして限界を設定した（０.２５０の閾値を陰性コントロールの平均値に加えた）。
【０１１８】
実施例４
本発明によるペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるＨＣＶに対する免疫グロブリンクラスＧのヒト抗体の測定
ペプチドまたはペプチド混合物を用いて前述の如くコーティングされたマイクロタイタープレートのウエル中、０.３Ｍｔｒｉｓ、０.３ＭＮａＣｌ、２０％ボビセリンおよび０.１％ ^RTween２０を含む検体緩衝液５０μｌに５０μｌの血清または血漿を添加した。３７℃で３０分間インキュベーション後、ウエル内容物を吸引除去し、そしてそれらウエルをＰＢＳ中に１ｇ／リットル ^RTween２０を含有する洗浄用緩衝液で５回洗浄した。次に最終希釈液中の接合体１００μｌを、好ましくはｔｒｉｓ、０.５％Tween２０中の１：３０００の予備的希釈液、および接合体緩衝液中の１：２６の最終希釈液を用いて、ウエルに添加した。３７℃で３０分間インキュベーション後、ウエル内容物を吸引除去しそして再び５回洗浄した。次に１００μｌのＴＭＢ基質調製物を各ウエルに加え、２０〜２２℃で３０分間インキュベートし、そしてインキュベーションを１００μｌの１規定硫酸の添加により止めた。着色溶液の吸光度をＰＢＳブランクを基準として用いて４５０nmの波長で測定した（Ｅ₄₅₀）。
【０１１９】
０.１０より高いＥ₄₅₀を生じた検体は抗−ＨＣＶ陽性として分類し、Ｅ₄₅₀が０.０５〜０.１０の範囲であった検体は抗−ＨＣＶ境界（マージナル）として分類し、そして０.０５より低いＥ₄₅₀を生じた検体は抗−ＨＣＶ陰性として分類した。
【０１２０】
表１は本発明ペプチド４０８３、および式Ｉで示されるより小さな配列の混合物を用いたヒトの検体についての実施例１、２および４に記載された測定から得られた結果をまとめたものである。表２のデータも同様にして本発明ペプチドＳＰ１０を用いて得られたものであり、両方のＥＬＩＳＡの結果をＨＰ１（実施例３）のそれと比較してある。
【０１２１】
表１
ペプチド４０８３を含むＥＬＩＳＡ、および固相上のより小さなペプチドの混合物を用いてヒトの検体の抗−ＨＣＶを測定した結果
【０１２２】
【表１】

【０１２３】
１）ｎ＝９７検体は０.１０Ｅの限界において＞２５の割合となる≫２.５Ｅの吸光度を示した。
【０１２４】
２）ｎ＝９４検体は＞２.５Ｅの吸光度を示した。それぞれわずか４および７検体の反応は比較的弱かったが、Ｅ₄₅₀値は０.８〜２.５（０.１０Ｅの限界）であり依然としてどちらかというと強い反応であった。
【０１２５】
表２
固相上に新規ペプチドＳＰ１０を含むＥＬＩＳＡを用いてヒトの検体の抗−ＨＣＶを測定した結果
【０１２６】
【表２】

【０１２７】
１）ｎ＝１４２検体は０.１Ｅの限界において≫２５の割合となる＞２.５Ｅの吸光度を示した；唯一の検体は１.２Ｅという値で比較的弱く反応したがそれでも市販ＥＬＩＳＡ（ＨＰ１）よりも相当に強い反応であった。
【０１２８】
市販テスト（ＨＰ１）で抗−ＨＣＶ陽性として分類されたすべての供試ヒト検体は同じく本発明ペプチドに基づくすべてのＥＬＩＳＡにより陽性であることが認められた。市販テスト（ＨＰ１）の結果と極めてよく一致するほか、ペプチドＥＬＩＳＡにおける極めて強度の信号形成も注目すべきである。同時に、健常供血者の縦断的検査結果からテストの干渉の受けやすさが極めて低いことが明らかとなっている。すなわち、血清および血漿の健常供血者をテストしたところ、本発明ペプチドに対する非特異的結合は極微にすぎなかった、換言すれば誤った陽性結果はほんのわずかにすぎなかった。
【０１２９】
表３は、実施例１、２および４による式（Ｉ）で示されるより小さな（１５アミノ酸）の使用に基づくＥＬＩＳＡを用いてヒトの検体をテストした際に得られたさらなる結果を示す。それらペプチドがＨＣＶ抗体のエピトープ規定に適していること、そしていくつかのペプチドの混合物（好ましくは３〜６種のペプチドを含有）としても抗−ＨＣＶ測定に適していることは明らかである。
【０１３０】
表３
実施例１による、マイクロタイタープレート表面上における１５アミノ酸より成るより小さなペプチドとヒト抗−ＨＣＶ陽性検体とのＥＬＩＳＡでの反応性；結果は４５０nmにおける吸光度（Ｅ₄₅₀）として報告する（−＝０.１０Ｅより低い陰性値）
【０１３１】
【表３】

【０１３２】
本発明ペプチドの混合物を用いて得られた反応性が示されている。このペプチドＥＬＩＳＡにより極めて強力な信号が形成されることから陽性および陰性結果が信頼性をもって弁別されることは明らかである。本発明による以下のペプチドまたはペプチド混合物を用いても同様の結果が得られた。
【０１３３】
４０７４／４０８１（各２μｇ／ml）
４０７４／４０８２（０.５および０.１２５μｇ／ml）
４０６０／４０７１／４０８１（各２μｇ／ml）、約１５ＡＡより成るより小さなペプチドの混合物が十分適していることがわかった：
４０５６／４０５５および４０５２（各０.５μｇ／ml）。
【０１３４】
本発明ペプチドのすべてについてテストした結果いずれの場合にも、検体反応性の地理的起源への依存性は認められなかった。
【０１３５】
実施例５
ＥＬＩＳＡ測定の至適化
様々に変えたＥＬＩＳＡ測定の可変パラメータは主に、コーティングに用いたペプチド濃度、またはペプチド混合物の場合にあってはそれらの全濃度および相互比であり、接合体濃度は１：３０００および１：２６希釈比で一定とした。さらにコーティング濃度は一定として接合体の予備的希釈率を変えた。いずれの可変変数も供血者の血清および血漿のテストによる特異性について、および陽性群における抗−ＨＣＶ測定による感度について確認した。さらにまた限界感度を抗−ＨＣＶ−陽性検体の連続希釈（抗−ＨＣＶ−陰性血清中で１：２、１：４など）による分析感度の形で測定しそして文献記載ペプチドを用いて得られた結果に対すると全く同様にして市販テストのデータと比較した。ヒトの検体について得られた結果を表４、５に例としてまとめる。
【０１３６】
表４、５
ペプチドＥＬＩＳＡ（４０８３）および市販テストによる抗−ＨＣＶ陽性血清および血漿の力価測定比較。比は特定信号を限界値で割った商として報告されており、また１よりも大きな値は陽性結果を示し、そして１より小さな値は陰性結果を示す。
【０１３７】
【表４】

