DE4121431A1 - Synthetische core-peptide zur bestimmung von hcv-antikoerpern und hcv-antigenen, mittel dazu und ihre verwendung in diesen nachweis-verfahren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Polypeptide zur immunchemischen Bestimmung von HCV-spezifischen Antikörpern und HCV-Antigenen sowie für diese Verfahren geeignete Mittel und ihre Verwendung.

Die Polypeptide eignen sich u. a. zum hochsensitiven und spezifischen Nachweis von HCV-Antikörpern für die Dia­ gnose einer Non A/Non B-Hepatitis, zum Nachweis ausge­ heilter Stadien einer Non A/Non B-Hepatitis-Erkrankung sowie zur Herstellung von Antikörpern, mit deren Hilfe die Bestimmung von HCV-Antigen im zellfreien Patienten­ blut möglich ist.

Die Non A/Non B-Hepatitis (NANBH) wird als übertragbare Krankheit bzw. Gruppe von Krankheitsbildern als Virus- assoziiert angesehen und ist von anderen Virus-indu­ zierten Krankheitsbildern abgrenzbar, die durch dif­ ferente Hepatitis-Viren ausgelöst wird wie Hepatitis A Virus (HAV), Hepatitis B Virus (HBV), Hepatitis D Virus (HDV) und Hepatitis E (HEV). Schließlich lassen sich auch Hepatitiden diagnostizieren, die durch Cytomegalie Virus (CMV) oder Epstein Barr Virus (EBV) hervorgerufen werden.

Auf Basis epidemiologischer Erhebungen lassen sich entsprechend dem Übertragungsweg mindestens zwei Non A/Non B-Hepatitiden (NANBH) definieren: das epidemische Hepatitis Virus (enterically transmitted NANBV), welches durch Wasser und Nahrungsmittel übertragen wird, sowie das Posttransfusions-Hepatitis Virus (blood transmitted NANBV), das durch Blut, Nadelstiche oder ähnliche Wege übertragen wird. Neben diesen Infektionswegen sind auch Übertragungen bekannt, die als sporadically occuring type NANBV (community acquired NANBV) keine offensichtliche Zugehörigkeit zu den beiden genannten Typen aufweisen. Obwohl die genaue Zahl von Agentien bzw. Viren, die eine NANBH auslösen, nicht bekannt ist, wurde das sog. Hepa­ titis C Virus (HCV) als ein ursächlicher Erreger dieser Krankheit kürzlich identifiziert (WO 89/04 669).

Eine klinische Diagnose stützte sich bis vor kurzem hauptsächlich auf die serologische Bestimmung von Anti­ genen und/oder dagegen gerichtete Antikörper, wobei die Tests spezifisch sind für Parameter aus der Gruppe der zitierten Hepatitis-Erreger HAV, HBV, HDV, HEV, CMV oder EBV und bei diesen Ausschlußverfahren nur bei solchen Patienten eine NANBH diagnostiziert wurde, die in den genannten Bestimmungen negativ reagierten.

Daneben wurden in Ermangelung eines NANBV-spezifischen Parameters auch sogenannte Surrogat-Marker angewendet, wie z. B. GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase, auch als ALT bezeichnet - alanine aminotransferase) oder Anti HBc (Hepatitis B core-spezifische Antikörper). Diese Hilfs­ mittel sind jedoch weder sensitiv noch spezifisch genug, um als zuverlässig gelten zu können, so daß durch Testung von Blutspendern auf Surrogat-Marker auch nur ein kleiner Teil der Post-Transfusions-Hepatitiden, die bei ca. 10% der transfundierten Patienten auftritt, vermieden werden konnte. Die Dringlichkeit der Einführung eines spezi­ fischen Tests wird durch die Tatsache unterstrichen, daß für etwa 90% der Post-Transfusions-Hepatitiden das NANBV verantwortlich gemacht wird. Das Hauptproblem dieser Er­ krankung besteht in der Tatsache, daß zwischen 25 und 55% der Infizierten chronische Leberschäden erleiden.

Mit der Entdeckung des HCV wurde die Basis für einen spezifischen Nachweis von HCV bzw. HCV-spezifischen Antikörpern geschaffen. Die Isolierung und Charakteri­ sierung des HCV bzw. entsprechender cDNA-Replikate von Teilen des HCV-Genoms ist Gegenstand der WO 89/04 669, worin die Einordnung des HCV in die Familie der Flavi- ähnlichen Viren vorgenommen wird. Dort wird auch die Verwendung von HCV-Antigen für den Nachweis von HCV-spezi­ fischen Antikörpern beschrieben sowie die Erzeugung von Antikörpern für die diagnostische Bestimmung von Antigen im Patientenblut. Zur Anwendung kommen aller­ dings gentechnologisch hergestellte Proteine, insbe­ sondere sog. Nicht-Struktur-Proteine (NSP) aus der Open reading frame region (ORF), die als Reaktionspartner in immunchemischen Nachweisverfahren Verwendung finden.

Unter einem immunchemischen Nachweis werden im Sinne dieser Erfindung alle Verfahren zusammengefaßt, die als homogene (in Lösung) oder heterogene (mit fester Phase) in vitro Methoden die Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern der Immunglobulinklassen A, D, E, G oder M (IgA, IgD, IgE, IgG oder IgM) in Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Speichel, Liquor oder Urin erlauben. Beispiele für diese auch Immunoassay genannten Verfahren sind Enzymimmunoassay (ELISA oder EIA), Radioimmunoassay (RIA), Immunfluoreszenzassay (IFA), Radioimmunopräzi­ pitation (RIPA), Agar Gel-Diffusion usw.

In der WO 89/04 669 wurde beispielsweise zum Nachweis von HCV-spezifischen Antikörpern (Anti-HCV) das dort genannte Antigen C-100-3 in der ELISA-Ausführung verwendet.

Die mit dem ELISA-Verfahren bei der Bestimmung von Anti HCV in Proben humanen Ursprungs maximal erzielbare Sensitivität wird jedoch bei chronischen NANB-Patienten mit ca. 80% und bei akuten NANB-Patienten mit ca. 30% angenommen.

In der WO 90/11 089 sind weitere Aminosäuresequenzen des HCV beschrieben, die zum Nachweis von Anti HCV verwendet werden können. Jedoch werden keine Angaben zur diagno­ stischen Relevanz bestimmter Proteinabschnitte gemacht, noch finden sich Beispiele für immundominante Epitope.

Grundsätzliches Problem beim Nachweis von Anti HCV mit den aus der Literatur bekannten Verfahren sind die immer noch bestehenden falsch-positiv und falsch-negativ reagierenden Proben.

Der genaue Anteil derartiger falsch-positiver Proben ist in Ermangelung eines Bestätigungstests nicht genau quantifizierbar, zumal in verschiedenen Populationen unterschiedliche Reaktivitäten dieser Art gefunden wurden (COLOMBO H., et al. Lancet 1990, Vol. 335, S. 1345). Die falsch-positiven Proben können aber bis zu 40% in der Gruppe gesunder Blutspender betragen (WEINER A., et al. Lancet 1990, Vol. 336, S. 695).

Aufgrund des Fehlens eines spezifischen und sensitiven HCV-Tests wird z. Z. ein nicht unerheblicher Anteil falsch reaktiver Proben im Blutspendewesen fälschlicher­ weise verworfen und gleichzeitig tatsächlich Anti HCV-po­ sitive Patienten immer noch nicht zuverlässig erfaßt.

Als wissenschaftliche Verbesserung dieser Situation wurde über einen Lösungsansatz mit synthetisch hergestellten core-Peptid berichtet (OKAMOTO H., et al. Japan. J. Exp. Med. 1990, Vol 60, No. 4, S. 223-233).

Dabei wurde von den insgesamt 3 potentiellen Antikörper-Binde­ stellen der core-Aminosäuresequenz 1-120 (OKAMOTO, H. et al., Jan. J. Exp. Med. 1990, Vol. 60, No. 3, S. 167-177) mit Hilfe physiko-chemischer Voraussage-Kriterien nach HOPP and WOOD (Proc. Nat. Acad. Sci. 1981, Vol. 78, S. 3824-3828) eine Sequenz ausgewählt.

