JPH04330098A - Hcv−特異的ペプチド、それらのための剤およびそれらの使用 - Google Patents
Hcv−特異的ペプチド、それらのための剤およびそれらの使用Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
原の免疫化学的測定のためのポリペプチドおよびこの方
法に適した剤およびその使用に関する。
テストにより、それぞれ異なる病原体に対する複数の異
なる抗体特異性を同時に検出するおよび/または同時に
測定するための免疫化学的方法に関する。
疾病または臨床像群として、ウイルス関連であり、また
様々な肝炎ウイルス例えば肝炎Aウイルス(HAV)、
肝炎Bウイルス(HBV)、肝炎Dウイルス(HDV)
および肝炎E(HEV)などによる他のウイルス誘導臨
床像からは区別できるものとされている。最後に、サイ
トメガロウイルス(CMV)またはエプスタインバーウ
イルス(EBV)による肝炎を診断することもできる。
くとも2タイプの非A/非B肝炎を定義することができ
る:水および食物により伝搬される流行性肝炎ウイルス
(経腸的に伝搬されるNANBV)、および血液、針刺
しまたは同様の経路により伝搬される輸出後肝炎ウイル
ス(血液により伝搬されるNANBV)。これらの感染
経路のほかに、特発的に発生するNANBV(“市中感
染NANBV(community acquired
NANBV)”)として、前述の2タイプとは明白な
関連がない伝搬の存在も知られている。NANBHの原
因となる作用体またはウイルスの正確な数は分っていな
いが最近、いわゆる肝炎Cウイルス(HCV)がこの病
気の一原因病原体として確認された(WO89/04
669)。
原の血清学的測定および/またはそれらに対する抗体に
基づいていており、それらテストはHAV、HBV、H
DV、HEV、CMVまたはEBVという肝炎病原体群
からのパラメータに対して特異的である。このいわゆる
排除法においてはNANBHはすべての前記測定が陰性
のときだけ診断された。
PT(グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、A
LTすなわちアラニンアミノ基転移酵素とも呼ばれる)
または抗HBc(肝炎Bコア特異的抗体)も用いられて
いる。しかしながら、これらの助剤は信頼性ありとする
ほど感度、特異性いずれも十分でない。従って、輸血患
者の約10%に発生する輸血後肝炎症例のほんのわずか
な一部を供血者検査によって回避することはできる。特
異的テスト導入が緊要のことであることはNANBVが
輸血後肝炎症例の約90%にあたるとされていることか
ら強調される。この疾病にともなう主たる問題は、25
〜55%の感染者が慢性肝傷害にかかるということであ
る。
特異的抗体の特異的検出の基礎が提供された。HCVお
よび、HCVゲノム部分の相当するcDNA複製物の単
離および確認はWO 89/04 669の主題となっ
ており、そこではHCVはフラビ(flavi)様ウイ
ルスのファミリーに属するとされている。さらにそこに
は、HCV抗原をHCV−特異的抗体検出に用いること
、および患者血中抗原の診断測定のために抗体を産生さ
せる(raise)することも記載されている。
に転写解読枠(open reading frame
,ORF)からのいわゆる非構造タンパク質(NSP)
が用いられるが、それらは免疫化学的検出方法における
反応剤として使用される。
あいにおいては、均一(溶液中)または不均一(固相使
用)イン・ビトロ法として、体液、例えば血清、血漿、
唾液、脳脊髄液または尿中の免疫グロブリンクラスA、
D、E、GまたはM(IgA、IgD、IgE、IgG
またはIgM)の抗原および/または抗体の測定を可能
にするあらゆる方法を包含する。イムノアッセイとも呼
ばれるこれらの方法の例は、酵素イムノアッセイ(EL
ISAまたはEIA)、ラジオイムノアッセイ(RIA
)、イムノフルオレセンスアッセイ(IFA)、ラジオ
イムノプレシピテーション(RIPA)、寒天ゲル拡散
などである。
IV特異的抗体(抗−HCV)の検出のために、ELI
SA法にそこに記載されている抗原C−100−3を用
いている。NSP3/4領域からの構築物(コンストラ
クト)C−100−3(これは酵母細胞中で遺伝子工学
により発現される)は363アミノ酸より成り、その配
列は図1に示されているが、図中のナンバリングシステ
ムは前記特許のそれに対応している。
CVを測定するためのELISA法で達成し得る最高感
度は、慢性NANB患者の場合で約80%そして急性N
ANB患者の場合で約30%と推定される。患者(ヒト
)からの血液についてのこれらの知見はNANBV感染
チンパンジーについての対応する研究によって支持され
ている。
築物に基づく抗−HCVの陽性検出は、ALT増加が生
じてから約6〜18週間までは成功せず、そしてその後
にNANBV接種してから3〜10週間後に病気の徴候
として認めることができる。すなわち、チンパンジーが
感染してから9〜26週間が、C−100−3構築物を
用いた従来のイムノアッセイによりHCV特異的抗体を
検出できるまでの総時間であることがわかる。
CV検出に使用できるHCVアミノ酸配列を記載してい
る。しかしながら、特定のタンパクセクションの診断上
の関連については全く記述がなく、また免疫優性(im
munodominant)エピトープの例も存在しな
い。
する上での基本的問題は誤って陽性および誤って陰性に
反応する検体がなおも存在することである。誤って陽性
となる検体は健常供血者群の40%にも到ることがある
(WEINERA., et al. Lancet1
990, Vol. 336, p. 695)。 従って、特異的かつ鋭敏なHCVテストがないというこ
とは、誤って反応するわずかとはいえない割合の検体が
献血センターにおいて間違って捨てられていること、そ
して同時に実際には抗−HCV−陽性である患者がなお
も信頼性をもって確認されないということを意味してい
る。
はC−100−3のORF領域(WO89/04 66
9より。図1)の特定配列を選びそしてそれらをイムノ
アッセイに用いている(ペプチドSP 42、117、
67および65。図2)。NANB感染チンパンジーの
研究の際には、診断上の価値を向上させることはできな
かった。逆にそこでなされた所見からは、記載ペプチド
はいずれも信頼性あるIgGまたはIgM測定の基礎と
して役立てるには不適切であるという結論となる。何故
ならば感度が不十分であり、また抗体検出までに少くと
も7〜17週間という診断ギャップは従来の検出方法と
比較しても時間短縮が無いことを意味しているからであ
る。さらにまた、特にSP 42は20〜40週間にわ
たる診断ギャップがあり診断テストに適していないこと
が分った(SAFFORD J., et al. I
nt. Symp.on Viral Hepatit
is and Liver Disease 1990
Houston, USA)。
ペプチドは、このペプチドについてはわずか抗HCV−
陽性検体の86%の確認しか可能でなかったが免疫優性
であるとされている。(DAWSON, G.J.,
et al. Int. Congress of V
irology 1990, Berlin, FRG
)。
改良できたとされている(OKAMOTOH., et
al. Japan. J. Exp. Med.
1990, Vol 60, No. 4, p. 2
23〜233)。 これはHOPPおよびWOOD(Proc. Nat.
Acad.Sci. 1981, Vol. 78,
p. 3824〜3828)により特定された物理化
学的予想基準を用いてコアアミノ酸配列1〜120の全
部で3つの潜在的抗体結合部位からある配列を選択する
ことより成る(OKAMOTO, H. et al.
, Japan. J. Exp. Med. 199
0, Vol. 60, No. 3, p. 167
〜177)。このペプチドは図3に示されているがNo
.39からNo.74までの番号の36アミノ酸より成
っている。
コアペプチドに基づくELISAを用いて一部の抗−H
CV−陽性血清中のHCV抗体を検出することができた
。この知見は、HCV RNA検出にポリメラーゼ連鎖
反応(PCR)を用いた比較研究によって確認された。
た26の抗−コアHCV−陽性検体(4.3%)から、
まさにわずか10例(1.65%)しかPCRによって
は確認し得ないことが明白となっている。逆に16名の
供血者(2.15%)はこのペプチドに対し誤って陽性
に反応した。すなわち、前記コアペプチドは場合によっ
ては抗−C−100テストよりも抗−HCV検出法に適
しているとされているが、従来のコアペプチドは一般に
相当な干渉されやすさを伴う。
早くかつ高い特異性をもって検出できるテストを開発す
るという目的に基づいたものである。
ORF領域および/またはHCVコア領域のアミノ末端
領域の区域からのある種のポリペプチドがHCV−特異
的抗体の検出に特に適していること、そして従来のペプ
チドに比べて感度が顕著に増大すると共に望ましくない
誤った陽性反応による干渉の受けやすさが著しく低下す
ることを見出した。
た免疫化学的検出方法においては、高い抗原濃度、従っ
て高いエピトープ密度、が達成されることを見出した。 これは特に、干渉する異物が存在しないために、高度に
濃縮された患者検体の検査が可能な場合に可能である。
び後期HCV抗体の免疫優性エピトープを有し、従って
縦断的検査(longitudinal invest
igation)の特に有利に用いることができるとい
うことも全く驚くべきことであった。
と特異的に反応するペプチドまたはペプチド混合物、C
−100−3のORF領域および/またはアミノ−末端
HCVコア領域の一部を含むそれらのアミノ酸配列に関
する。
、本発明の範囲において、約80AA以上のペプチドに
等しいものとして用いられる。
100−3として記されるHCVゲノムセクションのA
A 121〜AA 175(式I)およびAA 337
〜AA363(式II)のアミノ酸配列より成り、以下
の配列を有している:
化12】
末端領域からの配列は、HCV感染の後期抗体検出に有
益であることがわかった(例えばペプチド4081、4
056、4055および次の4060):
む、C−100−3のORF領域のカルボキシル−末端
領域(例えば4091)は、後期抗体の検出に特に適し
ていることが分った。
の初期確認に関係している。この関連で好ましいのは前
記ポリペプチド4071および4072、およびペプチ
ド4054、4053および4052である。
プチドにおいてつきとめられたが、そのうちの一つ(S
)は後期抗体を認識し、そして他方(F1およびF2)
は初期抗体を認識する。好ましいペプチドの例は以下の
アミノ酸配列のうちの一つを有している:AAa1−D
REVLYR−BAb1 (S)AAa2−QHLP
YIE−BAb2 (F1)AAa3−KQKALG
L−BAb3 (F2)式中AAおよびBAは任意の
所望のアミノ酸であり、またa1〜a3およびb1〜b
3は、各々相互にの独立的に、0より大きい、または0
に等しい整数である。
末端アミノ酸配列および式IIの配列と共に選ぶのが有
利である。約130〜160の式Iの中央アミノ酸配列
はそれらとは別個に用いることができる。
−末端HCVコア領域の一部、好ましくはコアとして記
されるHCVゲノムセクションのAA 1〜AA 35
のアミノ酸配列より成り、次の配列を有する:MSTN
PKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQ
IVGGVYIII
に好ましい。
染の急性期からの初期抗体と後期抗体との両者を確認す
ることができるが、これによってこれらペプチドに基づ
