CH675636A5 - - Google Patents

Description

  
 



  Die Erfindung betrifft einen neuen Assay auf Antikörper für Retroviren und neue Virenextrakte bzw. Isolate für die Verwendung bei dem Verfahren und insbesondere einen Virus, der dem humanen T-lymphotropen Virus verwandt ist zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern für Retroviren, insbesondere jene, die mit dem erlangten Immunmangelsyndrom (AIDS, von dem angelsächsischen Ausdruck acquired immune deficiency syndrome) assoziiert sind. 



  Die Wahrscheinlichkeit, dass das erlangte Immunmangelsyndrom (AIDS) durch ein infektiöses Mittel verursacht wird, ist seit einigen Jahren ersichtlich. Die Symptome dieser Krankheit wurden auf bestimmte, gut definierte Risikogruppen in einem Muster beschränkt, welches sehr wahrscheinlich macht, dass das Mittel durch Sexual- oder Blutkontakt übertragen wird. Obgleich diese Krankheit anfangs in den Vereinigten Staaten von Amerika entdeckt wurde, tritt ein erhöhtes Vorkommen der Krankheit auch sonst, einschliesslich in Europa, auf. 



  Eine Methode, von der man annimmt, dass durch sie die Krankheit übertragen wird, ist die Transfusion von Blut, welches von Spendern gespendet wurde, welche selbst mit Aidsvirus infiziert sind. Das Sammeln von gespendetem Blut bedeutet, dass, wenn Blut, welches von einem Spender gespendet wird, der einen Aidsvirus beherbergt, mit Proben von Blut von anderen Spendern vereinigt wird, dann das gesamte Blut und die anderen Produkte, die von diesem Pool stammen, kontaminiert sind, unabhängig davon, wie klein oder gross die Probe ist. Viele der Blutspender, welche einen Aidsvirus beherbergen, sind sich ihrer Infektion, insbesondere in den Anfangsphasen der Infektion, nicht bewusst und andere infizierte Spender werden sich, selbst wenn sie von ihrer Infektion wissen, weigern, entweder zuzugeben, dass sie die Krankheit haben oder dass sie zu einer hohen Risikogruppe gehören.

  Es besteht daher ein erhöhter Bedarf für relativ einfache, aber vollständig zuverlässige Tests, gemäss denen Proben aus Blut, welches für Transfusionszwecke bestimmt ist, auf die Anwesenheit von Aidsvirus oder Antikörpern für Aidsvirus routinemässig getestet werden können. Blutspenden, die in dem Test positiv reagieren, können für Transfusionszwecke zurückgewiesen werden, und die Kontamination anderer Blutproben durch das Zusammengeben mit der kontaminierten Probe kann vermieden werden. 



  Die Forschung hinsichtlich der Identifizierung und Isolierung des Mittels, welches für Aids verantwortlich ist, wird seit etwa 2 Jahren aktiv betrieben. Es gibt aber zwischen den verschiedenen Forschern auf diesem Gebiet hinsichtlich der genauen Identität und Nomenklatur keine Übereinstimmung. Über einen sogenannten Aidsvirusextrakt (Isolat) wurde zuerst 1983 von Montagnier und seinen Kollegen in Frankreich berichtet, die das Material "Lymphadenopathy Associated Virus One" (LAV-1) bezeichneten. Ungefähr  ein Jahr später haben Gallo und seine Kollegen in den Vereinigten Staaten Einzelheiten hinsichtlich der Isolierung eines anderen sogenannten Aidsvirus publiziert, welchen sie dann als "Human T-lymphotropic Virus Type III" (HTLVIII) bezeichneten. 



  Wir waren jetzt in der Lage, aus einem Lymphknotentumor ein humanes T-lymphotropes Retrovirus, welches mit HTLV-III und LAV verwandt ist, zu isolieren und welches von uns als CBL-1 bezeichnet wurde. Das CBL-1-Material ist ein stabiler Extrakt, welcher  in einer Wirtszellinie  gezüchtet  werden  kann und in einem Assay für den Nachweis von Antikörper für Aidsvirus in Serumproben verwendet werden kann. 



  Die Erfindung betrifft somit einen humanen T-lymphotropen Retrovirus CBL-1, der ätiologisch zu Aids verwandt ist, zur Verwendung im neuen Assay auf Antikörper für Retroviren. 