Dieses in Abb. 1 wiedergegebene Peptid umfaßt 36 Amino­ säuren der Numerierung No. 39 bis No. 74.

Die Aminosäuren werden als Ein-Buchstaben-Code nach folgendem Schlüssel wiedergegeben:

Ala = A, Arg = R, Asn = N, Asp = D, Cys = C, Gln = Q,
Glu = E, Gly = G, His = H, Ile = I, Leu = L, Lys = K,
Met = M, Phe = F, Pro = P, Ser = S, Thr = T, Trp = W,
Tyr = Y und Val = V.

Ein auf diesem core-Peptid basierender ELISA wurde von der Arbeitsgruppe ebenfalls entwickelt mit dem Ergebnis, daß in einigen Anti HCV-positiven Seren ein Nachweis gegenüber dem Anti C-100-Test möglich war. Dieser Befund wurde abgeleitet durch vergleichende Untersuchungen mit Hilfe der Polymerase Chain Reaction (PCR) zum Nachweis von HCV-RNA.

Jedoch machen gerade diese Untersuchungen bei den im Test von 606 Blutspendern Anti core HCV-positiv ermittelten 26 Proben (4,3%) deutlich, daß nur 10 (1,65%) Fälle mit PCR bestätigbar waren. Umgekehrt reagierten 16 Spender (2,65%) falsch positiv mit diesem Peptid. Das genannte core-Peptid erweist zwar in einigen Fällen als besser geeignet für ein Anti HCV-Nachweisverfahren als der Anti C-100-Test, jedoch sind erhebliche Störanfälligkeiten mit dieser Peptid-Struktur verbunden.

Überraschend wurde nun gefunden, daß der amino-terminale Bereich der HCV core-Region für den Nachweis HCV-spezi­ fischer Antikörper besonders geeignet ist und eine deut­ liche Empfindlichkeitssteigerung gegenüber Peptiden des Standes der Technik erzielt werden kann bei gleichzeitig signifikant erniedrigter Störanfälligkeit durch uner­ wünschte falsch positive Reaktionen.

Ferner wurde gefunden, daß mit den erfindungsgemäßen Peptiden eine hohe Antigenkonzentration und damit eine hohe Epitopdichte in einem immunchemischen Nachweisver­ fahren erreicht wird. Dies ist insbesondere dann möglich, wenn durch die Abwesenheit störender Kontaminationen die Untersuchung stark konzentrierter Patientenproben mög­ lich ist.

Es war auch völlig überraschend, daß die erfindungsge­ mäßen Peptide immundominante Epitope für frühe und späte HCV-Antikörper tragen und daher besonders vorteilhaft für Reihenuntersuchungen eingesetzt werden können.

Ein Gegenstand der Erfindung sind Peptide oder Proteine, die spezifisch mit Antikörpern gegen eine HCV Infektion reagieren, wobei ihre Aminosäuresequenzen Teilen der amino-terminalen HCV core-Region entsprechen. Bevorzugterweise werden diese Peptide peptidchemisch synthetisiert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Peptide wie oben beschrieben, wobei ihre Aminosäuresequenz gegenüber der natürlich vorkommenden Sequenz durch Ersatz, Hinzu­ fügen oder Weglassen von einer oder mehreren Aminosäuren dergestalt modifiziert ist, daß ihre Immunreaktivität im wesentlichen erhalten oder verbessert wird.

Gegenstand der Erfindung sind auch Peptide, die unterein­ ander verknüpft und/oder an einen Träger gebunden sind.

Ferner sind Gegenstand der Erfindung DNA Sequenzen, die für mindestens eines der oben beschriebenen Peptide co­ dieren.

Ein Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Antikörper, die zu mindestens einem der oben beschriebenen Peptide eine biospezifische Affinität haben.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ferner ein immunchemi­ sches Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von HCV Antikörpern unter Verwendung von Peptiden als Anti­ gen, wobei dies Peptide wie oben beschrieben sind.

Ein Gegenstand der Erfindung sind auch ein analytisches Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von HCV, wobei als spezifischer Schritt eine Hybridisierungsreak­ tion eingesetzt wird, in der mindestens eine Nukleinsäure­ sonde verwendet wird, die in ihrem spezifischen Teil komplementär zu mindestens einer der oben beschriebenen DNA Sequenzen ist.

Ein Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vaccine, die mindestens eines der oben beschriebenen Peptide enthält.

Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung der oben beschriebenen Peptide zur Erzeugung von Antikörpern in Säugetieren, insbesondere in Menschen.

Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zum Zwecke einer Differentialdiagnose zwischen früher und später Infektionsphase, wobei jeweils ein oder mehrere Peptide die spezifisch auf frühe Antikörper reagieren und ein oder mehrere Peptide, die spezifische auf späte Antikörper reagieren in getrennten Ansätzen mit der Probe zur Reaktion gebracht werden.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben be­ schriebenen Antikörper zu diagnostischen und therapeuti­ schen Zwecken.

Gegenstand der Erfindung sind neue synthetische Peptide, die vorzugsweise HCV Antikörper von rekonvaleszenten und/oder chronisch infizierten Patienten (späte Antikörper) oder hauptsächlich HCV-Antikörper während der akuten Infektionsphase (frühe Antikörper) erfassen, und es werden Polypeptide bzw. Mischungen von Peptiden beschrie­ ben, die sich als Basis von Screeningstests zum nichtdif­ ferenzierenden, aber hochsensitiven und wenig störanfäl­ ligen Nachweis von Anti HCV eignen.

Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren, die opti­ mierte Methoden beschreiben, wie das Lösen und Verwendung der Peptide, um die Substanz-spezifischen Merkmale voll zur Geltung zu bringen.

Durch diese Peptide wird die Erzeugung von spezifischen Antikörpern möglich, mit deren Hilfe durch die immunche­ mische Bestimmung entsprechender Antigene im zellfreien Patientenblut das Vorhandensein von HCV bereits vor dem Auftreten körpereigener Antikörper festgestellt werden kann.

Die Ausdrücke Peptide und Polypeptide werden im Sinne der Erfindung als gleichwertig für Peptide mit bis zu etwa 60 AS verwendet.

Es ist vorteilhaft, daß Polypeptide verwendet werden, die Sequenzen bzw. Strukturen enthalten, für die frühe und späte HCV-Antikörper spezifisch sind, da bei Verwendung eines Peptides mit beiden Typen von Bindungsstellen so­ wohl Proben aus frühen als auch Proben aus späteren In­ fektionsphasen erfaßt werden, daß auch Serokonversionen durch HCV-spezifische IgG- und/oder IgM-Antikörper verur­ sacht, sicher erfaßt werden, daß die Diskriminierung von positiven und negativen Proben mit außerordentlich hoher Trennschärfe möglich ist, daß keine Interferenz durch das für eine gentechnologische Proteindarstellung erforder­ liche Expressionssystem vorliegen kann oder andere bei Viruszucht unvermeidliche Wirtszell-Kontaminationen, und daß in Seren, Citrat-, Heparin-, und EDTA-Plasmen humanen Ursprungs eine sichere Bestimmung von HCV-spezifischen Antikörpern gewährleistet ist und eine Inaktivierung der Proben über 60 min. bei 55°C zu keinen Falsch-positiven Resultaten führt und daß schließlich durch diese Peptide die Erzeugung von spezifischen Antikörpern möglich wird, mit deren Hilfe durch die immunchemische Bestimmung entsprechender Antigene im zellfreien Patientenblut die diagnostische Lücke weiter geschlossen werden kann.

Gemäß dem Gegenstand der Erfindung wird eine Serie von neuen Peptiden beschrieben, die vorzugsweise HCV-core-spezi­ fische Antikörper von rekonvaleszenten oder chro­ nisch infizierten Patienten und/oder HCV-Antikörper während akuter Infektionsphasen erfassen und es werden Polypeptide bzw. Mischungen von Peptiden beschrieben, die sich als Basis von Screeningstests zum nichtdifferenzie­ renden, aber hochsensitiven und wenig störanfälligen Nachweis von Anti HCV core eignen.

Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen vorzugsweise jede Aminosäure-Sequenz zwischen AS 1 und AS 34 des als core beschriebenen Genomabschnittes von HCV mit folgender Primärsequenz:

MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVY (I)

Bevorzugte Peptide sind:

Besonders bevorzugt sind die Peptide SP 10 und SP 23.