く検出感度は従来技術に比べ相当向上する。もう一つの
利点はペプチドの高特異性であり、これによって一般に
、誤った陽性反応を示す検体数は少くなる。
異的なペプチド、連結ペプチドまたはペプチド混合物を
用いるのが有利である。何故ならば、両タイプの結合部
位があるので感染初期からの検体と感染後期からの検体
との両者を確認できるからである。さらにまた、HCV
−特異的IgGおよび/またはIgM抗体による血清転
化を信頼性よく確認でき、また一般に陽性および陰性検
体を、極めて高い正確さをもって弁別することができる
。さらに、一般的に、遺伝子工学によるタンパク質調製
に必要な発現系、あるいはウイルス増殖のためには不可
避である他の宿主細胞汚染による干渉もない。さらに一
般に、ヒト起源の血清、クエン酸加、ヘパリン加または
EDTA血漿中のHCV−特異的抗体の信頼し得る測定
が保証され、また検体を約56℃で約60分間不活性化
すれば一般に誤った陽性結果を与えることはない。最後
に、本発明によるこれらペプチドを用いて調製された特
異的抗体を用いれば、細胞不含患者血中の対応抗原の免
疫化学的測定によって診断ギャップをさらにうめること
ができる。
期のまた慢性感染患者からのHCV−特異的抗体および
/または感染急性期からのHCV抗体を確認する一連の
新規ペプチドが記載され、また無差別ではあるが極めて
鋭敏にかつ干渉をほとんど受けることなく抗−HCV抗
体を検出するためのスクリーニングテストの基礎として
適当なポリペプチドおよびポリペプチド混合物が記載さ
れている。
F領域またはコア領域の前述のペプチドの少くとも一つ
に対してバイオスペシフィック(biospecifi
c)アフィニティを有する抗体に関する。
る抗体で免疫化学的に測定することにより内生抗体が出
現する前であってもHCVの存在を確認することができ
る。
抗原として用いたHCV抗体を検出および/または測定
するための免疫化学的方法に関する。
体に対して特異的に反応する一以上のペプチドと後期抗
体に対して特異的に反応する一以上のペプチドとを別々
の混合物として検体と反応させることより成る、感染初
期と後期の鑑別診断方法に関する。
、特にヒト、において産生させるのに用いることに関す
る。
治療目的に用いることに関する。
チドの少くとも一つを単独でまたは他のペプチドまたは
抗体と共に含む剤に関する。
子工学により、好ましくは当業者に知られた方法による
合成により製造できる。ペプチドの化学合成は例えばB
ARANI,G.およびMERRIFIELD,R.B
.が“The Peptides, Analysis
, Synthesis and Biology”,
Vol. 2, Academic Press 1
980,ed. Erhard Gross, Joh
annes Meyenhoferに記載しているとお
り、特にポリペプチドとして、またはオーバーラップま
たは非オーバーラップアミノ酸配列を有するいくつかの
小ペプチドの混合物として行うことができる。
はその融合部分が後で除去されてしまう融合タンパク質
を含む。さらに、適切な場合には例えばグリコシル化、
アセチル化またはホスホリル化により修飾されたポリペ
プチドが包含される。
ておよびオーバーラップまたは非オーバーラップアミノ
酸配列を有するいくつかの小ペプチドの混合物として合
成することができる。
が、前記構造の単一ペプチドよりも、免疫化学的抗−H
CV検出にとって良い診断特性を有することがあること
も見出した。C−100−3のORF領域およびコア領
域のペプチドの混合物を用いるのが特に有利である。
の一以上を含むペプチドの混合物に関する。
ド、好ましくは2〜10、特に2〜4個のペプチドをブ
リッジを用いまたは用いずに連結する。それらペプチド
の長さは好ましくは6〜15個のアミノ酸である。二以
上のペプチドのポリマー体を当業者に知られた方法によ
り製造しそして担体例えばタンパク質またはラテックス
粒子に結合することさえもできる。すなわち、担体また
はブリッジとして特に適しているのは例えばヒト血清ア
ルブミンおよび/またはポリリジンである。それらペプ
チドを1〜40、好ましくは1〜20、特に1〜10個
のアミノ酸で延長することにより修飾することも同じく
可能である。付加的領域および構造は、ペプチド全体の
物理化学的挙動に対し有益な効果をもつことがあるが、
ペプチドまたはその部分の免疫反応性は維持されるべき
である。
たは用いないで相互に連結され、あるいは担体に結合さ
れ得るペプチドに関する。
受動吸着または共有結合特性を有益に変え、カプリング
方法に有利な効果を有し、あるいは該ペプチドに対する
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生させる
場合に抗原としてより強力に働く。
−QRKTKRNTNRRPQDVK−BAm(式中A
AおよびBAは任意の所望のアミノ酸であり、そしてn
およびmは各々相互に独立的に0〜約60、特に1〜4
0の整数である)で示されるペプチドに関する。
を相互にまたは担体に連結させるために一以上のアミノ
酸、好ましくはシステインをアミノ−末端またはカルボ
キシル−末端に結合することにより、チオグリコール酸
アミド化により、例えばアンモニウムまたはメチルアミ
ンなどでカルボキシル−末端アミド化することにより、
ペプチドを誘導体化するのが有利である。このタイプの
修飾はポリペプチド上の正味荷電を変えそしてペプチド
の物理化学的特性を改善しあるいは固体担体、担体タン
パク質または別のペプチドへのペプチドの共有結合を容
易にすることがある。さらに当業者は、本発明ペプチド
がそれら自体の間であるいはそれら自体を用いて遺伝子
工学または合成により複数の免疫関連エピトープが一つ
のペプチド上に局在するように調製され得ることも知っ
ている。
酸の置換、付加または欠失により修飾された本発明によ
るアミノ酸配列を有するペプチドに関する。
疫反応性を直接変化させることはないが、ペプチドの免
疫学的性質を向上させることは完全に可能である。すな
わち、例えば、メチオニンは自然酸化しやすいが、これ
はノルロイシン置換によりポリペプチドの抗原特性を本
質的に変えることなく防ぐことができる。
点を伴い得る広範にわたる様々な改変例えば欠失、挿入
または置換に付すことができることを知っている。この
タイプの修飾は例えばGly、Ala;Val、Ile
、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、
Thr;Lys、Arg;Phe、Tyr;Ala、S
er;Ala、Thr;Ala、Val;Ala、Pr
o;Ala、Glu;Leu、Gln;Gly、Phe
;Ile、SerおよびIle、Metなどの組合せに
関する。
20個の疎水性アミノ酸より成る疎水性配列、例えばP
he Ala Phe Ala Pheなどの付加の形
で向上させることも有利なことがある。
とも一つをコードするDNA配列に関する。
本発明によるDNA配列の少なくとも一つと相補的であ
る少なくとも一つの核酸プローブが用いられるハイブリ
ダイゼーション反応を特異的段階として用いるHCVの
検出および/または測定のための分析方法に関する。免
疫化学的検出は一般に均一(溶液中)または不均一(固
相使用)方法として抗原および/または抗体の測定を可
能にする方法を含む。イムノアッセイとも称されるこれ
らの例は酵素イムノアッセイ(ELISAまたはEIA
)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、イムノフルオレ
センスアッセイ(IFA)、ラジオイムノプレシピテー
ションアッセイ(RIPA)または寒天ゲル拡散アッセ
イなどである。
の態様ごとに、検出に用いたマーカーまたは測定原理(
例えば光度測定、放射性測定、視認、または凝集、散乱
光またはプレシピテーション挙動)、および固相につい
て相違している。当業者は結合および遊離検体抗体また
は抗原の分離は広く用いられてはいるが例えばいわゆる
均一アッセイでは絶対必要というわけではないことを知
っている。不均一イムノアッセイ、特に不均一ELIS
A法が好ましい。
irmatory test)”という用語が、ドット
(dot)法と称されるテストが名前により抗原の固定
の仕方を説明しているにすぎないのと同様、イムノアッ
セイの使用を説明しているにすぎないことを知っている
。
ド配列とある時点で接触させて特定の方法の特定の段階
で抗原−抗体複合体を形成しあるいは競合および阻合テ
ストにあっては適当な標識試薬の添加によりその形成を
防ぐことが免疫化学的検出方法の前提要件である。
ドと、あるいは標識されたペプチドと、あるいは両者と
接触させることができ、基本となる方法が、1−、2−
または多−段階法として、同一のまたは異なるペプチド
(またはペプチド混合物)を固相上におよび検出用液状
試薬としておよび特異的ないわゆる捕獲抗体(例えば抗
IgM)またはアフィニティー試薬(例えばプロテイン
A)との組合せで用いた免疫測定テストデザイン(二重
抗原サンドイッチ)または第二抗体テストの原理に基づ
くかどうかは重要でない。
吸着により、または特異的抗体または同様のアフィニテ
ィー法を用いて、例えばビオチン/アビジン複合体を介
して、しかし好ましくは吸着により結合させることがで
きる。
スチック例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリア
ミドおよびその他の合成ポリマー、天然ポリマー例えば
セルロースおよび誘導体化された天然ポリマー例えばセ
ルロースアセテートおよびニトロセルロース、およびガ
ラス(特にガラス繊維など)などである。ポリスチレン
が担体材料として適している。
イクロタイター(microtiter)プレートの形
態、あるいは懸濁液例えばラテックス粒子の形態とする
ことができる。シート様構造物、例えば紙片、小プレー
トおよび膜も同じく適している。担体表面は水性溶液に
対して透過性があるもの、ないものいずれであってもよ
い、
エル、微粒子、紙片および膜である。特に好ましい担体
はマイクロタイタープレート、ラテックス粒子、ポリス
チレンビーズまたは磁力に従いやすい粒子である。
度は一般に約0.01〜20μg/ml、好ましくは0
.01〜10μg/ml、特に好ましくは2〜10μg
/mlである。その高純度および強度の抗原性により、
例えば0.01〜2.0μg/ml、好ましくは0.1
〜0.5μg/mlという少量の使用を可能にする合成
により製造されたポリペプチドを用いるのが特に有利で
ある。担体の結合能は、特にポリスチレンを用いる場合
、一般的に飽和してしまうことはないので通常、複数の
異なるポリペプチド、殊に2〜5種、特に3〜4種の異
なるポリペプチドでコートすることができるが、このこ
とは特に有利である。
用いる場合には、適切なカップリング法は当業者に知ら
れたすべてのものである。さらにまた、多段階法例えば
、抗体が標識を有している予め形成されたペプチド−抗
体複合体、高アフィニティー系例えばビオチン/アビジ
ン(これらの反応剤の一方の標識)などをアレンジする
こともできる。
蛍光または化学発光色素である。さらに、例えば発色原
、発光原または蛍光原基質系により、または第1酵素に
より活性化される第2酵素を用いたその後の増幅系によ
り検出される酵素をマーカーとして用いることもできる
。
素、特にアルカリ性ホスファターゼおよび/または西洋
ワサビペルオキシダーゼまたは化学発光原例えばアクリ
ジニウムエステルである。
記載されている方法により行われる。
NAKANE et al., 1974, J. H
istochem. Cytochem. 22, 1
084〜1090の過沃素酸塩法を用いることができ、
またはパートナーをヘテロ二官能性試薬により連結する
ISHIKAWA et al. 1983, J.
