DE19500394C2

DE19500394C2 - Peptide zur Diagnose, zum Nachweis und zur Prävention von Hepatitis C Virus (HCV)-Infektionen

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Publication number: DE19500394C2
Application number: DE19500394A
Authority: DE
Inventors: Chang Yi Wang; Barbara H Hosein
Original assignee: United Biomedical Inc
Current assignee: United Biomedical Inc
Priority date: 1994-11-01
Filing date: 1995-01-09
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2015-01-10
Also published as: US5736321A; NL194971C; AU3966995A; JPH08208695A; WO1996013616A1; JPH11100397A; SG49183A1; NL9402224A; JP3199995B2; DE19500394A1; GB2294690B; GB9425604D0; GB2294690A

Description

Die Erfindung betrifft neue lineare und verzweigte Peptide, die sich spezifisch zur Diagnose, zum Nachweis und zur Prävention von Hepatitis C Virus (HCV)- Infektionen eignen. Insbesondere betrifft die Erfindung lineare und verzweigte synthetische Peptide, die mindestens eine antigene Determinante enthalten, die zum Nachweis von HCV-assoziierten Antikörpern im Patienten unter Verwendung von Immunoassay-Methoden wirksam ist. In einigen Fällen stellen diese Peptide auch Peptidbanken (Peptidbibliotheken) mit degenerierten Aminosäurepositionen dar.

Durch HCV hervorgerufene Non-A, Non-B-Hepatitis (NANBH) ist die häufigste Form der Post-Transfusionshepatitis. Deshalb besteht ein dringender Bedarf nach empfindlichen und spezifischen diagnostischen Nachweisverfahren, um unter potentiellen Blutspendern und anderen Personen Träger des Virus identifizieren zu können, die die Krankheit übertragen könnten. Es sind deshalb genaue Nachweisverfahren erforderlich, um infiziertes Blut und Blutprodukte aus Spenderblut mit hoher Sicherheit aussondern zu können.

Das ätiologische Agens HCV wurde von mehreren Gruppen kloniert und identifiziert; vgl. Houghton et al., EP 0 318 216, Okamoto et al. (1990) Jpn. J. Exp. Med. 60: 167; Houghton et al., EP 0 388 232, und Kato et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9524; Arima et al. (1989a) Gastroenterologia Japonica 24: 540; Reyes et al. (1990) Science 247: 1335; Arima et al. (1989b) Gastroenterologia Japonica 24: 545; Maeno et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 2685.

Das HCV-Genom hat eine Länge von etwa 10 Kilobasen (kb) und kodiert für ein einziges Polyprotein, das zu Strukturproteinen und Nicht-Strukturproteinen prozessiert wird. Ausgehend vom N-Terminus schließt das Polyprotein die Kapsid- und Hüllproteine des Strukturbereichs und die NS-1- bis NS-5-Proteine des Nicht-Strukturbereichs ein.

Einige der antigenen Bereiche von HCV sind identifiziert worden. Peptide und rekombinante Proteine aus diesen Bereichen zeigen einen unterschiedlichen Grad an Empfindlichkeit und Selektivität beim Nachweis und der Diagnose von HCV- Trägern. Es wurde über antigene Bereiche im Kernprotein (Kapsidprotein) berichtet; vgl. Wang, US-PS 5,106,726, Hosein et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3647, Okamoto et al., (1990) Jap. J. Exp. Med. 60: 223, Takahashi et al., (1992) J. Gen. Virol. 73: 667, Kotwal et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4486; im Hüllprotein und den NS-1-, NS-2- und NS-3- Proteinen; vgl. Wang et al., (1992) EP-A-0468527; im NS-4-Protein; vgl. Houghton (1989), Kuo et al., (1989) Science 244: 362, US-PS 5,106,726; und im NS-5-Protein; vgl. Maeno et al., (199O) Nucleic Acids Res. 18: 2685, Wang (1992).

Zusätzlich zu den von HCV abgeleiteten Antigenen kommen andere HCV- assoziierte Antigene vor, die anscheinend von Gensequenzen des Wirts kodiert werden. Eines dieser Antigene, unter der Bezeichnung GOR-Epitop bekannt, ist mit Seren von Patienten immunoreaktiv, die PCR-positiv für HCV sind; vgl. Mishiro et al., (1990) Lancet 336: 1400.

Zur Kartierung antigener Determinanten innerhalb bestimmter antigener Bereiche von HCV wurden serologische Analysen verwendet; vgl. Wang (1992) und US- PS 5,106,726. Bei diesen Kartierungsuntersuchungen wurden synthetische Peptide verwendet, um gut charakterisierte HCV-Serumproben zu untersuchen, und sie gestatteten die Identifizierung von besonders immunoreaktiven antigenen Bereichen von HCV.

Die Tatsache, daß synthetische Peptide zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV wirksam sind, hat zu zahlreichen Untersuchungen geführt, bei denen kurze synthetische Peptide zur Charakterisierung antigener Determinanten verwendet wurden. Beispielsweise wurde die Pepscan-Methode auf das gesamte HCV-1 Genom angewandt, um die Identifizierung immunoreaktiver Determinanten zu beginnen; vgl. Chien et al., WO 93/00365.

In bezug auf das Kernprotein wurde eine immunodominante antigene Determinante innerhalb der Aminosäurereste 21-45 beschrieben; vgl. Nagayama et al., (1994) J. Med. Virol. 42: 311-317, Siemoneit et al., (1994) Hybridoma 13: 9-13, Ferroni et al., (1993) J. Clin. Microbiol. 31: 1586-1591, Ishida et al., (1993) J. Clin. Microbiol. 31: 936-940. Anm.: Das hier verwendete Aminosäurenumerierungssystem entspricht dem für das HCV-1 Polyprotein verwendeten System.

Es wurde Bindung von menschlichen monospezifischen Antikörpern an ein Peptid gefunden, das den Aminosäureresten 33-50 des Kernproteins entsprach; vgl. Akatsuka et al., (1993) Hepatology 18: 503-510. Die Bindungsstelle eines menschlichen monoklonalen Antikörpers gegen das Kernprotein wurde von Cerino et al., (1993) J. Immunol. 151: 7005-7015, innerhalb der Aminosäurereste 34-45 lokalisiert. Monoklonale Antikörper der Maus, die an die Aminosäurereste 26-45 des Kernproteins binden, wurden von Gonzales-Peralta et al., (1994) J. Hepatol. 20: 143-147 beschrieben. Eine weitere antigene Determinante am N-Terminus des Kernproteins wurde unter Verwendung synthetischer Peptide innerhalb der Aminosäurereste 1-18 identifiziert; vgl. Sallberg et al., (1992a) J. Clin. Microbiol. 30: 1989-1994, Sallberg et al., (1992b) Immunol. Lett. 33: 27-33. Weitere antigene Peptide wurden zwischen diesen beiden Bereichen innerhalb der Aminosäurereste 11-28 [Sallberg, (1992a)] und der Aminosäurereste 7-21 [Ferroni et al., (1993)] gefunden.

Im NS-3-Protein wurde ein Konformationsepitop in den C-terminalen 100 Aminosäuren des c-33c Klons identifiziert; vgl. Kink et al., WO 93/09253. Ein menschlicher monoklonaler Antikörper, der für diese immunodominante antigene Determinante spezifisch ist, bindet auch an den C-Terminus des NS-3-Proteins; vgl. Mondelli et al. (1994) J. Virol. 68: 4829-4836; Habets et al., WO 94/14974.

Untersuchungen mit synthetischen Peptiden identifizierten zwei Epitope im NS-4-Protein innerhalb der Aminosäurereste 1661-1708 und 1710-1728; vgl. Simmonds et al., (1993) J. Clin. Microbiol. 31: 1493-1503. Bindung von monoklonalen Antikörpern der Maus wurde für die Aminosäurereste 1700-1705 gefunden; vgl. Gonzales-Peralta, supra. Bindung eines menschlichen monoklonalen Antikörpers, der gegen das NS-4-Protein gerichtet ist, wurde bezüglich der Aminosäurereste 1688-1705 berichtet; vgl. Cerino et al., (1991) J. Immunol. 147: 2692-2696.