【０１３８】
【表５】

【０１３９】
表４、５の結果から、血清力価測定の限界感度によって測定される本発明ペプチドに基づくＥＬＩＳＡの感度が比較のために同じ血清希釈比を用いてテストされた市販テストと少なくとも同程度に良いことは明らかである。実際、多くの場合において、市販テスト（ＨＰ１）においてすでに何回も陰性反応を与えていた希釈検体はこのペプチドＥＬＩＳＡによればなおも有意に陽性であると測定された。従って全体としては、本発明ペプチドを用いることによりＨＣＶ抗体の検出限界が向上するという結果が得られた。同じく新規ペプチドのその他のペプチド濃度、ペプチド配列または混合物を用いても同様の結果が得られた；例えば
４０８３（０.２５μｇ／ml）
４０７４／４０８１（各０.２５μｇ／ml）
４０７４／４０８２（各０.５μｇ／ml）
４０７４／４０８２（０.５および０.１２５μｇ／ml）
４０６０／４０８２（各２μｇ／ml）
【０１４０】
限界感度の測定のほか、至適系の場合には、非−ＨＣＶ−特異的抗体およびその他の潜在的干渉要因によって特異性についても検討した。その結果、本発明ペプチドを用いた抗−ＨＣＶ測定はＨＣＶに対して特異的であり、かついずれの既知の干渉、例えば他の抗体との交叉反応、熱失活による干渉などを受けないことが明らかとなった。さらにこのことは相対応して、感度を上げるべく均一に高血清濃度（検体緩衝液中１：２希釈比）を用いた記載の他の新規ペプチドまたはペプチド混合物についてもあてはまるが、それが可能であったのはペプチドの純度および固相上の高い抗原密度によるものである。
【０１４１】
本発明のもう一つのコアペプチドであるＳＰ１０とＨＰ１の比較を表６、７にまとめるが、これからも本発明ペプチドが従来技術に比べ、この場合は限界感度の向上すなわち分析感度の増大、を含む利点を有していることは明らかである。表６、７中の四つの力価測定は公表されているペプチドよりも２〜４倍も高い感度で測定され、また市販テスト（ＨＰ１）と比較した場合の倍率は８〜３２にものぼった。
【０１４２】
表６、７
コアペプチド（ＳＰ１０，２μｇ／ml）に基づくＥＬＩＳＡの分析感度の従来技術との比較。このために、陰性ヒト血清中の抗−ＨＣＶ−陽性ヒト血清の連続希釈液を調製し、そして本発明ペプチド（ＳＰ１０）に基づくＥＬＩＳＡによるテスト結果を市販ＨＣＶＥＬＩＳＡ（ＨＰ１）および文献（OKAMOTO et al）の図２により免疫関連ありと記載されているペプチドと比較した。すべてのデータは吸光度（Ｅ_450nm）を表わし、反応性ありとされる結果には下線を施してある。
【０１４３】
【表６】

【０１４４】
【表７】

【０１４５】
本発明によるもう一つのコアペプチド（ＳＰ２３）の評価も同様の結果を与えた。表８に示された比較結果から、感度に関しＳＰ２３がＳＰ１０と等価であること、および両方ペプチドが文献記載のペプチドよりも優れていることは明らかである。
【０１４６】
文献類似のペプチドＳＰ１２（ＡＡ４７−７５）は OKAMOTO et al.により記載されたペプチドとは厳密には対応しないが、中間配列（ＳＰ１１、Ａ２４−５３，表８）についての結果から、次の配列領域（ＡＡ３９−４７）には免疫関連エピトープは存在しないことは明らかであり、そしてＳＰ１１の極めて弱い反応性（なおも検出可能ではある）はそこに含まれるカルボキシ末端領域（図３に示されたオーバーラップ領域ＡＡ２４−３０）によるものとすることができる。
【０１４７】
表８
本発明による２種類のペプチドおよび公表された配列（ＡＡ３９−７５，OKAMOTO et al.）と新規構造物の間に位置するアミノ酸配列（ＳＰ１１，ＡＡ２４−５３，図３も参照されたし）のＥＬＩＳＡにおける免疫反応性の比較。すべてのデータは吸光度（Ｅ_450nm）を表わす。
【０１４８】
【表８】

【０１４９】
感度に関するこの驚くべき利点は未希釈検体のテストの際に特に明らかとなる。すなわち、表９に示された１１抗−ＨＣＶ−陽性検体のうち１１すべての検体が本発明ペプチドと反応することがわかった。これに対し文献記載のペプチドの場合にはわずか６検体しか陽性とならず、また市販テスト（ＨＰ１）で陽性反応示した例は全くなかった。両ペプチドと陽性反応する検体に関し、本発明ペプチドの方が同じテスト条件下において有意により強く反応することが顕著であるが、このことは、特に陽性／陰性弁別に対し相当な利点を与える。
【０１５０】
表９
ペプチドＥＬＩＳＡ（ＳＰ１０２μｇ／ml）の感度と従来技術との比較。このために、選ばれた１１個の自然の（native）ヒト抗−ＨＣＶ−陽性検体を本発明ペプチドに基づくＥＬＩＳＡでテストし、市販テスト（ＨＰ１）と、および文献（OKAMOTO et al.）において図３により免疫関連ありとして記載されているペプチドと比較した。すべてのデータは吸光度（Ｅ_450nm）を表わす。抗−ＨＣＶ−陽性検体ＨＣ９０−４９５もコントロールとしてテストした。
【０１５１】
【表９】

