DE4034982C2 - Synthetische Polypeptide zur Bestimmung von HCV-Antikörpern und HCV-Antigenen, Mittel dazu und ihre Verwendung in diesen Nachweis-Verfahren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Polypeptide zur immunchemischen Bestimmung von HCV-spezifischen Antikörpern und HCV- Antigenen sowie für dieses Verfahren geeignete Mittel und ihre Verwendung.

Die Polypeptide eignen sich u. a. zum hochsensitiven und spezifischen Nachweis von HCV-Antikörpern für die Diagno­ se einer Non A/Non B-Hepatitis, zur Differenzierung zwischen akuten und chronischen Stadien einer Non A/Non B-Hepatitis-Erkrankung sowie zur Herstellung von Anti­ körpern, mit deren Hilfe die Bestimmung von HCV-Antigen im zellfreien Patientenblut möglich ist.

Die Non A/Non B-Hepatitis (NANBH) wird als übertragbare Krankheit bzw. Gruppe von Krankheitsbildern als Virus­ assoziiert angesehen und ist von anderen Virusinduzier­ ten Krankheitsbildern abgrenzbar, die durch differente Hepatitis-Viren ausgelöst werden wie Hepatitis A Virus (HAV), Hepatitis B Virus (HBV), Hepatitis D Virus (HDV) und Hepatitis E (HEV). Schließlich lassen sich auch Hepatitiden diagnostizieren, die durch Cytomegalie Virus (CMV) oder Epstein Barr Virus (EBV) hervorgerufen werden.

Auf Basis epidemiologischer Erhebungen lassen sich entsprechend dem Übertragungsweg mindestens zwei Non A/Non B-Hepatitiden (NANBH) definieren: das epidemische Hepatitis Virus (enterically transmitted NANBV), welches durch Wasser und Nahrungsmittel übertragen wird, sowie das Posttransfusions-Hepatitis Virus (blood transmitted NANBV), das durch Blut, Nadelstiche oder ähnliche Wege übertragen wird. Neben diesen Infektionswegen sind auch Übertragungen bekannt, die als sporadically occuring type NANBV (community acquired NANBV) keine offensichtliche Zugehörigkeit zu den beiden genannten Typen aufweisen. Obwohl die genaue Zahl von Agentien bzw. Viren, die eine NANBH auslösen, nicht bekannt ist, wurde das sog. Hepa­ titis C Virus (HCV) als ein ursächlicher Erreger dieser Krankheit kürzlich identifiziert (WO 89/04 669).

Eine klinische Diagnose stützte sich bis vor kurzem hauptsächlich auf Ausschlußverfahren, wobei durch die serologische Bestimmung von Antigenen und/oder dagegen gerichtete Antikörper, die spezifisch sind für Parameter aus der Gruppe der zitierten Hepatitis-Erreger HAV, HBV, HDV, HEV, CMV oder EBV nur bei solchen Patienten eine NANBH diagnostiziert wurde, die in den genannten Bestim­ mungen negativ reagierten.

Daneben wurden in Ermangelung eines NANBV-spezifischen Parameters auch sogenannte Surrogat-Marker angewendet, wie z. B. GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase, auch als ALT bezeichnet - alanine aminotransferase) oder Anti-HBc (Hepatitis B core-spezifische Antikörper). Diese Hilfs­ mittel sind jedoch weder sensitiv noch spezifisch genug, um als zuverlässig gelten zu können, so daß durch Testung von Blutspendern auf Surrogat-Marker auch nur ein kleiner Teil der Post-Transfusions-Hepatitiden, die bei ca. 10% der transfundierten Patienten auftritt, vermieden werden konnte. Die Dringlichkeit der Einführung eines spezifi­ schen Tests wird durch die Tatsache unterstrichen, daß für etwa 90% der Post-Transfusions-Hepatitiden das NANBV verantwortlich gemacht wird. Das Hauptproblem dieser Erkrankung besteht in der Tatsache, daß zwischen 25 und 55% der Infizierten chronische Leberschäden erleiden.

Die Isolierung und Charakterisierung des HCV bzw. ent­ sprechender cDNA-Replikate von Teilen des HCV-Genoms ist Gegenstand der WO 89/04 669, worin die Einordnung des HCV in die Familie der Flavi-ähnlichen Viren vorgenommen wird. Dort wird auch die Verwendung von HCV-Antigen für den Nachweis von HCV-spezifischen Antikörpern beschrieben sowie die Erzeugung von Antikörpern für die diagnostische Bestimmung von Antigen im Patientenblut. Zur Anwendung kommen allerdings gentechnologisch hergestellte Proteine, insbesondere sog. Nicht-Struktur-Proteine (NSP) aus der Open reading frame region (ORF), die als Reaktionspartner in immunchemischen Nachweisverfahren Verwendung finden.

Unter einem immunchemischen Nachweis werden im Sinne dieser Erfindung alle Verfahren zusammengefaßt, die als homogene (in Lösung) oder heterogene (mit fester Phase) in vitro Methoden die Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern der Immunglobulinklassen A, D, E, G oder M (IgA, IgD, IgE, IgG oder IgM) in Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Speichel, Liquor oder Urin erlauben. Beispiele für diese auch Immunoassay genannten Verfahren sind Enzymimmunoassay (ELISA oder EIA), Radioimmunoassay (RIA), Immunfluoreszenzassay (IFA), Radioimmunopräzipi­ tation (RIPA), Agar Gel-Diffusion usw..

Der Nachweis von HCV-spezifischen Antikörpern (Anti HCV) unter Verwendung des in der WO 89/04 669 beschriebenen Antigens (C-100-3) in der ELISA-Ausführung gilt als der Stand der Technik zum Nachweis von Anti HCV. Das gentechnologisch in Hefezellen exprimierte Konstrukt C-100-3 aus dem NSP 3/4-Bereich (open reading frame region, ORF) umfaßt 363 Aminosäuren, deren Sequenz in Abb. 1 dargestellt wird, wobei das Numerierungssystem dem der o. g. Patentschrift entspricht. Die Aminosäuren werden als Ein-Buchstaben-Code nach folgendem Schlüssel wieder­ gegeben: Ala = A, Arg = R, Asn = N, Asp = D, Cys = C, Gln = Q, Glu = E, Gly = G, His = H, Ile = I, Leu = L, Lys = K, Met = M, Phe = F, Pro = P, Ser = S, Thr = T, Trp = W, Tyr = Y und Val = V.

Die mit dem ELISA-Verfahren gemäß dem Stand der Technik bei der Bestimmung von Anti HCV in Proben humanen Ur­ sprungs maximal erzielbare Sensitivität wurde in chroni­ schen NANB-Patienten mit ca. 80% und bei akuten NANB- Patienten mit nur ca. 30% ermittelt (AGIUS C., et al. ist Int. Symp. HCV 1989, Rom). Das heißt, daß der weitaus größte Teil von akut infizierten Blutspendern unerkannt bleibt mit dem Risiko einer HCV-Übertragung via Blutkon­ serve und selbst NANB-Patienten mit chronischem Krank­ heitsverlauf nicht zuverlässig diagnostiziert werden können, ohne daß allerdings zwischen beiden Verlaufs­ formen mit Hilfe dieses Tests unterschieden werden kann.

Diese Befunde an humanem Patientenblut werden gestützt durch entsprechende Untersuchungen bei Schimpansen, die mit NANBV infiziert wurden.

Dort gelingt ein positiver Anti HCV-Nachweis auf Basis des C-100-3-Konstruktes erst ca. 6-18 Wochen nach stattgefundener ALT-Erhöhung, was als Krankheitssymptom wiederum 3-10 Wochen nach Inokulation des NANBV beo­ bachtbar ist. Damit ergeben sich 9-26 Wochen nach Infektion eines Schimpansen als Gesamtzeitraum, bis mit dem Immunoassay gemäß dem Stand der Technik mit C-100-3- Protein des HCV spezifische Antikörper nachweisbar sind.