Synthetisiert und gereinigt wurden die Aminosäuresequen­ zen nach dem Stand der Technik, wie z. B. beschrieben von BARANI, G. und MERRIFIELD, R.B. in "The Peptides, Analy­ sis, Synthesis and Biology", Vol. 2, Academic Press 1980, Ed. Erhard Gross, Johannes Meyenhofer, insbesondere als ein Polypeptid oder als Mischung mehrerer kleiner Peptide mit überlappender oder nicht überlappender Aminosäure-Sequenz.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Peptide können sowohl frühe Antikörper aus akuten Infektionsphasen als auch späte Antikörper erfaßt werden, was wesentlich die Sensitivität der auf diesen Peptiden beruhenden Nachweise gegenüber dem Stand der Technik verbessert. Ein weiterer Vorteil ist die hohe Spezifität der Peptide der vorlie­ genden Erfindung, was im allgemeinen zu einer minimalen Zahl von falsch-positiv-reagierenden Proben führt.

Häufig ist es erstrebenswert, natürlich vorkommende Sequenzen zu modifizieren, um das Polypeptid besser als immundiagnostisches Reagenz nutzen zu können. Derartige Veränderungen betreffen beispielsweise: Zufügen eines Cysteins am Amino- oder Carboxy-terminalen Ende, um das Koppeln des Peptides an ein Carrier-Protein zu erleich­ tern, wobei häufig heterobifunktionelle Cross-linker Verwendung finden.

Bestimmte dem Fachmann bekannte Aminosäuren werden auch Amino- oder Carboxy-terminal an das Polypeptid addiert, um das Verknüpfen von Peptiden untereinander zu ermög­ lichen oder zum Koppeln an einen Träger oder größeres Peptid, oder um die physikalischen und chemischen Eigen­ schaften des Polypeptids zu modifizieren.

Dem Fachmann ist auch bekannt, daß Peptide auch vielfäl­ tig derivatisiert werden wie z. B. durch Amino-terminale Angliederung, Thioglykolsäure-Amidierung, Carboxy-termi­ nale Amidierung, wie z. B. mit Ammonium oder Methylamin. Derartige Modifikationen verändern die Nettoladung des Polypeptids und können physikochemische Eigenschaften verbessern oder die kovalente Bindung des Peptids an einem festen Träger, Carrier-Proteine oder ein anderes Peptid erleichtern. Es ist nicht sehr wahrscheinlich, daß solche Modifikationen zu direkten Veränderungen der Immunreaktivität eines Peptides führen, allerdings kann als Folge verbesserter physikochemischer Substanz-Eigen­ schaften durchaus ein besseres Merkmal des Peptides als immundiagnostisches Mittel resultieren. So neigt z. B. Methionin zu spontaner Oxidation, was durch Austausch gegen Norleucin verhindert werden kann, ohne daß sich die antigenen Eigenschaften des Polypeptides nennenswert ändern.

Es ist dem Fachmann bekannt, daß gegebene Aminosäure-Se­ quenzen den verschiedensten Veränderungen unterworfen werden können, wie z. B. Deletionen, Insertionen oder Substitutionen, womit verschiedene Vorteile verbunden sein können. Solche Modifikationen betreffen z. B. Kombinationen wie Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; Phe, Tyr; Ala, Ser; Ala, Thr; Ala, Val; Ala, Pro; Ala, Glu; Leu, Gln; Gly, Phe; Ile, Ser und Ile, Met.

Ebenfalls kann es vorteilhaft sein, in Form des Zusatzes einer hydrophoben Sequenz, umfassend etwa 2 bis 20 hydro­ phobe Aminosäuren wie z. B. Phe Ala Phe Ala Phe, die Ad­ sorptionseigenschaften des Polypeptides zu verbessern.

Es wurde gefunden, daß für einen immunchemischen Anti HCV-Nachweis Mischungen einzelner Peptide bessere dia­ gnostische Eigenschaften haben können, als einzelne Peptide der genannten Strukturen. Beispielsweise können geeignete Mischungen aus den genannten Peptiden SP 10 bis SP 32, aber auch aus anderen Peptiden aus Teilen der allgemeinen Formel I verwendet werden. Besonders vorteilhaft ist es, wenn man Mischungen aus den erfindungsgemäßen Peptiden und Peptiden, wie in DE P 40 34 982.9 beschrieben, verwendet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Mischungen von Peptiden, enthaltend ein oder mehrere Peptide der Formel I und/oder der Formel II und ein oder mehrere Peptide aus DE P 40 34 982.9.

In einer weiteren Ausführungsform werden 2 bzw. mehrere der genannten Peptide, vorzugsweise 2 bis 10, inbesondere 2 bis 4 Peptide mit oder ohne Spacer verknüpft. Es können sogar polymere Formen zweier oder mehrerer Peptide nach den Fachmann bekannten Methoden hergestellt bzw. an einen Carrier wie z. B. Protein oder Latexpartikel bzw. an einen Träger gebunden werden. Ebenso können die Peptide durch eine Verlängerung mit 1 bis 40, vorzugsweise 1 bis 20, insbesondere 1 bis 10 Aminosäuresen modifiziert werden. Die zusätzlichen Bereiche und Strukturen können das physikochemische Verhalten des Gesamtpeptides günstig beeinflussen, wobei jedoch die Immunreaktivität der Aminosäuresequenzen der Formel I oder Teile davon erhal­ ten werden soll.

Derartige Modifikationen verändern im allgemeinen die passive Adsorption oder kovalente Bindeeigenschaft an die Festphase positiv, beeinflussen das Kopplungsverfahren vorteilhaft oder wirken stärker als Antigen bei der Erzeugung von gegen die Peptide gerichtete polyklonale oder monoklonale Antikörper.

Zum Gegenstand der Erfindung gehören daher auch die Peptide der Formel II,

AS_n-QRKTKRNTNRRPQDVK-BS_m (II)

wobei AS und BS eine beliebige Aminosäure bedeuten und n und m unabhängig voneinander jeweils ganze Zahlen von 1 bis 40 sind.

Immunoassay

Unter dem Begriff immunchemisches Nachweisverfahren sind zahlreiche, sehr verschiedene Methoden bekannt, die sich in speziellen Ausführungsformen, dem zur Detektion ver­ wendeten Marker oder Meßprinzip (z. B. photometrisch, radiometrisch, visuell bzw. per Aggregations-, Streu­ licht- oder Präzipitations-Verhalten) und Festphasen unterscheiden. Dem Fachmann ist es bekannt, daß eine Trennung von gebundenen und freien Proben-Antikörpern oder -Antigen zwar weit verbreitet aber nicht unbedingt erforderlich ist, wie z. B. bei sogenannten homogenen Assays. Bevorzugt sind heterogene Immunoassays, insbesondere ELISA Verfahren.

Ebenso ist dem Fachmann bekannt, daß der Begriff "Be­ stätigungstest" nur die Anwendung eines Immunoassays beschreibt ähnlich wie die als Dot-Verfahren bezeichneten Tests per Name nur beschreiben, wie das Fänger-Antigen technisch immobilisiert wird.

Bei dem HCV-Antikörper Nachweis setzt ein immunchemisches Nachweisverfahren während des Ablaufes den Kontakt der Probe mit Peptidsequenzen aus der Formel I bzw. II voraus, um in einem bestimmten Schritt des jeweiligen Verfahrens einen HCV-Antigen/HCV-Antikörperkomplex aus­ zubilden oder bei Kompetitions- und Inhibitionstests die Bildung desselben durch Zusatz von markiertem Anti HCV oder HCV-Peptiden zu verhindern.

In den direkten Verfahren können die Antikörper mit festphasengebundenen Peptiden oder mit markierten Pep­ tiden oder mit beiden in Kontakt gebracht werden, wobei es unerheblich ist, ob das zugrundeliegende Verfahren als 1-, 2- oder Mehr-Schritt-Methode auf dem Prinzip des 2. Antikörper-Tests oder dem immunometrischen Testaufbau (Doppel-Antigen-Sandwich) entweder mit gleichen oder unterschiedlichen Peptiden bzw. Peptidmischungen auf der Festphase und als Flüssigreagenz für die Detektion) oder über spezifische Capture-Antikörper (z. B. Anti IgM) oder Affinitätsreagenzien (z. B. Protein A) beruht.