Viele Proteine infektiöser Agenzien oder zumindest Determinanten auf diesen Proteinen zeigen Stamm-abhängige Variationen auf der Sequenzebene. Beispielsweise kann zu einem bestimmten Zeitpunkt oder in einer bestimmten geographischen Region ein bestimmtes Antigen eine oder mehrere Punktmutationen gegenüber einem beliebigen Prototyp-Stamm aufweisen. Unter dem Einfluß dynamischer Variationen kann bei einer solchen antigenen Determinante auf diese Weise ein extrem komplexes Antigenprofil entstehen, so daß ein empfindlicher oder spezifischer Nachweis zunehmend schwierig wird, je weiter sich die Determinante vom Prototyp entfernt (d. h. je weiter sie von ihm "wegdriftet"). Dementsprechend können komplexe Antigene ein vereinfachtes Mittel zum Nachweis mehrerer Stämme darstellen.

Für HCV haben sich bisher Kombinationen synthetischer Peptide aus mehreren Proteinen oder Bereichen von HCV als diagnostisch wirksam erwiesen; vgl. Ishida et al., 1993, Wang (1992). Diese Tests repräsentieren jedoch lediglich Sequenzen eines einzigen Stammes. Entsprechend wirft die bekannte HCV- Sequenzvariabilität (vgl. Bukh et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8234- 8238) Probleme im Hinblick auf einen empfindlichen Antikörpernachweis auf. Dies gilt sowohl bei Tests auf der Basis von Peptiden als auch bei solchen auf der Basis rekombinanter Proteine. Ein mit KCL-163 bezeichneter Test mit synthetischen Peptiden, die auf einem japanischen HCV-Stamm basieren, hat sich in einer japanischen Population als empfindlicher und spezifischer erwiesen als ein C100-3-Test auf der Basis des Stammes HCV-1; vgl. Kawano et al., (1991) Gastroenterol. Jpn. 26: 218-220. Polypeptide auf der Basis der HCV-1- Klone 5-1-1, C-33c und C-22 haben in einem RIBA-Test (Radioimmunoblot- Assay) Antikörper von Seren, die mit HCV Typ II infiziert waren, besser erkannt als Antikörper von Seren, die mit HCV Typ I infiziert waren; vgl. Alonso et al., (1994) J. Clin. Microbiol. 32: 211-212). Das Polypeptid von Klon C-100-3 hingegen war gegenüber Seren, die mit HCV Typ I infiziert waren, empfindlicher als gegenüber Seren, die mit HCV Typ I infiziert waren; vgl. Nagayama et al., (1993) J. Clin. Invest. 92: 1529-1533.

Darüber hinaus können typ-spezifische, vom NS-4-Protein abgeleitete synthetische Peptide zur Unterscheidung von HCV-Genotypen verwendet werden; vgl. Simmonds et al. (1993), supra. Eine einzige Aminosäure in einem Kernpeptid (Aminosäuren 101-108) einer HCV-Variante verminderte die Reaktivität mit 8 verschiedenen HCV-1 Seren; vgl. Sallberg et al. (1992a), supra.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Peptide bereitzustellen, die für den Nachweis von HCV-Antikörpern empfindlich und selektiv sind und die den Einfluß Stamm-abhängiger antigener Variationen durch Verwendung von Peptidbanken (Peptidbibliotheken) ausgleichen können.

Die Lösung dieser Aufgabe ergibt sich aus den Patentansprüchen 1 bis 1 3, die Peptidzusammensetzungen betreffen.

Die erfindungsgemäße Peptidzusammensetzung umfaßt mindestens ein lineares oder mindestens ein verzweigtes Peptid der allgemeinen Formel:

(Peptid)-Y
(Peptid)₂X
(Peptid)₄X₂X
(Peptid)₈X₄X₂X
(Peptid)₁₆X₈X₄X₂X,

in der Y eine Hydroxyl- oder Aminogruppe an der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure des Peptids ist und X der Rest einer Aminosäure oder eines Aminosäure-Analogons mit zwei Aminogruppen und einer Carboxylgruppe ist, wobei jede Gruppe in der Lage ist, eine Peptidbindung zu bilden. Erfindungsgemäß ist der Peptidrest (Peptid) spezifisch immunoreaktiv mit NANBH-assoziierten Antikörpern und umfaßt eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 5 bis 34 (vgl. die Tabellen 1, 3, 5 und 7) oder eines der Peptide der allgemeinen Formel I, II, III oder IV, die spezielle Substitutionen und degenerierte Positionen enthalten, wie sie nachstehend in der Beschreibung erläutert sind.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV oder zur Diagnose von HCV-Infektionen oder NANBH unter Verwendung einer wirksamen Menge einer Peptidzusammensetzung der Erfindung in einem Immunoassay, insbesondere einem ELISA oder einem passiven Hemagglutinations-Assay (PHA). Erfindungsgemäß werden ferner Immunoassays und Kits zum Nachweis und zur Diagnose von NANBH und HCV-Infektionen bereitgestellt.

Abb. 1 zeigt die Immunoreaktivität einer Verdünnungsreihe eines menschlichen monoklonalen Antikörpers (B12.F8), der spezifisch für das HCV Kernprotein ist, mit Peptidgemisch A (Beispiel 6) und einem bekannten HCV-Antikörper- Nachweiskit (Ortho HCV 3.0; Ortho Diagnostic Systems, Inc.).

Abb. 2 zeigt die Immunoreaktivität einer Verdünnungsreihe eines menschlichen monoklonalen Antikörpers (60H9[9]D10E6), der spezifisch für das HCV NS-4- Protein ist, mit Peptidgemisch A (Beispiel 6) und einem bekannten HCV- Antikörper-Nachweiskit (Ortho HCV 3.0).

Abb. 3 zeigt die Immunoreaktivität einer Verdünnungsreihe eines menschlichen monoklonalen Antikörpers (CM3.B6), der spezifisch für das HCV NS-3-Protein ist, mit Peptidgemisch A (Beispiel 6) und einem bekannten HCV-Antikörper- Nachweiskit (Ortho HCV 3.0).

Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe basiert auf intensiven serologischen Analysen, die zu einer Verfeinerung und einer weitergehenden Definierung immunoreaktiver Peptide führte, die sich zum Nachweis und zur Diagnose von HCV-Infektionen eignen.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß synthetische Peptide, die im Rahmen einer HCV-Prototypsequenz mehrfache Substitutionen durch natürliche (übliche) und nicht-natürliche (unübliche) Aminosäuren enthalten, äußerst wirksam zum Nachweis und zur Diagnose von HCV-Infektionen sind. Diese mehrfach substituierten Peptide können auch degenerierte Positionen mit Sequenzvariabilität enthalten, um hohe Selektivität und Empfindlichkeit für eine Vielzahl von HCV-Stämmen bereitzustellen. Die dementsprechend bevorzugten Peptide der Erfindung sind in den Tabellen 1, 3, 5 und 7 aufgeführt.

Jedes der Peptide in den Tabellen weist ein spezielles Muster von Substitutionen, Deletionen oder degenerierten Positionen in seinem Peptidrest relativ zu einer der vier Prototypsequenzen auf, die nachstehend angegeben sind:

Eine Position in einer Prototypsequenz, an der ein Aminosäurerest durch einen anderen Rest ersetzt ist, wird als "substituierte Position" bezeichnet. In ähnlicher Weise wird eine Position in einer Prototypsequenz, an der ein Aminosäurerest nicht vorliegt, als "deletierte Position" bezeichnet. Schließlich wird eine Position in einer Prototypsequenz, an der im Zuge der Peptidsynthese ein einziger Aminosäurerest durch ein Gemisch von zwei oder mehr Aminosäureresten ersetzt wurde (wie im Falle der nachstehend beschriebenen Peptidbanken bzw. Peptidbibliotheken) als "degenerierte Position" bezeichnet.

Die Peptide der Erfindung können linear oder verzweigt sein. Die Erfindung schließt Polymere, Konjugate und Gemische der Peptide ein. Einige Peptide sind Hybride von einem oder mehreren HCV-Antigenen aus verschiedenen HCV- Proteinen, z. B. dem NS-4-Protein und dem Kernprotein.