Beim Menschen scheint diese diagnostische Lücke minde­ stens ebenso groß zu sein, wenn nicht sogar größer; in der zitierten PCT sind Daten von 6 bis 12 Monaten ange­ geben, dies würde die geringe Sensitivität von 20-30% bei akut infizierten NANB-Patienten erklären. Weitere Einschränkungen des Verfahrens gemäß dem Stand der Technik ergeben sich im Hinblick auf die Spezifität, da ein nennenswerter Teil der in diesem ELISA reaktiven Proben durch Störungen des Testsystems verursacht wird. Der genaue Anteil derartiger falsch positiver Proben ist in Ermangelung eines validierten Bestätigungstests nicht exakt quantifizierbar, zumal in verschiedenen Popula­ tionen unterschiedliche Reaktivitäten dieser Art gefunden wurden (COLOMBO M., et al. Lancet 1990, Vol. 335, S. 1345). Der Anteil falsch positiver Werte kann aber bis zu 40% in der Gruppe gesunder Blutspender betragen (WEINER A., et al. Lancet 1990, Vol. 336, S. 695). Als Ursache dieser Störungen wurde Lagerung und Hitzeinaktivierung der Proben beschrieben (DESMYTER J., et al. Int. Symp. on Viral Hepatitis and Liver Disease 1990, Houston, USA), aber auch Interferenzen durch Antikörper gegen die zur Expression in Hefezellen verwendete Superoxid-Dismutase, Hefe-Kontaminationen und Rheumafaktoren wurden festge­ stellt (IKEDA, Y., et al. Lancet 1990, Vol. 335, S. 1345­ /THEILMANN, L., et al. Lancet 1990, Vol. 335, S. 1346 und KIDD, S., et al. Int. Congr. of Virology 1990, Berlin FRG).

In Ermangelung eines validierten Bestätigungstests muß damit davon ausgegangen werden, daß z. Z. ein nicht unerheblicher Anteil falsch positiver Proben im Blut­ spendewesen fälschlicherweise verworfen wird bei gleich­ zeitig ungenügend zuverlässiger Erfassung von tatsächlich Anti HCV-positiven Patienten.

Um diese Nachteile zu beseitigen, wurden von anderen Ar­ beitsgruppen in dem C-100-3-Protein enthaltene Sequenzen synthetisch in Form von Polypeptiden hergestellt und in einem Immunoassay eingesetzt (Peptide sp42, 117, 67 und 65 aus Fig. 2). Bei der Untersuchung von NANB-infizierten Schimpansen konnte keine Verbesserung der diagnostischen Wertigkeit erzielt werden. Die dabei gemachten Beobach­ tungen führten vielmehr zu dem Schluß, daß keines der beschriebenen Peptide (siehe Fig. 2) geeignet ist, als Basis einer zuverlässigen IgG- oder IgM-Bestimmung zu dienen, da die Empfindlichkeit unzureichend ist und mit einer diagnostischen Lücke von mindestens 7 bis 17 Wochen bis zum Antikörper-Nachweis keine Verkürzung gestattet. Darüber hinaus wurde gefunden, daß insbesondere das als sp42 bezeichnete Polypeptid (Aminosäure 126 bis 167, Abb. 2) mit einer 20 bis 40 Wochen dauernden diagnostischen Lücke besonders ungeeignet für einen diagnostischen Test sei und ein geeigneter Screeningtest für Anti HCV auf anderen Sequenzen aus differenten HCV-Genom-Abschnitten für ein zuverlässiges Diagnostikum zum Nachweis von Anti HCV beruhen müsse (SAFFORD J., et al. Int. Symp. on Viral Hepatitis and Liver Disease 1990 Houston, USA).

Auf Basis der genannten Peptide wurden auch ELISAs ent­ wickelt, deren Evaluierung wiederum auf eine nicht aus­ reichende Sensitivität verwies, insbesondere bezüglich der bestehenden erheblichen diagnostischen Lücke, so daß das Einsatzgebiet von C-100-3-analogen Polypeptiden wegen der fehlenden Stör-Kontaminationen lediglich in einer Verwendung als Bestätigungstest für reaktive Proben gesehen wird, nicht jedoch als Basis eines Screeningtests (DAWSON, G. J., et al. Int. Congress of Virology 1990, Berlin FRG). Gerade dort ist jedoch vor allem im Hinblick auf die zitierten Leistungsmerkmale Spezifität und insbe­ sondere Sensitivität eine signifikante Verbesserung ge­ fordert, da in dieser Testebene falsch negativ reagieren­ de Spender unerkannt bleiben und keiner weiteren Unter­ suchung mehr zugeführt werden und falsch positive Ergeb­ nisse zumindest einen zusätzlichen Arbeits- und Finanz­ aufwand erfordern.

In der Analyse der beschriebenen synthetisch hergestell­ ten Peptide wird dem als sp67 bezeichneten Polypeptid (Aminosäure 116 bis 182, siehe Fig. 2) eine immundomi­ nante Region zugesprochen, ohne daß jedoch mit diesem Peptid durch Erkennung von frühen (IgM-) Antikörpern die diagnostische Lücke als verkleinert gefunden worden wäre und lediglich eine 86%ige Erfassung von Anti HCV-posi­ tiven Proben mögliche war (86,2%, ermittelt im Inhibi­ tionstest mit sp67, DAWSON, G. J., et al. Int. Congress of Virology 1990, Berlin, FRG). Das in sp67 größtenteils enthaltene sp42 (Aminosäure 126 bis 167, siehe Fig. 2) wurde als völlig bedeutungslos für den Anti HCV-Nachweis gefunden. Eine weitere immunreaktive Region wurde Car­ boxy-terminal auf dem sp65 (Aminosäure 298-363) nach­ gewiesen (DAWSON, G. J., et al. Int. Congress of Virology 1990, Berlin, FRG).

Der vorliegenden Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zu finden, HCV-Infektionen möglichst frühzeitig und mit hoher Spezifität nachzuweisen.

Im Gegensatz zu der bis dahin herrschenden Meinung wurde jedoch überraschenderweise gefunden, daß bestimmte syn­ thetisch hergestellte Polypeptide aus dem Bereich des C-100-3 Konstruktes, die aus nachstehend aufgeführten Aminosäuresequenzen ausgewählt wurden, geeignet sind, die diagnostische Lücke signifikant zu verkleinern bei gleichzeitig zuverlässigem Nachweis später Antikörper und signifikant verbesserter Spezifität. Bedingt durch die Reindarstellung der nachstehend aufgeführten Polypeptide ist es auch möglich, eine hohe Antigenkonzentration und damit eine hohe Epitopdichte in einem immunchemischen Nachweisverfahren zu erzielen. Ferner wird durch die Ab­ wesenheit störender Kontaminationen als Kennzeichen der synthetischen Peptide die Untersuchung wenig oder gar nicht verdünnter Patientenproben möglich, wodurch insge­ samt die Empfindlichkeit eines Immunoassays signifikant verbessert.

Durch eine Auftrennung der Peptide mit Bindungsstellen für frühe bzw. späte HCV-spezifische Antikörper ist eine zuverlässige Differenzierung zwischen akuten und chroni­ schen Krankheitsverläufen erstmals möglich. Diese Peptide oder Mischungen davon können zuverlässig in hochsensiti­ ven und hochspezifischen Screeningassays für Reihenunter­ suchungen eingesetzt werden.