Die Bindung der Peptide an die Festphase kann kovalent, adsorptiv oder mittels spezifischer Antikörper oder ähnlich affiner Methoden, z. B. über den Biotin/Avidin-Kom­ plex stattfinden.

Als Trägermaterial für die Festphase sind Kunststoffe wie Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyamid und andere synthe­ tische Polymere, natürliche Polymere wie Zellulose, sowie derivatisierte natürliche Polymere wie Zelluloseacetat und Nitrozellulose als auch Glas, insbesondere als Glas­ faser geeignet. Im allgemeinen ist Polystyrol bevorzugt.

Die Träger können die Form von Kugeln, Stäben, Röhrchen, und Mikrotiterplatten haben oder in Form von Suspensionen wie z. B. Latexpartikel vorliegen. Flächenförmige Gebilde wie Streifenpapiere, Plättchen und Membranen sind eben­ falls geeignet. Die Oberfläche der Träger kann sowohl für wäßrige Lösungen durchlässig als auch undurchlässig sein.

Bevorzugte Träger sind Kugeln, Röhrchen, Näpfchen, Mikro­ partikel, Streifenpapiere und Membranen. Besonders bevor­ zugte Träger sind Mikrotiterplatten, Latexpartikel, Polystyrol-Kugeln oder magnetisch anziehbare Teilchen.

Bei Verwendung der Peptide als markierte Derivate zur Detektion kommen alle dem Fachmann bekannten Kopplungs­ techniken in Frage. Auch mehrstufige Verfahren wie z. B. präformierte Peptid-Antikörper-Komplexe, in denen der Antikörper die Markierung trägt, oder hochaffine Systeme, wie z. B. Biotin/Avidin mit Markierung eines dieser Reaktionspartner, können angeordnet werden.

Als Marker können beispielweise radioaktive Isotope, fluoreszierende oder chemilumineszierende Farbstoffe verwendet werden. Auch Enzyme, die z. B. durch chromo­ gene, luminogene oder fluorogene Substratsysteme oder durch nachgeschaltete Verstärkersysteme mit einem 2. Enzym, das durch das erste aktiviert wird, nachgewiesen werden, können als Marker verwendet werden. Bevorzugte Enzyme sind beispielsweise alkalische Phosphatase oder Meerrettich Peroxidase.

Die Markierung erfolgt nach Verfahren, die für die genannten Marker als Stand der Technik beschrieben sind.

Im Falle der Markierung der Antikörper mit Peroxidase kann die Periodat Technik nach NAKANE, et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22, 1084-1090, angewendet werden oder ein Verfahren gemäß ISHIKAWA et al., 1983, J. Immunoassay 4, 209-327, in dem die Partner mit einem heterobifunktionellen Reagenz verknüpft werden.

Neben diesen Verfahren können die Peptide zur Sensibili­ sierung von geeigneten Oberflächen wie z. B. Latex oder Erythrozyten verwendet werden, um durch Peptid-spezifi­ sche Antikörper induzierte physikochemische Veränderungen wie z. B. Präzipitationen, Aggregation oder Lichtstreuung automatisch oder visuell zu messen. Es ist bekannt, daß die Peptide auch nicht derivatisiert zur Inhibition dieser Meßprinzipien wie auch der zuvor genannten Metho­ den eingesetzt werden können.

Für den Nachweis von HCV können immundiagnostische Verfahren verwendet werden, die sich polyklonaler oder monoklonaler Antikörper bedienen, welche mit Hilfe der erfindungsgemäßen Peptide oder Derivaten davon darge­ stellt werden. Die für das Nachweisverfahren in Frage kommenden Ausführungsformen sind dem Fachmann bekannt und dadurch gekennzeichnet, daß in einem bestimmten Schritt HCV-Antikörper/HCV-Antigen-Komplexe gebildet werden oder die Komplexbildung in Kompetitionsverfahren durch Zusatz eines markierten Antigens inhibiert wird.

Für die Etablierung eines solchen HCV-Antigen-Tests kommen als Festphasen, Marker oder Meßprinzip alle bei der HCV-Antikörper-Bestimmung erläuterten Möglichkeiten in Frage, wobei das Kompetitionsprinzip und die Doppel­ antikörper-sandwich Technik als immunchemische Methode besonders bevorzugt sind. Dabei ist es unerheblich, ob die Verfahren als 1- oder 2-Schritt-Verfahren ausgelegt sind. Es können sogar Mehrschrittverfahren mit unmar­ kierten Nachweisantikörper durchgeführt werden, die mit Hilfe eines weiteren dagegen gerichteten Antikörpers bestimmt werden, der entsprechend markiert ist. Für die Erzeugung der HCV-Antikörper ist es vorteilhaft, die Peptide derart zu modifizieren, daß deren antigene Eigenschaft verbessert wird, wie dies z. B. durch Kopp­ lung am Serumalbumin oder keyhole limpet hemocyanin möglich ist.

Ferner ist eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die Bestimmungen mehrerer Analyten gleichzeitig nichtdiffe­ renzierend in einem Testansatz durchzuführen. Um nur ein Beispiel aus immunchemischen Verfahren zu nennen, ist es in einem Enzymimmunoassay (ELISA) nach dem Testprinzip eines 2. Antikörpers, der markiert ist, vorteilhaft, den Anti HCV-Nachweis mit Antikörper-Bestimmungen zu kombinieren, die für andere Antigene spezifisch sind. Dazu wird eine Mischung der erfindungsgemäßen HCV-Peptide mit anderen Antigenen z. B. den Peptiden aus DE P 40 34 899.7 allein und/oder HIV-Antigenen hergestellt, auf geeigneten Festphasen immobilisiert und mit der Probe in Kontakt gebracht, um bei Vorhandensein von Antigen-spezi­ fischen Antikörpern entsprechende Antigen-Antikörper-Kom­ plexe auf der Festphase auszubilden. Nach Auswaschen ungebundener Reaktanten erfolgt der Nachweis mit markier­ ten Antikörpern, die z. B. für humanes Immunglobulin G spezifisch sind. Ein derartiges Verfahren ist außeror­ dentlich vorteilhaft, indem die Zahl von Einzelbestim­ mungen bei Reihenuntersuchungen erheblich reduziert wird, um den Faktor 2 bei 2 Antigen-Spezifitäten und sogar 3, wenn man 3 Antikörper-Nachweise kombiniert. Möglich wird ein derartiges Verfahren durch die Anwendung der neuen Peptide, deren hohe Reinheit und starke Antigenität die Verwendung kleinster Mengen von 0,1 bis 0,5 µg/ml in einem immunchemischen Verfahren gestattet, so daß in dem genannten Beispiel die Bindekapazität der Festphase bei weitem nicht gesättigt ist (übliche Beschichtungskonzen­ tration ca. 2-10 µg/ml), so daß andere Antigen-Spezi­ fitäten zusätzlich erfolgreich beschichtet werden können. Dies gilt sinngemäß für alle angesprochenen Ausführungs­ formen von immunchemischen Bestimmungen. Es ist bekannt, daß aus dem gleichen Zusammenhang auch die erfindungsge­ mäßen HCV-Peptide zusammen mit anderen HCV-Peptiden oder Antikörpern für den gleichzeitigen Nachweis von Anti HCV und einem oder mehrerer Antigene (z. B. Hepatitis-B surface Antigen, HBsAg) ebenso verwendet werden kann wie für andere Kombinationen, wie z. B. 2 Antigene und Anti HCV, 1 Antigen, Anti HCV und einen weiteren Antikörper usw.

Bevorzugt ist eine Kombination von HCV Antigenen des Strukturbereichs, insbesondere der core-Region mit HCV-Antigenen des Nicht-Strukturbereichs und/oder HIV Antigenen.

Schließlich kann die vorliegende Erfindung auch angewen­ det werden bei Verwendung eines immundiagnostischen Elements, das die Festphase und in trockener Form einen Teil oder auch alle erforderlichen Reagenzien enthält, wobei auch hier die neuen HCV-Peptide entweder festpha­ senseitig oder im Detektionsreagenz oder in beiden enthalten sind und eine Anti HCV-Bestimmung, ein HCV-Antigen-Nachweis oder Kombinationen mit anderen Analyten durchgeführt wird.