【０１５２】
コアペプチドを用いた力価測定（表６、７）および予め選ばれた自然血清から導かれたこれらの結果（表９）は市販血清パネル（ロット番号ＰＨＶ１０１およびロット番号ＰＨＶ２０１，Boston Biomedica, 米国）に対するテスト結果により確認された。
【０１５３】
特に、いわゆる低力価抗−ＨＣＶパネルの結果は表１０、１１にまとめ、そして混合力価抗−ＨＣＶパネルの結果は表１２、１３にまとめる。本発明によるコアペプチドを用いて得られたデータ結果を従来技術としての市販テストを用いて得られたデータと比較する。
【０１５４】
表１０、１１
表１０、１１は１５個の低力価で十分確認された抗−ＨＣＶ−陽性検体より成るパネルＰＨＶ１０１の自然抗−ＨＣＶ−陽性検体について、ペプチドＥＬＩＳＡ（ＳＰ１０，２μｇ／ml）の感度を従来技術と比較したものである（材料および比較テスト結果は Boston Biomedica（米国）により上市されたもの）。すべてのＥＬＩＳＡデータは比の値、すなわち検体吸光度のカットオフに対する比のである。＜１.０の値は陰性とし、また＞１.０は陽性とする。
【０１５５】
【表１０】

【０１５６】
【表１１】

【０１５７】
表１０、１１より、一つの例外（ＰＨＶ０１−０３）はあるが、すべての抗−ＨＣＶ−陽性検体が新規ペプチドに対し正しい陽性反応を与えることは明らかである。市販テストとの比較により、検体信号：カットオフ比により表わされる信号強度は比較のためにテストされるアッセイよりも本発明ペプチドを用いた場合の方が著しく強いことが顕著であるが、このことは新規ペプチドＥＬＩＳＡの信頼性が著しく向上したことを示している。
【０１５８】
これらのデータ（＞２５の比、これは＞２.５の吸光度に相当する）によれば、従来技術の定義により検体は低力価にすぎず、驚くべきことに新規ペプチドとは強い反応性を示すことがわかる。
【０１５９】
前記の一つの例外（検体０３）は本検体中にはコア特異的抗体が存在しないことを実証する確認テストにおける比較結果のデータによって説明される（Ｃ２２ｃは遺伝子工学により大腸菌において調製されるコアタンパク質である）。このテストによれば、検体０３は実際陰性として分類されるべきである。
【０１６０】
表１２、１３にまとめられた第２パネルについてのテストからも同様の所見が得られた：全部で２２抗−ＨＣＶ−陽性検体のうちの１９検体は、驚くべきことに、吸光度が２.５よりも大きく（＞２５の比に相当する）極めて強い陽性であることがわかる。パネルに含まれる３つの抗−ＨＣＶ−陰性血清は正しく陰性（＜１.０の比）として分類される。最後に、検体Ｎｏ.ＰＨＶ２０１−０８、−１０および−２０も問題の範囲内で正しいことがわかる。何故ならば、これら検体は確認テストによりコア特異的抗体を全く（−０８および−１０）またはほとんど（−２０）を示さないからである。
【０１６１】
表１２、１３は、様々な抗−ＨＣＶ力価を有する十分確認された抗−ＨＣＶ−陽性検体より成るパネルＰＨＶ２０１の自然抗−ＨＣＶ−陽性検体についてペプチドＥＬＩＳＡ（ＳＰ１０，２μｇ／ml）の感度を従来技術と比較したものである。（材料および比較テスト結果は Boston Biomedica により上市されたものである）。すべてのＥＬＩＳＡデータは検体吸光度をカットオフ値で割った商である比として与えられる。＜１.０の値は陰性結果を表わし、そして＞１.０の値は陽性結果を表わす。
【０１６２】
【表１２】

【０１６３】
【表１３】

【０１６４】
実施例６
本発明ペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるチンパンジー血清中の抗−ＨＣＶの測定
マイクロタイタープレートのウエルに吸着させた様々なペプチドおよびペプチド混合物を様々な感染量のＮＡＮＢＶに感染したチンパンジーからの血清を用いて試験した。接種後２週間ごとに採取した一連の検体を市販テストを用いてＧＯＴだけでなくＧＰＴについても測定し、またすべての検体を並行的にかつ本発明ペプチドを用いたＥＬＩＳＡにより測定した。実施例３の市販テスト（ＨＰ１）と同様に、ペプチドＥＬＩＳＡにはＰＯＤで標識されたポリクローナルウサギ抗体を４倍濃縮して検出に用い、また酵素基質ＴＭＢを用いて４５０nmで光度測定を行った。テスト手順は前述のヒト抗−ＨＣＶ測定に対応するものとし、０.１Ｅを固定限界としまた表１４、１５、１６の結果は特定の吸光度のこのカットオフ値に対する割合（比）として示したものである。
【０１６５】
表１４、１５、１６
市販テスト（ＨＰ１）およびＮＳＰ４領域からの本発明ペプチドまたはペプチド混合物を用いたＥＬＩＳＡによるチンパンジー検体の抗−ＨＣＶ測定。最初の３回値のデータは限界の設定に用いる吸光度であり、以後はそれをもとに特定信号と限界の比を求めた。
【０１６６】
【表１４】