Immunoassey 4, 209〜327の方法
を用いることができる。
チド−特異的抗体により誘発された物理化学的変化例え
ば沈殿、凝集または光散乱などを自動的にまたは視覚的
に測定するために、適当な表面例えばラテックスまたは
赤血球の感作に用いることもできる。さらにペプチドを
誘導体化することなく前述の方法と同様これら測定原理
の阻害に用いることができることも知られている。
体を用いて調製されたポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体を用いる免疫診断法を抗原検出に用いることが
できる。この検出法に適した態様は当業者に知られてい
て、特定の段階で抗体−抗原複合体を形成するか、また
は競合法において標識抗原の添加により複合体形成を阻
害することより成る。
ーまたは測定プリンシプルとして適しているのは相当す
る抗体測定について記載されているすべての可能性であ
るが、競合原理および二重抗体サンドイッチ法が免疫化
学的方法として特に好ましい。この脈絡においては、方
法が1−、2−または3−段階法として設計されるかど
うかは重要でない。すなわち多段階法は、未標識検出抗
体であってそれらに対する適切に標識された別の抗体を
用いて測定されるものを使用して行うことができる。例
えば血清アルブミンまたはスカシガイヘモシアニンにカ
ップリングさせることによって可能であるが(B. S
. Schaffhausen, Hybridoma
Technologie, the Bioscie
nces and Medicine, ed. T.
A. Springer, Plenum Pres
s NY, London, 1985)、ペプチドを
それらの免疫原性が改善されるように修飾しておくこと
は抗体の産生(raising)に有利である。
態で一部あるいは全部の必要試薬を含む免疫診断要素を
用いる場合にも適用でき、そしてこの場合にも本発明の
新規ペプチドは固相側または検出試薬中またはその両方
に含まれそして抗体測定、抗原検出またはその他の被分
析物質(analyte)との組合せが行われる。
つは、それらによってHCV抗体の信頼性ある測定が可
能となる点である。さらにこれらのペプチドを用いれば
急性感染期からの初期抗体も確認されるが、これにより
これらペプチドに基づく検出感度が従来技術に比べ相当
に向上し、さらにはこれら抗体タイプ(初期または後期
抗体)に対する適宜の結合部位を有するペプチドを二つ
の異なるテスト方法に相互に別々に用いれば一方におけ
る急性期と他方における慢性または回復期との間の鑑別
が可能となる。最後に、本発明によって得られるもう一
つの利点は本発明のペプチドの特異性が高い点であり、
これによって誤って陽性反応を示す検体数は最小に抑え
られることになる。
ルス安全対策上、そして他方においてはコスト上の理由
から、いわゆる組合せテストが開発されそして1989
年来利用可能となっているが、これにより抗−HIV
1および/または抗−HIV2の同時非鑑別検出ができ
る(K. Koerner et al., Lab.
Med. 14, 159〜161, 1990)こ
の開発が可能となったのは、それら二つのHIVサブタ
イプが相互に大きな類似性を示しさらにそれらが同じウ
イルスクラスに属するためである。すなわち、かかる抗
−HIV 1/2組合せテストにおける抗−HIV 1
測定も抗−HIV 1とHIV 2抗原との交叉反応に
基づいている(M. Busch et al., T
ransfusion 30/2, 184〜187,
1990)が、同じくやはり逆に抗−HIV2検出は
抗−HIV 2およびHIV 1抗原の間で生じる反応
によって高められる。これに基づいて、二つの抗体特異
性を有する組合せ検出の確立は、関連のあるまたは構造
類似の抗原を用いる場合には相対的に簡単であることが
わかる。非A非B肝炎の病原体、いわゆる肝炎Cウイル
ス(HCV)の検出は本発明による抗−HCV測定の確
立のための必要条件であった。それに伴ってスクリーニ
ングテストの性能面では改良されるが、最新の抗−HC
Vテストについても、一方において抗−HIV組合せテ
ストおよび他方において抗−HCV個別テストによる個
々の供血者の検査には相当な努力と相当な付加的コスト
が伴うという問題が生じる。
ての商業ベースの態様および大部分の抗−HIV組合せ
テストは遺伝子工学によるHCVまたはHIVポリペプ
チドに基づいている。しかしながら、やはり今日にいた
るも、HCV(フラボウイルス)およびHIV(レトロ
ウイルス)の場合のように異なるウイルスクラス関係が
存在することから、類似抗原を使用できないときは複数
の異なる抗原を含む唯一のテスト混合物中の複数の異な
る抗体特異性を一回の免疫化学的検出で同時に測定する
ことには成功を収めていない。本発明の意味において、
異なる抗体特異性とは、相互の交叉反応性が極めて低い
か全くない抗体を意味する。複数のウイルス抗原に対す
る全部で三つの抗体特異性を検出するためのこのタイプ
のテストは、感度の点でもまた相互に干渉しあう相互作
用の結果干渉の受けやすさ(特異性)の点でも、特定の
個別のテストの対応特性よりも劣る傾向にあるとされて
いた。
体の異なるエピトープを担体に固定すればそれぞれ異な
る病原体に対する複数の異なる抗体または異なる抗体特
異性を単一テストで免疫化学的に検出できることも見出
された。
感度は少なくとも個別テストの感度には相当する。すな
わち、例えば、本発明方法の場合に抗−HIV1/2お
よび抗−HCVについて測定される感度特徴は少なくと
も個別テストのそれらに相当する。
る干渉の受けやすさが本発明方法により低下するという
ことも全く驚くべきことであった。すなわち、例えば本
発明による抗−HIV/抗−HCVの特異性をテストし
たところ、得られた特異性は二つの個別テストの全体に
よって与えられるものよりも高かった。その結果、間違
って捨てられる供血数は全体として減少させることがで
きる。
以上のエピトープを担体に固定しそして該病原体の検出
および/または測定を単一のテストで行うことより成る
、それぞれ異なる病原体に対する複数の異なる抗体特異
性を検出および/または測定するための免疫化学的方法
にも関する。
は、異なる病原体の非鑑別同時測定を行うのが望ましい
ことがある。これは、様々な抗体間の区別をすることな
くイエスの応答またはノーの応答(すべての抗体特異性
について陰性)だけが得られることを意味する。
別測定も望ましい。これは、本発明の範囲内において、
例えば免疫測定テストにあっては、異なるウイルス特異
的標識を有する抗原、例えばペルオキシダーゼを有する
HIV 1抗原、アルカリ性ホスファターゼを有するH
IV 2抗原およびβ−ガラクトシダーゼを有するHC
V抗原を用いることにより、直接可能である。次に、同
時結合した抗体特異性を順次または同時に測定すること
は、異なる酵素基質を用いることにより可能である。
応抗原を特異的に検体に添加することにより阻害するこ
とである。
たは測定が鑑別的または非鑑別的に、好ましくは非鑑別
的に、行われる、異なる抗体特異性を同時検出および/
または同時測定するための免疫化学的方法に関する。
性を有する抗体および一般に極めて低いまたはゼロの交
叉反応性の対象となっている病原体を意味する。これら
の例は、HIV 1+2、HCV、HTLV I+II
、HBVまたはトレポネーマ・パリダム(Trepon
ema pallidum)、好ましくはHIVおよび
HCVである。
合部位(エピトープ)を有する前記病原体の、特にHI
V 1、HIV 2およびHCVの、抗原を担体に固定
するのが特に有利である。このようにすれば、例えば、
血清転化を確認でき、一般に高い正確さをもって陽性お
よび陰性検体を弁別でき、遺伝子工学によるタンパク質
調製に必要な発現系による干渉は一般に起こり得ず、ウ
イルス増殖上不可避である他の宿主細胞汚染は一般には
存在せず、ヒト起源の血清、クエン酸加、ヘパリン加お
よびEDTA血漿における異なる特異性を有するHIV
−およびHCV−特異的抗体の一般に信頼し得る測定が
保証され、また56℃で60分間検体を不活性化させれ
ば誤った陽性結果を生じることはない。
HIV 1および/またはHIV 2およびHCVの)
ポリペプチド(それらは高感度抗HIV/抗−HCV検
出に適している)、そしてさらに、組合せ抗体検出のス
クリーニングテストの基礎として適したポリペプチド混
合物より成る単一エピトープおよび/またはそれらの組
合せである。
たはHIV 2およびHCVのポリペプチド混合物にも
関する。
HIV 1 (Ratner et al., Na
ture 1985, 313, 277〜284のナ
ンバリングシステム): IV トランスメンブレンタンパク質(gp 41)
:AA 580−AA 630 V エンベロープタンパク質 (gp 12
0):AA 490−AA 540 VI コアタンパク質
(p 24):AA 240−AA 390 2.HIV 2 (Gyader et al.,
Nature 1987, 326, 662〜669
のナンバリングシステム): VII トランスメンブレンタンパク質(gp 3
6):AA 570−AA 620 VIII エンベロープタンパク質 (gp
110):AA480−AA 530 IX コアタンパク質
(p 26):AA 230−AA 380 3.HCV(WO 89/04669およびWO 90
/11089のナンバリングシステム): X 非構造タンパク質4(NSP 4):AA
121−AA 175XI 非構造タンパク質
3(NSP 3):AA 1−AA 265XII
構造タンパク質 (コア):AA 1−AA
80
CVスクリーニングテストにとって)特に好ましいのは
前記ポリペプチドの混合物であり、その一部を例示とし
て記すが、考えられる可能性をそれらに限定するもので
はない: XIII gp 41 HIV 1 gp 36 HIV 2 NSP 3 HCV XIV gp 41 HIV 1 gp 36 HIV 2 NSP 4 HCV コア HCV XV gp 41 HIV 1 gp 36 HIV 2 NSP 3 HCV NSP 4 HCV コア HCV XVI gp 41 HIV 1 p 24 HIV 1 gp 36 HIV 2 NSP 3 HCV コア HCV または XVII gp 41 HIV 1 p 24 HIV 1 gp 36 HIV 2 p 24 HIV 2 NSP 3 HCV NSP 4 HCV コア
用途に対するよりよい免疫学的性質が得られる。
下のペプチドは特に適していることが判明した:
6】
CVの異なるタンパク質領域からのさらなるペプチドも
、これらのポリペプチドに免疫関連がある限り、一体化
することができる。逆に、例えばHIV 1およびHC
Vペプチドの混合物を用いて抗−HIV 1/抗−HC
Vだけを同時測定するが例えば抗−HBV/抗−HIV
1/抗−HCVは測定しないために、対応ペプチドを省
くことにより非鑑別検出において特定の抗体を排除する
ことも、例えば疫学的課題の上からは、有利なこともあ
る。さらに、HCVとは同一でないペプチド、例えばま
さにHIVを、HCVペプチドについて前述した方法を
同様にして誘導体化と修飾することもできる。
病原体に対する複数の抗体を単一のテストで検出ができ
、しかもなお個別テストで達成し得るのと同じ高さの特
異性または感度が達成される点である。
ものであるが、本発明をそれらに限定するものではない
。
チド混合物によるマイクロタイタープレートのコーティ
ング 1〜10mg/mlのペプチドを含む蒸留水中の50%
酢酸中の本発明ペプチド貯蔵溶液から0.10M重炭酸
ナトリウム(pH9.6)中の連続2倍希釈液を調製し
た、すなわちペプチド濃度が50、20、12.5、6
.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0
.2、0.1、0.05および0.01μg/mlであ
る一連の希釈液を得た。個別ペプチドの混合物について
も手順は同様とし、0.1M重炭酸ナトリウムに希釈す
ることにより、前述の通りの全体的最終濃度ではあるが
いくつかのペプチドの混合物の場合にあってはそれらを
等濃度で(1:1混合物の場合)または相互に対し様々
な割合で含むものを得るために、前記貯蔵溶液を付加的
に例えば10:1または1:4というように様々な割合
で混合した。
マイクロタイタープレート、タイプB(Nunc.Ro
skilde、デンマーク、により供給されたもの)の
16ウエルに入れた。希釈液を入れたテストプレートを
20℃で18時間放置し、次いでウエル内の溶液を吸引
により除去し、そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学
的食塩水(PBS、pH7.4)中の10g/リットル
牛血清アルブミンの溶液300μlを用いて充填および
吸引除去により3〜4回洗浄し、そしてそれらテストプ
レートを次いでシリカゲル上、20℃で乾燥した。
するペルオキシダーゼ標識抗体、および検出用TMB基
質の調製 KOEHLERおよびMILSTEINのモノクローナ
ル抗体調製法(Nature 256, 495,
1975)によりh−IgGに対する抗体を調製し、同
じ抗原特異性を有する異なるモノクローナル抗体をST
AEHLI et al. (J. of Immun
ological Methods 32、 297
〜304、 1980)により記載された方法により確
認した。ゲルクロマトグラフィーおよびリン酸緩衝食塩
水(PBS、pH7.4)に対する透析による精製後、
モノクローナル抗体画分含有プール(タンパク質4mg
/ml)を次いでTANAMORI etal.(J.