Die nachfolgend beschriebenen Beispiele stellen Aus­ führungsformen der Erfindung dar, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung von Peptid-Lösungen und Beschichtung von Mikrotitrationsplatten mit diesen Peptiden bzw. Peptid-Mischungen

Aus Stammlösungen der erfindungsgemäßen Peptide in 50% Essigsäure in destilliertem Wasser, enthaltend 1 bis 10 mg Peptid/ml wurden 2fache Verdünnungsreihen in 0,10 M Natriumbicarbonat pH 9,6 angelegt, also eine Reihe mit den Konzentrationen 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56, 0,78, 0,39, 0,2, 0,1, 0,05 und 0,01 µg Peptid/ml erhalten. Bei Mischungen von einzelnen Peptiden wurde analog vorge­ gangen, wobei die Stammlösungen zusätzlich in verschiede­ nen Verhältnissen gemischt wurden, z. B. 10 : 1 oder 1 : 4, um durch Verdünnung in 0,1 M Natriumbicarbonat die oben angegebenen Gesamt-Endkonzentrationen zu erhalten, die aber bei Mischungen mehrerer Peptide diese gleichkon­ zentriert (bei 1 : 1-Mischung) oder in verschiedenen Verhältnissen zueinander enthalten.

100 µl einer jeden Verdünnung wurde in jeweils 16 Ver­ tiefungen von Mikrotiterplatten, Typ B der Firma Nunc, Roskilde, Dänemark gegeben. Die mit den Verdünnungen gefüllten Testplatten wurden 18 Stunden bei 20°C be­ lassen, dann wurden die Lösungen in den Vertiefungen ab­ gesaugt und die Vertiefungen drei 3- bis 4mal mit 300 µl einer Lösung von 10 g/l Rinderserumalbumin in phosphatge­ pufferter physiologischer Kochsalzlösung, (PBS, pH 7,4) durch Füllen und Absaugen gewaschen und die Testplatten anschließend über Kieselgel bei 20°C getrocknet.

Beispiel 2 Herstellung eines Peroxidase-markierten Antikörpers gegen Humanes Immunglobulin der IgG-Rlasse (h-IgG) sowie TMB-Substrat für die Detektion

Antikörper gegen h-IgG wurden gemäß der Methode von KOEHLER und MILSTEIN zur Darstellung monoklonaler Antikör­ per erzeugt (Nature 256, 495, 1975), wobei verschiedene monoklonale Antikörper mit der gleichen Antigen-Spezifi­ tät mit der von STÄHLI et al. (J. of Immunological Methods 32, 297-304, 1980) beschriebenen Methode iden­ tifiziert wurden.

Nach gelchromatographischer Reinigung und Dialyse gegen Phosphat-gepufferter Saline (PBS, pH 7,4) wurde der die monoklonalen Antikörper-Fraktion enthaltende Pool (4 mg Protein/ml) anschließend mit N-gamma-Maleimidobutylyl­ oxisuccinimid (GMBS), bezogen von der Fa. Behring Dia­ gnostics, umgesetzt wie von TANAMORI et al. (J. Immunol. Meth. 62, 123-131, 1983) beschrieben. 2-Iminothiolanhydrochlorid (Fa. Sigma, Kat. Nr. I 6256) wurde mit Meerrettich-Peroxidase (POD), bezogen von der Fa. Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 413 470, umgesetzt wie von KING et al. (Biochem. 17, 1499-1506, 1978) be­ schrieben. Aus dem GMBS-IgG Konjugat und dem Iminothio­ lan-POD Konjugat wurde ein IgG-POD Konjugat hergestellt wie von TANAMORI beschrieben.

Die erhaltene Lösung des IgG-POD-Konjugats hatte einen Proteingehalt von 360 µg/ml. Das Verhältnis von POD zu IgG wurde mit 2.8 bestimmt. Die Lösung wurde anschließend auf 500 ng/ml IgG-POD mit einer Lösung von 50 ml/l foeta­ lem Kälberserum (FKS), 5 g/l Polyoxiethylen-(20)-sorbitan Monalaureat (®Tween 20) in PBS verdünnt und erhielt die Bezeichnung Anti IgG/POD-Konjugat. Für die Verwendung im ELISA wurde die nachfolgende Verdünnung in Tris-Puffer pH 7,4, enthaltend 0,5% ®Tween 20 variiert (zwischen 1 : 100- und 1 : 20 000-Verdünnung), um einheitlich eine 1 : 26-Endverdünnung in Konjugat-Puffer herzustellen, enthal­ tend 0,1 M 2-Amino-2(hydroxymethyl) 1,3-propandiol (Tris), 0,1 M Kochsalz (NaCl) sowie 0,1% ®Tween pH 8.4. Gemäß dem Stand der Technik dargestellte polyklonale Antikörper vom Kaninchen wurden so eingestellt, daß eben­ falls eine Gebrauchsverdünnung von 1+25 erzielt wurde.

Zum Nachweis von Anti-HIV-POD wurde ein Substratsystem oder eine Substratzubereitung verwandt, enthaltend Wasserstoffperoxid und Tetramethylbenzidin (TMB), welche aus zwei Stammlösungen hergestellt wurde.

Stammlösung 1: TMB-Dihydrochlorid wurde unter Rühren in einer Konzentration von 5 g/l, d. h. von 16 mmol/l in bidestilliertem Wasser gelöst und mit 5normaler Salz­ säure auf pH 1,5 eingestellt. Zu dieser Lösung wurde Penicillin G unter Rühren in einer Endkonzentration von 200 mg/l, d. h. von 0,56 mmol/l zugesetzt.

Stammlösung 2: zu 900 ml bidestilliertem Wasser wurde 1,4 ml Eisessig, 1,5 ml 1normale NaOH und 250 mg, d. h. 3 mmol H₂O₂ als Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Addukt zuge­ setzt. Nach vollständigem Lösen wurde mit bidestilliertem Wasser auf 1 l aufgefüllt.

TMB-Substratzubereitung: Ein Volumenteil der Stammlösung 1 und 10 Volumenteile der Stammlösung 2 wurden miteinan­ der vermischt.

Beispiel 3 Bestimmung von humanen Antikörpern der Immunglobulin G-Klasse gegen HCV im ELISA mit den erfindungsgemäßen Peptiden

50 µl Serum oder Plasma wurden zu 50 µl Probenpuffer, enthaltend 0,3 M Tris, 0,3 M NaCl, 20% Boviserin und 0,1% ®Tween 20 in Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben, die wie beschrieben mit Peptiden beschichtet wurden. Nach Inkubation über 30 Min. bei 37°C wurde der Inhalt der Vertiefungen durch Absaugen entfernt und die Vertiefungen fünfmal mit Waschpuffer enthaltend 1 g/l ®Tween 20 in PBS gewaschen. Dann erfolgte die Zugabe von 100 µl endverdünntem Konjugat in die Vertiefungen, wobei bevorzugt mit einer Vorverdünnung von 1 : 3000 in Tris-, 0,5% ®Tween 20 und einer Endverdünnung von 1 : 26 in Konjugatpuffer gearbeitet wurde. Nach einer Inkubation über 30 Min. bei 37°C wurde der Inhalt der Vertiefungen durch Absaugen entfernt und wiederum fünfmal gewaschen. Anschließend wurden in jedes Well 100 µl TMB-Substratzu­ bereitung gegeben, 30 Min. bei 20-22°C inkubiert und die Inkubation durch Zugabe von 100 µl 1normaler Schwe­ felsäure beendet. Die Extinktion der gefärbten Lösung wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm (E₄₅₀) gegen einen Leerwert von PBS gemessen.

Als Anti-HCV-positiv wurden solche Proben eingestuft, die eine E₄₅₀ von größer als 0,10 erzeugten, als Anti HCV-grenzwertig die Proben, deren E₄₅₀ im Bereich von 0,05 bis 0,10 lag und als Anti HCV negativ solche Proben, die eine E₄₅₀ kleiner als 0,05 erzeugten.

Die Ergebnisse der Tab. 1 stellen die vergleichenden Untersuchungen von Anti HCV-positiven Humanseren dar.