【０１６７】
【表１５】

【０１６８】
【表１６】

【０１６９】
表１４、１５、１６に示された結果は、特にＡＬＴ経過（course）および市販テスト（ＨＰ１）からの相当する結果との比較において、本発明ペプチドの利点を際立たせている。
【０１７０】
すなわち、例えば、動物Ｎｏ.１２３は肝生検標本の電顕検査ではＮＡＮＢＨが検出されたのに市販テスト（ＨＰ１）では全く抗体−陽性とされていない。これに対し、４０８３に基づくＥＬＩＳＡを用いれば信頼性あるＨＣＶ抗体検出がＡＬＴ増加とほぼ同時に可能である。
【０１７１】
特に、動物Ｎｏ.０４８においては前述のすべてのペプチドまたはペプチド混合物を用いることにより陽性／陰性が鋭敏に弁別されるという意味において、極めて信頼性ある抗−ＨＣＶ検出がＡＬＴ増大とほぼ同時にまた市販テスト（ＨＰ１）の平均１８週間前に行われることから、ペプチドＥＬＩＳＡ結果がＡＬＴレベル増大と時間的に一致することは明らかである。ペプチド間を比較すると、４０６０と４０８１（アミノ−およびカルボキシル−末端配列）および中央構造を構成する４０９０の比較から明らかなように、中央アミノ酸配列が式Ｉの完全ペプチド（４０８３）による初期ＨＣＶ抗体認識に相当寄与していることが特に明白である。
【０１７２】
ＡＬＴとほぼ同時の同様のＨＣＶ抗体の初期確認結果は動物Ｎｏ.１４７の実験によっても得られ、その場合にはＡＬＴ増大とほぼ同時に、この場合にも市販テスト（ＨＰ１）を用いた場合よりも約１６〜１８週間早く信頼性ある抗体検出が可能である。
【０１７３】
表１７および表１８
ＨＣＶ感染した２匹のチンパンジーからの血清検体中の抗−ＨＣＶ測定。市販テスト（ＨＰ１）による結果を合成的に製造された本発明によるコアペプチド（ＳＰ１０，２μｇ／ml）と対比して示す。それら結果は特定信号と限界の比として示す。
【０１７４】
【表１７】

【０１７５】
【表１８】

【０１７６】
新規コアペプチドについて表１７および１８に示された結果は、特にＡＬＴ経過および市販ＥＬＩＳＡ（ＨＰ１）の対応結果と比較することにより、本発明ペプチドの利点を強調している。
【０１７７】
特に、動物Ｎｏ.０４８においては陽性／陰性が鋭敏に弁別されるという意味において極めて信頼性ある抗−ＨＣＶ検出がＡＬＴ増大とほぼ同時にまた市販テスト（ＨＰ１）の平均２０週間前に行われることから、コアペプチドＥＬＩＳＡ結果がＡＬＴ増大と時間的に一致することは明らかである。
【０１７８】
ＡＬＴとほぼ同時の同様のＨＣＶ抗体初期確認結果は動物Ｎｏ.１４７の試験によっても得られ、その場合、市販テスト（ＨＰ１）よりも約４週間早く信頼性あるＨＣＶ抗体検出が可能である。
【０１７９】
全体として、本発明によるペプチドおよび免疫化学的検出方法へのそれらの使用は、遺伝子工学により製造されたタンパク質および従来技術の他の合成ペプチドに基づくこれまでに記載されたすべての方法よりも相当に高感度であることがわかる。感染後期における感度向上の故に、新規ペプチドは付加的に、初期ＨＣＶ抗体を信頼性をもって測定することができる、従って現存している診断ギャップが著しく低下するという相当な利点を提供する。さらにまた、本発明によるペプチドは非特異的結合に対して感度が相当に低いが、これは動物の検体および人間起源の検体のいずれについても、市販テスト（ＨＰ１）に比べバックグラウンドが激減する（市販テスト（ＨＰ１）の場合最大０.４Ｅ₄₉₂であるのに対し最大０.１０Ｅ₄₅₀）ことによって少なからず表わされ、従って相当鋭敏な陰性／陽性弁別が可能となる。最後に、記述すべき有利な点は、全体的測定時間が短縮されることおよび検体量が５０μｌで比較的正確にペピットでとることができるので、正確度が増すことである。
【０１８０】
実施例７
ＮＳＰ４ペプチド４０８３およびコアペプチドＳＰ１０の混合物を調製するためのペプチド溶液の調製、およびこのペプチド混合物によるマイクロタイタープレートのコーティング
各々６mg／mlのペプチドを含む蒸留水中の５０％酢酸中のペプチドＳＰ１０および４０８３の貯蔵溶液から０.１０Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９.６）中の連続２倍希釈液を調製した。すなわち、ペプチド濃度が５０、２５、１２.５、６.２５、３.１２、１.５６、０.７８、０.３９、０.２、０.１、０.０５および０.０１μｇ／mlである一連の希釈液を得た。個別ペプチドの混合物についても手順は同様とし、０.１Ｍ重炭酸ナトリウムに希釈することにより、前述の通りの全体的最終濃度であるがいくつかのペプチドの混合物の場合にあってはそれを等濃度で（１：１混合物の場合）または相互に対し様々な割合で含むものを得るために、前記貯蔵液を付加的に例えば１０：１または１：４というように様々な割合で混合した。
【０１８１】
それぞれについて、１００μｌの希釈液をマイクロタイタープレート、タイプＢ（Nunc, Roskilde，デンマークにより供給されたもの）の１６ウエルに入れた。希釈液を入れたテストプレートを２０℃で１８時間放置し、次いでウエル内の溶液を吸引により除去し、そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学的食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７.４）中の１０ｇ／リットル牛血清アルブミンの溶液３００μｌを用いて充填および吸引除去により３〜４回洗浄し、そしてそれらテストプレートを次いでシリカゲル上、２０℃で乾燥した。
【０１８２】
１μｇ／mlの４０８３および１μｇ／mlのＳＰ１０濃度がペプチド混合物のコーティングに適していることがわかったが、これは表１９〜２１にまとめられそして実施例４および５に記載の如く行って得られた結果の基礎をなすものである。従来技術とのこれまでの比較とは対照的に、これからの比較はすべて実施例３に記載の如き市販の第２世代の抗−ＨＣＶＥＬＩＳＡ（ＨＰ２）に関連したものとなる。
【０１８３】
表１９および２０：
本発明によるＥＬＩＳＡおよび市販のＨＰ２に基づくデータは、いわゆる終点力価（end point titer）であり、これをもって抗−ＨＣＶ−陰性血清中の血清の最高予備希釈率（所与のテストにおいて再現性よく陽性であることが認められたもの）が規定される。
【０１８４】
【表１９】