Immunol. Meth. 62、 123〜1
31、1983)により記載されている方法によりN−
ガンマ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド(G
MBS)(Behring Diagnostics社
より入手)と反応させた。
より供給された。カタログ番号I 6256)をKIN
G et al. (Biochem. 17、 14
99〜1506、 1978)により記載された方法に
より、西洋ワサビペルオキシダーゼ(POD)(Boe
hringer Mannheim社より入手。カタロ
グ番号413470)と反応させた。IgG−POD接
合体はGMBS−IgG接合体とイミノチオラン−PO
D接合体からTANAMORI et al. (su
pra)により記載された方法により調製した。
パク質含量は360μg/mlであった。POD対Ig
G比は2.8として測定された。その溶液を次に、50
ml/リットル牛胎児血清(FCS)、5g/リットル
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート
(RTween20)のPBS溶液を用いて500ng
/ml IgG−PODまで希釈しそして抗−IgG/
POD接合体と呼んだ。ELISAに用いるために、次
に0.5% RTween20を含有するtris緩衝
液(pH7.4)への希釈を(1:100〜1:20,
000希釈範囲で)様々に行って、0.1M2−アミノ
−2−(ヒドロキシメチル)−1,3−プロパンジオー
ル(tris)、0.1M塩化ナトリウム(NaCl)
および0.1% RTween(pH8.4)を含む接
合体緩衝液中で均一に1:26最終希釈液を調製した。 従来技術に従って調製されたウサギポリクローナル抗体
は使用の為に同じく1+25の希釈液が得られるように
調節した。
つの貯蔵溶液から調製された過酸化水素およびテトラメ
チルベンチジン(TMB)を含む基質調製物または基質
系を用いた。
、5g/リットル、すなわち16mmol/リットル濃
度で二重蒸留水に溶解しそして5規定塩酸でpH1.5
に調節した。ペニシリンGをこの溶液に撹拌しながら2
00mg/リットル、すなわち0.56mmol/リッ
トルの最終濃度として添加した。
mlの1規定NaOHおよび、250mgすなわち3m
molのH2O2(尿素/過酸化水素アダクトとして)
を900mlの二重蒸留水に添加した。溶解完了後、そ
の混合物を二重蒸留水で1リットルとした。
と10容量部の貯蔵溶液2とを混合した。
P 1)であるが、このキットではWO 89/046
69に記載されそして遺伝子工学により酵母で調製され
るC−100−3構築物が抗原として用いられている。 ヒトの血清および血漿を検査するための手順は製造元の
包装への差し込みに示されたものとした。例えば検体希
釈は1:11とし、血清のインキュベーションは1時間
行い、抗ヒトIgG/POD接合体のインキュベーショ
ンは1時間行い、そしてO−フェニレンジアミン(OP
D)を基質とする酵素基質系を用い、492nmで光度
測定を行い、そして限界を設定した(0.40Eの閾値
を陰性コントロールの平均値に加える)。
NSP3領域(C33C)からの付加的エピトープを含
むもう一つの市販のELISA(HP 2)に対して全
く同様の手順を用いた。すなわち、ヒトの検体の検査に
オリジナルテストキットを前述の如く製造元により説明
された手順に関するすべての説明を順守して用いた。
チンパンジーの血清または血漿中のHCV−特異的抗体
を測定するための手順ではヒトIgGに対するウサギで
調製されたポリクローナル抗体を検出に用いた。このた
めに、ウサギ抗血清のIgG画分を実施例2に記載のと
おり精製し、透析しそしてペルオキシターゼ(POD)
で標識した。予備テストで確認されたヒトIgGに対す
る抗体の交叉反応をチンパンジーIgGに信頼性よく適
応させる(fashion over)ために、その最
終濃度をモノクローナル抗−IgG/POD接合体濃度
の4倍に調節した。
示したので表14〜16に記載の如く限界設定を改める
必要があった(表14〜16参照)。
測定のための比較用抗−HIV 1+2組合せテストは
、合成的に調製されたHIV 1およびHIV 2のペ
プチドに基づく市販品(HP 3)である。このテスト
の手順も製造元の包装への差し込みのそれとしたところ
、例えば検体希釈は1:2とし、血清のインキュベーシ
ョンは30分間とし、接合体(抗−ヒトIgG/POD
)のインキュベーションは30分間とし、そしてテトラ
メチルベンチジン(TMB)を基質とする酵素基質系を
用い、450nmで光度測定を行い、そして限界を設定
した(0.250の閾値を陰性コントロールの平均値に
加えた)。
に対する免疫グロブリンクラスGのヒト抗体の測定ペプ
チドまたはペプチド混合物を用いて前述の如くコーティ
ングされたマイクロタイタープレートのウエル中、0.
3M tris、0.3M NaCl、20%ボビセリ
ンおよび0.1% RTween20を含む検体緩衝液
50μlに50μlの血清または血漿を添加した。37
℃で30分間インキュベーション後、ウエル内容物を吸
引除去し、そしてそれらウエルをPBS中に1g/リッ
トル RTween20を含有する洗浄用緩衝液で5回
洗浄した。次に最終希釈液中の接合体100μlを、好
ましくはtris、0.5%Tween20中の1:3
000の予備的希釈液、および接合体緩衝液中の1:2
6の最終希釈液を用いて、ウエルに添加した。37℃で
30分間インキュベーション後、ウエル内容物を吸引除
去しそして再び5回洗浄した。次に100μlのTMB
基質調製物を各ウエルに加え、20〜22℃で30分間
インキュベートし、そしてインキュベーションを100
μlの1規定硫酸の添加により止めた。着色溶液の吸光
度をPBSブランクを基準として用いて450nmの波
長で測定した(E450)。
抗−HCV陽性として分類し、E450が0.05〜0
.10の範囲であった検体は抗−HCV境界(マージナ
ル)として分類し、そして0.05より低いE450を
生じた検体は抗−HCV陰性として分類した。
Iで示されるより小さな配列の混合物を用いたヒトの検
体についての実施例1、2および4に記載された測定か
ら得られた結果をまとめたものである。表2のデータも
同様にして本発明ペプチドSP 10を用いて得られた
ものであり、両方のELISAの結果をHP 1(実施
例3)のそれと比較してある。
り小さなペプチドの混合物を用いてヒトの検体の抗−H
CVを測定した結果
において>25の割合となる≫2.5Eの吸光度を示し
た。
度を示した。それぞれわずか4および7検体の反応は比
較的弱かったが、E450値は0.8〜2.5(0.1
0Eの限界)であり依然としてどちらかというと強い反
応であった。
いてヒトの検体の抗−HCVを測定した結果
】
において≫25の割合となる>2.5Eの吸光度を示し
た;唯一の検体は1.2Eという値で比較的弱く反応し
たがそれでも市販ELISA(HP 1)よりも相当に
強い反応であった。
として分類されたすべての供試ヒト検体は同じく本発明
ペプチドに基づくすべてのELISAにより陽性である
ことが認められた。市販テスト(HP 1)の結果と極
めてよく一致するほか、ペプチドELISAにおける極
めて強度の信号形成も注目すべきである。同時に、健常
供血者の縦断的検査結果からテストの干渉の受けやすさ
が極めて低いことが明らかとなっている。すなわち、血
清および血漿の健常供血者をテストしたところ、本発明
ペプチドに対する非特異的結合は極微にすぎなかった、
換言すれば誤った陽性結果はほんのわずかにすぎなかっ
た。
I)で示されるより小さな(15アミノ酸)の使用に基
づくELISAを用いてヒトの検体をテストした際に得
られたさらなる結果を示す。それらペプチドがHCV抗
体のエピトープ規定に適していること、そしていくつか
のペプチドの混合物(好ましくは3〜6種のペプチドを
含有)としても抗−HCV測定に適していることは明ら
かである。
ける15アミノ酸より成るより小さなペプチドとヒト抗
−HCV陽性検体とのELISAでの反応性;結果は4
50nmにおける吸光度(E450)として報告する(
−=0.10Eより低い陰性値)
反応性が示されている。このペプチドELISAにより
極めて強力な信号が形成されることから陽性および陰性
結果が信頼性をもって弁別されることは明らかである。 本発明による以下のペプチドまたはペプチド混合物を用
いても同様の結果が得られた。
074/4082(0.5および0.125μg/ml
)4060/4071/4081(各2μg/ml)、
約15AAより成るより小さなペプチドの混合物が十分
適していることがわかった: 4056/4055および4052(各0.5μg/m
l)。
た結果いずれの場合にも、検体反応性の地理的起源への
依存性は認められなかった。
コーティングに用いたペプチド濃度、またはペプチド混
合物の場合にあってはそれらの全濃度および相互比であ
り、接合体濃度は1:3000および1:26希釈比で
一定とした。さらにコーティング濃度は一定として接合
体の予備的希釈率を変えた。いずれの可変変数も供血者
の血清および血漿のテストによる特異性について、およ
び陽性群における抗−HCV測定による感度について確
認した。さらにまた限界感度を抗−HCV−陽性検体の
連続希釈(抗−HCV−陰性血清中で1:2、1:4な
ど)による分析感度の形で測定しそして文献記載ペプチ
ドを用いて得られた結果に対すると全く同様にして市販
テストのデータと比較した。ヒトの検体について得られ
た結果を表4、5に例としてまとめる。
る抗−HCV陽性血清および血漿の力価測定比較。比は
特定信号を限界値で割った商として報告されており、ま
た1よりも大きな値は陽性結果を示し、そして1より小
さな値は陰性結果を示す。
感度によって測定される本発明ペプチドに基づくELI
SAの感度が比較のために同じ血清希釈比を用いてテス
トされた市販テストと少なくとも同程度に良いことは明
らかである。実際、多くの場合において、市販テスト(
HP 1)においてすでに何回も陰性反応を与えていた
希釈検体はこのペプチドELISAによればなおも有意
に陽性であると測定された。従って全体としては、本発
明ペプチドを用いることによりHCV抗体の検出限界が
向上するという結果が得られた。同じく新規ペプチドの
その他のペプチド濃度、ペプチド配列または混合物を用
いても同様の結果が得られた;例えば4083(0.2
5μg/ml) 4074/4081(各0.25μg/ml)4074
/4082(各0.5μg/ml)4074/4082
(0.5および0.125μg/ml)4060/40
82(各2μg/ml)
ほか、至適系の場合には、非−HCV−特異的抗体およ
びその他の潜在的干渉要因によって特異性についても検