Weiterhin enthalten einige der Peptide degenerierte Positionen, d. h. diese Peptide stellen Banken bzw. Bibliotheken von Peptiden dar. Bei Peptidbanken sind degenerierte Aminosäurepositionen diejenigen Positionen bekannter Sequenzvariabilität, wie sie infolge Stamm-abhängiger Unterschiede bei verschiedenen HCV-Isolaten gefunden werden. An den degenerierten Positionen befindet sich somit irgendeiner von zwei oder mehreren möglichen Aminosäureresten. Die für eine gegebene Position möglichen Reste werden anhand bekannter Sequenzvariationen, die an dieser Position innerhalb der Sequenz des Peptids auftreten, ermittelt. Das Verhältnis der bei der Synthese für eine bestimmte Position verwendeten Aminosäuren kann entweder durch die Frequenz repräsentiert werden, mit der die gegebenen Reste in den bekannten Varianten auftreten, oder durch eine einfache äquimolare Verteilung der möglichen Aminosäuren an dieser Position. Für die vorliegende Erfindung muß nicht jede Sequenzposition, die einer Virusstamm-abhängigen Variation unterliegen kann, berücksichtigt werden.

Ein lineares Peptid der Erfindung kann von etwa 30 bis etwa 100 Aminosäurereste, vorzugsweise etwa 40 bis etwa 85 Aminosäurereste enthalten. Jedoch kann das lineare Peptid der Erfindung auch aus nur 8 oder 9 Aminosäureresten bestehen.

Die Peptide der Erfindung eignen sich zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV in Körperflüssigkeiten sowie zur Diagnose von HCV-Infektionen.

Die Peptide der Erfindung können auch einige weitere Aminosäuren, einschließlich nicht-natürlicher (unübliche) Aminosäuren, aufweisen, die an die endständigen Aminosäuren gebunden sind. Beispielsweise kann die Sequenz KKK (Lysin-Lysin-Lysin) an den Amino-Terminus jedes der Peptide der Erfindung. gebunden sein. Bei verzweigten Peptiden kann ein Rest M (Methionin) an den Carboxy-Terminus des Peptidrestes gebunden sein, d. h. zwischen den Peptidrest und die Verzweigung. Die Peptide der Erfindung können auch einen Cysteinrest am C-Terminus tragen, um die Thiol-Gruppe des Cysteins zur Bildung einer kovalenten Bindung an eine elektrophile Gruppe auszunutzen, z. B. an eine N^α-Chloracetyl-modifizierte Aminosäure oder eine Maleinimid derivatisierte α- oder ε-Aminogruppe eines Lysinrestes, der an den N-Terminus eines anderen Peptids gebunden ist.

HCV unterliegt bekanntlich häufigen Mutationen. Es sind mehrere Varianten von Stämmen/Isolaten bekannt, zum Beispiel PT, J, J1 und J4; vgl. Houghton (1989), Okamoto (1990), Houghton (1990) und Kato (1990), supra. Es ist zu erwarten, daß noch weitere Virusstammvarianten existieren; vgl. Bukh et al., (1993). Anpassungen der vorgeschriebenen Sequenzen an durch Stammvariationen entstehende konservative Substitutionen können durchgeführt werden, sofern das Muster der substituierten, deletierten oder degenerierten Positionen in einem gegebenen Peptid beibehalten wird. Auf diese Weise können die Peptide der Erfindung mittels Änderungen, die ihre Antigenität nicht beeinträchtigen, Stamm-abhängige Variationen ausgleichen, die innerhalb verschiedener HCV-Isolate bestehen.

Somit wird durch die erfindungsgemäß durchführbaren Änderungen die Immunoreaktivität der Peptide der Erfindung mit HCV-Antikörpern beibehalten, das Muster der substituierten, deletierten oder degenerierten Positionen jedoch nicht beeinträchtigt. Die Änderungen können in Substitutionen, Insertionen, Deletionen oder Degenerationen an etwa 2 bis etwa 5 Positionen oder alternativ bei bis zu etwa 10% der Positionen in einem Peptid der Tabellen 1, 3, 5 oder 7 bestehen. Darüber hinaus leiten sich die durchführbaren Änderungen von bekannten HCV-Stämmen ab.

Die Peptide der Erfindung werden synthetisiert und gegen eine Auswahl von HCV-Seren (HCV-Serumpanel) getestet, um, wie nachstehend beschrieben, die Immunoreaktivität der Peptide zu bestimmen.

Die Peptide der Erfindung können auch zur Bildung von Konjugaten verwendet werden, d. h. die Peptide können direkt oder indirekt in an sich bekannter Weise an Trägerproteine, wie Rinderserumalbumin (BSA), menschliches Serumalbumin (HSA) oder an Erythrocyten oder Latexpartikel gebunden werden.

Der Ausdruck "natürliche" oder "übliche" Aminosäuren bezeichnet die 20 Aminosäuren, die üblicherweise in Proteinen gefunden werden, nämlich Alanin, Asparaginsäure, Asparagin, Arginin, Cystein, Glycin, Glutamin, Glutaminsäure, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin, Tryptophan und Valin. Der Ausdruck natürliche Aminosäuren schließt sowohl die D- als auch die L-Formen ein.

Der Ausdruck "nicht-natürliche" oder "unübliche" Aminosäuren schließt sowohl die D- als auch die L-Form jeder anderen Aminosäure ein, unabhängig davon, ob sie innerhalb eines Proteins oder anderweitig in der Natur vorkommt, oder ob sie synthetisch hergestellt wird. Beispiele für nicht-natürliche Aminosäuren sind u. a. β-Alanin, Ornithin, Norleucin, Norvalin, Hydroxyprolin, Thyroxin, γ-Amino buttersäure, Homoserin und Citrullin.

Die linearen Peptide der Erfindung haben die allgemeine Formel

[Peptid]-Y,

in der Y eine Hydroxyl- oder Aminogruppe darstellt. Die linearen Peptide schließen Gemische, Konjugate und Polymere ein. Die Peptide umfassen mindestens eine antigene Determinante, die spezifisch immunoreaktiv mit Antikörpern gegen HCV ist.

Die verzweigten Peptide der Erfindung haben eine der folgenden allgemeinen Formeln:

(Peptid)₂X
(Peptid)₄X₂X
(Peptid) ₈X₄X₂X
(Peptid)₁₆X₈X₄X₂X,

in denen X der Rest einer Aminosäure oder eines Aminosäureanalogons mit zwei Aminogruppen und einer Carboxylgruppe ist, wobei jede Gruppe in der Lage ist, eine Peptidbindung zu bilden. Vorzugsweise ist X ein Lysinrest oder der Rest eines Lysin-Analogons, wie Ornithin. Das Aminosäureanalogon kann eine α- Aminosäure, eine β-Aminosäure oder jede andere natürliche oder nicht natürliche Aminosäure mit zwei Aminogruppen und einer Carboxylgruppe sein, die zur Bildung von Peptidbindungen verfügbar sind. Bevorzugte verzweigte Peptide der Erfindung sind Dimere, Tetramere und Octamere, insbesondere solche Peptide, die als Kernstruktur der Verzweigung ein Lysin aufweisen, d. h. bei denen der Rest X ein Lysinrest ist. Verzweigte Dimere und Octamere sind besonders bevorzugt.

Der Peptidrest der linearen oder verzweigten Peptide kann hinsichtlich seiner Länge von etwa 8 oder 9 bis etwa 100 Aminosäureresten variieren. Vorzugsweise enthalten die Peptidreste etwa 9 bis etwa 60 Aminosäurereste.

Die bevorzugten Peptide der Erfindung sind in den Tabellen 1, 3, 5 und 7 aufgeführt.

Die Erfindung betrifft auch Peptidzusammensetzungen mit einem oder mehreren der Peptide der allgemeinen Formel I, II, III oder IV. Peptide der allgemeinen Formel I sind solche, die im wesentlichen den Rahmen der 81 Aminosäuren- Prototypsequenz von SEQ ID NO: 4 beibehalten, die mit HCV-NS-3-Antikörpern immunoreaktiv sind und die folgende substituierte, deletierte oder degenerierte Positionen enthalten:

Position 3: Norvalin; Position 7: Norvalin oder Val : AIa : Thr : Phe : Tyr : Nva im Verhältnis 3 : 3 : 1 : 1 : 1 : 1; Position 8: Valin oder Norvalin; Position 16: Norvalin; Position 20: Arginin; Position 26: Norleucin; Position 33: Norleucin; Position 39: Serin; Position 46: Norvalin; Position 52: Alanin; Position 60: Serin; Position 63: Norleucin; Position 68: Serin; und Position 74: Norvalin.