【０１８５】
【表２０】

【０１８６】
表２１
血清および血漿を同時に得た９３０名の健常供血者に対するテスト結果
【表２１】

【０１８７】
実施例８
式XVIII、XIX、XXおよびXXIIで示されるペプチドを用いて式XIVによる混合物を調製するためのペプチド溶液の調製、およびこれらペプチド混合物によるマイクロタイタープレートのコーティング
ポリペプチドＳＰＨ９（式XVIII）、ＳＰＨ２０（式XIX）、４０８３（式XX）およびＳＰ１０（式XXII）を５０％酢酸（v/v）に６mg／ml濃度となるように溶解した。
【０１８８】
これら４種類の貯蔵溶液を実施例４に記載の如く様々な容量基準比で混合しそしてポリペプチド総濃度が０.２〜８μｇ／mlとなるように０.１０Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９.６）に希釈した。
【０１８９】
それぞれについて、１００μｌの各希釈溶液をマイクロタイター、タイプＢ（Nunc, Roskilde, デンマークにより供給されたもの）の１６ウエルに入れた。充填されたテストプレートを２０℃で１８時間インキュベートした。次にそれら溶液を吸引により除去し、そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学的食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７.４）中の１０ｇ／リットル牛血清アルブミンの溶液３００μｌを用いて３〜４回洗浄しそしてそれらテストプレートを次いでシリカゲル上、２０℃で乾燥した。
【０１９０】
実施例９
コーティング混合物のためのＨＩＶ１、ＨＩＶ２およびＨＶＣペプチド濃度の至適化、およびＥＬＩＳＡ測定および評価基準の至適化
実施例８に記載の４種類の貯蔵溶液について１：１：１：１比（ｖ／ｖ）から開始してコーティング溶液中のＨＩＶ１、ＨＩＶ２およびＨＶＣの各ペプチド最終濃度（単位：μｇ／ml）となるように、各場合の他の３ペプチドを一定に保ちつつ４種類すべての可変含量を相互に独立的に変化させた。すなわち

まで。
【０１９１】
これら混合物を実施例８に記載の如くマイクロタイタープレートに固定しそして実施例４および５に記載の如くＥＬＩＳＡで評価し、同じくペルオキシダーゼ標識抗体濃度もヒト免疫グロブリンＧに対して至適化した。
【０１９２】
対応する陽性ヒト血清の陰性ヒト血清中の連続希釈液により調製された低力価抗−ＨＩＶ１、抗−ＨＩＶ２および抗−ＨＣＶ検体より成る検体を用いて至適化の評価を行った。さらに同じく、バックグランド反応（すなわち所与の被覆されたマイクロタイタープレートへの非特異的結合）を規定できるようにいくつかの抗−ＨＩＶおよび抗−ＨＣＶ−陰性検体についてもテストした。
【０１９３】
選択基準として設定したのは、力価測定の為の一連のヒト抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ−陽性検体の測定における最大の特異性を有する信号、すなわち高い限界感度、と同時に、抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ−陰性検体に対するテストにおける低いバックグランドである。
【０１９４】
通常好ましいコーティング混合物をこれら基準に基づいて見出し、それより次の混合物を選んだ：

【０１９５】
１：３０００という実施例２の接合体濃度（および１：２６という均一な付加的最終希釈率）が好ましいことがわかり、そしてテストは実施例４におけると同様に行った。これまでの限界設定とは対照的に、これらの条件下では、陰性コントロール平均値と０.２５０Ｏ.Ｄ.の和よりも大きい４５０nmにおける吸光度を有する検体を抗−ＨＩＶ−および／または抗−ＨＣＶ−陽性として分類した（新しい限界設定）。
【０１９６】
これらの設定を以下の実施例１０〜１５に対し均一かつ不変に適用した。
【０１９７】
実施例１０
ＥＬＩＳＡによるＨＩＶ１、ＨＩＶ２およびＨＣＶに対する免疫グロブリンＧクラスのヒト抗体の測定
【０１９８】
式XIVのペプチド混合物を用いて実施例９の至適化条件下で表２２〜２４に示された検体を実施例４に記載の如くテストした。抗−ＨＩＶ１または２については、本発明方法の反応性を抗−ＨＩＶ１／２組合せテスト（Enzygnost^R 抗−ＨＩＶ１／２。Behringwerke ＡＧ社により供給されたもの。ＨＰ３）。Du Pont社により供給された市販のウエスターンブロット（抗−ＨＩＶ１および抗−ＨＩＶ２）をコントロールに用いた。２種類の異なるＥＬＩＳＡ方法（ＨＰ１およびＨＰ２）を用いてＨＣＶを検出した。
【０１９９】
表２２〜２４のデータから明らかなように、本発明方法を用いれば、ヒト起源の検体中の抗−ＨＩＶ１および抗−ＨＩＶ２および抗−ＨＣＶが安全にかつ信頼性をもって検出される。
【０２００】
表２２
抗−ＨＩＶ１／２組合せテスト（Enzygnost^R 抗−ＨＩＶ１／２，ＨＰ３）と比較された本発明方法による抗−ＨＩＶ１の測定
強反応性とは光度測定評価において吸光度が＞２.５であることを意味する；すべての抗−ＨＩＶ１−陽性検体はＨＣＶ−陰性である。
【０２０１】
【表２２】

【０２０２】
表２３
抗−ＨＩＶ１／２組合せテスト（Enzygnost^R 抗−ＨＩＶ１／２，ＨＰ３）と比較された本発明方法による抗−ＨＩＶ２の測定
強反応性とは光度測定評価において吸光度が＞２.５であることを意味する；すべての２８抗−ＨＩＶ２−陽性検体はＨＣＶ陰性である。
【０２０３】
【表２３】