討した。その結果、本発明ペプチドを用いた抗−HCV
測定はHCVに対して特異的であり、かついずれの既知
の干渉、例えば他の抗体との交叉反応、熱失活による干
渉などを受けないことが明らかとなった。さらにこのこ
とは相対応して、感度を上げるべく均一に高血清濃度(
検体緩衝液中1:2希釈比)を用いた記載の他の新規ペ
プチドまたはペプチド混合物についてもあてはまるが、
それが可能であったのはペプチドの純度および固相上の
高い抗原密度によるものである。
P 10とHP 1の比較を表6、7にまとめるが、こ
れからも本発明ペプチドが従来技術に比べ、この場合は
限界感度の向上すなわち分析感度の増大、を含む利点を
有していることは明らかである。表6、7中の四つの力
価測定は公表されているペプチドよりも2〜4倍も高い
感度で測定され、また市販テスト(HP 1)と比較し
た場合の倍率は8〜32にものぼった。
LISAの分析感度の従来技術との比較。このために、
陰性ヒト血清中の抗−HCV−陽性ヒト血清の連続希釈
液を調製し、そして本発明ペプチド(SP 10)に基
づくELISAによるテスト結果を市販HCV ELI
SA(HP1)および文献(OKAMOTO et a
l)の図2により免疫関連ありと記載されているペプチ
ドと比較した。 すべてのデータは吸光度(E450nm)を表わし、反
応性ありとされる結果には下線を施してある。
P 23)の評価も同様の結果を与えた。表8に示され
た比較結果から、感度に関しSP 23がSP 10と
等価であること、および両方ペプチドが文献記載のペプ
チドよりも優れていることは明らかである。
7−75)はOKAMOTO et al.により記載
されたペプチドとは厳密には対応しないが、中間配列(
SP 11、A 24−53,表8)についての結果か
ら、次の配列領域(AA 39−47)には免疫関連エ
ピトープは存在しないことは明らかであり、そしてSP
11の極めて弱い反応性(なおも検出可能ではある)
はそこに含まれるカルボキシ末端領域(図3に示された
オーバーラップ領域AA 24−30)によるものとす
ることができる。
AA 39−75,OKAMOTO et al.)と
新規構造物の間に位置するアミノ酸配列(SP 11,
AA 24−53,図3も参照されたし)のELISA
における免疫反応性の比較。すべてのデータは吸光度(
E450nm)を表わす。
体のテストの際に特に明らかとなる。すなわち、表9に
示された11抗−HCV−陽性検体のうち11すべての
検体が本発明ペプチドと反応することがわかった。これ
に対し文献記載のペプチドの場合にはわずか6検体しか
陽性とならず、また市販テスト(HP 1)で陽性反応
示した例は全くなかった。両ペプチドと陽性反応する検
体に関し、本発明ペプチドの方が同じテスト条件下にお
いて有意により強く反応することが顕著であるが、この
ことは、特に陽性/陰性弁別に対し相当な利点を与える
。
度と従来技術との比較。このために、選ばれた11個の
自然の(native)ヒト抗−HCV−陽性検体を本
発明ペプチドに基づくELISAでテストし、市販テス
ト(HP 1)と、および文献(OKAMOTO et
al.)において図3により免疫関連ありとして記載
されているペプチドと比較した。すべてのデータは吸光
度(E450nm)を表わす。 抗−HCV−陽性検体HC 90−495もコントロー
ルとしてテストした。
)および予め選ばれた自然血清から導かれたこれらの結
果(表9)は市販血清パネル(ロット番号PHV 10
1およびロット番号PHV 201,Boston B
iomedica, 米国)に対するテスト結果により
確認された。
結果は表10、11にまとめ、そして混合力価抗−HC
Vパネルの結果は表12、13にまとめる。本発明によ
るコアペプチドを用いて得られたデータ結果を従来技術
としての市販テストを用いて得られたデータと比較する
。
CV−陽性検体より成るパネルPHV 101の自然抗
−HCV−陽性検体について、ペプチドELISA(S
P 10,2μg/ml)の感度を従来技術と比較した
ものである(材料および比較テスト結果は Bosto
n Biomedica(米国)により上市されたもの
)。すべてのELISAデータは比の値、すなわち検体
吸光度のカットオフに対する比のである。<1.0の値
は陰性とし、また>1.0は陽性とする。
01−03)はあるが、すべての抗−HCV−陽性検体
が新規ペプチドに対し正しい陽性反応を与えることは明
らかである。市販テストとの比較により、検体信号:カ
ットオフ比により表わされる信号強度は比較のためにテ
ストされるアッセイよりも本発明ペプチドを用いた場合
の方が著しく強いことが顕著であるが、このことは新規
ペプチドELISAの信頼性が著しく向上したことを示
している。
.5の吸光度に相当する)によれば、従来技術の定義に
より検体は低力価にすぎず、驚くべきことに新規ペプチ
ドとは強い反応性を示すことがわかる。
にはコア特異的抗体が存在しないことを実証する確認テ
ストにおける比較結果のデータによって説明される(C
22cは遺伝子工学により大腸菌において調製されるコ
アタンパク質である)。このテストによれば、検体03
は実際陰性として分類されるべきである。
ついてのテストからも同様の所見が得られた:全部で2
2抗−HCV−陽性検体のうちの19検体は、驚くべき
ことに、吸光度が2.5よりも大きく(>25の比に相
当する)極めて強い陽性であることがわかる。パネルに
含まれる3つの抗−HCV−陰性血清は正しく陰性(<
1.0の比)として分類される。最後に、検体No.P
HV 201−08、−10および−20も問題の範囲
内で正しいことがわかる。何故ならば、これら検体は確
認テストによりコア特異的抗体を全く(−08および−
10)またはほとんど(−20)を示さないからである
。
有する十分確認された抗−HCV−陽性検体より成るパ
ネルPHV 201の自然抗−HCV−陽性検体につい
てペプチドELISA(SP 10,2μg/ml)の
感度を従来技術と比較したものである。(材料および比
較テスト結果は Boston Biomedica
により上市されたものである)。すべてのELISAデ
ータは検体吸光度をカットオフ値で割った商である比と
して与えられる。<1.0の値は陰性結果を表わし、そ
して>1.0の値は陽性結果を表わす。
血清中の抗−HCVの測定 マイクロタイタープレートのウエルに吸着させた様々な
ペプチドおよびペプチド混合物を様々な感染量のNAN
BVに感染したチンパンジーからの血清を用いて試験し
た。接種後2週間ごとに採取した一連の検体を市販テス
トを用いてGOTだけでなくGPTについても測定し、
またすべての検体を並行的にかつ本発明ペプチドを用い
たELISAにより測定した。実施例3の市販テスト(
HP 1)と同様に、ペプチドELISAにはPODで
標識されたポリクローナルウサギ抗体を4倍濃縮して検
出に用い、また酵素基質TMBを用いて450nmで光
度測定を行った。テスト手順は前述のヒト抗−HCV測
定に対応するものとし、0.1Eを固定限界としまた表
14、15、16の結果は特定の吸光度のこのカットオ
フ値に対する割合(比)として示したものである。
発明ペプチドまたはペプチド混合物を用いたELISA
によるチンパンジー検体の抗−HCV測定。最初の3回
値のデータは限界の設定に用いる吸光度であり、以後は
それをもとに特定信号と限界の比を求めた。
にALT経過(course)および市販テスト(HP
1)からの相当する結果との比較において、本発明ペ
プチドの利点を際立たせている。
生検標本の電顕検査ではNANBHが検出されたのに市
販テスト(HP 1)では全く抗体−陽性とされていな
い。これに対し、4083に基づくELISAを用いれ
ば信頼性あるHCV抗体検出がALT増加とほぼ同時に
可能である。
すべてのペプチドまたはペプチド混合物を用いることに
より陽性/陰性が鋭敏に弁別されるという意味において
、極めて信頼性ある抗−HCV検出がALT増大とほぼ
同時にまた市販テスト(HP1)の平均18週間前に行
われることから、ペプチドELISA結果がALTレベ
ル増大と時間的に一致することは明らかである。ペプチ
ド間を比較すると、4060と4081(アミノ−およ
びカルボキシル−末端配列)および中央構造を構成する
4090の比較から明らかなように、中央アミノ酸配列
が式Iの完全ペプチド(4083)による初期HCV抗
体認識に相当寄与していることが特に明白である。
期確認結果は動物No.147の実験によっても得られ
、その場合にはALT増大とほぼ同時に、この場合にも
市販テスト(HP 1)を用いた場合よりも約16〜1
8週間早く信頼性ある抗体検出が可能である。
抗−HCV測定。市販テスト(HP 1)による結果を
合成的に製造された本発明によるコアペプチド(SP
10,2μg/ml)と対比して示す。それら結果は特
定信号と限界の比として示す。
8に示された結果は、特にALT経過および市販ELI
SA(HP 1)の対応結果と比較することにより、本
発明ペプチドの利点を強調している。
陰性が鋭敏に弁別されるという意味において極めて信頼
性ある抗−HCV検出がALT増大とほぼ同時にまた市
販テスト(HP 1)の平均20週間前に行われること
から、コアペプチドELISA結果がALT増大と時間
的に一致することは明らかである。
確認結果は動物No.147の試験によっても得られ、
その場合、市販テスト(HP 1)よりも約4週間早く
信頼性あるHCV抗体検出が可能である。
免疫化学的検出方法へのそれらの使用は、遺伝子工学に
より製造されたタンパク質および従来技術の他の合成ペ
プチドに基づくこれまでに記載されたすべての方法より
も相当に高感度であることがわかる。感染後期における
感度向上の故に、新規ペプチドは付加的に、初期HCV
抗体を信頼性をもって測定することができる、従って現
存している診断ギャップが著しく低下するという相当な
利点を提供する。さらにまた、本発明によるペプチドは
非特異的結合に対して感度が相当に低いが、これは動物
の検体および人間起源の検体のいずれについても、市販
テスト(HP 1)に比べバックグラウンドが激減する
(市販テスト(HP 1)の場合最大0.4E492で
あるのに対し最大0.10E450)ことによって少な
からず表わされ、従って相当鋭敏な陰性/陽性弁別が可
能となる。最後に、記述すべき有利な点は、全体的測定
時間が短縮されることおよび検体量が50μlで比較的
正確にペピットでとることができるので、正確度が増す
ことである。
10の混合物を調製するためのペプチド溶液の調製、お
よびこのペプチド混合物によるマイクロタイタープレー
トのコーティング 各々6mg/mlのペプチドを含む蒸留水中の50%酢
酸中のペプチドSP 10および4083の貯蔵溶液か
ら0.10M重炭酸ナトリウム(pH9.6)中の連続