Nva steht für Norvalin. Die hiergenannten Positionen in den allgemeinen Formeln I-IV beziehen sich auf die in SEQ ID NO: 1-4.

Peptide der allgemeinen Formel II sind solche Peptide, die im wesentlichen den Rahmen der 61 Aminosäuren-Prototypsequenz von SEQ ID NO: 3 beibehalten, die mit HCV-Kernprotein-Antikörpern immunoreaktiv sind und die folgende substituierte oder degenerierte Positionen enthalten:
Position 4: Pro:Gly im Verhältnis 9 : 1; Position 8: Ornithin; Position 10: Thr:Asn im Verhältnis 7 : 3; Position 16: Lysin; Position 21: Norvalin; Position 24: Hydroxyprolin; Position 30: Norvalin; Position 36: Valin oder Norleucin; Position 43: Norleucin; Position 45: Leucin; Position 48: Thr:Pro im Verhältnis 9 : 1; Position 52: Threonin oder Thr:Ala:Glu:Lys im Verhältnis 1:1:1:1; und Position 57: Hydroxyprolin.

Peptide der allgemeinen Formel III sind solche Peptide, die im wesentlichen den Rahmen der 47 Aminosäuren-Prototypsequenz SEQ ID NO: 2 gefolgt von der 9- Aminosäuren-Prototypsequenz der Reste 21 bis 29 von SEQ ID NO: 3 beibehalten, die mit HCV-NS-4- oder -Kernprotein-Antikörpern immunoreaktiv sind und die folgende substituierte oder degenerierte Positionen enthalten:
Position 1: Ser : Asn im Verhältnis 8 : 2; Position 2: Gly : Asp : Gln im Verhältnis 8 : 1 : 1; Position 3: Lys : Arg im Verhältnis 6 : 4; Position 4: Pro : Val : Ala im Verhältnis 8 : 1 : 1; Position 5: Threonin; Position 6: Ile : Val im Verhältnis 6 : 4; Position 7: Ile : Val : Ala im Verhältnis 6 : 2 : 2; Position 10: Arg : Lys im Verhältnis 8 : 2; Position 12: Norvalin; Position 15: Arg : Gln : Glu im Verhältnis 3 : 5 : 2; Position 16: Glu : Ala im Verhältnis 8 : 2; Position 19: Aspartat; Position 22: Aspartat; Position 24: Ser : Ala im Verhältnis 4 : 6; Position 25: Gln : Ser im Verhältnis 4 : 6; Position 26: His : Lys : Arg im Verhältnis 8 : 1 : 1; Position 27: Leu : Ala im Verhältnis 8 : 2; Position 28: Pro : Ala im Verhältnis 8 : 2; Position 29: Tyr : Leu im Verhältnis 8 : 2; Position 30: Norleucin oder Norvalin; Position 31: Aspartat; Position 32: Gln : Glu im Verhältnis 8 : 2; Position 34: Met : Gln im Verhältnis 8 : 2; Position 35: Met : Gln : Arg im Verhältnis 4 : 4 : 2; Position 36: Leu : Met : Ile im Verhältnis 8 : 1 : 1; Position 39: Asparagin; Position 40: Phe : Leu im Verhältnis 8 : 2; Position 42: Gln : Ser im Verhältnis 8 : 2; Position 44: Ala : Ile im Verhältnis 8 : 2; oder Position 45: Valin; und Position 55: Asparagin.

Die Peptide der allgemeinen Formel IV sind solche Peptide, die im wesentlichen den Rahmen der 44 Aminosäuren-Prototypsequenz von SEQ ID NO: 1 beibehalten, die mit HCV-NS-5-Antikörpern immunoreaktiv sind und die folgende substituierte oder degenerierte Positionen enthalten:
Position 2: Ornithin; Position 8: Pro : Leu : Val im Verhältnis 8 : 1 : 1; Position 10: Norvalin; Position 12: Thr : Ser : Pro im Verhältnis 5 : 4 : 1; Position 15: Lys : Asp : Arg im Verhältnis 4 : 4 : 2; Position 17: Glutamat; Position 19: Glu : Val : Gln im Verhältnis 5 : 4 : 1; Position 21: Pro : Ala im Verhältnis 9 : 1; Position 22: Val : Thr im Verhältnis 8 : 2; Position 23: Norvalin; Position 24: His : Leu : Ala im Verhältnis 8 : 1 : 1; Position 27: Pro : Ala im Verhältnis 8 : 2; Position 30: Pro : Ser im Verhältnis 9 : 1; Position 31: Hydroxyprolin; Position 32: Lys : Pro : Arg im Verhältnis 8 : 1 : 1; Position 33: Ser : Ala : Lys : Gln im Verhältnis 4 : 4 : 1 : 1; Position 34: Pro : Thr im Verhältnis 8 : 2; Position 36: Val : Ile : Thr im Verhältnis 5 : 4 : 1; Position 37: Hydroxyprolin; Position 41: Lys : Arg im Verhältnis 4 : 6; Position 42: Lys : Arg im Verhältnis 7 : 3; und Position 44: Thr : Ala im Verhältnis 9 : 1.

Die Peptide der allgemeinen Formeln I, II, III und IV können linear oder verzweigt sein und die Erfindung schließt Polymere, Konjugate und Gemische dieser Peptide entsprechend den hier beschriebenen Ausführungsformen ein.

Der Ausdruck "HCV-NS-3-Antikörper" schließt Antikörper ein, oder Seren oder Plasmaproben, die Antikörper enthalten, die mit Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) immunoreaktiv sind oder daran binden. Der Ausdruck "HCV-Kernprotein- Antikörper" schließt Antikörper ein, oder Seren oder Plasmaproben, die Antikörper enthalten, die mit Peptid VIIIE (SEQ ID NO: 3) immunoreaktiv sind oder daran binden. Der Ausdruck "HCV-NS-4-Antikörper" schließt Antikörper ein, oder Seren oder Plasmaproben, die Antikörper enthalten, die mit Peptid IIH (SEQ ID NO:2) immunoreaktiv sind oder daran binden. Der Ausdruck "HCV- NS-5-Antikörper" schließt Antikörper ein, oder Seren oder Plasmaproben, die Antikörper enthalten, die mit Peptid 1 (SEQ ID NO: 1) immunoreaktiv sind oder daran binden.

Die Peptidzusammensetzungen der Erfindung können aus einem oder mehreren der Peptide der Erfindung zusammengesetzt sein. Vorzugsweise enthalten diese Zusammensetzungen 1 bis 10 Peptide, insbesondere 1 bis 4 Peptide.

In einer bevorzugten Ausführungsform schließen die Peptidzusammensetzungen der Erfindung die Peptide 29, 33, 25, 19, 28 und 27, und vorzugsweise die Peptide 29, 33, 25 und 19 ein. Anm.: Die Peptide sind hier durch die Kennzahl der entsprechenden Sequenzen im Sequenzprotokoll bezeichnet.

Die Peptidzusammensetzungen der Erfindung schließen auch Gemische von Peptiden ein. Das zur Diagnose oder zum Nachweis von HCV wirksame Verhältnis von Peptiden in Peptidzusammensetzungen, die Gemische der Peptide der Erfindung enthalten, läßt sich ohne weiteres bestimmen. Im allgemeinen liegen diese Verhältnisse im Bereich von etwa 1 bis etwa 50, bezogen auf das Gewicht an Peptid.

Bevorzugte Peptidzusammensetzungen zur Diagnose und zum Nachweis von HCV-Infektionen sind Gemisch A, das die Peptide 29, 33, 25 und 19 enthält, Gemisch B, das die Peptide 27, 33, 25 und 19 enthält, und Gemisch C, das die Peptide 33, 25, 19 und 28 enthält. Eine bevorzugte Ausführungsform stellt Gemisch A mit einem Gewichtsverhältnis von 1 : 1 : 0,5 : 8 dar.