【０２０４】
表２４
本発明によるＥＬＩＳＡ法による抗−ＨＣＶの検出
吸光度が＞２.５００に達した検体を強反応性とした。穏やかな強さの反応性を示す検体についてはいわゆる比を記すが、これは所与のＥＬＩＳＡのカットオフ値で検体吸光度を割った商を意味する。１.０より低い値は合意により（by agreement）陰性とする。１.０より高い値は陽性とされ、また得られる比が大きいほど反応性は強くなる；すべての抗−ＨＣＶ−陽性検体はＨＩＶ−陰性である。
【０２０５】
【表２４】

【０２０６】
実施例１１
従来技術と比較された抗−ＨＩＶおよび抗−ＨＣＶに対する本発明によるＥＬＩＳＡの分析感度の測定
本発明によるＥＬＩＳＡの分析感度の評価モデルとして、陽性検体の力価測定を用意しそして実施例９に記載のＥＬＩＳＡでテストした。全体として、抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ−陰性血清中で抗−ＨＩＶ１および抗−ＨＩＶ２−陽性ヒト血清の各々について３つの希釈液を調製し、そして限界感度は、新しい限界値（陰性コントロール平均値と０.２５０閾値の和）を用いて、特定のテスト系における依然として反応性を示す最後の予備希釈液として規定した。
【０２０７】
これら限界感度テストの結果を表２５（抗−ＨＩＶ１）、表２６（抗−ＨＩＶ２）および表２７（抗−ＨＣＶ）に吸光度としてまとめる。
【０２０８】
表２５
抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（Enzygnost^R 抗−ＨＩＶ 1/2）と比較された抗−ＨＩＶ１に対する本発明によるＥＬＩＳＡの限界感度の測定
３種類の抗−ＨＩＶ１−陽性検体をヒト抗−ＨＩＶ１−および抗−ＨＣＶ−陰性血清を用いて予備的な連続２倍希釈液を行い、そしてこれら希釈液を実施例３と同様にして、あるいは比較テストの製造元の包装体差し込みに従ってテストした。すべてのデータは吸光度（Ｅ₄₅₀）である。すべての抗−ＨＩＶ−陽性検体はＨＰ２において陰性反応を示した。
【０２０９】
【表２５】

【０２１０】
表２６
抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（Enzygnost^R 抗−ＨＩＶ 1/2）で比較された抗−ＨＩＶ２に対する本発明によるＥＬＩＳＡの限界感度の測定
３種類の抗−ＨＩＶ２−陽性検体をヒト抗−ＨＩＶ１−および抗−ＨＣＶ−陰性血清を用いて予備的な連続２倍希釈液を行い、そしてこれら希釈液を実施例３と同様にして、あるいは比較テストの製造元の包装体差し込みに従ってテストした。すべてのデータは吸光度（Ｅ₄₅₀）である。すべての抗−ＨＩＶ−陽性検体はＨＰ２において陰性反応を示した。
【０２１１】
【表２６】

【０２１２】
表２７
抗−ＨＣＶに対する本発明によるＥＬＩＳＡの限界感度の測定
ヒト抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ−陰性血清を用いて４種類の確認された抗−ＨＣＶ−陽性検体を予備的に連続２倍希釈し、そしてこれら希釈液を実施例３と同様にしてテストした。すべてのデータは吸光度（Ｅ_450nm）である。
【０２１３】
【表２７】

【０２１４】
抗−ＨＣＶに対しても手順は同様とし、４種類の抗−ＨＣＶ−陽性検体の連続希釈液を表２７に記載の如く調製し、抗−ＨＩＶと同様にテストおよび評価し、そして第２世代の市販抗−ＨＣＶＥＬＩＳＡ（ＨＰ２）を用いた結果と比較した。
【０２１５】
さらに、各供血の反応性の特異性についても、抗−ＨＣＶテストでは未希釈の抗−ＨＩＶ１−および抗−ＨＩＶ２−陽性検体を、そして逆に抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（Enzygnost^R 抗−ＨＩＶ 1/2）では抗−ＨＣＶ−陽性検体を検査することにより個別テストとしてテストした。
【０２１６】
表２５〜２７にまとめた結果から、抗−ＨＩＶ１および抗−ＨＩＶ２のいずれについても本発明によるＥＬＩＳＡの限界感度が抗−ＨＩＶ 1/2組合せテストの限界感度に相当することが明らかである。さらに本発明によるＥＬＩＳＡのＨＣＶ限界感度も市販の抗−ＨＣＶＥＬＩＳＡ（ＨＰ２）の限界感度に相当した。しかしながら、従来技術に従ってこれら３種類の抗体特異性を検出しようとすれば全部で少なくとも２種類のテスト（抗−ＨＩＶ 1/2組合せテストと少なくとも一つの抗−ＨＣＶテスト）が必要であるのに対し、本発明方法によればたった一つのテスト混合物を用いるだけで全く同じ信頼性をもってまた同等の感度をもってこの検出が可能となる。
【０２１７】
さらに表２５〜２７のデータから、この新しいＥＬＩＳＡにおける抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ−陽性検体の強反応性が特に有利であることが明らかである。何故ならば抗−ＨＩＶ検体は特異的抗−ＨＣＶテストで陰性に反応し、また抗−ＨＣＶ−陽性検体は特異的抗−ＨＩＶテストで陰性に反応したからである。
【０２１８】
実施例１２
本発明ＥＬＩＳＡによる感染初期からの抗−ＨＩＶ１−陽性検体（血清転化）の測定
合計３名の患者からＨＩＶ１感染の極く初期の間の規定の時点でくり返し採取された連続血液検体についてテストを行った。これらの血清パネルは市販されている（Boston Biomedica Inc., 米国）。本発明ＥＬＩＳＡにより得られた結果と抗−ＨＩＶ 1/2組合せテストとの比較を表２８に示した。
【０２１９】
表２８
すべてのデータは吸光度（Ｅ_450nm）であり、そして特定の限界値を超える値を陽性とすることができる。
【０２２０】
【表２８】