2倍希釈液を調製した。すなわち、ペプチド濃度が50
、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0
.78、0.39、0.2、0.1、0.05および0
.01μg/mlである一連の希釈液を得た。個別ペプ
チドの混合物についても手順は同様とし、0.1M重炭
酸ナトリウムに希釈することにより、前述の通りの全体
的最終濃度であるがいくつかのペプチドの混合物の場合
にあってはそれを等濃度で(1:1混合物の場合)また
は相互に対し様々な割合で含むものを得るために、前記
貯蔵液を付加的に例えば10:1または1:4というよ
うに様々な割合で混合した。
マイクロタイタープレート、タイプB(Nunc, R
oskilde,デンマークにより供給されたもの)の
16ウエルに入れた。希釈液を入れたテストプレートを
20℃で18時間放置し、次いでウエル内の溶液を吸引
により除去し、そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学
的食塩水(PBS,pH7.4)中の10g/リットル
牛血清アルブミンの溶液300μlを用いて充填および
吸引除去により3〜4回洗浄し、そしてそれらテストプ
レートを次いでシリカゲル上、20℃で乾燥した。
lのSP 10濃度がペプチド混合物のコーティングに
適していることがわかったが、これは表19〜21にま
とめられそして実施例4および5に記載の如く行って得
られた結果の基礎をなすものである。従来技術とのこれ
までの比較とは対照的に、これからの比較はすべて実施
例3に記載の如き市販の第2世代の抗−HCV ELI
SA(HP 2)に関連したものとなる。
Aおよび市販のHP 2に基づくデータは、いわゆる終
点力価(end point titer)であり、こ
れをもって抗−HCV−陰性血清中の血清の最高予備希
釈率(所与のテストにおいて再現性よく陽性であること
が認められたもの)が規定される。
するテスト結果
ペプチドを用いて式XIVによる混合物を調製するため
のペプチド溶液の調製、およびこれらペプチド混合物に
よるマイクロタイタープレートのコーティング ポリペプチドSPH 9(式XVIII)、SPH 2
0(式XIX)、4083(式XX)およびSP 10
(式XXII)を50%酢酸(v/v)に6mg/ml
濃度となるように溶解した。
の如く様々な容量基準比で混合しそしてポリペプチド総
濃度が0.2〜8μg/mlとなるように0.10M重
炭酸ナトリウム(pH9.6)に希釈した。
液をマイクロタイター、タイプB(Nunc, Ros
kilde, デンマークにより供給されたもの)の1
6ウエルに入れた。充填されたテストプレートを20℃
で18時間インキュベートした。次にそれら溶液を吸引
により除去し、そしてそれらウエルをリン酸緩衝生理学
的食塩水(PBS,pH7.4)中の10g/リットル
牛血清アルブミンの溶液300μlを用いて3〜4回洗
浄しそしてそれらテストプレートを次いでシリカゲル上
、20℃で乾燥した。
よびHVCペプチド濃度の至適化、およびELISA測
定および評価基準の至適化 実施例8に記載の4種類の貯蔵溶液について1:1:1
:1比(v/v)から開始してコーティング溶液中のH
IV 1、HIV 2およびHVCの各ペプチド最終濃
度(単位:μg/ml)となるように、各場合の他の3
ペプチドを一定に保ちつつ4種類すべての可変含量を相
互に独立的に変化させた。すなわち
クロタイタープレートに固定しそして実施例4および5
に記載の如くELISAで評価し、同じくペルオキシダ
ーゼ標識抗体濃度もヒト免疫グロブリンGに対して至適
化した。
連続希釈液により調製された低力価抗−HIV 1、抗
−HIV 2および抗−HCV検体より成る検体を用い
て至適化の評価を行った。さらに同じく、バックグラン
ド反応(すなわち所与の被覆されたマイクロタイタープ
レートへの非特異的結合)を規定できるようにいくつか
の抗−HIVおよび抗−HCV−陰性検体についてもテ
ストした。
為の一連のヒト抗−HIV−および抗−HCV−陽性検
体の測定における最大の特異性を有する信号、すなわち
高い限界感度、と同時に、抗−HIV−および抗−HC
V−陰性検体に対するテストにおける低いバックグラン
ドである。
基準に基づいて見出し、それより次の混合物を選んだ:
(および1:26という均一な付加的最終希釈率)が好
ましいことがわかり、そしてテストは実施例4における
と同様に行った。これまでの限界設定とは対照的に、こ
れらの条件下では、陰性コントロール平均値と0.25
0 O.D.の和よりも大きい450nmにおける吸光
度を有する検体を抗−HIV−および/または抗−HC
V−陽性として分類した(新しい限界設定)。
対し均一かつ不変に適用した。
に対する免疫グロブリンGクラスのヒト抗体の測定
198】式XIVのペプチド混合物を用いて実施例9の
至適化条件下で表22〜24に示された検体を実施例4
に記載の如くテストした。抗−HIV1または2につい
ては、本発明方法の反応性を抗−HIV 1/2組合せ
テスト(EnzygnostR 抗−HIV 1/2。 Behringwerke AG社により供給されたも
の。HP 3)。DuPont社により供給された市販
のウエスターンブロット(抗−HIV 1および抗−H
IV 2)をコントロールに用いた。2種類の異なるE
LISA方法(HP1およびHP 2)を用いてHCV
を検出した。
、本発明方法を用いれば、ヒト起源の検体中の抗−HI
V 1および抗−HIV 2および抗−HCVが安全に
かつ信頼性をもって検出される。
R 抗−HIV 1/2,HP 3)と比較された本発
明方法による抗−HIV 1の測定 強反応性とは光度測定評価において吸光度が>2.5で
あることを意味する;すべての抗−HIV 1−陽性検
体はHCV−陰性である。
R 抗−HIV 1/2,HP 3)と比較された本発
明方法による抗−HIV 2の測定 強反応性とは光度測定評価において吸光度が>2.5で
あることを意味する;すべての28抗−HIV 2−陽
性検体はHCV陰性である。
度が>2.500に達した検体を強反応性とした。 穏やかな強さの反応性を示す検体についてはいわゆる比
を記すが、これは所与のELISAのカットオフ値で検
体吸光度を割った商を意味する。1.0より低い値は合
意により(by agreement)陰性とする。1
.0より高い値は陽性とされ、また得られる比が大きい
ほど反応性は強くなる;すべての抗−HCV−陽性検体
はHIV−陰性である。
する本発明によるELISAの分析感度の測定本発明に
よるELISAの分析感度の評価モデルとして、陽性検
体の力価測定を用意しそして実施例9に記載のELIS
Aでテストした。全体として、抗−HIV−および抗−
HCV−陰性血清中で抗−HIV 1および抗−HIV
2−陽性ヒト血清の各々について3つの希釈液を調製
し、そして限界感度は、新しい限界値(陰性コントロー
ル平均値と0.250閾値の和)を用いて、特定のテス
ト系における依然として反応性を示す最後の予備希釈液
として規定した。
−HIV 1)、表26(抗−HIV 2)および表2
7(抗−HCV)に吸光度としてまとめる。
R 抗−HIV 1/2)と比較された抗−HIV 1
に対する本発明によるELISAの限界感度の測定 3種類の抗−HIV 1−陽性検体をヒト抗−HIV
1−および抗−HCV−陰性血清を用いて予備的な連続
2倍希釈液を行い、そしてこれら希釈液を実施例3と同
様にして、あるいは比較テストの製造元の包装体差し込
みに従ってテストした。すべてのデータは吸光度(E4
50)である。すべての抗−HIV−陽性検体はHP
2において陰性反応を示した。
R 抗−HIV 1/2)で比較された抗−HIV 2
に対する本発明によるELISAの限界感度の測定 3種類の抗−HIV 2−陽性検体をヒト抗−HIV
1−および抗−HCV−陰性血清を用いて予備的な連続
2倍希釈液を行い、そしてこれら希釈液を実施例3と同
様にして、あるいは比較テストの製造元の包装体差し込
みに従ってテストした。すべてのデータは吸光度(E4
50)である。すべての抗−HIV−陽性検体はHP
2において陰性反応を示した。
の測定 ヒト抗−HIV−および抗−HCV−陰性血清を用いて
4種類の確認された抗−HCV−陽性検体を予備的に連
続2倍希釈し、そしてこれら希釈液を実施例3と同様に
してテストした。すべてのデータは吸光度(E450n
m)である。
種類の抗−HCV−陽性検体の連続希釈液を表27に記
載の如く調製し、抗−HIVと同様にテストおよび評価
し、そして第2世代の市販抗−HCV ELISA(H
P 2)を用いた結果と比較した。
も、抗−HCVテストでは未希釈の抗−HIV 1−お
よび抗−HIV 2−陽性検体を、そして逆に抗−HI
V 1/2組合せテスト(EnzygnostR 抗−
HIV 1/2)では抗−HCV−陽性検体を検査する
ことにより個別テストとしてテストした。
IV 1および抗−HIV 2のいずれについても本発
明によるELISAの限界感度が抗−HIV 1/2組
合せテストの限界感度に相当することが明らかである。 さらに本発明によるELISAのHCV限界感度も市販
の抗−HCV ELISA(HP 2)の限界感度に相
当した。 しかしながら、従来技術に従ってこれら3種類の抗体特
異性を検出しようとすれば全部で少なくとも2種類のテ
スト(抗−HIV 1/2組合せテストと少なくとも一
つの抗−HCVテスト)が必要であるのに対し、本発明
方法によればたった一つのテスト混合物を用いるだけで
全く同じ信頼性をもってまた同等の感度をもってこの検
出が可能となる。
しいELISAにおける抗−HIV−および抗−HCV
−陽性検体の強反応性が特に有利であることが明らかで
ある。何故ならば抗−HIV検体は特異的抗−HCVテ
ストで陰性に反応し、また抗−HCV−陽性検体は特異
的抗−HIVテストで陰性に反応したからである。
−陽性検体(血清転化)の測定 合計3名の患者からHIV 1感染の極く初期の間の規
定の時点でくり返し採取された連続血液検体についてテ
ストを行った。これらの血清パネルは市販されている(
Boston Biomedica Inc., 米国
)。本発明ELISAにより得られた結果と抗−HIV
1/2組合せテストとの比較を表28に示した。
て特定の限界値を超える値を陽性とすることができる。
によるELISAは低力価抗−HIV 1−陽性検体を
抗−HIV 1/2組合せテスト(Enzygnost
R 抗−HIV 1/2)と全く同じ信頼性をもって検
出する。同様に表28のデータと比較することにより、
本発明の新規ペプチドELISAによりHIV 1−特
異的抗体の最初の検出が可能となる最も早い時点も、従
来技術としての特異的個別抗−HIV 1テストと少な
くとも同じ早さとすることができることが明らかである
。