Zur Bestimmung der Wirksamkeit der Peptide der Erfindung zum Nachweis und zur Diagnose von HCV-Antikörpern werden die Peptide auf ihre Immunoreaktivität mit Proben getestet, die vorher durch Screening von Tausenden von Patienten- und Normalseren auf Immunoreaktivität mit HCV ausgewählt worden sind. Derartige HCV-spezifische Serumpanels sind im Handel erhältlich. Beispiele solcher Serumpanels und Verfahren zur Auswahl geeigneter Panels sind in den Beispielen angegeben.

Die Strategie zur serologischen Bestätigung der Wirksamkeit hängt von den erwarteten Eigenschaften der zu untersuchenden antigenen Determinanten ab. Beispielsweise kann das Screening bei universellen immunodominanten Bereichen, wie dem gp41-Transmembranpeptid von HIV-1, mittels einer einzigen repräsentativen Serumprobe aus einem Patienten, der mit dem Virus infiziert ist, erfolgen. Bei antigenen Determinanten, die nicht von den Seren aller infizierter Patienten erkannt werden oder gegen die Antikörper spät oder nur transient gebildet werden, müssen große Serumpanels zum Screening verwendet werden. Beide Screeningverfahren können verwendet werden, um die immunologische Analyse von HCV mittels der Peptide der Erfindung zu verbessern. Die letztgenannte Methode ist jedoch bei der Untersuchung auf überlegene Selektivität und Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Peptide besonders brauchbar.

Von den verwendeten Serumpanels hängt auch die Identifizierung antigener Determinanten ab. Je genauer das Panel eine Population repräsentiert, die höchstwahrscheinlich bezüglich einer Determinante seropositiv ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, daß die antigene Determinante identifiziert und sorgfältig kartiert werden kann. Zur Erweiterung des Reaktivitätsspektrums eines Assays, der bereits identifizierte antigene Determinanten oder Epitope umfaßt, sollte deshalb zum Screening eine große Zahl von Proben von Patienten verwendet werden, die möglicherweise infiziert sind, jedoch seronegativ bezüglich bekannter Antigene oder Epitope sind.

Das Verfahren der "serologischen Bestätigung" ist besonders schwierig, wenn die zu identifizierende antigene Determinante lediglich in einer Subpopulation einer infizierten Patientengruppe Antikörper aus löst. Sofern derartige antigene Bereiche Ziel des Nachweises werden, muß besonders auf synthetische Peptide geachtet werden, die sehr schwache Reaktivität zeigen.

In dieser Hinsicht gestattet die niedrige Hintergrundabsorption von synthetischen Peptiden, insbesondere Peptiden mit nicht-natürlichen Aminosäuren, den genauen Nachweis schwacher Reaktivität. In einigen Fällen sind Absorptionen von 50 mA gegenüber Hintergrundablesung ausreichend signifikant und können im Wege sukzessiver Verbesserung der Aminosäuresequenz eines Peptids zur Identifizierung wichtiger antigener Determinanten führen. Bei ausreichender Laborroutine lassen sich auch dann konsistente und zuverlässige Ergebnisse erhalten, wenn man im Bereich von Absorptionen unterhalb 200-300 mA arbeitet.

Die Peptide der Erfindung lassen sich in an sich bekannter Weise herstellen, zum Beispiel nach der Merrifield-Methode; vgl. J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154.

Eine weitere Schwierigkeit, die sich bei Verwendung der Peptide der Erfindung im Vergleich zu rekombinant exprimierten Proteinen (oder Peptiden) auf ein Mindestmaß beschränken läßt, ist die hohe Zahl falsch-positiver Ergebnisse, die durch die Gegenwart von antigenem Material hervorgerufen wird, das zusammen mit dem von HCV abgeleiteten rekombinanten Material aufgereinigt wird. Beispielsweise haben bestimmte normale Patienten Antikörper gegen Escherichia coli- oder Hefe-Proteine, die mit antigenem Material der Expressionsyssteme kreuzreagieren, wie sie für diagnostische Tests auf der Basis rekombinanter Proteine verwendet werden. Seren solcher normaler Patienten können eine falsch-positive Reaktion in derartigen Immunoassays zeigen. Solche falschen Reaktionen sind bei den Immunoassays der Erfindung ausgeschlossen.

Die Peptidzusammensetzungen der Erfindung werden synthetisch hergestellt, so daß sich die Produktqualität leicht steuern läßt. Entsprechend ist die Reproduzierbarkeit der Versuchsergebnisse sichergestellt. Weiterhin sind für jeden Test nur sehr geringe Mengen Peptid erforderlich, und die Kosten zur Herstellung der Peptide sind relativ niedrig. Infolgedessen sind die Kosten für das Screening von Körperflüssigkeiten auf Antikörper gegen HCV und zur Diagnose von HCV-Infektionen relativ niedrig. Als weiterer Vorteil ist bei Verwendung von Peptidbanken bzw. -bibliotheken das breitere Reaktivitätsspektrum bezüglich einer größeren Anzahl von HCV-Stämmen zu nennen. Degenerierte Positionen der Peptidbanken stellen ein "offenes" diagnostisches Werkzeug dar, das die Stamm-spezifischen Sequenzvariationen (und die daraus folgende Variation in der Antikörperspezifität), die sich aus der großen Anzahl an HCV-Stämmen ergibt, ausgleicht. Somit erhöhen Peptidbanken die Fähigkeit der antigenen Peptide zur Reaktion mit Antikörpern, die für einen breiteren Bereich von HCV-Varianten spezifisch sind.

Die Peptide und Peptidzusammensetzungen der Erfindung können zum Nachweis und zur Diagnose von HCV-Infektionen als Testreagenzien in einem Enzym gebundenen Immunoabsorptionsassay (enzyme-linked immunoadsorbent assay; ELISA), einem Enzym-Immunodotassay, einem passiven Hämagglutinations- Assay (z. B. ein PHA-Test), einem Antikörper-Peptid-Antikörper-Sandwich-Assay, einem Peptid-Antikörper-Peptid-Sandwich-Assay oder anderen bekannten Immunoassays verwendet werden. Bezüglich der Peptide der Erfindung kann jeder geeignete Immunoassay verwendet werden. Derartige Methoden sind bekannt und in zahlreichen Standardwerken beschrieben, z. B. von Harlow et al., (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Seiten 726ff. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Immunoassay ein ELISA unter Verwendung einer festen Phase, auf die die Peptidzusammensetzungen der Erfindung durch Coating aufgetragen wurden. ELISA-Methoden sind bekannt. Eine andere bevorzugte Ausführungsform des Immunoassays ist ein PHA-Test.

Die Immunoassays der Erfindung werden zum Screening von Körperflüssigkeiten und Geweben auf die Anwesenheit von HCV-reaktiven Antikörpern verwendet. Sie erleichtern dem Arzt die Diagnose von HCV-Infektionen. Beispiele für Körperflüssigkeiten, die untersucht werden können, schließen Blut und Blutfraktionen, wie Plasma und Serum, Speichel oder irgendeine andere Flüssigkeit ein, die Antikörper gegen HCV enthalten kann.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Kit zum Nachweis von HCV- Antikörpern oder zur Diagnose von HCV-Infektionen in Körperflüssigkeiten von Säugern, z. B. Serum, Gewebeextrakten, Gewebeflüssigkeiten, in vitro- Zellkulturüberständen und Zell-Lysaten. Das Kit kann aus mehreren Kompartimenten bestehen, wobei ein erster Behälter ein Peptid oder mehrere der Peptide, d. h. eine Peptidzusammensetzung, der Erfindung enthält.

Vorzugsweise ist das Kit der Erfindung ein ELISA- oder ein PHA-Kit zum Nachweis von HCV-Antikörpern oder zur Diagnose einer HCV-Infektion. Als ELISA-Testkit enthält das Kit:

(a) einen Behälter [z. B. eine Platte mit 96 Vertiefungen, wie eine Mikrotiterplatte (96-Well-Platte)] mit einer festen Phase, die durch Coating mit einer der Peptidzusammensetzungen der Erfindung beschichtet wurde;
(b) eine negative Kontrollprobe;
(c) eine positive Kontrollprobe;
(d) ein Probenverdünnungsmittel; und
(e) Antikörper gegen menschliche IgG-Antikörper, wobei diese Antikörper mit einem Reportermolekül markiert sind.

Wenn das Reportermolekül ein Enzym ist, dann kann das Kit auch ein Substrat für das Enzym enthalten.