  Es wurde gefunden, dass CBL-1 während langer Zeiten in einer leukämischen T-Zellinie, die als CCRF-CEM bezeichnet wird und von Foley et al, Cancer 18, 522-529 (1965) beschrieben wird, gehalten werden kann, und die Erfindung betrifft weiterhin CCRF-CEM-Zellen, welche den erfindungsgemässen CBL-1-Virus beherbergen. 



  Für Bestätigungszwecke haben wir Proben der CCRF-CEM-Zellen, welche das erfindungsgemässe CBL-1-Virus beherbergen, bei der National (jetzt European) Collection of Animal Cell Cultures (NCACC) bei dem Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG England hinterlegt. Die Hinterlegungsstelle NCACC wurde als Internationale Hinterlegungsstelle gemäss dem Budapester Vertrag von 1977 anerkannt. Die Hinterlegung erfolgte am 11. Januar 1985 und erhielt die Hinterlegungsnummer 85 011 101. 



  Das erfindungsgemässe CBL-1-Material wurde aus Lymphozyten isoliert, die in einer Biopsie eines Lymphknotentumors eines britischen Patienten gezüchtet wurden, der auf immunoplastische Lymphoma, die mit Aids assoziiert war, behandelt wurde. Fragmente der Biopsie wurden in einem Kulturmedium gehalten, zu dem man T-Zellenwachstumsfaktor zugab, und nach etwa 2 Tagen wurden die CCRF-CEM-Zellen zu der Kultur gegeben, welche bei solchen Bedingungen gehalten wurde, dass die primären Lymphozyten im Verlauf von etwa einem Monat verschwanden, während die CCRF-CEM-Zellen sich vermehrten und chronisch mit dem CBL-1-Virus infiziert wurden. 



  Es wurde gezeigt, dass der CBL-1-Virus den zuvor beschriebenen Extrakten von HTLV-III verwandt ist, da er 
 
   (a) eine Umkehrtranskriptaseaktivität mit einer Präferenz für Mg<+><+>-Kationen besitzt, und ausserdem 
   (b) durch die Morphologie der Viruspartikel, welche durch Elektronenmikroskopie kenntlich gemacht wurde, 
   (c) durch indirekte Immunofluoreszenz, die für Virenantigene in CBL-1 infizierte CCRF-CEM-Zellen mit Seren, hergestellt von Aids-Patienten, spezifisch ist, 
   (d) durch Vergleich in dem Festphasen-Radioimmunoassay mit HTLV-III und LAV-1, 
 



  und wird somit von der taxanomischen Gruppe der Retroviridae  umfasst, welche humane T-zellenlymphotrope Viren enthalten. 



  Eine vorläufige DNA-Sequenzanalyse zeigt, dass die Sequenz des CBL-1-Virus, obgleich sie eng mit der der anderen humanen T-lymphotropen Retroviren, die bis jetzt be schrieben wurden, verwandt ist, nicht mit der der zuvor beschriebenen Materialien identisch ist, sondern an verschiedenen Stellen eine Sequenzvariation zeigt. 



   Es wurde gezeigt, dass die infizierten Zellen, die beim NCACC hinterlegt wurden, kontinuierlich Viren und virale Antigene im Verlauf von mindestens 6 Monaten synthetisieren. 



  Obgleich gefunden wurde, dass CCRF-CEM-Zellen ein idealer Wirt für den erfindungsgemässen CBL-1-Virus ist, wurde gefunden, dass die Zellen ebenfalls verwendet werden können, um ein ähnliches Virus zu beherbergen, welches von uns aus dem peripheren Blut des gleichen Patienten, dem die Lymphknotentumorbiopsie entnommen wurde, isoliert wurde und ähnliche Viren, die von anderen Patienten, die mit Aids verwandten Viren infiziert sind, isoliert wurden. Wir haben gezeigt, dass diese Zellinie einen wertvollen Wirt für die in-vitro-Züchtung nicht nur von dem erfindungsgemässen CBL-1-Material, sondern ebenfalls von anderen verwandten Materialien ergibt. 



  Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren für die Analyse einer biologischen Probe auf Antikörper für Retroviren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die biologische Probe in Kontakt mit 
 
   (1) einem insolubilisierten Antigen, welches Retroviren-Antigene, gebunden an Globulin, enthält, wobei das Globulin selbst an einen inerten festen Träger gebunden ist, und 
   (2) einem Immunoglobulin, welches einen spezifischen Antikörper für die Retroviren-Antigene enthält, und welches mit einem nicht radioaktiven Erkennungsmarkierungsmittel markiert ist, bringt und die flüssige Phase von der festen Phase trennt und die Menge an Erkennungsmarkierung, die entweder mit der flüssigen oder festen Phase assoziiert ist, bestimmt. 
 



  Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Testkit bzw. ein Testbesteck bzw. ein Testerzeugnis zur Durchführung des obigen Verfahrens, welches 
 
   (1) eine erste Komponente, die ein insolubilisiertes Antigen ist, welches Retroviren-Antigene, gebunden an Globulin, enthält, wobei das Globulin selbst an einen inerten festen Träger gebunden ist, und 
   (2) eine zweite Komponente, welche ein Immunoglobulin ist, welches einen spezifischen Antikörper für die Retroviren-Antigene enthält, und welches mit einem nicht radioaktiven Erkennungsmarkierungsmittel markiert ist, umfasst. 
 



  Wie oben angegeben, ist die Hauptverwendung von CBL-1 die, dass es eine Komponente in einem Testsystem für die Routineprüfung von Transfusionsblut ist, um festzustellen, ob es von einem Subjekt, welches mit Aidsvirus infiziert ist, stammt. Wir haben ein System auf der Grundlage des gleichzeitigen Konkurrenzassays unter Verwendung von immobilisierten CBL-1-Antigenen oder anderen Retrovirus-Antigenen als feste Phase und des Testserums als flüssige Phase entwickelt. 



  Genauer gesagt, basiert der erfindungsgemässe gleichzeitige Konkurrenzassay auf der Immobilisierung des CBL-1-Antigens oder eines anderen Retrovirus-Antigens durch seine Bindung an eine feste Phase über einen Liganden, d.h. Globu lin , und dann unterwerfen der Bindungsstellen an diesem immobilisierten Antigen einer konkurrierenden Einwirkung eines Gemisches aus Testserum-Antikörper und bekanntem Antikörper für das Aidsvirus, welcher durch das Erkennungsmittel identifiziert werden kann. Wir haben gefunden, dass die zufriedenstellendsten Ergebnisse erreicht werden können, wenn das Erkennungsmittel eine Enzymmarkierung ist. Die Verwendung einer Enzymmarkierung anstatt einer Radiomarkierung besitzt Vorteile, da die Bestrahlungsbiogefahr nicht auftritt, und eine unerwartete Konsequenz ist, dass die Assay-Immuninkubation auf 1 Stunde oder darunter verkürzt werden kann. 



  Eine weitere Alternative ist die Verwendung der Immunofluoreszenz zur Kenntlichmachung der Anwesenheit eines bekannten Antikörpers, der an ein immobilisiertes Antigen gebunden ist. 



  Wie oben angegeben, wurde gefunden, dass die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn das Antigen an die feste Phase über einen Liganden d.h. Globulin, der ein Antikörper ist, gebunden ist. 



  Eine Technik ist die Verwendung eines Humanserums mit hohem Titer, welches von irgendeinem, der asymptomatisch mit Aidsvirus infiziert ist, entnommen wurde. Das ideale Serum wird einen hohen Titer an Antikörpern für Aidsvirus enthalten, wird jedoch von einem Patienten stammen, dessen Immunoglobulinwerte im Normalbereich liegen. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der gegenüber dem Retrovirus gezüchtet wurde. Wird dieser in an sich bekannter Weise unter Verwendung von Mäusen gezüchtet, dann können bestimmte Vorteile sichergestellt werden, wie es im folgenden genauer erläutert wird. 



  Das Material für die feste Phase ist zweckdienlich Polystyrol, welches in Form von Rohren, Perlen oder bevorzugt als Plättchen mit einer Vielzahl von Oberflächenwellen oder anderen Oberflächeneindrücken bzw. -vertiefungen verwendet wird. Gamma-Globulin, das aus dem ausgewählten Serum oder einem anderen Antikörper hergestellt worden ist, wird dann auf das Polystyrol aufgetragen, und das Antigen wird an das mit Globulin beschichtete Polystyrol unter Bildung der ersten Komponente des Tests gebunden. Diese Komponente kann nass oder trocken während mehrerer Monate gelagert werden. 