Ohne damit einen bestimmten Wirkungsmechanismus festlegen zu wollen, gehen wir davon aus, daß die erfindungsgemäßen Peptide Sequenzen bzw. Strukturen enthalten, die für frühe und/oder späte HCV-Antikörper spezifisch sind. Bei Verwendung eines Peptides mit beiden Typen von Bindungs­ stellen können demnach sowohl Proben aus frühen als auch Proben aus späteren Infektionsphasen erfaßt werden. Auch Serokonversionen durch HCV spezifische IgG- und/oder IgM-Antikörper verursacht, können sicher erfaßt werden. Ferner ist die Diskriminierung von positiven und negati­ ven Proben mit außerordentlich hoher Trennschärfe sowie eine Differenzierung zwischen akuten und chronischen Verlaufsformen durch die Auswahl entsprechender Peptid­ sequenzen mit Bindungsstellen für frühe oder späte HCV-Antikörper möglich. Durch die peptidchemische Syn­ these wird sichergestellt, daß keine Interferenz durch das für eine gentechnologische Proteindarstellung erfor­ derliche Expressionssystem vorliegen kann oder andere bei Viruszucht unvermeidliche Wirtszell-Kontaminationen, und daß in Seren, Citrat-, Heparin-, und EDTA-Plasmen humanen Ursprungs eine sichere Bestimmung von HCV-spezifischen Antikörpern gewährleistet ist und eine Inaktivierung der Proben (z. B. über 60 min. bei 55°C) zu keinen falsch-po­ sitiven Resultaten führt.

Gegenstand der Erfindung sind Peptide oder Proteine gemäß der Ansprüche, die spezifisch mit Antikörpern gegen eine HCV Infektion rea­ agieren, wobei ihre Aminosäuresequenzen Teilen des HCV C-100-3 Konstruktes entsprechen.

Bevorzugterweise werden diese Peptide peptidchemisch synthetisiert.

Gegenstand der Erfindung sind auch Peptide wie oben beschrieben, wobei ihre Aminosäuresequenz gegenüber der natürlich vorkommenden Sequenz durch Ersatz, Hinzufügen oder Weglassen von einer oder mehreren Aminosäuren dergestalt modifiziert ist, daß ihre Immunreaktivität im wesentlichen erhalten oder verbessert wird.

Ferner sind Gegenstand der Erfindung DNA Sequenzen, die für mindestens eines der oben beschrieben Peptide.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Antikörper, die zu mindestens einem der oben beschriebenen Peptide eine biospezifische Affinität haben.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein immunchemisches Verfahren zu Nachweis und/oder zur Bestimmung von HCV Antikörpern unter Verwendung von Peptiden als Antigen, wobei dies Peptide wie oben beschrieben sind.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein analytisches Ver­ fahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von HCV, wobei als spezifischer Schritt eine Hybridisierungsreak­ tion eingesetzt wird, in der mindestes eine Nukleinsäure­ sonde verwendet wird, die in ihrem spezifischen Teil komplementär zu mindestes einer der oben beschriebenen DNA Sequenzen ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vaccine, die mindestens eines der oben beschriebenen Peptide enthält.

Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zum Zwecke einer Differentialdiagnose zwischen früher und später Infektionsphase, wobei jeweils ein oder mehrere Peptide die spezifisch auf frühe Antikörper reagieren und ein oder mehrere Peptide, die spezifische auf späte Antikörper reagieren in getrennten Ansätzen mit der Probe zur Reaktion gebracht werden.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben be­ schriebenen Antikörper zu diagnostischen und therapeuti­ schen Zwecken.

Gegenstand der Erfindung sind neue synthetische Peptide, die entweder vorzugsweise HCV Antikörper von rekonvales­ zenten oder chronisch infizierten Patienten (späte Anti­ körper) oder hauptsächlich HCV-Antikörper während der akuten Infektionsphase (frühe Antikörper) erfassen, und es werden Polypeptide bzw. Mischungen von Peptiden beschrieben, die sich als Basis von Screeningstests zum nichtdifferenzierenden, aber hochsensitiven und wenig störanfälligen Nachweis von Anti HCV eignen.

Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren, die opti­ mierte Methoden beschreiben, wie das Lösen und Verwendung der Peptide, um die Substanz-spezifischen Merkmale voll zur Geltung zu bringen.

Durch diese Peptide wird die Erzeugung von spezifischen Antikörpern möglich, mit deren Hilfe durch die immunche­ mische Bestimmung entsprechender Antigene im zellfreien Patientenblut das Vorhandensein von HCV bereits vor dem Auftreten körpereigener Antikörper festgestellt werden kann.

Die Ausdrücke Peptide und Polypeptide werden im Sinne der Erfindung als gleichwertig für Peptide mit bis zu etwa 60 AS verwendet.

Die neuen Peptide des erfindungsgemäßen Verfahrens um­ fassen bevorzugterweise Aminosäure-Sequenzen zwischen AS 120 und AS 176 (I) sowie zwischen AS 337 und AS 363 (II) des als C-100-3 beschriebenen Genomabschnittes von HCV mit folgenden Primärsequenzen:

121 175
SGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIEQGMMLAEQFKQKALGLLQTASRQA I
HVGPGEGAVQWMNRLIAFASRGNHVSP II

Diese Aminosäure-Sequenzen können sowohl als ein Polypep­ tid, als auch als Mischung mehrerer kleiner Peptide mit überlappender oder nicht überlappender Aminosäure-Sequenz synthetisiert werden.

Vorteilhaft ist es, einerseits die Amino-terminalen Se­ quenzen zusammen mit der Carboxy-terminalen Aminosäure­ sequenz und der Sequenz 337 bis 363 zu verwenden und andererseits die mittlere Aminosäuresequenz von etwa 130 bis 160 getrennt davon anzuwenden, wobei die entsprechen­ den Sequenzen wiederum in Form mehrerer kleiner, vorzugs­ weise 6 bis 15 Aminosäuren umfassender Peptide syntheti­ siert werden können, oder als jeweils ein Polypeptid, welches im ersten Fall wo es sich um auseinanderliegende Strukturen handelt, durch synthetisches Zusammenführen entweder bei der Synthese direkt oder nachträglich durch kovalente Kupplung getrennt hergestellter Peptide mit Hilfe bekannter Kupplungstechniken durch Einführung eines geeigneten Spacers in Form natürlich vorkommender, 1 bis 40 Aminosäuren umfassender Sequenzen oder durch Integra­ tion anderer für diesen Zweck bekannter Agentien.

Ein unerwarteter Vorteil der neuen Peptide der vorlie­ genden Erfindung ist, daß sie eine zuverlässige Bestim­ mung von HCV-Antikörpern gestatten. Ferner werden mit Hilfe dieser Peptide auch frühe Antikörper aus akuten Infektionsphasen erfaßt, was wesentlich die Sensitivität der auf diesen Peptiden beruhenden Nachweise gegenüber dem Stand der Technik verbessert und außerdem die Diffe­ renzierung zwischen akuten Phasen einerseits und chro­ nischen bzw. rekonvaleszenten Stadien andererseits dann gestattet, wenn die Peptide mit den entsprechenden Bindungsstellen für diese Antikörper-Typen (frühe bzw. späte Antikörper) getrennt voneinander in zwei verschie­ denen Testverfahren verwendet werden.

Schließlich ergibt sich als weiterer Vorteil die hohe Spezifität der Peptide der vorliegenden Erfindung, was zu einer Minimierung der Zahl von falsch-positiv reagieren­ den Proben führt.

Auswahl der Peptide

Potentielle Epitope der Aminosäuresequenz wurden nach verschiedenen physikochemischen Kriterien ausgewählt, die helfen, vorauszusagen, welche Teile eines Polypeptids wahrscheinlich oberflächenorientiert sind und damit immunogen sein können. Unter diesen bekannten Verfahren wurde der Hydrophobizitäts-Plot von HOPP und WOOD angewendet (Proc. Nat. Acad. Sci. 78, 3824-3828 (1981) sowie eine analoge Methode von KYTE und DOOLITTLE (J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982). Die empirische Voraussage einer Protein-Konfirmation nach CHOU und FASMAN (Ann. Rev. Bioch. 47, 251-276 (1978)) ist ebenfalls eine nützliche Methode, um voraussichtlich immunogene Bereiche eines Polypeptids zu definieren. Obwohl diese theoretischen Ansätze hilfreiche Methoden darstellen, finden sich viele Ausnahmen, darunter auch einige, die Gegenstand der Erfindung sind.

Synthetisiert und gereinigt wurden die Aminosäuresequen­ zen nach dem Stand der Technik, wie z. B. beschrieben von BARANI, G. und MERRIFIELD, R. B, in "The Peptides, Analy­ sis Synthesis and Biology", Vol. 2, Academic Press 1980, Ed. Erhard Gross, Johannes Meyenhofer.