【０２２１】
表２８の結果から明らかなように、本発明によるＥＬＩＳＡは低力価抗−ＨＩＶ１−陽性検体を抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（Enzygnost^R 抗−ＨＩＶ 1/2）と全く同じ信頼性をもって検出する。同様に表２８のデータと比較することにより、本発明の新規ペプチドＥＬＩＳＡによりＨＩＶ１−特異的抗体の最初の検出が可能となる最も早い時点も、従来技術としての特異的個別抗−ＨＩＶ１テストと少なくとも同じ早さとすることができることが明らかである。
【０２２２】
実施例１３
本発明ＥＬＩＳＡによる低力価抗−ＨＩＶ１−陽性検体の測定
表２９は本発明の新規ＨＩＶ／ＨＣＶペプチドＥＬＩＳＡを用いた市販の抗−ＨＩＶ低力価パネルについてのテストで得られた結果を抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（Enzygnost^R 抗−ＨＩＶ 1/2）と比較したものをまとめて示したものである。
【０２２３】
Boston Biomedica, Inc. 社（米国）により供給された検体パネルは、抗−ＨＩＶ１測定法により低力価抗−ＨＩＶ１−陽性として分類された合計１５の検体より成る。
【０２２４】
表２９
Boston Biomedica Inc. 社（米国）により供給された低力価抗−ＨＩＶ１パネルについてのテスト結果
すべてのデータは４５０nmの波長における吸光度である。記載の限界値を超える値が陽性である。
【０２２５】
【表２９】

【０２２６】
表２９の結果から、抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（Enzygnost^R 抗−ＨＩＶ 1/2）に比べ、本発明によるＨＩＶ／ＨＣＶペプチドＥＬＩＳＡを用いるときはすべての検体が比較的強い反応性を示すことが明らかである。
【０２２７】
実際、パネルの４つの検体は本発明の新規ペプチドＥＬＩＳＡによれば抗−ＨＩＶ 1/2組合せテスト（Enzygnost^R 抗−ＨＩＶ 1/2）よりも強い反応性を示すが、このことは興味深いことである（Ｎｏ. １、２、１２および１５）。これらの検体についての付加的テストからＨＣＶ検体の同時存在が明らかとなったがこのことからも本発明方法による抗−ＨＩＶ１／−ＨＩＶ２および−ＨＣＶの非鑑別検出の信頼性が確認される。
【０２２８】
実施例１４
本発明ＥＬＩＳＡによる低力価抗−ＨＣＶ−陽性検体の測定
表３０に含まれる結果は、本発明の新規ＨＩＶ１／ＨＩＶ２およびＨＣＶペプチドＥＬＩＳＡ、およびBoston Biomedica Inc. 社（米国）により供給された低力価抗−ＨＣＶパネルを用いて得られたものである。さらにこの表３０は最新式の抗−ＨＣＶＥＬＩＳＡ（ＨＰ２）を用いて同一パネルについて得られたデータである。
【０２２９】
本発明によるおよび市販のＥＬＩＳＡについてのデータはいわゆる終点力価でありこれをもって、所与のテストにおいて再現性よく陽性であると認められた最高の予備的希釈率が規定される。
【０２３０】
【表３０】

【０２３１】
表３０の結果から、１４個すべての陽性検体が本発明ＥＬＩＳＡにより信頼性をもってかつ明白に陽性とされたことが明らかである。これに関し、信号強度が極めて高いことに注目すべきであるが、これは高い反応性によるものとすることができる。
【０２３２】
この高い特異性は表３０に示された限界感度にも反映されている。これらの検出限界は、自然ヒト検体を抗−ＨＣＶ−陰性血清中で予備的に連続２倍希釈し次いで実施例４と同様にテストすることにより規定されたが、その場合、依然として反応性が認められる最後の予備的希釈段階がいわゆる最終力価となる。
【０２３３】
これに基づいて、表３０のデータから、本発明による新規ＨＩＶ１／ＨＩＶ２／ＨＣＶペプチドＥＬＩＳＡが、事実、ＰＶＣ１０１パネルにおいて抗−ＨＣＶに対して従来技術よりも良い検出限界を有していることが明らかである。
【０２３４】
実施例１５
一群の健常供血者における新規ペプチドの非特異的反応率の測定
ＥＬＩＳＡにおける誤った陽性結果につながる非特異的反応頻度を測定するために全部でｎ＝５１２の健常供血者を用いた。さらに当該方法への凝固系の可能性としての干渉をも検査できるように、これらの供血者から血清と血漿を同時に採取した。
【０２３５】
これら３種類のテスト（本発明によるＥＬＩＳＡ、抗−ＨＣＶＥＬＩＳＡＨＰ２および抗−ＨＣＶ 1/2 ＨＰ３）（いわゆる初回テスト）のうちの一つで反応性のあった検体に同じテスト（いわゆる再テスト）をくり返し、そしてその反応性に再現性がある場合には、比較のための方法としての抗−ＨＩＶ１ウエスターンブロットおよび抗−ＨＣＶＥＬＩＳＡＣＨＰ１）で検査した。
【０２３６】
この確認法によっては、このスクリーニングにおいて前記３種類のＥＬＩＳＡのうちの一つで反応性を示した反応性検体のいずれも抗−ＨＩＶ１−または抗−ＨＣＶ−陽性であると確認することはできなかった。すなわち、スクリーニングで拒絶されたすべての検体は特定の方法において終始誤った陽性として分類された。
【０２３７】
表３１：
５１２個の血清および５１２個のいわゆる対合である血漿を同時採取したｎ＝５１２名の健常供血者のスクリーニング。初回テスト後の結果を示す；再テストの結果については表３２を参照されたい。
【０２３８】
【表３１】