Als Vergleich finden sich in diesen Tabellen auch ent­ sprechende Angaben, die durch Testung mit dem Ortho-ELISA erhalten wurden.

Von den geprüften 143 Humanproben, die mit dem Ortho-Test als Anti HCV-positiv klassifiziert waren, wurden alle 143 Proben mit einem ELISA basierend auf einem erfindungsge­ mäßen Peptid (SP 10) ebenfalls positiv gefunden. Dabei fällt neben der sehr guten Übereinstimmung zu den Ergeb­ nissen des Ortho-HCV-ELISAs eine sehr starke Signalstärke des Peptid-ELISAs auf. Gleichzeitig machen die Ergebnisse der Reihenuntersuchung von gesunden Blutspendern deut­ lich, daß die Störanfälligkeit des Tests äußerst gering ist. So wurde bei der Testung von 500 Spendern von Serum und Plasma keine unspezifische Bindung an das erfindungs­ gemäße Peptid beobachtet, d. h. es wurden keine falsch­ positiv-Resultate erhalten.

Tabelle 1

Ergebnisse der Bestimmung von Anti HCV mit einem ELISA, enthaltend das neue Peptid SP 10 auf der Festphase, im Vergleich zu Ortho HCV-ELISA mit humanen Proben

Beispiel 4 Optimierung der ELISA-Bestimmung

Als veränderliche Parameter der ELISA-Bestimmung wurden hauptsächlich die bei der Beschichtung verwendeten Peptid-Konzentration oder bei Mischungen von Peptiden deren Gesamtkonzentration sowie Verhältnis zueinander variiert bei einer konstanten Konjugat-Konzentration von 1 : 3000 und 1 : 26-Verdünnung. Zusätzlich wurde bei festgelegten Beschichtungs-Konzentrationen die Konjugat-Vor­ verdünnung variiert. Beide veränderlichen Größen wurden hinsichtlich Spezifität durch Testung von Blut­ spender-Seren und -Plasmen validiert sowie in Bezug auf Sensitivität durch Bestimmung von Anti HCV in positiven Kollektiven. Darüber hinaus wurde die Grenzempfindlich­ keit in Form der analytischen Sensitivität durch serielle Verdünnung von Anti HCV-positiven Proben (1 : 2, 1 : 4 usw. in Anti HCV-negativen Seren) ermittelt und mit den Daten des Ortho-Tests ebenso verglichen, wie mit den Resultaten, die unter Verwendung des Literatur-beschrie­ benen Peptids erzielt wurden.

Die in Tab. 2 zusammengefaßten Vergleiche machen deut­ lich, daß das erfindungsgemäße Peptid gegenüber dem Stand der Technik Vorteile bietet, die in verbesserten Grenz­ empfindlichkeiten, d. h. gesteigerter analytischer Sensitivität besteht. So wurden die 4 Titrationen der Tab. 2 gegenüber dem publizierten Peptid um den Faktor 2 bis 4 empfindlicher bestimmt und verglichen mit Ortho sogar um den Faktor 8 bis 32.

Tabelle 2 Vergleich der analytischen Sensitivität eines Peptid-ELISAs (Sp 10, 2 µg/ml) zum Stand der Technik. Dazu wurden Verdünnungsreihen von Anti HCV positiven humane

eren in negativem Humanserum hergestellt und die Ergebnisse der Testung mit einem ELISA basie­ rend auf einem erfindungsgemäßen Peptid (SP10) verglichen mit Ortho's HCV-ELISA sowie einem Peptid, das gemäß der Abb. 2 in der Literatur als immunrelevant beschrieben wird (OKAMOTO et al.). Alle Angaben stellen Extinktionswerte dar (E_{450 nm}), wobei die als reaktiv anzusehenden Ergebnisse unterstrichen sind.

Zu ähnlichen Ergebnissen führte die Auswertung eines weiteren erfindungsgemäßen Peptids (SP 23). Die in Tab. 3 vergleichend dargestellten Ergebnisse lassen erkennen, daß das SP 23 dem SP 10 hinsichtlich der Empfindlichkeit entspricht, wobei sich beide Peptide vorteilhaft von dem Literatur-beschriebenen Peptid abheben.

Obwohl das Literatur-analoge Peptid SP 12 (AS 47-75) nicht exakt dem von OKAMOTO et al. beschriebenen Peptid entspricht (AS 39-74), wird durch die Ergebnisse der Zwischensequenz (SP 11, As 24-53, Tab. 3) deutlich, daß in dem folgenden Sequenzbereich (AS 39-47) keine immunrelevanten Epitope vorhanden sind und die sehr schwache, noch nachzuweisende Reaktivität des SP 11 durch den darin enthaltenen Carboxy-terminalen Bereich des SP 10 zurückzuführen ist (überlappender Bereich AS 24-30 gemäß Abb. 1).

Tabelle 3

Vergleich der Immunreaktivitäten im ELISA zwischen 2 erfindungsgemäßen Peptiden und einer Aminosäuresequenz, die zwischen der publizierten Sequenz (AS 39-74), OKAMOTO et al.) und den neuen Strukturen liegt (SP 11, AS 24-53, siehe auch Fig. 1). Alle Angaben stellen Extinktionswerte dar (E_{450 nm})

Besonders deutlich wird dieser überraschende Empfindlich­ keitsvorteil bei der Testung von unverdünnten Proben. So werden von den in Tab. 4 wiedergegebenen 11 Anti HCV-positiven Proben mit dem erfindungsgemäßen Peptid alle 11 als reaktiv ermittelt, während das Literaturbeschriebene Peptid nur 6 Proben positiv findet und Ortho′s HCV-ELISA in keinem Fall positiv reagiert. In Bezug auf die mit den beiden Peptiden übereinstimmend positiv reagierenden Proben fällt auf, daß das erfindungsgemäße Peptid unter gleichen Testbedingungen signifikant stärker reagiert, was insbesondere für die Positiv/Negativ-Diskriminierung erhebliche Vorteile bietet.

Tabelle 4 Vergleich der Sensitivität eines Peptid-ELISAs (SP10 2 µg/ml) zum Stand der Technik. Dazu wurden 11 ausgewählte native humane Anti HCV-positive Proben mit einem ELISA basierend auf einem erfindungsgemäßen Peptid vergleichend getestet mit Ortho's HCV-ELISA sowie einem Peptid, das gemäß der Abb. 2 in d

Literatur als immunrelevant beschrieben wird (OKAMOTO et al.). Alle Angaben stellen Extinktionswerte dar (E_{450 nm}). Die Anti-HCV positive Probe HC 90-495 wurde als Kontrolle mitgetestet

Diese an Hand der Titrationen (Tab. 2) und vorselektierten nativen Humanseren abgeleiteten Befunde (Tab. 4) werden bestätigt durch die Resultate der Testung von kommerziell erhältlichen Serumpanel (LOT PHV 101 und LOT PHV 201, Boston Biomedica, USA).

Im einzelnen sind die Ergebnisse des sog. low titre Anti HCV-Panel in Tab. 5 und die Resultate des Mixed titre Anti HCV-Panel in Tab. 6 zusammengefaßt. Den Ergebnissen der mit dem erfindungsgemäßen Peptid erhobenen Daten in Spalte 6 wurden gegenübergestellt die Daten, die mit kommerziellen Tests als Stand der Technik erhoben wurden:

Abbott's HCV EIA (Spalte 1)
Ortho's HCV ELISA (Spalte 2)
Abbott's Bestätigungs-ELISA (Spalte 3)
Ortho's Bestätigungs-RIBA, 2. Generation (Spalte 4)
sowie andere serologische Parameter (Spalte 5)

Tabelle 5

Die Tab. 5 zeigt den Vergleich der Sensitivität eines Peptid-ELISAs (SP 10, 2 µg/ml) zum Stand der Technik bei nativen Anti HCV-positiven Proben des Panels PHV 101, umfassend 15 niedrigtitrige gut charakterisierte Anti HCV-positive Proben (Vertrieb des Materials und der Ver­ gleichs-Testergebnisse durch Fa. Boston Biomedica, USA). Alle ELISA-Angaben erfolgen als ratio-Werte, womit das Verhältnis von Proben-Extinktion zu cut-off beschrieben wird. Werte von < 1,0 werden als negativ und < 1,0 als positiv angesehen.