体の測定 表29は本発明の新規HIV/HCVペプチドELIS
Aを用いた市販の抗−HIV低力価パネルについてのテ
ストで得られた結果を抗−HIV 1/2組合せテスト
(EnzygnostR 抗−HIV 1/2)と比較
したものをまとめて示したものである。
nc. 社(米国)により供給された検体パネルは、抗
−HIV 1測定法により低力価抗−HIV 1−陽性
として分類された合計15の検体より成る。
国)により供給された低力価抗−HIV 1パネルにつ
いてのテスト結果すべてのデータは450nmの波長に
おける吸光度である。記載の限界値を超える値が陽性で
ある。
合せテスト(EnzygnostR 抗−HIV 1/
2)に比べ、本発明によるHIV/HCVペプチドEL
ISAを用いるときはすべての検体が比較的強い反応性
を示すことが明らかである。
ペプチドELISAによれば抗−HIV 1/2組合せ
テスト(EnzygnostR 抗−HIV 1/2)
よりも強い反応性を示すが、このことは興味深いことで
ある(No. 1、2、12および15)。これらの検
体についての付加的テストからHCV検体の同時存在が
明らかとなったがこのことからも本発明方法による抗−
HIV 1/−HIV 2および−HCVの非鑑別検出
の信頼性が確認される。
測定 表30に含まれる結果は、本発明の新規HIV 1/H
IV 2およびHCVペプチドELISA、およびBo
ston Biomedica Inc. 社(米国)
により供給された低力価抗−HCVパネルを用いて得ら
れたものである。さらにこの表30は最新式の抗−HC
V ELISA(HP2)を用いて同一パネルについて
得られたデータである。
いてのデータはいわゆる終点力価でありこれをもって、
所与のテストにおいて再現性よく陽性であると認められ
た最高の予備的希釈率が規定される。
体が本発明ELISAにより信頼性をもってかつ明白に
陽性とされたことが明らかである。これに関し、信号強
度が極めて高いことに注目すべきであるが、これは高い
反応性によるものとすることができる。
度にも反映されている。これらの検出限界は、自然ヒト
検体を抗−HCV−陰性血清中で予備的に連続2倍希釈
し次いで実施例4と同様にテストすることにより規定さ
れたが、その場合、依然として反応性が認められる最後
の予備的希釈段階がいわゆる最終力価となる。
発明による新規HIV1/HIV2/HCVペプチドE
LISAが、事実、PVC 101パネルにおいて抗−
HCVに対して従来技術よりも良い検出限界を有してい
ることが明らかである。
率の測定 ELISAにおける誤った陽性結果につながる非特異的
反応頻度を測定するために全部でn=512の健常供血
者を用いた。さらに当該方法への凝固系の可能性として
の干渉をも検査できるように、これらの供血者から血清
と血漿を同時に採取した。
ISA、抗−HCV ELISA HP 2および抗−
HCV 1/2 HP 3)(いわゆる初回テスト)の
うちの一つで反応性のあった検体に同じテスト(いわゆ
る再テスト)をくり返し、そしてその反応性に再現性が
ある場合には、比較のための方法としての抗−HIV
1ウエスターンブロットおよび抗−HCV ELISA
CHP 1)で検査した。
グにおいて前記3種類のELISAのうちの一つで反応
性を示した反応性検体のいずれも抗−HIV 1−また
は抗−HCV−陽性であると確認することはできなかっ
た。すなわち、スクリーニングで拒絶されたすべての検
体は特定の方法において終始誤った陽性として分類され
た。
いわゆる対合である血漿を同時採取したn=512名の
健常供血者のスクリーニング。初回テスト後の結果を示
す;再テストの結果については表32を参照されたい。
は表31にまとめられている。3個の血清(および2個
の対合血漿)が本発明方法において反応性を示したのに
対し、抗−HIV 1/2 ELISAでは1個の血清
(および1個の相当する血漿)が反応性を示し、また抗
−HCV ELISAでは5個の血清(および4つの相
当する血漿)が反応性を示した。特定のELISAで反
応性を示した供血者は同一でなかった。
くり返したところ表32に示される像が得られ、2個の
血清(2個の対合血漿)は本発明によるペプチドELI
SAで再テスト反応性を示し、1個の血清(1個の対合
血漿)は抗−HIV 1/2 ELISAで反応性を示
しそして4個の血清(4個の対合血漿)は抗−HCV
ELISAで反応性を示した。
−および抗−HCV−陽性であるとして確認することが
できなかったことから、表32に示した特異性データは
、検査されたELISAの各々および血清および血漿に
ついて、(全512個の血清および512個の血漿のう
ち)正しく陰性と認められた検体の率(%)を計算する
ことにより測定されたものである。
務付けられている従来の抗−HIVおよび抗−HCVテ
ストによるときは、全部で5名の供血者が排除されねば
ならなかったであろう。すなわち、1名の供血者は抗−
HIV 1/2テストにおいてくり返し誤った陽性を示
しそして4名の供血者は抗−HCVテストにおいてくり
返し誤った陽性を示した。これに対し本発明によるEL
ISAによるときは、ひょっとして誤った反応を示す供
血者数は2名に過ぎない。
2および抗−HCVの同時非鑑別検出のための本発明
の新規ペプチドELISAは、現在有効な感度基準から
して、一方において抗−HIV 1/2および他方にお
いて抗−HCVの個別テストの各々至適の性能に少なく
とも相当するということができる。すなわちパネル、す
なわち抗−HIV 1および/または抗−HIV 2お
よび/または抗−HCVを含む自然検体からのデータは
、低力価抗−HIV 1または抗−HIV 2または抗
−HCV検体の限界感度および最先認識時点についての
テストと全く同様に同等の効率を示している。従来技術
によるときはこのようにして3種類の異なるテスト、あ
るいは抗−HIV 1/2組合せテストに徴すれば2種
類の異なるテストを用いて初めてこれら3種類の抗体特
異性が可能であるのに対して、本発明によるELISA
には効率は同じであるのに1種類のテストしか必要でな
いという利点がある。特に、抗−HIV 1、抗−HI
V 2および抗−HCVのテストの実施が義務付けられ
ている血液銀行にとって、本発明の新規ペプチドELI
SAは、抗−HIV 1、抗−HIV 2および抗−H
CVの測定において、少なくとも同じ信頼性および安定
性をもって、相当な労力および費用の軽減となる。
さを測定したところ、全く驚くべきことに、特異性が極
めて良好である、すなわち誤った陽性結果数がほんのわ
ずかであるため、抗−HIV 1/2テストとそれとは
別に抗−HCVテストを有する従来のスクリーニング手
順に比べ、より少ない再テストおよびより少ない確認テ
ストで済み、また拒絶されねばならない供血も少なくて
済むことがわかった。このことは本発明方法による方法
が式IV〜XIIおよびXIII〜XVIIで示される
HIVおよびHCVペプチドの他の群によっても提供さ
れる経済的および化学的利点を有していることを意味し
ている。
が最も重要となっている他の課題にも極めて適している
。すなわち、他のテスト条件下で、あるいは例えば実施
例10〜14における計算により、幾分好ましさに欠け
る特異性データ(とはいえ依然として従来技術水準には
相当する)でよしとするのであれば、従来技術よりも著
しく向上した感度特徴を本発明方法により得ることが完
全に可能であることを示すことができる。
度まで低下したとすれば、抗−HIV 1、抗−HIV
2および抗−HCVに対するすべての限界感度は相当
に(少なくとも2倍)改善されることになろう。健常供
血者のスクリーニングにおいて非特異的、すなわち誤っ
た陽性、反応を示す検体率として全部で5名の供血者(
くり返し反応性を示した)が得られる(実施例15)。 これは2種類の個別テストの結果に完全に相当するが、
抗体検出感度は相当に向上した。
P
列番号:31 HIVアミノ酸配列
配列(WO/89/04669より)。
00−3のORF領域からの既知ペプチドとの比較。
知ペプチドとの比較。
Claims (52)
- 【請求項1】 HCVに対する抗体と特異的に反応し
またそのアミノ酸配列が式I: 【化1】 で示される少くとも一つの配列を部分的にまたは完全に
含むペプチド。 - 【請求項2】 HCVに対する抗体と特異的に反応し
またそのアミノ酸配列が式II: 【化2】 で示される少くとも一つの配列を部分的にまたは完全に
含むペプチド。 - 【請求項3】 下記のアミノ酸配列のうちの少くとも
一つを含有する請求項1記載のペプチド:【化3】 【化4】 - 【請求項4】 HCVに対する抗体と特異的に反応し
、そしてそのアミノ酸配列が少くともアミノ末端HCV
コア領域の一部を含むペプチド。 - 【請求項5】 アミノ酸配列が少くとも式III:M
STNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPG
GQIVGGVY IIIで示される少くとも一つの配
列を部分的または完全に含む請求項4記載のペプチド。 - 【請求項6】 下記のアミノ酸配列のうちの少くとも
一つを含む請求項5記載のペプチド: 【化5】 - 【請求項7】 下記のアミノ酸配列のうちの少くとも
一つを含む請求項4記載のペプチド: 【化6】 - 【請求項8】 下記のアミノ酸配列のうちの少くとも
一つを含む請求項4記載のペプチド: AAa1−DREVLYR−BAb1 AAa2−QHLPY
IE−BAb2 および/または AAa3−KQKALGL−BAb3 (式中、AAおよびBAは任意の所望のアミノ酸であり
、そしてa1〜a3およびb1〜b3は、各々相互に独
立的に、0より大きいまたは0に等しい整数である。) - 【請求項9】 下記のアミノ酸配列のうちの少くとも
一つを含む請求項5記載のペプチド: AAn−QRKTKRNTNRRPQDVK−BAm(
式中AAおよびBAは任意の所望のアミノ酸であり、そ
してnおよびmは、各々相互に独立的に、1〜40の整
数である。) - 【請求項10】 そのアミノ酸配列が一以上のアミノ
酸の置換、付加または欠失により修飾されている請求項
1〜9のいずれかに記載のペプチド。 - 【請求項11】 請求項1〜10のうちの少くとも一
つに記載のペプチドを含むペプチド混合物。 - 【請求項12】1.HIV 1(Ratner et
al., Nature 1985, 313, 27
7〜284のナンバリングシステムによる): IV トランスメンブレンタンパク質(qp 41)
:AA 580−AA 630 V エンベロープタンパク質(qp 120):AA
490−AA 540または VI コアタンパク質(p 24):AA 240
−AA 390 2.HIV 2(Gyader et al., Na
ture 1987, 326, 662〜669のナ
ンバリングシステムによる):VII トランスメン