Das Testkit wird beispielsweise wie folgt verwendet:
Eine zu untersuchende Probe, z. B. eine Körperflüssigkeit eines Säugers die gegebenenfalls mit Probenverdünnungsmittel verdünnt wurde, wird für einen Zeitraum und unter Bedingungen mit dem Peptid in dem Behälter in Kontakt gebracht, die ausreichen, damit möglicherweise vorhandene Antikörper binden können. Nach Abtrennung von nicht gebundenem Material, z. B. durch Waschen mit steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, wird der sekundäre Komplex mit markierten Antikörpern gegen menschliche IgG-Antikörper in Kontakt gebracht. Diese Antikörper binden an den sekundären Komplex unter Bildung eines tertiären Komplexes. Da die zweiten Antikörper mit einem Reportermolekül markiert sind, läßt sich bei Zugabe von Nachweismitteln der tertiäre Komplex nachweisen. Das Reportermolekül kann ein Enzym, ein Radioisotop, ein Fluorophor, ein biolumineszierendes Molekül, ein chemilumineszierendes Molekül, Biotin, Avidin, Streptavidin oder dergleichen sein. Für den ELISA ist das Reportermolekül vorzugsweise ein Enzym.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung und sind nicht als einschränkend zu verstehen.

Beispiel 1 ELISA-Testverfahren

Die Vertiefungen einer 96-Well-Platte werden gesondert für 1 Stunde bei 37°C mit 5 µg/ml Peptid unter Verwendung von 100 µl pro Well in 10 mM NaHCO₃ Puffer, pH 9,5, durch Coating beschichtet, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Peptid-beschichteten Wells werden mit 250 µl einer 3 Gew.-%igen Gelatinelösung in PBS für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, um unspezifische Proteinbindungsstellen zu blockieren. Anschließend wird dreimal mit PBS gewaschen, das 0,05 Vol.-% TWEEN 20 enthält, und getrocknet. Die Testproben, die HCV-Antikörper-positive Patientenseren enthalten, werden im Volumenverhältnis 1 : 20 mit PBS verdünnt, das 20 Vol.-% normales Ziegenserum, 1 Gew.-% Gelatine und 0,05 Vol.-% TWEEN 20 enthält. 100 µl der verdünnten Proben werden in jedes der Wells gegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert.

Sodann werden die Wells sechsmal mit 0,05 Vol.-%iger TWEEN 20-Lösung in PBS gewaschen, um nicht gebundene Antikörper abzutrennen. Meerrettich- Peroxidase-konjugierte Ziege-Anti-Human-IgG-Antikörper werden als sekundärer Antikörpertracer verwendet, der an den HCV-Antikörper-Peptid-Antigenkomplex in den positiven Wells bindet. 100 µl der Peroxidase-markierten Ziege-Anti- Human-IgG-Antikörper in einer Verdünnung von 1 : 1800 in 1 Vol.-% normalem Ziegenserum, 0,05 Vol.-%iger TWEEN 20-Lösung in PBS werden in jedes Well gegeben und weitere 15 Minuten bei 37°C inkubiert.

Sodann werden die Wells sechsmal mit 0,05 Vol.-%iger TWEEN 20-Lösung in PBS gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, und dann mit 100 µl des Substratgemisches behandelt, das 0,04 Gew.-% o-Phenylendiamin (OPD) und 0,12 Vol.-% Wasserstoffperoxid in einem Natriumcitratpuffer, pH 5,0, enthält. Dieses Substratgemisch wird zum Nachweis der Peroxidasemarkierung verwendet, wobei sich ein farbiges Produkt bildet. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 100 µl 1,0 M H₂SO₄ abgebrochen und die Absorption bei 492 nm (A_492nm) gemessen.

Beispiel 2 Immunoreaktivität von NS-3-reaktiven Peptiden

Die Vertiefungen von 96-Well-Platten wurden gesondert gemäß Beispiel 1 für 1 Stunde bei 37°C mit jedem der angegebenen 17 Peptide (Tabelle 2; die entsprechenden Aminosäuresequenzen sind in Tabelle 1 angegeben) durch Coating beschichtet. Die Peptide wurden mit einem ausgewählten Panel von Seren getestet, die mit einem immunodominanten Konformationsepitop des NS-3-Proteins reaktiv waren, nicht aber mit linearen Epitopen desselben Bereiches. Die Seren für das Panel wurden wie folgt ausgewählt: HCV- seropositive Plasmaproben aus einer bekannten Quelle (North American Biologicals, Inc.) wurden auf Reaktivität mit dem synthetischen Peptid 4 (SEQ ID NO:4) untersucht, das konformationelle und lineare Epitope enthält; vgl. Mondelli (1994), supra. Die mit Peptid 4 reaktiven Proben wurden weiterhin auf Reaktivität mit Pep18 [Wang (1992), supra] untersucht. Pep18 enthält lineare Epitope, zeigt jedoch nicht das konformationelle Epitop. Das ausgewählte Serumpanel bestand aus den Proben, die mit Peptid 4, aber nicht mit Pep18 reagiert hatten.

Die Summen der EIA Absorptionsablesungen bei 492 nm sind für jedes Peptid in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Seren für ein partiell oder vollständig konserviertes Konformationsepitop, das in Peptid 4 vorhanden ist, Reaktivität besitzen (36-103% bezogen auf Peptid 4).

Beispiel 3 Immunoreaktivität von Kernprotein-reaktiven Peptiden

Die Immunoreaktivität der Peptide 22 und 26 (Tabelle 3) wurde mit einer Gruppe bekannter HCV-Serenproben aus HCV-Panel 3 bestimmt, die Antikörper gegen das Kernprotein gemäß dem ELISA-Test nach Beispiel 1 zeigten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Die bei den Proben 3-3, 3-8 und 3-26 erhaltene Absorption war größer mit den Peptiden 22 und 26 als mit Peptid VIIIE (SEQ ID NO: 3). Die bei der Probe 3-39 erhaltene Absorption war stärker mit Peptid 26 als mit Peptid VIIIE, und die bei den Proben 3-1 und 3-41 erhaltene Absorption war stärker mit dem Octamer von Peptid 22 als mit Peptid VIIIE.

Beispiel 4 Immunoreaktivität von NS-4-reaktiven Peptiden und NS-4-Kernprotein-reaktiven Hybrid-Peptiden

Die Immunoreaktivität der Peptide 3KIIH, 27, 28, 29 und 30 (Tabelle 5) wurde mit einem Panel bekannter HCV-Seren aus dem HCV-Panel 3 bestimmt, die Antikörper gegen das NS-4-Protein im ELISA-Test nach Beispiel 1 zeigten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Sämtliche Peptide zeigten eine stärkere Reaktivität als das Prototyp-HCV-1-Peptid 3KIIH.

Beispiel 5 Immunoreaktivität von NS-5-reaktiven Peptiden

Die Immunoreaktivität von NS-5-reaktiven Peptiden (Tabelle 7) mit einem Panel bekannter HCV-Seren aus HCV-Panel 3 wurde im ELISA-Test gemäß Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse (Tabelle 8) zeigen, daß diese Peptide eine ähnliche Immunoreaktivität aufweisen. Sämtliche 3 Peptidbanken (31, 32 und 33), die Gemische von Aminosäuren an bestimmten Positionen enthalten, zeigten eine Immunoreaktivität, die vergleichbar oder größer war, als die von Peptid 34, das keine Peptidbank darstellt.

Beispiel 6 Nachweis von HCV-Antikörpern durch Peptidgemische

Das Peptidgemisch A mit den Peptiden 25, 29, 33 und 19, wobei das letztgenannte Peptid mit BSA konjugiert war, wurde in einem Gewichtsverhältnis von 2 : 2 : 0,5 : 8 (µg/ml) zur Beschichtung durch Coating verwendet. Dieses Gemisch wurde in einem ELISA-Test gemäß Beispiel 1 mit Peptidgemisch B verglichen, das die Peptide 25, 27-Octamer, 33 und 19 enthielt und in einem Gewichtsverhältnis von 2 : 2 : 0,5 : 8 (µg/ml) zur Beschichtung durch Coating verwendet wurde, wobei das letztgenannte Peptid 19 mit BSA konjugiert war.