  Die zweite Komponente des Tests umfasst die IgG-Fraktion, die aus dem Testserum isoliert worden ist, und wenn die Erkennung mittels einer Enzymmarkierung erfolgt, kann diese IgG-Fraktion beispielsweise mit Meerettich-Peroxidase (HRPO) nach an sich bekannten Verfahren konjugiert werden. 



  Das erfindungsgemässe Testkit kann zum Vermischen der markierten IgG-Komponente mit dem Testserum und In-Kontakt-bringen des Gemisches aus IgG und Testserum mit dem insolubilisierten Antigen, Trennen der festen und flüssigen Phasen voneinander und Bestimmung des Ausmasses, gemäss dem das IgG an das Antigen gebunden wurde, verwendet werden. Entsprechend den gleichzeitigen Konkurrenz-Assays ist, je grösser das Ausmass ist, gemäss dem die IgG-Komponente der flüssigen Phase an die feste Phase gebunden ist, um so geringer die Menge an Antikörper oder Antigen in dem Testserum. Durch Auswahl geeigneter Kontrollwerte ist es daher möglich, einen Routinetest zu haben, wo, wenn HRPO als Markierungsmittel verwendet wird, das Testserum als frei von Aids-Antikörper oder Antigen angesehen werden kann, vorausgesetzt, dass die optische Dichte (OD) der Testprobe einen vorbestimmten Minimalwert erreicht.

   Irgendeine Probe des Testserums, wel che eine OD-Zählung unter dem vorbestimmten Wert, der aufgezeichnet wurde, verursacht, kann daher zurückgewiesen werden, wodurch eine Transfusion mit einer Blutspende, die möglicherweise mit Aidsvirus oder Antikörper kontaminiert ist, vermieden wird. 



  Als Alternative zu CBL-1 als Retrovirus-Antigen in dem Assayverfahren und dem diagnostischen Testkit gemäss der vorliegenden Erfindung kann man andere Retroviren verwenden. Diese können andere humane Retroviren sein, die ätiologisch mit dem Aidsvirus, wie dem humanen T-lymphotropen Retrovirus HTLV-III oder anderen humanen Retroviren, wie dem humanen T-Leukämiavirus, HTLV-II oder HTLV-I oder tierischen Retroviren, wie dem Maedi-Visna oder Rinder-Leukosisvirus verwandt sind. 



  Wie es im folgenden näher erläutert wird, ergibt die indirekte Bindung von humanen Retrovirus-Antigenen an die feste Phase über das Globulin eine bestimmte Vervielfältigung der Ergebnisse, und das Testformat erlaubt eine einfache, schnelle und genaue Bestimmung auf die Anwesenheit oder Abwesenheit der Kontamination von Blutproben durch relativ wenig ausgebildete und ungeübte Techniker. 


 Beschreibung der Zeichnungen 
 
 
   Figur 1 zeigt die Festphase ELISA für Anti-HTLV-III.

  In der Figur sind die optischen Dichten, die man bei einer Reihe von Tests klinischer Seren einschliesslich solcher, die für Anti-HTLV-III reaktiv und nichtreaktiv sind, sowie  Ergebnisse, die zuvor durch Radioimmunoassay bekannt waren, dargestellt. 
   In Figur 2 sind ähnliche Ergebnisse wie in Figur 2 dargestellt, jedoch diesmal für Anti-HTLV-I, bestimmt gemäss einer ähnlichen, einstufigen, gleichzeitig konkurrierenden ELISA. 
 



  Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. 