ブレンタンパク質(qp 36): AA 570−AA 620 VIII エンベロープタンパク質(qp 110)
:AA 480−AA 530または IX コアタンパク質(p 26):AA 230−
AA 380 3.HCV(WO 89/04669およびWO 90
/11089のナンバリングシステム): X 非構造タンパク質4(NSP 4):AA 1
21−AA 175 XI 非構造タンパク質3(NSP 3):AA
1−AA 265または XII 構造タンパク質(コア): AA 1−AA 80 を含む、HIV 1および/またはHIV 2およびH
CVの少くとも二つの種を異にするポリペプチドより成
るペプチド混合物。 - 【請求項13】 【化7】 を含む請求項12記載のペプチド混合物。
- 【請求項14】XIII qp 41 HIV 1qp
36 HIV 2 NSP 3 HCV、 XIV qp 41 HIV 1 qp 36 HIV 2 NSP 4 HCV コア HCV、 XV qp 41 HIV 1qp 36 H
IV 2 NSP 3 HCV NSP 4 HCV コア HCV、 XVI qp 41 HIV 1P 24 HI
V 1 qp 36 HIV 2 NSP 3 HCV コア HCV または XVII qp 41 HIV 1 p 24 HIV 1 qp 36 HIV 2 p 24 HIV 2 NSP 3 HCV NSP 4 HCV コア を含むペプチド混合物。 - 【請求項15】 少くとも 【化8】 および少くとも一つのHIV 1および/またはHIV
2からの配列を含む請求項14記載のペプチド混合物
。 - 【請求項16】 そのアミノ酸配列が一以上のアミノ
酸の置換、付加または欠失により修飾されている請求項
12〜15のいずれかに記載のペプチド混合物。 - 【請求項17】 ペプチドが直接にまたは担体を介し
て相互に連結されている請求項12〜16のいずれかに
記載のペプチド混合物。 - 【請求項18】 ペプチド化学により合成された請求
項1〜17のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド
混合物。 - 【請求項19】 請求項1〜11に記載の少くとも一
つのペプチドをコードするDNA配列。 - 【請求項20】 請求項1〜11に記載の少くとも一
つのペプチドに対するバイオスペシフィック・アフィニ
ティを有する抗体。 - 【請求項21】 請求項1〜11のいずれかに記載の
ペプチドを用いるHCV抗体の検出および/または測定
のための免疫化学的方法。 - 【請求項22】 感染の初期および後期に特異的なペ
プチドの組合せが用いられ、そして特異性において該ペ
プチドの組合せに対応する複数の短鎖ペプチドおよび/
または一以上のポリペプチドの混合物が用いられる請求
項21記載の方法。 - 【請求項23】 その特異的部分において請求項19
記載の少くとも一つのDNA配列に相補的な少くとも一
つの核酸プローブが用いられるハイブリダイゼーション
反応を特異的段階として用いることより成るHCVの検
出および/または測定のための分析方法。 - 【請求項24】 感染の初期および後期を鑑別診断す
るために各場合について初期抗体に対して特異的に反応
する一以上のペプチドと後期抗体に対して特異的に反応
する一以上のペプチドを別々の混合物として検体と反応
させる請求項21記載の方法。 - 【請求項25】 特定の病原体の一以上のエピトープ
を一以上の担体に固定しそして該病原体の検出および/
または測定を単一のテストとして行うことより成る、そ
れぞれ異なる病原体に対する複数の異なる抗体特異性の
検出および/または測定のための免疫化学的方法。 - 【請求項26】 一以上のエピトープが単一担体に固
定される請求項25記載の方法。 - 【請求項27】 検出および/または測定が非鑑別的
に行われる請求項25記載の方法。 - 【請求項28】 異なる病原体がHIV、HCV、H
TLV、HBVおよびトレポネーマ・パリダムより成る
群より選ばれる請求項25〜27のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項29】 異なる病原体がHIVおよびHCV
である請求項25〜28のいずれかに記載の方法。 - 【請求項30】 エピトープがHIV 1および/ま
たはHIV 2およびHCVからの少くとも二つの種を
異にするポリペプチドより選択される請求項29記載の
方法。ただし 1. HIV 1(Ratner et al.,
Nature 1985, 313, 277〜284
のナンバリングシステムによる)は:IV トランス
メンブレンタンパク質(qp 41):AA 580
−AA 630 V エンベロープタンパク質(qp 120):AA
490−AA 540または VI コアタンパク質(p 24):AA 240
−AA 390 であり、 2. HIV 2(Gyader et al.,
Nature 1987, 326, 662〜669
のナンバリングシステムによる)は:VII トラン
スメンブレンタンパク質(qp 36): AA 570−AA 620 VIII エンベロープタンパク質(qp 110)
:AA 480−AA 530または IX コアタンパク質(p 26):AA 230−
AA 380 であり、 3. HCV(WO 89/04669およびWO
90/11089のナンバリングシステムによる): X 非構造タンパク質4(NSP 4):AA 12
1−AA 175 XI 非構造タンパク質3(NSP 3):AA
1−AA 265または XII 構造タンパク質(コア): AA 1−AA 80 である。 - 【請求項31】 エピトープが式 【化9】 で示されるHIV 1および/またはHIV 2および
HCVからの少くとも二つの種を異にするポリペプチド
より選ばれる請求項29または30に記載の方法。 - 【請求項32】 エピトープがエピトープ混合物であ
りそして XIII qp 41 HIV 1qp 36 H
IV 2 NSP 3 HCV、 XIV qp 41 HIV 1qp 36 H
IV 2 NSP 4 HCV コア HCV、 XV qp 41 HIV 1qp 36 H
IV 2 NSP 3 HCV NSP 4 HCV コア HCV、 XVI qp 41 HIV 1P 24 HI
V 1 qp 36 HIV 2 NSP 3 HCV コア HCV または XVII qp 41 HIV 1p 24 HI
V 1 qp 36 HIV 2 p 24 HIV 2 NSP 3 HCV NSP 4 HCV コア より選ばれる請求項29〜31のいずれかに記載の方法
。 - 【請求項33】 エピトープがエピトープ混合物であ
りそして式 【化10】 およびHIV 1および/またはHIV 2からの少く
とも一つの配列を有する少くとも二つの種を異にするポ
リペプチドより選ばれる請求項29〜32のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項34】 ペプチドのアミノ酸配列が一以上の
アミノ酸の置換、付加または欠失により修飾されている
請求項21〜33のいずれかに記載の方法。 - 【請求項35】 エピトープが直接にまたは担体を介
して相互に連結されている請求項21〜34のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項36】 担体がヒト血清アルブミンおよび/
またはポリリジンである請求項35記載の方法。 - 【請求項37】 担体がポリスチレン、ポリ塩化ピニ
ル、ポリアミドまたはその他の合成ポリマー、天然ポリ
マー例えばセルロースおよび誘導体化された天然ポリマ
ー例えばセルロースアセテートおよびニトロセルロース
、およびガラス、特にガラス繊維、より選ばれる請求項
21〜36のいずれかに記載の方法。 - 【請求項38】 担体がポリスチレンである請求項2
1〜37のいずれか記載の方法。 - 【請求項39】 エピトープ結合抗体の検出および/
または測定が該エピトープ結合抗体に対する酵素標識、
蛍光標識、化学発光標識、ビオチン標識または放射性標
識抗体を用いて行われる請求項21〜30のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項40】 請求項1〜18のいずれかに記載の
ペプチドまたはペプチド混合物より成る一以上のエピト
ープが固定されている一以上の担体を含む、HCV抗体
の検出および/または測定のための免疫学的テストキッ
ト。 - 【請求項41】 特定の病原の一以上のエピトープが
固定されている、担体を含むそれぞれ異なる病原体に対
する複数の異なる抗体特異性の同時検出および/または
同時測定のための免疫学的テストキット。 - 【請求項42】 担体がポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ル、ポリアミドおよびその他の合成ポリマー、天然ポリ
マー例えばセルロースおよび誘導体化された天然ポリマ
ー例えばセルロースアセテートおよびニトロセルロース
、およびガラス、特にガラス繊維、より成る群より選ば
れる請求項40または41記載のテストキット。 - 【請求項43】 担体がポリスチレンである請求項4
2記載のテストキット。 - 【請求項44】 同時検出および/または同時測定が
エピトープ結合抗体に対する酵素標識、蛍光標識、化学
発光標識、ビオチン標識または放射性標識抗体を用いて
行われる請求項40〜43のいずれかに記載のテストキ
ット。 - 【請求項45】 酵素すなわちアルカリ性ホスファタ
ーゼおよび/または西洋ワサビペルオキシダーゼが酵素
標識抗体として用いられる請求項44記載のテストキッ
ト。 - 【請求項46】 異なる病原体がHIV、HCV、H
TLV、HPVおよびトリポネーマ・パリダムより成る
群より選ばれる請求項41〜45のいずれかに記載のテ
ストキット。 - 【請求項47】 異なる病原体がHIVまたはHCV
である請求項41〜46のいずれかに記載のテストキッ
ト。 - 【請求項48】 HIV 1、HIV 2およびHC
Vに対する抗体が検出される請求項41〜47のいずれ
かに記載のテストキット。 - 【請求項49】 請求項1〜18のいずれかに記載の
少くとも一つのペプチドまたはペプチド混合物またはそ
れらに対する抗体を含むワクチン。 - 【請求項50】 請求項1〜18のいずれかに記載の
ペプチドまたはペプチド混合物の哺乳動物、特にヒト、
において抗体を産生させるための使用。 - 【請求項51】 請求項20および50の少くとも一
つに記載の抗体の診断および治療目的の使用。 - 【請求項52】 診断方法が不均一イムノアッセイで
ある請求項51に記載の抗体の使用。
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