Dem Fachmann ist bekannt, natürlich vorkommende Sequenzen zu modifizieren, um Polypeptide besser als immundiagno­ stisches Reagenz nutzen zu können. Derartige Verände­ rungen betreffen z. B.:

Zufügen eines Cysteins am Amino- oder Carboxy-terminalen Ende, um das Koppeln des Peptides an ein Carrier-Protein zu erleichtern, wobei häufig heterobifunktionelle Cross­ linker Verwendung finden.

Bestimmte dem Fachmann bekannte Aminosäuren werden auch Amino- oder Carboxy-terminal an das Polypeptid addiert, um das Verknüpfen von Peptiden untereinander zu ermög­ lichen oder zum Koppeln an einen Träger oder größeres Peptid, oder um die physikalischen und chemischen Eigen­ schaften des Polypeptids zu modifizieren.

Bekannt ist dem Fachmann auch, daß Peptide auch vielfäl­ tig derivatisiert werden können wie z. B. durch Amino­ terminale Angliederung, Thioglykolsäure-Amidierung, Car­ boxy-terminale Amidierung, wie z. B. mit Ammonium oder Methylamin. Derartige Modifikationen verändern die Netto­ ladung des Polypeptids und können physikochemische Eigen­ schaften verbessern oder die kovalente Bindung des Pep­ tids an einem festen Träger, Carrier-Proteine oder ein anderes Peptid erleichtern. Es ist nicht sehr wahrschein­ lich, daß solche Modifikationen zu direkten Veränderungen der Immunreaktivität eines Peptides führen, allerdings kann als Folge verbesserter physikochemischer Substanz- Eigenschaften durchaus ein besseres Merkmal des Peptides als immundiagnostisches Mittel resultieren. So neigt z. B. Methionin zu spontaner Oxidation, was durch Austausch ge­ gen Norleucin verhindert werden kann, ohne daß sich die antigenen Eigenschaften des Polypeptids nennenswert ändern.

Es ist dem Fachmann bekannt, daß gegebene Aminosäure-Se­ quenzen den verschiedensten Veränderungen unterworfen werden können, wie z. B. Deletionen, Insertionen oder Substitutionen, womit verschiedene Vorteile verbunden sein können. Solche Modifikationen betreffen z. B. Kombinationen wie Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg: Phe, Tyr; Ala, Ser; Ala, Thr; Ala, Val; Ala, Pro; Ala, Glu; Leu, Gln; Gly, Phe; Ile, Ser und Ile, Met.

Ebenfalls kann es vorteilhaft sein, in Form der Zusatzes einer hydrophoben Sequenz, umfassend etwa 2 bis 20 hydrophobe Aminosäuren wie z. B. Phe Ala Phe Ala Phe, die Adsorptionseigenschaften des Polypeptides zu verbessern.

Erfindungsgemäße Polypeptide sind:

Es wurde auch gefunden, daß für einen immunchemischen anti-HCV-Nachweis Mischungen einzelner Peptide bessere diagnostische Eigenschaften haben können, als einzelne Peptide der genannten Strukturen, so daß geeignete Mischungen aus den aufgeführten Peptiden, aber auch anderer Syntheseprodukte enthaltende Sequenzen aus der allgemeinen Beschreibung I für einen Immunoassay geeig­ neter sein können als ein beschriebenes Peptid.

Für den Nachweis später Antikörper einer HCV-Infektion haben sich bevorzugterweise Strukturen aus dem Amino- und Carboxyterminalen Bereich der Formel I als geeignet erwiesen, wie z. B. die Peptide 4081, 4056, 4055 sowie das nachstehende 4060:

Überraschenderweise hat sich auch der Carboxy-terminale Bereich des C-100-3-Konstruktes für den Nachweis später Antikörper als besonders geeignet erwiesen, umfassend die Aminosäuren der Formel II. Ein Syntheseprodukt, das 4091 wird stellvertretend als immunreaktiv beschrieben.

Es wurde gefunden, daß der mittlere Bereich der Formel I für die frühe Erfassung von Anti HCV relevant ist, bevorzugt sind hier die bereits erwähnten Polypeptiden 4071 und 4072 sowie die kleineren Peptide 4054, 4053 und 4052, die als Syntheseprodukte durch beispielhafte Ver­ suche charakterisiert wurden.

Es können auf dem Peptid gemäß Formel I 2 Epitope lokali­ siert werden, von denen mit hoher Wahrscheinlichkeit eines (S) späte Antikörper, das andere (F1) frühe Anti­ körper erkennt

Eine weitere Erkennungsstelle für frühe Antikörper ist F2

Die Peptide S, F1 und F2 sind besonders bevorzugt, wobei auch Peptide und Proteine, die die genannten Peptide einschließen und eine Immunreaktion mit anti-HCV zeigen, bevorzugt sind.

Bevorzugt sind auch Peptide, die sie eine der folgenden Aminosäuresequenzen einschließen

AS_a1-DVEVLYR-BS_b1
AS_a2-QHLPYIE-BS_b2
AS_a3-KQKALGL-BS_b3'

wobei AS und BS eine Aminosäure bedeuten und a1-a3 und b1-b3 jeweils ganze Zahlen sind, die mindestens 0 betragen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden 2 bzw. mehrere dieser Peptide oder mehrere Peptide mit der in den Formeln I und II enthaltenden Sequenzen mit oder ohne Spacer verknüpften oder sogar polymere Formen zweier oder mehrerer Peptide hergestellten bzw. an einen Carrier wie z. B. Protein oder Latexpartikel bzw. an einen Träger zu binden. Ferner ist bevorzugt eine Modifikation der Peptide gemäß Formel I und II derart, daß eine Amino- oder Carboxy-terminale Verlängerung mit 2 bis 40, bevor­ zugt 5 bis 20, natürlicherweise vorkommenden Aminosäure­ sequenzen (siehe Fig. 1) vorgenommen wird, wobei die zusätzlichen Bereiche und Strukturen, das physikochemi­ sche Verhalten des Gesamtpeptides eventuell günstig beeinflussen und die Immunreaktivität auf den Aminosäure­ sequenzen der Formeln 1 und II beruht.

Derartige Modifikationen verändern u. a. die passive Adsorption oder kovalente Bindeeigenschaft an die Fest­ phase gegebenenfalls positiv, beeinflussen das Kopplungs­ verfahren vorteilhaft oder wirken stärker als Antigen bei der Erzeugung von gegen die Peptide gerichtete Antikör­ per, die polyklonal oder monoklonal sein können.

Unter dem Begriff immunchemisches Nachweisverfahren sind dem Fachmann zahlreiche, sehr verschiedene Methoden be­ kannt, die sich in speziellen Ausführungsformen, dem zur Detektion verwendeten Marker oder Meßprinzip (z. B. photometrisch, radiometrisch, visuell bzw. per Aggrega­ tions-, Streulicht- oder Präzipitations-Verhalten) und Festphasen unterscheiden. Dem Fachmann ist bekannt, daß eine Trennung von gebundenen und freien Proben-Antikör­ pern oder -Antigenen zwar weit verbreitet aber nicht unbedingt erforderlich ist, wie z. B. bei sogenannten homogenen Assays. Bevorzugt sind heterogene Immunoassays. Besonders bevorzugt sind ELISA Verfahren.

Bei dem HCV-Antikörper Nachweis setzt ein immunchemisches Nachweisverfahren während des Ablaufes den Kontakt der Probe mit Peptidsequenzen aus den Formeln I und/oder II voraus, um in einem bestimmten Schritt des jeweiligen Verfahrens einen HCV-Antigen/HCV-Antikörperkomplex auszubilden oder bei Kompetitions- und Inhibitionstests die Bildung desselben durch Zusatz von markiertem anti- HCV oder HCV-Peptiden zu verhindern.