 Beispiel 1 
 


 Isolierung und Charakterisierung von CBL-1 
 



  Der Virus CBL-1 wurde aus Lymphozyten isoliert, die aus einer Lymphknotentumorbiopsie eines britischen Patienten, der für immunoplastische Lymphoma behandelt wurde, welcher mit erlangtem Immunmangelsyndrom (AIDS) assoziiert ist, kultiviert. Die Lymphknotenbiopsie wurde in kleine Fragmente geschnitten und in ein Kulturmedium gegeben, welches aus RPMI-1640 Grundmedium, ergänzt mit 10%igem fötalem Kalbserum und 10  mu g/ml Phytohaemagglutinin, bestand. Nach 24 Stunden wurde konditioniertes Medium, welches T-Zellenwachstumsfaktor, geerntet von gemischten Kulturen aus tonsillaren Lymphozyten, enthielt, zugegeben, und das Phytohaemagglutinin wurde entfernt. 48 Stunden nach der Initiierung der Kultur wurde Antiserum für Interferon alpha zugegeben. Nach 48 Stunden wurden CCRF-CEM-Zellen (im folgenden als CEM-Zellen bezeichnet) ebenfalls zugegeben.

  Die CEM-Zellen sind eine permanent wachsende leukämische T-Zellenlinie, die von Foley et al (1965) Cancer 18: 522-9 beschrieben wird. 



  Unter den Züchtungsbedingungen verschwinden die primären Lymphozyten im Verlauf von 4-wöchiger Kultur, während die  CEM-Zellen exponentiell wuchern. Der CBL-1-Virus, produziert durch die primären Lymphozyten, infiziert die CEM-Zellen, und nach 8-wöchiger Kultur sind die CEM-Zellen chronisch mit dem CBL-1-Virus infiziert. Die Erhaltung der CBL-1-infizierten CEM-Zellen erforderte keinen T-Zellenwachstumsfaktor oder Anti-Interferon alpha. Diese CBL-1-infizierten CEM-Zellen wurden wie oben angegeben bei NCACC unter der Hinterlegungsnummer 85 011 101 hinterlegt. 



  Es konnte gezeigt werden, dass der CBL-1-Virus den zuvor beschriebenen Isolaten von HTLV-III/LAV verwandt ist, da es (a) eine Umkehrtranskriptaseaktivität mit einer Bevorzugung für Mg<2><+>-Kationen aufweist, durch die Morphologie der Virusteilchen, die durch Elektromikroskopie sichtbar gemacht wurden, und (b) durch indirekte Immunofluoreszenz, die für die viralen Antigene in CBL-1-infizierten CEM-Zellen mit Seren, hergestellt von Aids-Patienten, spezifisch ist, und durch Vergleich mit anderen Aidsvirusextrakten in der Festphase RIA. Die CEM/CBL-1-Zellen haben den Virus und virale Antigene im Verlauf von 6 Monaten kontinuierlich weitersynthetisiert. 


 Beispiel 2 
 


 1. Antigen-Herstellung 
 



  Ein rohes, gefriergetautes Zell-Lysat wird auf folgende Weise hergestellt. HT-H9-Zellen, infiziert mit HTLV-IIIB, können zu einer maximalen Dichte in einer Suspensionskultur wachsen. Die Kulturen werden auf 4 DEG C gekühlt, und 0,25% v/v  beta -Propiolacton werden während 2 Stunden zugegeben. Die Zellen werden dann aus dem Kulturfluid herausgesponnen und mit niedriger Geschwindigkeit pelletisiert. Die Zellenpel lets werden erneut in destilliertem Wasser resuspendiert und drei Gefrier/Tauzyklen unterworfen. Bei jedem Zyklus wird der Rest der Zellenpellets sorgfältig resuspendiert. Nach dem dritten Zyklus wird der Extrakt auf 0,25% vol/vol mit  beta -Propiolacton eingestellt und bei 4 DEG C während 2 Stunden gehalten. Er wird dann auf 37 DEG C während einer halben Stunde erwärmt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert im Bereich von 7,4 gehalten.

  Das rohe Lysat wird geklärt und bei -20 DEG C gelagert. Vor der Verwendung wird es in TRIS-Puffer, ergänzt mit 0,1% BSA und Detergens, verdünnt. Die Wahl des Detergens und seine Konzentration ist wichtig, und es wurde gefunden, dass die Verwendung von Tween 20 bei einer Konzentration von 0,1% optimal ist, wodurch die Aktivität der Antigenpräparation dreifach oder manchmal mehr verstärkt wird. Nach Verdünnung in TRIS-BSA/Tween 20 wird das Antigen 30 Minuten bei 37 DEG C inkubiert. Es ist während dieser Stufe, dass eine Antigenverstärkung auftritt. 