【０２３９】
【表３２】

【０２４０】
最初の一連のテストの結果（初回時結果）は表３１にまとめられている。３個の血清（および２個の対合血漿）が本発明方法において反応性を示したのに対し、抗−ＨＩＶ 1/2 ＥＬＩＳＡでは１個の血清（および１個の相当する血漿）が反応性を示し、また抗−ＨＣＶＥＬＩＳＡでは５個の血清（および４つの相当する血漿）が反応性を示した。特定のＥＬＩＳＡで反応性を示した供血者は同一でなかった。
【０２４１】
これら９個の反応性血清についてテストをくり返したところ表３２に示される像が得られ、２個の血清（２個の対合血漿）は本発明によるペプチドＥＬＩＳＡで再テスト反応性を示し、１個の血清（１個の対合血漿）は抗−ＨＩＶ 1/2 ＥＬＩＳＡで反応性を示しそして４個の血清（４個の対合血漿）は抗−ＨＣＶＥＬＩＳＡで反応性を示した。
【０２４２】
これら検体のいずれについても抗−ＨＩＶ−および抗−ＨＣＶ−陽性であるとして確認することができなかったことから、表３２に示した特異性データは、検査されたＥＬＩＳＡの各々および血清および血漿について、（全５１２個の血清および５１２個の血漿のうち）正しく陰性と認められた検体の率（％）を計算することにより測定されたものである。
【０２４３】
表３２のデータに基づくと、各供血時に義務付けられている従来の抗−ＨＩＶおよび抗−ＨＣＶテストによるときは、全部で５名の供血者が排除されねばならなかったであろう。すなわち、１名の供血者は抗−ＨＩＶ 1/2テストにおいてくり返し誤った陽性を示しそして４名の供血者は抗−ＨＣＶテストにおいてくり返し誤った陽性を示した。これに対し本発明によるＥＬＩＳＡによるときは、ひょっとして誤った反応を示す供血者数は２名に過ぎない。
【０２４４】
要約すると、抗−ＨＩＶ１、抗−ＨＩＶ２および抗−ＨＣＶの同時非鑑別検出のための本発明の新規ペプチドＥＬＩＳＡは、現在有効な感度基準からして、一方において抗−ＨＩＶ 1/2および他方において抗−ＨＣＶの個別テストの各々至適の性能に少なくとも相当するということができる。すなわちパネル、すなわち抗−ＨＩＶ１および／または抗−ＨＩＶ２および／または抗−ＨＣＶを含む自然検体からのデータは、低力価抗−ＨＩＶ１または抗−ＨＩＶ２または抗−ＨＣＶ検体の限界感度および最先認識時点についてのテストと全く同様に同等の効率を示している。従来技術によるときはこのようにして３種類の異なるテスト、あるいは抗−ＨＩＶ 1/2組合せテストに徴すれば２種類の異なるテストを用いて初めてこれら３種類の抗体特異性が可能であるのに対して、本発明によるＥＬＩＳＡには効率は同じであるのに１種類のテストしか必要でないという利点がある。特に、抗−ＨＩＶ１、抗−ＨＩＶ２および抗−ＨＣＶのテストの実施が義務付けられている血液銀行にとって、本発明の新規ペプチドＥＬＩＳＡは、抗−ＨＩＶ１、抗−ＨＩＶ２および抗−ＨＣＶの測定において、少なくとも同じ信頼性および安定性をもって、相当な労力および費用の軽減となる。
【０２４５】
さらに、この新規テストの干渉の受けやすさを測定したところ、全く驚くべきことに、特異性が極めて良好である、すなわち誤った陽性結果数がほんのわずかであるため、抗−ＨＩＶ 1/2テストとそれとは別に抗−ＨＣＶテストを有する従来のスクリーニング手順に比べ、より少ない再テストおよびより少ない確認テストで済み、また拒絶されねばならない供血も少なくて済むことがわかった。このことは本発明方法による方法が式IV〜XIIおよびXIII〜XVIIで示されるＨＩＶおよびＨＣＶペプチドの他の群によっても提供される経済的および化学的利点を有していることを意味している。
【０２４６】
本発明による方法は限界感度の最大至適化が最も重要となっている他の課題にも極めて適している。すなわち、他のテスト条件下で、あるいは例えば実施例１０〜１４における計算により、幾分好ましさに欠ける特異性データ（とはいえ依然として従来技術水準には相当する）でよしとするのであれば、従来技術よりも著しく向上した感度特徴を本発明方法により得ることが完全に可能であることを示すことができる。
【０２４７】
例えば、限界値（実施例９）が０.１吸光度まで低下したとすれば、抗−ＨＩＶ１、抗−ＨＩＶ２および抗−ＨＣＶに対するすべての限界感度は相当に（少なくとも２倍）改善されることになろう。健常供血者のスクリーニングにおいて非特異的、すなわち誤った陽性、反応を示す検体率として全部で５名の供血者（くり返し反応性を示した）が得られる（実施例１５）。これは２種類の個別テストの結果に完全に相当するが、抗体検出感度は相当に向上した。
【０２４８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｃ−１００−３のＯＲＦ領域のアミノ酸の一次配列（ＷＯ／８９／０４６６９より）。
【図２】式Ｉおよび式IIの本発明による配列とＣ−１００−３のＯＲＦ領域からの既知ペプチドとの比較。
【図３】ＨＣＶコアタンパク質の本発明による配列と既知ペプチドとの比較。

Claims

ＨＣＶに対する抗体と特異的に反応し、そしてそのアミノ酸配列が下記のアミノ酸配列であるペプチド：
請求項１に記載のペプチドを含むＨＣＶ抗体の検出および／または測定のためのペプチド混合物。
ペプチド化学により合成された請求項１または２に記載のペプチドまたはペプチド混合物。
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド混合物を用いるＨＣＶに対する抗体の検出および／または測定のための免疫化学的方法。
請求項１に記載のペプチドが固定されている一以上の担体を含む、ＨＣＶに対する抗体の検出および／または測定のための免疫学的テストキット。
担体がポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミドおよびその他の合成ポリマー、天然ポリマーおよび誘導体化された天然ポリマー、およびガラスより成る群より選ばれる請求項５に記載のテストキット。
担体がポリスチレンである請求項６に記載のテストキット。