In den direkten Verfahren können die Antikörper mit festphasengebundenen Peptiden oder mit markierten Pepti­ den oder mit beiden in Kontakt gebracht werden, wobei es unerheblich ist, ob das zugrundeliegende Verfahren als 1-, 2- oder Mehr-Schritt-Methode auf dem Prinzip des 2. Antikörper-Tests oder dem immunometrischen Testaufbau (Doppel-Antigen-Sandwich entweder mit gleichen oder unterschiedlichen Peptiden bzw. Peptidmischungen auf der Festphase und als Flüssigreagenz für die Detektion) oder über spezifische Capture-Antikörper (z. B. Anti IgM) oder Affinitätsreagenzien (z. B. Protein A) beruht.

Die Bindung der Peptide an die Festphase kann kovalent, adsorptiv oder vermittels spezifischer Antikörper oder ähnlich affiner Methoden, z. B. über den Biotin/Avidin- Komplex erfolgen.

Als Trägermaterial für die Festphase sind Kunststoffe wie z. B. Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyamid und andere synthetische Polymere, natürliche Polymere wie Zellulose, sowie derivatisierte natürliche Polymere wie Zellulose­ acetat und Nitrozellulose als auch Glas, insbesondere als Glasfaser geeignet.

Die Träger können die Form von Kugeln, Stäben, Röhrchen, und Mikrotiterplatten haben oder in Form von Suspensionen wie z. B. Latexpartikel oder magnetisch anziehbare Par­ tikel vorliegen. Flächenförmige Gebilde wie Streifenpa­ piere, Plättchen und Membranen sind ebenfalls geeignet. Die Oberfläche der Träger kann sowohl für wässrige Lö­ sungen durchlässig als auch undurchlässig sein.

Bevorzugte Träger sind Kugeln, Röhrchen, Näpfchen, Mikro­ partikel, Streifenpapiere und Membranen. Besonders bevor­ zugte Träger sind Mikrotitrationsplatten, Latexpartikel, Polystyrol-Kugeln oder magnetisch anziehbare Teilchen.

Als Marker können verwendet werden radioaktive Isotope, fluoreszierende und chemilumineszierende Farbstoffe sowie Enzyme, deren Nachweis durch chromogene, luminogene oder fluorogene Substratsysteme oder durch nachgeschaltete Verstärkersysteme mit einem 2. Enzym, das durch das erste aktiviert wird, möglich ist. Bevorzugt werden Enzyme und Chemoluminogene.

Es sind mehrstufige Verfahren wie z. B. präformierte Peptid-Antikörper-Komplexe sind möglich, in denen der Antikörper die Markierung trägt, oder hochaffine Systeme wie z. B. Biotin/Avidin mit Markierung eines dieser Reaktionspartner.

Die Markierung erfolgt nach Verfahren, die für die genannten Marker als Stand der Technik beschrieben sind.

Im Falle der Markierung der Antikörper mit Peroxidase kann die Periodat Technik nach NAKANE, et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22, 1084-1090, angewandt werden oder ein Verfahren gemäß ISHIKAWA et al., 1983, J. Immunoassay 4, 209-327, in dem die Partner mit einem heterobifunktionellen Reagenz verknüpft werden.

Neben diesen Verfahren können die Peptide zur Sensibili­ sierung von geeigneten Oberflächen, wie z. B. bei Latex oder Erythrozyten, verwendet werden, um durch Peptid-spe­ zifische Antikörper induzierte physikochemische Verän­ derungen wie z. B. Präzipitation, Aggregation oder Lichtstreuung automatisch oder visuell zu messen. Es ist naheliegend, daß die Peptide auch nicht-derivatisiert zur Inhibition dieser Meßprinzipien wie auch der zuvor ge­ nannten Methoden eingesetzt werden können.

Für den Nachweis von HCV-Antigen, enthaltend die in For­ mel I und II angegebenen Aminosäuresequenz können z. B. immundiagnostische Verfahren angewendet werden, die sich polyklonaler oder monoklonaler Antikörper bedienen, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Peptide oder Derivaten davon dargestellt werden. Die für das Nachweisverfahren in Frage kommenden Ausführungsformen sind dadurch gekenn­ zeichnet, daß in einem bestimmten Schritt HCV-Antikör­ per/HCV-Antigen-Komplexe gebildet werden oder die Kom­ plexbildung in Kompetitionsverfahren durch Zusatz eines markierten Antigens inhibiert wird.

Für die Etablierung eines solchen HCV-Antigen-Tests kommen als Festphasen, Marker oder Meßprinzip alle bei der HCV-Antikörper-Bestimmung erläuterten Möglichkeiten in Frage, wobei das Kompetitionsprinzip und die Doppel­ antikörper-sandwich Technik als immunchemische Methode besonders bevorzugt sind.

Dabei ist es unerheblich, ob die Verfahren als 1- oder 2-Schritt ausgelegt sind, es kommen sogar Mehrschritt­ verfahren mit unmarkierten Nachweisantikörper in Frage, die mit Hilfe eines weiteren dagegen gerichteten Anti­ körpers bestimmt werden, der entsprechend markiert ist. Für die Erzeugung der HCV-Antikörper ist es vorteilhaft, die Peptide derart zu modifizieren, daß deren antigene Eigenschaft verbessert wird, wie dies z. B. durch Kopplung am Serumalbumin oder keyhole limpet-hemocyanin­ möglich ist.

Ferner ergibt sich als eine weitere Anwendung der Erfin­ dung, daß mehrere Analyten gleichzeitig nichtdifferen­ zierend in einem Testansatz bestimmt werden können. Zum Beispiel ist es in einem Enzymimmunoassay (ELISA) vor­ teilhaft, den Anti HCV-Nachweis mit Antikörper-Bestim­ mungen zu kombinieren, die für andere Antigene spezifisch sind. Dazu wird eine Mischung der erfindungsgemäßen HCV-Peptide mit anderen Antigenen z. B. HIV-Antigenen hergestellt, auf geeigneten Festphasen immobilisiert und mit der Probe in Kontakt gebracht, um bei Vorhandensein von Antigen-spezifischen Antikörpern entsprechende Anti­ gen-Antikörper-Komplexe auf dar Festphase auszubilden. Nach Auswaschen ungebundener Reaktanten erfolgt der Nachweis mit markierten Antikörpern, die z. B. für humanes Immunglobulin G spezifisch sind. Ein derartiges Verfahren ist außerordentlich vorteilhaft, da die Zahl von Einzelbestimmungen bei Reihenuntersuchungen erheblich reduziert wird. Möglich wird ein derartiges Verfahren durch die Anwendung der neuen Peptide, deren hohe Rein­ heit und starke Antigenität die Verwendung kleinster Mengen von 0,1 bis 0,5 µg/ml in einem immunchemischen Verfahren gestattet, so daß in dem genannten Beispiel die Bindekapazität der Festphase bei weitem nicht gesättigt ist (übliche Beschichtungskonzentration ca. 2-10 µg/ml), so daß andere Antigen-Spezifitäten zusätzlich erfolgreich beschichtet werden können. Diese Vorteilhaftigkeit gilt sinngemäß für alle angesprochenen Ausführungsformen von immunchemischen Bestimmungen. Es ist naheliegend, daß aus dem gleichen Grund auch HCV-Peptide zusammen mit Antikör­ pern für den gleichzeitigen Nachweis von Anti HCV und einem oder mehrerer Antigene (z. B. Hepatitis-B surface Antigen, HBsAg) ebenso verwendet werden kann wie für andere Kombinationen, wie z. B. 2 Antigene und Anti HCV 1 Antigen, Anti HCV und einen weiteren Antikörper usw.. Bevorzugt ist eine Kombination von HCV und HIV Antigenen.

Schließlich kann die vorliegende Erfindung auch angewen­ det werden in einem immundiagnostischen Element, das eine Festphase und in trockener Form einen Teil oder auch alle erforderlichen Reagenzien enthält, wobei auch hier die erfindungsgemäßen HCV-Peptide entweder Festphasenseitig oder im Detektionsreagenz oder in beiden enthalten sind und eine Anti HCV-Bestimmung, ein HCV-Antigen-Nachweis oder Kombinationen mit anderen Analyten durchgeführt wird.