  Die Antigen-Präparation, die auf diese Weise erhalten wurde, kann verwendet werden, um die Expression von HTLV-III-Antigen bei verschiedenen definierten Kulturbedingungen zu verfolgen. Die Antigenizität kann in Festphasen-RIA unter Verwendung von Festphasen-Anti-HTLV-III und einem zweiten Reagens, welches <1><2><5>-J Anti-HTLV-III enthält, quantitativ eingeteilt werden. Bei der letzten Analyse wird das Antigen in einer Verdünnung verwendet, welche ein P-N-Verhältnis von 10:1 mit 1 bis 2% Markierungsbindung in Anwesenheit negativer Sera (vgl. im folgenden unter Assayverfahren) erlaubt. Es gab eine variable Abstossung der viralen Antigene in das überstehende Fluid der Zellen, aber in relativen Beziehungen wurde die Hauptmasse des nachweisbaren Antigens in den Zellpellets gelassen.

   Dies galt für CBL-1 und für andere Isolate (Extrakte) von HTLV-III, die in  CEM-Zellen oder HT-H9-Zellen getragen wurden. Es gab keine Beschränkung der Antigenreinheit (vgl. im folgenden), und es war richtig, die Antigenexpression in den Zellen zu maximieren. Die Antigen-Präparation, die hier verwendet wurde, war leicht herzustellen, vermutlich mit höherer Ausbeute pro Volumen Zellkultur als Antigen, welches aus Überstandfluid hergestellt wurde, und sie ist bei -20 DEG C stabil. Sie kann leicht durch  beta -Propiolacton inaktiviert werden. Man kann ebenfalls stark erwarten, dass durch die Verwendung von Tween 20 der Titer von irgendeinem infektiösen Virus verringert wird. 


 2. Antisera 
 



  Das Reagens für den Assay wird aus menschlichem Serum mit hohem Titer hergestellt, welches aus Personen stammt, die asymptomatisch mit Aids-Retrovirus infiziert sind. Die Auswahl der Sera für die Reagensherstellung war wichtig. Das Serum hatte einen hohen Titer von Anti-HTLV-III gemäss RIA und kam von einem Patienten, dessen Immunoglobulingehalte im Normalbereich lagen. In der Praxis ist es im allgemeinen erforderlich, Reagenzien von einer kleinen Zahl Seren herzustellen, die die obigen Kriterien erfüllen, und das Wirken der Reagenzien in dem Assay zu prüfen. Damit diese Reagenzien nichtinfektiös sind, werden die als Ausgangsmaterial verwendeten Sera durch Erhitzen bei 56 DEG C während 30 Minuten behandelt. 


 (a) Herstellung von Anti-HTLV-IIIB-Globulin 
 



  Dieses Material wird zur in-situ-Reinigung an einem Festphasen-HTLV-IIIB-Antigen verwendet. In dieser Strategie liegen beachtliche Vorteile. Globulin von wärmebehandeltem  Serum wird zweimal mit 40% gesättigtem Ammoniumsulfat präzipitiert. Dies ist das einfachste Reagens für die Globulinbeschichtung, durch die es möglich ist, entweder Gesamtserum oder gereinigtes IgG zu verwenden. Das Globulin wurde mit einer optimalen Verdünnung verwendet, welche durch individuelle Titration des Reagenses bestimmt werden muss. Das Festphasenmaterial war Polystyrol in Form von Wells bzw. kleinen Schälchen und wurde mit Globulin beschichtet. Die freien Bindungsstellen wurden dann mit einem inerten Protein - in diesem Fall 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) - abgeschreckt bzw. abgebunden. Die beschichtete und abgeschreckte feste Phase wurde nass bei 4 DEG C während Monaten gelagert.

  Ein Trocknen ergab ein noch stabileres Produkt. Zum Beschichten der festen Phase wurde HT-H9/HTLV-IIIB-Lysat, wie oben beschrieben, in TRIS-BSA-Tween-Puffer bis zu einer Verdünnung, welche, in nachfolgenden Testen, die Möglichkeit ergab, dass 1 bis 2% der Markierung an negatives Serum gebunden wurde, verdünnt. Die Beschichtung wurde am wirksamsten während einer 2tägigen Inkubation des Antigens bei Raumtemperatur in fester Phase und anschliessender Nasslagerung bei 4 DEG C bis zur Verwendung erreicht. Vorversuche zeigten, dass die feste Phase in dieser Form während mehrerer Monate stabil ist. Sie kann jedoch ebenfalls ohne signifikanten Verlust der Potenz getrocknet werden und verbleibt während mehrerer Monate stabil. 