Peptid 19 wurde unter Verwendung von m-Maleinimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimidester (MBS) nach den Angaben des Herstellers (Pierce Chemical Co.) bzw. nach Kitagawa et al. (1976) J. Biochem. 79 : 233-236 mit BSA konjugiert. Zur Untersuchung der Nachweisempfindlichkeit der Gemische A und B wurden die Gemische mit einem speziell ausgewählten Serumpanel getestet, das Seren enthielt, die spezifische Immunoreaktivität bezüglich der Kernprotein-, NS-3-, NS-4- oder NS-5-Bereiche von HCV zeigten. Dieses Panel wurde durch Screening von Seren gegen Peptid VIIIE (SEQ ID NO: 3) hergestellt, um Kernprotein-spezifische Seren zu identifizieren, gegen Peptid IIH (SEQ ID NO: 2), um NS-4-spezifische Seren zu identifizieren, gegen Pep11 (Wang (1992), supra), um NS-5-spezifische Seren zu identifizieren, und gegen Peptid 4 (SEQ ID NO: 4), um NS-3-spezifische Seren zu identifizieren. Die auf diese Weise identifizierten Seren wurden dann mit normalen menschlichen Seren verdünnt, damit sie eine schwache bis mäßige Reaktivität gegenüber diesen gleichen Peptiden zeigten (d. h. damit sie eine Absorption bei 492 nm im Bereich von 0,3 bis 2,0 aufwiesen). Die verdünnten Proben stellten dann das spezielle Panel zur Untersuchung der Nachweisempfindlichkeit dar (Tabelle 9), das zum Testen der Gemische A und B verwendet wurde.

Die beiden Gemische hatten vergleichbare Empfindlichkeit (Tabelle 9).

Beispiel 7

Gemisch A (Beispiel 6) wurde bezüglich seiner Nachweisempfindlichkeit mit einer Verdünnungsreihe menschlicher monoklonaler Antikörper getestet, die spezifisch waren für a) das Kernprotein von HCV, nämlich B12.F8 (Cerino, 1993, supra), b) das NS-4-Protein von HCV, nämlich 60H9[9]D10E6 (Cerino, 1991, supra) und c) das NS-3-Proteinkonformationsepitop, nämlich CM3.B6 (Mondelli, 1994, supra). Dieselbe Verdünnungsreihe wurde parallel dazu mit einem bekannten Anti-HCV-Testkit (Ortho HCV 3.0) getestet, das aus einem Gemisch rekombinanter Proteine aus der Region des Kernproteins und der NS-3-, NS-4- und NS-5-Proteine zusammengesetzt ist. Die analytische Empfindlichkeit beim Nachweis der gegen die drei obengenannten Bereiche gerichteten Antikörper gegen sämtliche drei Bereiche war bei Verwendung von Peptidgemisch A 2 bis 8mal höher als beim Gemisch der rekombinanten Proteine des bekannten Kits; vgl. Abb. 1 bis 3.

Beispiel 8

Insgesamt 1034 Proben, die in der PCR-Analyse (Wang et al., (1992) Gastroenterology 103 : 609) oder nach dem Chiron* RIBA* HCV 2.0 Strip Immunoblot Assay (*TM; Ortho Diagnostic Systems, Inc., Raritan, NJ, V.St.A.) HCV-positiv waren, wurden bezüglich des Peptidgemisches A im ELISA gemäß Beispiel 1 und 6 getestet. Diese Proben wurden von NANBH-Patienten mit chronischer oder akuter Hepatitis, Blutern, Patienten, die mehrmals Transfusionen erhalten hatten, HCV-infizierten Patienten, die Serokonversion zeigten, und Blutspendern, die als mit HCV infiziert identifiziert worden waren, erhalten. Sämtliche 1034 als positiv bestätigte Proben waren in diesem Test positiv mit dem Peptidgemisch A bei einem mittleren Signal/Hintergrund- Verhältnis (mean signal/cutoff ratio) von 10.

Eine Sammlung von 3154 Blutspenderproben (zufällig ausgewählt) wurde in gleicher Weise im ELISA mit dem Peptidgemisch A getestet. Die Spezifität des Tests in der Blutspenderpopulation war größer als 99,5%. Das mittlere Signal/Hintergrund-Verhältnis der Proben betrug 0,3. Somit lieferten die als positiv bestätigten Proben ein mittleres Signal/Hintergrund-Verhältnis, das 33 mal höher war als das mit den zufällig ausgewählten Blutspenderproben erhaltene Verhältnis.

Tabelle 2

Immunoreaktivität NS-3-reaktiver Peptide

Tabelle 3

Kernprotein-reaktive Peptide

Tabelle 4

Immunoreaktivität Kernprotein-reaktiver Peptide

Tabelle 5

NS-4-reaktive Peptide

Tabelle 6

Immunoreaktivität NS-4-reaktiver Peptide

Tabelle 7

NS-5-reaktive Peptide

Tabelle 8

Immunoreaktivität NS-5-reaktiver Peptide

Tabelle 9

Nachweisempfindlichkeit von Peptidgemischen

Für das nachstehende Sequenzprotokoll werden für nicht-natürliche (unübliche) Aminosäuren folgende Abkürzungen verwendet:

Norvalin: Nva
Norleucin: Nle
Ornithin: Orn
Hydroxyprolin: Hyp

Sequenzprotokoll

Claims

1. Peptidzusammensetzung, umfassend mindestens ein lineares oder verzweigtes Peptid der allgemeinen Formel: (Peptid)-Y
(Peptid)₂X
(Peptid)₄X₂X
(Peptid)₈X₄X₂X
(Peptid)₁₆X₈X₄X₂Xin der Y eine Hydroxyl- oder Aminogruppe an der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure des Peptids und X der Rest einer Aminosäure oder eines Aminosäure-Analogons mit zwei Aminogruppen und einer Carboxylgruppe ist, wobei jede Gruppe in der Lage ist, eine Peptidbindung zu bilden, und wobei die Peptidgruppe (Peptid) spezifisch immunoreaktiv mit Hepatitis C Virus (HCV)-Antikörpern ist, und die Peptidgruppe eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 5-34, wobei SEQ ID NO: 5-34 Bestandteile dieses Anspruchs sind.

2. Peptidzusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend ein Gemisch aus oder mehreren der Peptide.

3. Peptidzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei eines oder mehrere Peptide mit einem Träger konjugiert ist.

4. Peptidzusammensetzung, umfassend mindestens ein lineares oder verzweigtes Peptid der allgemeinen Formel: (Peptid)-Y
(Peptid)₂X
(Peptid)₄X₂X
(Peptid)₈X₄X₂X
(Peptid)₁₆X₈X₄X₂Xin der Y eine Hydroxyl- oder Aminogruppe an der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure des Peptids ist, X der Rest einer Aminosäure oder eines Aminosäure-Analogons mit zwei Aminogruppen und einer Carboxylgruppe ist, wobei jede Gruppe in der Lage ist, eine Peptidbindung zu bilden, und die Peptidgruppe (Peptid) spezifisch immunoreaktiv mit Hepatitis C Virus (HCV)-Antikörpern ist, wobei die Peptidgruppe ein Peptid umfaßt, das im wesentlichen den Rahmen der 81 Aminosäuren- Prototypsequenz von SEQ ID NO: 4 beibehält, das mit HCV-NS-3-Antikörpern immunoreaktiv ist und das folgende substituierte oder degenerierte Positionen enthält:
Position 3: Norvalin; Position 7: Norvalin oder Val : Ala : Thr : Phe : Tyr : Nva im Verhältnis 3 : 3 : 1 : 1 : 1 : 1; Position 8: Valin oder Norvalin; Position 16: Norvalin; Position 20: Arginin; Position 26: Norleucn; Position 33: Norleucin; Position 39: Serin; Position 46: Norvalin; Position 52: Alanin; Position 60: Serin; Position 63: Norleucin; Position 68: Serin; und Position 74: Norvalin, wobei die 81 Aminosäuren-Prototypsequenz von SEQ ID NO: 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