Die nachfolgend beschriebenen Beispiele stellen Ausfüh­ rungsformen der Erfindung dar, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung von Peptid-Lösungen und Beschichtung von Mikrotrationsplatten mit diesen Peptiden bzw. Peptid- Mischungen

Aus Stammlösungen der erfindungsgemäßen Peptide in 50% Essigsäure in destilliertem Wasser, enthaltend 1 bis 10 mg Peptid/ml wurden 2fache Verdünnungsreihen in 0,10 M Natriumbicarbonat pH 9,6 angelegt, also eine Reihe mit den Konzentrationen 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56, 0,78, 0,39, 0,2, 0,1, 0,05 und 0,01 µg Peptid/ml erhalten. Bei Mischungen von einzelnen Peptiden wurde analog vorgegan­ gen, wobei die Stammlösungen zusätzlich in verschiedenen Verhältnissen gemischt wurden, z. B. 10 : 1 oder 1 : 4, um durch Verdünnung in 0,1 M Natriumbicarbonat die oben angegebenen Gesamt-Endkonzentrationen zu erhalten, die aber bei Mischungen mehrerer Peptide diese gleichkonzen­ triert (bei 1 : 1-Mischung) oder in verschiedenen Ver­ hältnissen zueinander enthalten.

100 µl einer jeden Verdünnung wurde in jeweils 16 Wells von Mikrotiterplatten, Typ B der Firma Nung, Roskilde, Dänemark gegeben. Die mit den Verdünnungen gefüllten Testplatten wurden 18 Stunden bei 20°C belassen, dann wurden die Lösungen in den Wells abgesaugt und die Wells 3-4 mal mit 300 µl einer Lösung von 10 g/l Rinderse­ rumalbumin in phosphatgepufferter physiologischer Koch­ salzlösung, (PBS, pH 7,4) durch Füllen und Absaugen gewaschen und die Testplatten anschließend über Kieselgel bei 20°C getrocknet.

Beispiel 2 Herstellung eines Peroxidase-markierten Antikörpers gegen Humanes Immunglobulin der IgG-Klasse (h-IgG) sowie TMD- Substrat für die Detektion

Antikörper gegen h-IgG wurden gemäß der Methode von KOEHLER und MILSTEIN zur Darstellung monoklonaler Anti­ körper erzeugt (Nature 256, 495, 1975), wobei verschie­ dene monoklonale Antikörper mit der gleichen Antigen- Spezifität mit der von STÄHLI et al. (J. of Immunological Methods 32, 297-304, 1980) beschriebenen Methode iden­ tifiziert wurden.

Nach gelchromatographischer Reinigung und Dialyse gegen Phosphat-gepufferter Saline (PBS, pH 7,4) wurde der die monoklonalen Antikörper-Fraktion enthaltende Pool (4 mg Protein/ml) anschließend mit N-gamma-Maleimidobutylyloxi­ succinimid (GMBS), bezogen von der Fa. Behring Diagnos­ tics, umgesetzt wie von TANAMORI et al. (J. Immunol. Meth. 62, 123-131, 1983) beschrieben.

Die erhaltene Lösung des IgG-POD Konjugats hatte einen Proteingehalt von 360 µg/ml. Das Verhältnis von POD zu IgG wurde mit 2.8 bestimmt. Die Lösung wurde anschließend auf 500 ng/ml IgG-POD mit einer Lösung von 50 ml/l foetalem Kälberserum (FKS), 5 g/l Polyoxiethylen-(20)- sorbitan Monalaureat (^RTween 20) in PBS verdünnt und erhielt die Bezeichnung Anti IgG/POD-Konjugat. Für die Verwendung im ELISA wurde die nachfolgende Verdünnung in Tris-Puffer pH 7,4, enthaltend 0,5% ^RTween 20 variiert (zwischen 1 : 100- und 1 : 20.000-Verdünnung), um ein­ heitlich eine 1 : 26-Endverdünnung in Konjugat-Puffer herzustellen, enthaltend 0,1 M 2-Amino-2(hydroxymethyl) 1,3-propandiol (Tris), 0,1 M Kochsalz (NaCl) sowie 0,1% ^RTween pH 8,4.

Gemäß dem Stand der Technik dargestellte polyklonale Antikörper vom Kaninchen wurden so eingestellt, daß ebenfalls eine Gebrauchsverdünnung von 1 + 25 erzielt wurde.

Zum Nachweis von Anti-IgG/POD-Konjugat wurde ein Substrat­ system oder eine Substratzubereitung verwandt, enthaltend Wasserstoffperoxid und Tetramethylbenzidin (TMB), welche aus zwei Stammlösungen hergestellt wurde.

Stammlösung 1: TMB-Dihydrochlorid wurde unter Rühren in einer Konzentration von 5 g/l, d. h. von 16 mmol/l in bidestilliertem Wasser gelöst und mit 5 normaler Salz­ säure auf pH 1,5 eingestellt. Zu dieser Lösung wurde Penicillin G unter Rühren in einer Endkonzentration von 200 mg/l, d. h. von 0,56 mmol/l zugesetzt.

Stammlösung 2: zu 900 ml bidestilliertem Wasser wurde 1,4 ml Eisessig, 1,5 ml 1 normale NaOH und 250 mg, d. h. 3 mmol H₂O₂ als Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Addukt zuge­ setzt. Nach vollständigem Lösen wurde mit bidestilliertem Wasser auf 1 l aufgefüllt.

TMB-Substratzubereitung: Ein Volumenteil der Stammlösung 1 und 10 Volumenteile der Stammlösung 2 wurden miteinan­ der vermischt.

Beispiel 3 Stand der Technik

Als Stand der Technik wurde der kommerziell erhältliche HCV-ELISA Testkit (Bestell Nr. 940 900) der Fa. ORTHO eingesetzt, in dem als Antigen das in der WO 89/04669 beschrieben, gentechnologisch in Hefe hergestellte C-100-3 Konstrukt verwendet wird. Bei der Untersuchung von humanen Seren und Plasmen wurde, wie in der Packungs­ beilage des Herstellers angegeben gearbeitet, z. B. Pro­ benverdünnung von 1 : 11 und 1 h-Inkubation von Serum, 1 h-Inkubation von Konjugat sowie dem Enzymsubstrat-System mit o-Phenylendiamin (OPD) als Substrat, photometrischer Messung bei 492 nm sowie die Grenzwert Festlegung (zu dem Mittelwert der Negativ-Kontrollen wird ein threshold von 0,40 E addiert).

Demgegenüber wurde bei der Bestimmung von HCV-spezifi­ schen Antikörpern in Schimpansen-Serum oder -Plasma derart verfahren, daß mit einem am Kaninchen erzeugten polyklonalen Antikörper gegen Human IgG detektiert wurde. Dazu wurde die IgG-Fraktion des Kaninchen-Antiserums wie in Beispiel 7 beschrieben gereinigt, dialysiert und mit Peroxidase (POD) markiert. Die Endkonzentration wurde im Vergleich zum monoklonalen Anti-IgG/POD-Konjugat etwa 4fach konzentrierter eingestellt, um über die in Vorver­ suchen validierte Kreuzreaktion der Antikörper gegen humanes IgG für Schimpansen-IgG sicher zu gestalten.

Die Grenzwert-Festlegung mußte modifiziert werden, indem der threshold auf 0,60 E erhöht wurde, da die Initial­ werte aller Schimpansen bereits höhere Werte aufwiesen (siehe Tab. 4 A-C).