 (b) Markierung von Globulin 
 



  Das in 2(a) oben beschriebene IgG wird mit HRPO unter Verwendung von heterobifunktionellen Derivaten in üblicher Weise konjugiert, wobei man ein molares Substitutionsverhältnis von 1:3 erhält. Dieses Material wurde in Assoziation mit der oben in 2(a) beschriebenen festen Phase in einem  Enzymimmunoassay für den Nachweis von Antikörper für Aids-Retroviren in Proben von Körperflüssigkeiten verwendet. 



  Für Vergleichszwecke wurde eine weitere Probe des IgG mit <1><2><5>-J bis zu einer spezifischen Aktivität von 15  mu Ci pro  mu g Protein markiert. 


 Beispiel 3 
 


 Einstufige Konkurrenz-ELISA für Anti-CEM/CBL-1-Serumreagenzien 
 



  Ein humanes Serum, welches einen hohen Titer an Anti-HTLV-III enthielt, wurde für die Herstellung von beschichtetem Globulin, wie zuvor in Beispiel 2.2 beschrieben, verwendet. Polystyrol-Schälchen mit rundem Boden werden mit einer optimalen Verdünnung von Globulin beschichtet und dann mit einem inerten Protein, in diesem Fall 0,1% BSA, abgeschreckt bzw. abgebunden. Das gleiche Serum wird als Quelle für Immunoglobulin verwendet, welches durch Ionenaustauschchromatographie an DE 52, wie zuvor beschrieben, gereinigt wurde. IgG wurde mit Meerettich-Peroxidase bei einem ungefähren Substitutionsverhältnis von 3 Molekülen Meerettich-Peroxidase pro 1 Molekül IgG gekuppelt. 



  Die Wirkung des Konjugats wird bestimmt durch Inkubation über Schälchen, die zuvor mit einem indirekten Antikörper mit Virus-Antigenen, welche von HTLV-III infizierten Zellen stammen, und mit Antigenen nichtinfizierten Zellen beschichtet waren. Die optimale Verdünnung des Konjugats wurde als die genommen, bei der man eine maximale Farbbindung mit dem infizierten Zell-Antigen und eine minimale Farbbindung mit den nichtinfizierten Zellen erhält. 


 CEM/CBL-1-Antigen 
 



  Zellen, welche dauernd mit CEM/CBL-1-Virus infiziert sind, wurden bis zur maximalen Dichte in nichthaftenden Rührkulturen gezüchtet. Die Rührkulturen werden auf 4 DEG C abgekühlt und dann auf 0,25% Volumen mit  beta -Propiolacton gebracht. Nach 2stündiger Inkubation bei 4 DEG C werden die Zellpellets geerntet und den Gefrier- und Auftauzyklen unterworfen und dann, wie zuvor beschrieben, durch Zentrifugieren geklärt. Der Gewebekulturextrakt wird dann mittels weiterer 2 Stunden Inkubation bei 4 DEG C mit 0,25%  beta -Propiolacton behandelt und dann wie zuvor hydrolysiert. In diesem Fall ist das Verdünnungsmittel für die Zellaufbrechung und den Gefrier-Auftauzyklus phosphatgepuffertes Salz, welches mit 0,1% Tween 20 ergänzt ist. Die Antigen-Präparationen werden anschliessend an einer festen Phase titriert, welche mit hohem Titer Anti-HTLV-III-Globulin beschichtet ist.

  Die Verdünnung, welche einen OD 450 nm zwischen 1,0 und 1,2 bei den im folgenden definierten Bedingungen ergab, wurde als Arbeitsverdünnung für den darauffolgenden Test verwendet. 