Aus den Daten der Tab. 5 wird ersichtlich, daß mit einer Ausnahme (PHV 01-03) alle Anti-HCV-positiven Proben rich­ tig positiv mit dem neuen Peptid reagieren. Im Vergleich mit den kommerziellen Tests fällt auf, daß die Signal­ stärke, ausgedrückt im ratio Signal der Probe: cut off mit dem erfindungsgemäßen Peptid signifikant stärker er­ mittelt wurde als mit den vergleichend geprüften Assays, worin sich eine deutlich bessere Zuverlässigkeit des neuen Peptid-ELISAs ausdrückt.

Gemäß diesen Daten (ratio < 25, was Extinktionen von < 2,5 entspricht), handelt es sich nur nach der Defini­ tion gemäß des Standes der Technik um niedrig-titrige Proben, die mit dem neuen Peptid überraschend als stark reaktiv ermittelt werden.

Die eine Ausnahme (Probe 03) erklärt sich aus den Daten des Ortho-Bestätigungstests, der ein Fehlen von core­ spezifischen Antikörpern in dieser Probe nachweist (C22c stellt das gentechnologisch in E. coli hergestellte Protein dar). Gemäß diesem Test wäre die Probe 03 sogar als negativ zu klassifizieren.

In ähnlichen Beobachtungen führt die Testung des zweiten in Tab. 6 zusammengefaßten Panels: von den insgesamt 22 Anti HCV-positiven Proben werden 19 mit Extinktionen von größer 2,5 (entspricht ratio < 25) überraschend extrem stark positiv gefunden. Die drei in dem Panel enthaltenen Anti HCV-negativen Seren werden richtig als negativ klassifiziert (ratios < 1,0). Schließlich werden auch die Proben Nr. PHV 201-08, -10 und -20 im Sinne der Frage­ stellung richtig gefunden, da diese Proben keine (-08 und -10) bzw. wenig (-20) core-spezifische Antikörper gemäß Ortho′s Bestätigungstest aufweisen.

Tab. 6 zeigt den Vergleich der Empfindlichkeit eines Peptid-ELISAs (SP 10, 2 µg/ml) zum Stand der Technik bei nativen Anti HCV-positiven Proben des Panel PHV 201, umfassend gut charakterisierte Anti HCV-positive Proben mit unterschiedlichen Anti HCV-Titern. (Vertrieb des Materials und der Vergleichs-Testergebnisse durch die Firma Boston Biomedica, USA). Alle ELISA Angaben werden als ratios wiedergegeben, die den Quotienten aus Proben-Ex­ tinktion und cut-off-Wert darstellen. Werte von < 1,0 stellen ein Negativ- und Werte von < 1,0 ein Positiv-Er­ gebnis dar.

Beispiel 6 Ortho-HCV-ELISA

Der kommerziell erhältliche ELISA der Fa. Ortho Diagno­ stics Inc., USA (Best. Nr. 940 900) zur Bestimmung von Anti HCV beruhend auf dem gentechnologisch hergestellten C-100-3-Konstrukt (Hefe) wurde bei der Untersuchung von humanen Seren und Plasmen, exakt wie in der Packungsbei­ lage des Herstellers angegeben, bearbeitet, z. B. Proben­ verdünnung von 1 : 11 und 1 h-Inkubation von Serum, 1 h Inkubation von Konjugat sowie dem Enzymsubstrat-System mit o-Phenylendiamin (OPD) als Substrat, photometrischer Messung bei 492 nm sowie die Grenzwert-Festlegung (zu dem Mittelwert der Negativ-Kontrollen wird ein threshold von 0,40 E addiert).

Demgegenüber wurde bei der Bestimmung von HCV-spezi­ fischen Antikörpern in Schimpansen-Serum oder -Plasma derart verfahren, daß mit einem am Kaninchen erzeugten polyklonalen Antikörper gegen Human IgG detektiert wurde. Dazu wurde die IgG-Fraktion des Kaninchen-Antiserums wie in Beispiel 7 beschrieben gereinigt, dialysiert und mit Peroxidase (POD) markiert. Die Endkonzentration wurde im Vergleich zum monoklonalen Anti-IgG/POD-Konjugat etwa 2fach konzentrierter eingestellt, um über die in Vorver­ suchen validierte Kreuzreaktion der Antikörper gegen humanes IgG für Schimpansen-IgG sicher zu gestalten.

Die Grenzwert-Festlegung mußte modifiziert werden, indem der threshold auf 0,60 E erhöht wurde, da die Initial­ werte aller Schimpansen bereits höhere Werte aufwiesen (siehe Tab. 7A und B).

Die in Tab. 7A und B aufgeführten Ergebnisse stellen sog. ratios dar, mit denen der Quotient aus spezifischem Signal und Grenzwert definiert wird.

Beispiel 7 Bestimmung von Anti HCV in Schimpansen-Seren mit den erfindungsgemäßen Peptiden im ELISA

Das neue Peptid SP 10, adsorbiert in Vertiefungen von Mikroti­ terplatten wurde mit Seren von Schimpansen untersucht, die mit verschiedenen infektiösen Dosen des NANBV infi­ ziert wurden. Von den sequentiellen Entnahmen alle 2 Wochen post Inokulation wurden neben der GOT auch die GPT mit kommerziellen Tests gemessen und alle Proben parallel in Ortho-HCV-ELISA sowie im ELISA mit erfindungsgemäßen Peptiden bestimmt. Ähnlich wie beim Ortho-HCV-ELISA des Beispiels 6 wurden beim Peptid-ELISA die polyklonale Kaninchen-Antikörper, markiert mit POD, 2fach stärker konzentriert zur Detektion verwendet, wobei das Enzymsub­ strat TMB verwendet wurde mit photometrischer Messung bei 450 nm. Die Testdurchführung entsprach der vorstehend beschriebenen Bestimmung von humanen Anti HCV mit 0,1 E als Grenzwertfestlegung sowie Wiedergabe der Ergebnisse der Tab. 7 als Verhältnis der spezifischen Extinktions­ werte zu diesem cut off-Wert (ratios).

Tabelle 7 A u. B

Anti HCV-Bestimmung in Serum-Proben von 2 Schimpansen, die mit HCV infiziert wurden. Dargestellt werden die Ergebnisse mit dem Ortho-HCV ELISA im Vergleich zu einem erfindungsgemäßen synthetisch hergestellten Peptid (SP 10, 2 µg/ml), wobei die Ergebnisse als ratios aus spezi­ fischem Signal und Grenzwert dargestellt werden

Tier Nr. 048

Tier Nr. 147

Die in den Tab. 7A und B dargestellten Ergebnisse unterstreichen die Vorteilhaftigkeit der erfindungsge­ mäßen Peptide, insbesondere wenn man mit den entspre­ chenden Resultaten des Ortho-HCV-ELISAs und dem ALT-Ver­ lauf vergleicht.

Insbesondere die zeitliche Kongruenz der Peptid-ELISA-Er­ gebnisse mit den angestiegenen ALT-Werten wird bei Tier Nr. 048 deutlich, wo ein Anti-HCV-Nachweis fast gleich­ zeitig mit dem ALT-Anstieg und durchschnittlich 20 Wochen vor dem Ortho HCV ELISA im Sinne einer scharfen positiv­ negativ-Diskriminierung sehr zuverlässig erfolgt.

Zu ähnlichen Ergebnissen einer frühen, fast mit ALT zeitgleichen Erfassung von HCV-Antikörpern führten die Untersuchungen des Tieres Nr. 147, bei dem ein zuverläs­ siger HCV-Antikörper-Nachweis wiederum ca. 4 Wochen früher möglich ist als mit dem Ortho-Test.