Beispiel 4 Bestimmung von humanen Antikörpern der Immunglobulin G-Rlasse gegen HCV im ELISA mit den erfindungsgemäßen Peptiden

50 µl Serum oder Plasma wurden zu 50 µl Probenpuffer, enthaltend 0,3 M Tris, 0,3 M NaCl, 20% Boviserin und 0,1­ % ^RTween 20 in Wells von Mikrotiterplatten gegeben, die wie beschrieben mit Peptiden bzw. Peptid-Mischungen be­ schichtet wurden. Nach Inkubation über 30 Min. bei 37°C wurde der Inhalt der Wells durch Absaugen entfernt und die Wells fünfmal mit Waschpuffer enthaltend 1 g/l ^RTween 20 in PBS gewaschen. Dann erfolgte die Zugabe von 100 µl endverdünntem Konjugat in die Wells, wobei bevorzugt mit einer Vorverdünnung von 1 : 3000 in Tris-, 0,5% Tween 20 und einer Endverdünnung von 1 : 26 in Konjugatpuffer ge­ arbeitet wurde. Nach einer Inkubation über 30 Min. bei 37°C wurde der Inhalt der Wells durch Absaugen entfernt und wiederum fünfmal gewaschen. Anschließend wurden in jedes Well 100 µl TMB-Substratzubereitung gegeben, 30 Min. bei 20-22°C inkubiert und die Inkubation durch Zugabe von 100 µl 1-normaler Schwefelsäure beendet. Die Extinktion der gefärbten Lösung wurde bei einer Wellen­ länge von 450 nm (E₄₅₀) gegen einen Leerwert von PBS gemessen.

Als Anti-HCV-positiv wurden solche Proben eingestuft, die eine E₄₅₀ von größer als 0,10 erzeugten, als Anti HGV- grenzwertig die Proben, deren E₄₅₀ im Bereich von 0,05 bis 0,10 lag und als Anti HIV negativ solche Proben, die eine E₄₅₀ kleiner als 0,05 erzeugten.

Die Ergebnisse der Tab. 1 stellen sogenannte "ratios" dar, mit denen der Quotient von spezifischen Extinktions­ signalen zum Grenzwert (0,10 E) definiert wird. Als Vergleich finden sich in diesen Tabellen auch entspre­ chende Angaben, die durch Testung mit den Ortho HCV-ELISA erhalten wurden.

In Tab. 2 sind Resultate wiedergegeben, die durch Testung von humanen Proben mit ELISA erhalten wurden, die auf der Verwendung kleinerer Sequenzen (15 Aminosäuren) der Formel I beruhen. Es wird deutlich, daß die Peptide zur Epitop-Definition von HCV-Antikörpern bzw. als Mischung von mehrerer Peptiden, bevorzugt 3 bis 6 Peptide enthal­ tend, für die Bestimmung von Anti HCV geeignet sind.

Tab. 1

Ergebnisse der Bestimmung von Anti HCV mit einem ELISA, enthaltend das neue Peptid 4083 auf der Festphase, im Vergleich zum Ortho HCV-ELISA mit humanen Proben

Nur 4 bzw. 7 Proben reagierten schwächer, aber mit E₄₅₀- Werten zwischen 0,8 und 2,5 und einem Grenzwert von 0,10 E immer noch recht stark.

Tab. 2

Reaktivitäten von humanen Anti HCV-positiven Proben (Ortho HCV: positiv) in ELISAs mit kleineren, 15 Amino­ säuren umfassende Peptide auf der Oberfläche von Mikro titerplatten nach Beispiel 6; die Resultate werden als Extinktionswerte bei 450 nm (E₄₅₀) wiedergegeben (- = negativer Befund unter 0,10 E).

Von 101 Proben, die mit dem Ortho-Test als Anti HCV-po­ sitiv klassifiziert waren, wurden 101 Proben mit einem ELISA basierend auf einem erfindungsgemäßen Peptid (4083) ebenfalls positiv gefunden. Dargestellt sind ebenfalls die Reaktivitäten, wie sie mit einer Mischung von erfin­ dungsgemäßen Peptiden erhalten wurden (4060 und 4082 je 2 µg/ml).

Es fällt neben der sehr guten Übereinstimmung zu den Ergebnissen des Ortho-HCV-ELISAs auf, daß durch die sehr starke Signalbildung der Peptid-ELISA eine zuverlässige Diskriminierung zwischen Positiv- und Negativ-Ergebnissen erzielt wird. Analoge Resultate wurden mit folgenden erfindungsgemäßen Peptiden bzw. Peptidmischungen erzielt.
4074/4081 (je 2 µg/ml)
4074/4082 (0,5 und 0,125 µg/ml)
4060/4071/4081 (je 2 µg/ml), wobei sich Mischungen kleinerer, ca. 15 AS umfassender Peptide als durchaus geeignet erwiesen:
4056/4055 und 4052 (je 0,5 µg/ml).

Eine Abhängigkeit der Reaktivität der Proben von deren geographischem Ursprung konnte überhaupt nicht festgestellt werden.

Beispiel 5 Optimierung der ELISA-Bestimmung

Als veränderliche Parameter der ELISA-Bestimmung wurden hauptsächlich die bei der Beschichtung verwendeten Peptid-Konzentration oder bei Mischungen von Peptiden deren Gesamtkonzentration sowie Verhältnis zueinander variiert bei einer konstanten Konjugat-Konzentration von 1 : 3000 und 1 : 26-Verdünnung. Zusätzlich wurde bei festgelegten Beschichtungs-Konzentrationen die Konjugat- Vorverdünnung variiert. Beide veränderlichen Größen wurden hinsichtlich Spezifität durch Testung von Blut­ spenderseren und -plasmen validiert sowie in Bezug auf Sensitivität durch Bestimmung von Anti HCV in positiven Kollektiven. Darüber hinaus wurde die Grenzempfindlich­ keit in Form der analytischen Sensitivität durch serielle Verdünnung von Anti HCV-positiven Proben (1 : 2, 1 : 4 usw. in Anti HCV-negativen Seren) ermittelt und mit den Daten des vergleichend getesteten Ortho-Tests verglichen.

Die durch vergleichende Untersuchungen des Peptid-ELISA und dem Ortho HCV-ELISA mit humanen Proben erhaltene Ergebnisse sind in Tab. 3 beispielhaft zusammengefaßt.

Tab. 3

Vergleichende Titration von Anti HCV-positiven Seren und Plasmen im Peptid-ELISA (4083) und Ortho HCV. Angegeben werden ratios als Quotienten der spezifischen Signale zum Grenzwert, wobei Werte größer 1 ein positives, und Werte von kleiner 1 ein negatives Ergebnis anzeigen.

Die Ergebnisse der Tab. 3 machen deutlich, daß die Sensitivität des auf den erfindungsgemäßen Peptiden beruhenden ELISAs, gemessen an der Grenzempfindlichkeit von Serumtitrationen mindestens so gut ist wie der vergleichend in identischen Serumverdünnungen getestete Ortho HCV-Test. In vielen Fällen wurden sogar Verdün­ nungen noch signifikant positiv mit dem Peptid ELISA gemessen, die im Ortho-HCV-Test bereits wiederholbar negativ reagierten, so daß insgesamt eine bessere Nach­ weisgrenze von HCV-Antikörpern mit den erfindungsgemäßen Peptiden resultiert. Analoge Ergebnisse wurden ebenfalls mit anderen Peptidkonzentrationen, Peptidsequenzen oder Mischungen der neuen Peptide erzielt; wie z. B.
4083 (0,25 µg/ml)
4074/4081 (je 0,25 µg/ml)
4074/4082 (je 0,5 µg/ml)
4074/4082 (0,5 und 0,125 µg/ml)
4060/4082 (je 2 µg/ml)

Über die Bestimmung der Grenzempfindlichkeit hinaus wurde bei optimierten Systemen auch die Spezifität anhand Nicht-HCV-spezifischer Antikörper sowie anderer poten­ tieller Störfaktoren überprüft, wobei deutlich wurde, daß die Anti HCV-Bestimmung mit den erfindungsgemäßen Peptiden für HCV spezifisch ist und keinen bekannten Interferenzen wie z. B. Kreuzreaktionen anderer Antikör­ per, Störungen durch Hitzeinaktivierung o. ä. unterliegt. Sinngemäß gilt dies auch für andere bei den Beispielen 4 und 5 angegebene neuen Peptide bzw. Peptidmischungen, bei denen einheitlich eine hohe Serumkonzentration (Verdün­ nung 1 : 2 in Probenpuffer) angewendet wurde, um die Sensitivität zu steigern, was durch die Reinheit der Peptide und der hohen Antigen-Dichte auf der Festphase möglich wurde.