5. Peptidzusammensetzung, umfassend mindestens ein lineares oder ein verzweigtes Peptid der allgemeinen Formel: (Peptid)-Y
(Peptid)₂X
(Peptid)₄X₂X
(Peptid)₈X₄X₂X
(Peptid)₆X₈X₄X₂Xin der Y eine Hydroxyl- oder Aminogruppe an der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure des Peptids ist, X der Rest einer Aminosäure oder eines Aminosäure-Analogons mit zwei Aminogruppen und einer Carboxylgruppe ist, wobei jede Gruppe in der Lage ist, eine Peptidbindung zu bilden, und die Peptidgruppe (Peptid) spezifisch immunoreaktiv mit Hepatitis C Virus (HCV)-Antikörpern ist, wobei die Peptidgruppe ein Peptid umfaßt das im wesentlichen den Rahmen der 61 Aminosäuren- Prototypsequenz von SEQ ID NQ: 3 beibehält, das mit HCV-Kernprotein- Antikörpern immunoreaktiv ist und das folgende substituierte oder degenerierte Positionen enthält:
Position 4: Pro : Gly im Verhältnis 9 : 1; Position 8: Ornithin; Position 10: Thr : Asn im Verhältnis 7 : 3; Position 1 6: Lysin; Position 21: Norvalin; Position 24: Hydroxyprolin; Position 30: Norvalin; Position 36: Valin oder Norleucin; Position 43: Norleucin; Position 45: Leucin; Position 48: Thr:Pro m Verhältnis 9 : 1; Position 52: Threonin oder Thr : Ala : Glu : Lys im Verhältnis 1 : 1 : 1 : 1; und Position 57: Hydroxyprolin, wobei die 61 Aminosäuren- Prototypsequenz von SEQ ID NO: 3 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

6. Peptidzusammensetzung, umfassend mindestens ein lineares oder ein verzweigtes Peptid der allgemeinen Formel: (Peptid)-Y
(Peptid)₂X
(Peptid)₄X₂X
(Peptid)₈X₄X₂X
(Peptid)₁₆X₈X₄X₂Xin der Y eine Hydroxyl- oder Aminogruppe an der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure des Peptids ist, X der Rest einer Aminosäure oder eines Aminosäure-Analogons mit zwei Aminogruppen und einer Carboxylgruppe ist, wobei jede Gruppe in der Lage ist, eine Peptidbindung zu bilden, und die Peptidgruppe (Peptid) spezifisch immunoreaktiv mit Hepatitis C Virus (HCV)-Antikörpern ist, wobei die Peptidgruppe ein Peptid umfaßt, das im wesentlichen den Rahmen der 47 Aminosäuren- Prototypsequenz von SED ID NO: 2 gefolgt von der 9-Aminosäuren- Prototypsequenz der Reste 21 bis 29 von SED ID NO: 3 beibehält, das mit HCV-NS-4- oder -Kernprotein-Antikörpern immunoreaktiv ist und das folgende substituierte oder degenerierte Positionen enthält:
Position 1: Ser : Asn im Verhältnis 8 : 2; Position 2: Gly : Asp : Gln im Verhältnis 8 : 1 : 1; Position 3: Lys : Arg im Verhältnis 6 : 4; Position 4: Pro : Val : Ala im Verhältnis 8 : 1 : 1; Position 5: Threonin; Position 6: Ile : Val im Verhältnis 6 : 4; Position 7: Ile : Val : Ala im Verhältnis 6 : 2 : 2; Position 10: Arg : Lys im Verhältnis 8 : 2; Position 12: Norvalin; Position 15: Arg : Gln : Glu im Verhältnis 3 : 5 : 2; Position 16: Glu : Ala im Verhältnis 8 : 2; Position 19: Aspartat; Position 22: Aspartat; Position 24: Ser : Ala im Verhältnis 4 : 6; Position 25: Gln : Ser im Verhältnis 4 : 6; Position 26: His : Lys : Arg im Verhältnis 8 : 1 : 1; Position 27: Leu : Ala im Verhältnis 8 : 2; Position 28: Pro : Ala im Verhältnis 8 : 2; Position 29: Tyr : Leu im Verhältnis 8 : 2; Position 30: Norleucin oder Norvalin; Position 31: Aspartat; Position 32: Gln : Glu im Verhältnis 8:2; Position 34: Met : Gln im Verhältnis 8 : 2; Position 35: Met : Gln : Arg im Verhältnis 4 : 4 : 2; Position 36: Leu : Met : Ile im Verhältnis 8 : 1 : 1; Position 39: Asparagin; Position 40: Phe : Leu im Verhältnis 8 : 2; Position 42: Gln : Ser im Verhältnis 8 : 2; Position 44: Ala : Ile im Verhältnis 8 : 2; oder Position 45: Valin; und Position 55: Asparagin, wobei die 47 Aminosäuren-Prototypsequenz von SEQ ID NO: 2 und die 9 Aminosäuren-Prototypsequenz der Reste 21 bis 29 von SEQ ID NO: 3 Bestandteile dieses Anspruchs sind.

7. Peptidzusammensetzung, umfassend mindestens ein lineares oder ein verzweigtes Peptid der allgemeinen Formel: (Peptid)-Y
(Peptid)₂X
(Peptid)₄X₂X
(Peptid)₈X₄X₂X
(Peptid)₁₆X₈X₄X₂Xin der Y eine Hydroxyl- oder Aminogruppe an der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure des Peptids ist X der Rest einer Aminosäure oder eines Aminosäure-Analogons mit zwei Aminogruppen und einer Carboxylgruppe ist, wobei jede Gruppe in der Lage ist, eine Peptidbindung zu bilden, und die Peptidgruppe (Peptid) spezifisch immunoreakiv mit Hepatitis C Virus (HCV)-Antikörpern ist, wobei die Peptidgruppe ein Peptid umfaßt, das im wesentlichen den Rahmen der 44 Aminosäuren- Prototypsequenz SEQ ID NO: 1 beibehält, das immunoreaktiv mit HCV-NS-5- Antikörpern ist und das folgende substituierte oder degenerierte Positionen enthält:
Position 2: Ornithin; Position 8: Pro : Leu : Val im Verhältnis 8 :1:1; Position 10: Norvalin; Position 12: Thr : Ser : Pro im Verhältnis 5 : 4 : 1; Position 15: Lys : Asp : Arg im Verhältnis 4 : 4 : 2; Position 17: Glutamat: Position 19: Glu : Val : Gin im Verhältnis 5 : 4 : 1; Position 21: Pro : Ala im Verhältnis 9 : 1; Position 22: Val : Thr im Verhältnis 8 : 2; Position 23: Norvalin; Position 24: His : Leu : Ala im Verhältnis 8 :1 : 1, Position 27: Pro : Ala im Verhältnis 8 : 2; Position 30: Pro:Ser im Verhältnis 9 : 1; Position 31: Hydroxyprolin; Position 32: Lys:Pro:Arg im Verhältnis 8 :1 : 1; Position 33: Ser : Ala : Lys : Gln im Verhältnis 4 : 4 : 1 : 1; Position 34: Pro : Thr im Verhältnis 8 : 2; Position 36: Val : IIe : Thr im Verhältnis 5 : 4 : 1; Position 37: Hydroxyprolin; Position 41: Lys : Arg im Verhältnis 4 : 6; Position 42: Lys : Arg im Verhältnis 7: 3; und Position 44: Thr : Ala im Verhältnis 9 : 1;
wobei die 44 Aminosäuren-Prototypsequenz von SEQ ID NO:1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

8. Peptidzusammensetzung, umfassend Gemisch A, das die Peptide (SEQ ID NO) 29, 33, 25 und 19 enthält, Gemisch B, das die Peptide (SEQ ID NO) 27, 33, 25 und 19 enthält oder Gemisch C, das die Peptide (SEQ ID NO) 33, 25, 19 und 28 enthält, wobei SEQ ID NO: 19, 25, 27, 28, 29 und 33 Bestandteile dieses Anspruchs sind.

9. Verwendung der Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem Immunoassay zum Nachweis von HCV-Antikörpern oder zur Diagnose einer HCV-Infektion.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Immunoassay ein ELISA, ein Sandwich-Assay oder ein PHA-Assay ist.

11. Verwendung der Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem Kit zum Nachweis von HCV-Antikörpern oder zur Diagnose einer HCV-Infektion.

12. Verwendung nach Anspruchs 11, wobei der Kit ein ELISA-Testkit, ein Sandwich-Assaykit oder ein PHA-Assaykit ist.