Insgesamt stellen sich die erfindungsgemäßen Peptide bzw. deren Verwendung in immunchemischen Nachweisverfahren wesentlich sensitiver dar, als alle bisher beschriebenen Verfahren basierend auf gentechnologisch hergestellten Proteinen sowie anderen synthetischen Peptiden. Bei verbesserter Sensitivität in späteren Infektionsphasen bieten die neuen Peptide zusätzlich wesentliche Vorteile, indem die Bestimmung früher HCV-Antikörper zuverlässig möglich wird und damit die z. Z. bestehende diagnostische Lücke signifikant verkleinert wird. Darüber hinaus stellen sich die erfindungsgemäßen Peptide wesentlich unempfindlicher gegenüber unspezifischen Bindungen dar, was sich nicht zuletzt in einem gegenüber dem Ortho-Test drastisch verringerten background ausdrückt (max. 0,10 E₄₅₀) gegenüber max. 0,4 E₄₉₂ bei Ortho), und dies sowohl bei Proben tierischer als auch menschlicher Herkunft, so daß eine wesentlich schärfere Negativ-Positiv-Diskrimi­ nierung möglich wird. Schließlich sind als vorteilhafte Aspekte die kürzere Gesamtdauer und präzisere Bestimmung durch das genauer zu pipettierende Probenvolumen von 50 µl zu nennen.

Beispiel 8 Herstellung von Peptid-Lösungen und Bindung der Peptid-Mischungen an Mikrotitrationsplatten

Aus Stammlösungen der Peptide SP 10 und 4083 (DE 40 34 982.9) in 50% Essigsäure in destilliertem Wasser, enthaltend je 6 mg Peptid/ml wurden 2fache Verdünnungsreihen in 0,10 M Natriumbicarbonat pH 9,6 angelegt, also eine Reihe mit den Konzentrationen 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56, 0,78, 0,39, 0,2, 0,1, 0,05 und 0,01 µg Peptid/ml erhalten. Bei Mischungen von einzelnen Peptiden wurde analog vorgegangen, wobei die Stammlö­ sungen zusätzlich in verschiedenen Verhältnissen gemischt wurden, z. B. 10 : 1 oder 1 : 4, um durch Verdünnung in 0,1 M Natriumbicarbonat die oben angegebenen Gesamt-End­ konzentrationen zu erhalten, die aber bei Mischungen mehrerer Peptide diese gleichkonzentriert (bei 1 : 1-Mischung) oder in verschiedenen Verhältnissen zueinan­ der enthalten.

100 µl einer jeden Verdünnung wurde in jeweils 16 Ver­ tiefungen von Mikrotiterplatten, Typ B der Firma Nunc, Roskilde, Dänemark gegeben. Die mit den Verdünnungen gefüllten Testplatten wurden 18 Stunden bei 20°C belas­ sen, dann wurden die Lösungen in den Vertiefungen abge­ saugt und die Vertiefungen 3-4mal mit 300 µl einer Lösung von 10 g/l Rinderserumalbumin in phosphatge­ pufferter physiologischer Kochsalzlösung, (PBS, pH 7,4) durch Füllen und Absaugen gewaschen und die Testplatten anschließend über Kieselgel bei 20°C getrocknet.

Als geeignet hat sich eine Konzentration von 1 µg 40 83/ml und 1 µg SP 10/ml für die Beschichtung der Peptid-Mischung herausgestellt, wobei diese Konzentration die Basis der in Tab. 8 bis 10 zusammengefaßten Ergeb­ nisse darstellt, die wie in Beispiel 3 beschrieben, erhalten wurden. Mischung auf den in Tabelle 10 und 11 sowie 12 dargestellten Ergebnissen basiert.

Tab. 8 und 9

Die Angaben zu dem erfindungsgemäßen und kommerziellen ELISA stellen sogenannte Endpunkt-Titer dar, mit denen die höchste Vorverdünnung eines Serums in Anti HCV-nega­ tivem Serum definiert wird, die in einem gegebenen Test reproduzierbar positiv ermittelt wurde.

Tabelle 8

BBI Low titre Anti HCV PANEL PHV 101

Tabelle 9

BBI Mixed titre Anti HCV PANEL PHV 201

Tabelle 10

Ergebnisse der Testung von 930 gesunden Blutspendern, von denen gleichzeitig Serum und Plasma gewonnen wurde

Claims (25)

1. Peptide, die spezifisch mit Antikörpern gegen das HCV reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Aminosäu­ resequenzen Teilen der amino-terminalen HCV-core-Re­ gion entsprechen.

2. Peptide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Aminosäuresequenz teilweise oder ganz der Formel I entsprechen: MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGQIVGGVY (I)

3. Peptide gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einer der folgenden Aminosäuresequenzen entsprechen:

4. Peptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der folgenden Aminosäuresequenz entspricht:

5. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Aminosäuresequenz gegenüber der natürlich vorkommenden Sequenz durch Ersatz, Hinzufügen oder Weglassen von einer oder mehreren Aminosäuren dergestalt modifiziert ist, daß ihre Immunreaktivität im wesentlichen erhalten oder verbessert wird.

6. Mischung von Peptiden, die Peptide nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 und Peptide aus DE P 40 34 982.9 enthalten.

7. Peptide nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide untereinander verknüpft sind.

8. Peptide nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide an einen Träger gebunden sind.

9. DNA Sequenzen, die für mindestens eines der Peptide gemäß Anspruch 1-8 codieren.

10. Antikörper, die zu mindestens einem der Peptide gemäß Anspruch 1-8 eine biospezifische Affinität haben.

11. Immunchemisches Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von HCV Antikörpern unter Verwendung von Peptiden als Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß dies Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-8 sind.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kombination von Peptiden verwendet wird, die für frühe und späte Phasen der Infektion spezifische sind, wobei entweder Mischungen mehrerer kürzerer Peptide oder ein Polypeptid, das in seiner Spezifität dieser Mischung entspricht, verwendet wird.

13. Analytisches Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von HCV, dadurch gekennzeichnet, daß als spezifischer Schritt eine Hybridisierungsreaktion eingesetzt wird, in der mindestens eine Nukleinsäure­ sonde verwendet wird, die in ihrem spezifischen Teil komplementär zu mindestens einer der DNA Sequenzen gemäß Anspruch 9 ist.

14. Vaccine, die mindestens ein Peptid oder eine Mischung von Peptiden gemäß einem der Ansprüche 1-8 enthält.

15. Verwendung von Peptiden oder Mischungen von Peptiden nach mindestens einem der Ansprüche 1-8 zur Erzeu­ gung von Antikörpern in Säugetieren, insbesondere in Menschen.

16. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß zum Zwecke einer Differentialdiagnose zwischen früher und später Infektionsphase jeweils ein oder mehrere Peptide die spezifisch auf frühe Antikörper reagieren und ein oder mehrere Peptide, die spezifi­ sche auf späte Antikörper reagieren in getrennten Ansätzen mit der Probe zur Reaktion gebracht werden.

17. Verwendung von Antikörpern gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 und 15 zu diagnostischen und therapeuti­ schen Zwecken.

18. Verwendung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das diagnostische Verfahren ein heterogener Immunoassay ist.

19. Peptide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie peptidchemisch synthetisiert werden.

20. Peptide gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine der folgenden Aminosäuresequenzen einschließen, AS_n-QRKTKRNTNRRPQDVK-BS_mwobei AS und BS eine beliebige Aminosäure bedeuten und n und m unabhängig voneinander jeweils ganze Zahlen von 1 bis 40 sind.

21. Immunologischer Test zum Nachweis und/oder Bestimmung von HCV Antikörpern, wobei der Test einen Träger enthält, an dem ein oder mehrere Epitope der Peptide oder Peptidmischungen nach mindestens einem der An­ sprüche 1-8 und 19-20 fixiert sind.

22. Test nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyamid und anderen synthetischen Polymeren, natürlichen Polymeren wie Zellulose sowie derivatisierten natürlichen Polymeren wie Zelluloseacetat und Nitrozellulose als auch Glas, insbesondere als Glasfaser.

23. Test nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Polystyrol ist.

24. Test nach mindestens einem der Ansprüche 21-23, dadurch gekennzeichnet, daß der gleichzeitige Nachweis und/oder die gleichzeitige Bestimmung mit Hilfe von enzym-markierten, fluoreszenz-markierten, chemilumi­ neszenz-markierten, biotin-markierten oder radioak­ tiv-markierten Antikörpern gegen die epitop-gebundenen Antikörper erfolgt.

25. Test nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß als enzym-markierte Antikörper die Enzyme alkalische Phosphatase und/oder Meerrettich Peroxidase verwendet werden.