Beispiel 6 Bestimmung von Anti HCV in Schimpansen-Seren mit den erfindungsgemäßen Peptiden im ELISA

Verschiedene Peptide bzw. Peptid-Mischungen, adsorbiert in Wells von Mikrotiterplatten wurden mit Seren von Schimpansen untersucht, die mit verschiedenen infektiösen Dosen des NANBV infiziert wurden. Von den sequentiellen Entnahmen alle 4 Wochen post Inokulation wurden neben der GOT auch die GPT mit kommerziellen Tests gemessen und alle Proben parallel in Ortho-HCV-ELISA sowie im ELISA mit erfindungsgemäßen Peptiden bestimmt. Ähnlich wie beim Ortho-HCV-ELISA des Beispiels 3. wurden beim Peptid-ELISA die polyklonale Kaninchen-Antikörper, markiert mit POD, 4fach stärker konzentriert zur Detektion verwendet, wobei das Enzymsubstrat TMB verwendet wurde mit photometrischer Messung bei 450 nm. Die Testdurchführung entsprach der vorstehend beschriebenen Bestimmung von humanen Anti HCV mit 0,1 E als Grenzwertfestlegung sowie Wiedergabe der Ergebnisse der Tab. 4 als Verhältnis der spezifischen Extinktionswerte zu diesem cut off-Wert (ratios).

Die in Tab. 4A bis 4C aufgeführten Ergebnisse stellen sogenannte "ratios" dar, mit denen der Quotient aus spezifischem Signal und Grenzwert definiert wird.

Tab. 4 A-C

Anti HCV-Bestimmung in Schimpansen-Proben mit dem Ortho HCV-ELISA und ELISAs mit erfindungsgemäßen Peptiden bzw. Peptidmischungen. Die Angaben erfolgen bei den ersten 3 Zeitwerten in Extinktionen, die für die Festlegung der Grenzwerte dienen, woraus die nachfolgenden ratios aus spezifischem Signal und Grenzwert gebildet wurden.

Die in den Tab. 4A-C dargestellten Ergebnisse unter­ streichen die Vorteilhaftigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, insbesondere wenn man mit den entsprechenden Resultaten des Ortho-HCV-ELISAs und dem ALT-Verlauf ver­ gleicht.

So wird beispielsweise Tier Nr. 123 vom Ortho HCV ELISA gar nicht Antikörperpositiv gefunden, obwohl anhand von Leberbiopsien elektronenmikroskopisch eine NANBH nachge­ wiesen wurde. Demgegenüber wird mit dem ELISA basierend auf 4083 fast gleichzeitig mit dem ALT-Anstieg ein zu­ verlässiger HCV-Antikörper-Nachweis möglich.

Insbesondere die zeitliche Kongruenz der Peptid-ELISA- Ergebnisse mit den angestiegenen ALT-Werten wird bei Tier Nr. 048 deutlich, wo mit allen beschriebenen Peptiden bzw. Peptid-Mischungen ein Anti-HCV-Nachweis fast gleich­ zeitig mit dem ALT-Anstieg und durchschnittlich 18 Wochen vor dem Ortho HCV ELISA im Sinne einer scharfen Positiv- Negativ-Diskriminierung sehr zuverlässig erfolgt. Ins­ besondere die Vergleiche unter den Peptiden legen nahe, daß die Erkennung der frühen HCV-Antikörper durch das Gesamtpeptid der Formel I (4083) erheblich durch die mittleren Aminosäuresequenz mitbestimmt wird wie der Vergleich der Mischung aus 4060 und 4081 (Amino- und Carboxy-terminale Sequenzen) und dem die mittlere Struk­ tur umfassenden 4090 deutlich macht.

Zu ähnlichen Ergebnissen einer frühen, fast mit ALT zeit­ gleichen Erfassung von HCV-Antikörpern führten die Untersuchungen des Tieres Nr. 147, bei dem ein zuver­ lässiger HCV-Antikörper-Nachweis etwa zeitgleich mit dem ALT-Anstieg wiederum ca. 16-18 Wochen früher möglich ist als mit dem Ortho-Test.

Insgesamt stellen sich die erfindungsgemäßen Peptide bzw. deren Verwendung in immunchemischen Nachweisverfahren wesentlich sensitiver dar, als alle bisher beschriebenen Verfahren basierend auf gentechnologisch hergestellten Proteinen sowie anderen synthetischen Peptiden. Bei verbesserter Sensitivität in späteren Infektionsphasen bieten die neuen Peptide zusätzlich wesentliche Vorteile, indem die Bestimmung früher HCV-Antikörper zuverlässig möglich wird und damit die z. Z. bestehende diagnostische Lücke signifikant verkleinert wird. Darüber hinaus stellen sich die erfindungsgemäßen Peptide wesentlich unempfindlicher gegenüber unspezifischen Bindungen dar, was sich nicht zuletzt in einem gegenüber dem Ortho-Test drastisch verringerten background ausdrückt (max. 0,10 ­ E₄₅₀) gegenüber max. 0,4 E₄₉₂ bei Ortho), und dies sowohl bei Proben tierischer als auch menschlicher Herkunft, so daß eine wesentlich schärfere Negativ-Positiv-Diskrimi­ nierung möglich wird. Schließlich sind als vorteilhafte Aspekte die kürzere Gesamtdauer und präzisere Bestimmung durch das genauer zu pipettierende Probenvolumen von 50 ­ µl zu nennen.

Claims (12)

1. Peptide, die spezifisch mit Antikörpern gegen HCV reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Aminosäuresequenzen mindestens einer der folgenden Sequenzen entsprechen:

2. Peptide, die spezifisch mit Antikörpern gegen HCV reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Aminosäuresequenzen teilweise der Aminosäuresequenz des folgenden Peptids 4083 entsprechen:
121 175
SGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIEQGMMLAEQFKQKALGLLQTASRQA.
und daß sie mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen enthalten:
AS_a1-DREVLYR-BS_b1
AS_a2-QHLPYIE-BS_b2
AS_a3-KQKALGL-BS_b3
wobei AS und BS jeweils eine Aminosäure bedeuten und a1-a3 und b1-b3 jeweils ganze Zahlen sind, die mindestens 0 betragen.

3. DNA Sequenzen, die für mindestens eines der Peptide gemäß Anspruch 1 und 2 kodieren.

4. Antikörper, die zu mindestens einem der Peptide gemäß Anspruch 1 und 2 eine biospezifische Affinität haben.

5. Immunchemische Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von HCV Antikörpern unter Verwendung von Peptiden als Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß dies Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 und 2 sind.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kombination von Peptiden verwendet wird, die für frühe und späte Phasen der Infektion spezifisch sind, wobei entweder Mischungen mehrerer kürzerer Peptide oder ein Polypeptid, das in seiner Spezifität dieser Mischung entspricht, verwendet wird.

7. Vaccine, die mindestens ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 und 2 enthält.

8. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zum Zwecke einer Differentialdiagnose zwischen früher und später Infektionsphase jeweils ein oder
mehrere Peptide, die spezifisch auf frühe Antikörper reagieren und ein oder
mehrere Peptide, die spezifisch auf späte Antikörper reagieren, in getrennten Ansätzen mit der Probe zur Reaktion gebracht werden.

9. Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 4 zum Nachweis von HCV- Antigen.

10. Verwendung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper in einem heterogenen Immunoassay eingesetzt werden.

11. Peptide gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie peptidchemisch synthetisiert werden.

12. Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von HCV, dadurch gekennzeichnet, daß als spezifischer Schritt eine Hybridisierungsreaktion eingesetzt wird, in der mindestens eine Nukleinsäuresonde verwendet wird, die in ihrem spezifischen Teil komplementär zu mindestens einer der DNA- Sequenzen gemäß Anspruch 3 ist.