 Optimierung und Format bzw. Grösse der Tests 
 



  Schälchen, die mit Globulin mit hohem Titer beschichtet sind und anschliessend abgebunden bzw. abgeschreckt wurden, werden mit 100  mu l einer optimalen Verdünnung von CEM/CBL-1-Antigen inkubiert. Nach einer über-Nacht-Inkubation bei Raumtemperatur werden die Antigenextrakte von den Schälchen abgewaschen, welche dann bei solchen Bedingungen getrocknet wurden, von denen gefunden wurde, dass sie die Stabilität immobilisierter CEM/CBL-1-Virusantigene aktivieren. Zum Testen werden 25  mu l antikörperpositives- und antikörpernegatives Serum in getrennte Schälchen gegeben und 75  mu l ELISA-Konjugat in detergensergänztem destilliertem Wasser werden  zu den Schälchen gegeben. Das Gemisch aus Testserum und Konjugat wird in den Schälchen während unterschiedlicher Zeiten bei unterschiedlichen Bedingungen (Immuninkubation) inkubiert.

   Die Schälchen werden dann dreimal mit SalzlösungTween (0,8% Natriumchloridlösung, ergänzt mit 0,1% Tween 20) gewaschen. Nach drei Waschvorgängen werden die Schälchen mit Salz-Tween gefüllt und können während 2 Minuten bei Raumtemperatur die Feuchtigkeit aufnehmen. Danach wird der Waschvorgang mit drei Waschzyklen wiederholt. Danach werden 100  mu l Chromogensubstrat, in diesem Fall 3, 3 min , 5, 5 min -Tetramethylbenzidin (TMB) zugegeben. Nach 20minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Chromogenfreigabe durch Zugabe von 50  mu l von 4 normaler Schwefelsäure beendigt. Die Farbstofffreigabe wurde spektrophotometrisch bei 450 nm gemessen.

  Die Arbeitsverdünnung von irgendeinem besonderen CEM/CBL-1-Antigen wird als die Verdünnung angenommen, bei der man zuverlässig eine optische Dichte zwischen 1 und 1,2 mit negativem Serum erhält, wenn es bei ELISA unter optimalen Bedingungen, definiert als Immuninkubation von 1 Stunde bei 45 DEG C, verwendet wurde. 


 Ergebnisse 
 



  Ein Vergleich zwischen den Ergebnissen, die man bei dem an sich bekannten RIA unter Verwendung einer festen Phase und <1><2><5>-J-markiertem IgG, beschrieben wie in Beispiel 2, erhält und den ELISA-Ergebnissen, die man bei diesem Beispiel erhält, werden zwei unerwartete Vorteile erkennbar, die zu Gunsten von ELISA sprechen. Erstens erhält man bei suboptimalen Antigen-Präparationen, welche in RIA schlechte Ergebnisse geben, beim gleichen Titer gute Ergebnisse bei ELISA. Zweitens ist es, wie in der Tabelle erläutert wird, mit RIA nicht möglich, die Inkubationszeiten unter 3 Stunden zu verringern.

  Es besteht aber ein Bedarf für einen schnellen  Assay, d.h. 1 bis 2 Stunden insgesamt, bei der Transfusionsdurchführung, und dies ist nur mit ELISA möglich. 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Title: Tabelle 
<tb>Head Col 01 to 05 AL=L: Zeit/Temperaturversuche in RIA mit <125>-J-markiertem IgG 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Zeit/Std.: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Temperatur: 
<tb>SubHead Col 03 to 05 AL=L:

  Kontrollsera 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Negativ: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Abgekürzt
(Cutoff): 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>Positiv: 
<tb> <SEP>18 <SEP>Ü <SEP>1,13* <SEP>0,28 <SEP>0,08 
<tb> <SEP>3 <SEP>Ü RT <SEP>0,37 <SEP>0,19 <SEP>0,1 
<tb> <SEP>2 <SEP>Ü <SEP>0,30 <SEP>0,18 <SEP>0,09 
<tb> <SEP>1 <SEP>Ü <SEP>0,34 <SEP>0,15 <SEP>0,1 
<tb> <SEP>3 <SEP>Ü <SEP>0,43 <SEP>0,15 <SEP>0,11 
<tb> <SEP>2 <SEP>Ü 37 DEG C <SEP>0,43 <SEP>0,19 <SEP>0,09 
<tb> <SEP>1 <SEP>Ü <SEP>0,28 <SEP>0,18 <SEP>0,12 
<tb> <SEP>3 <SEP>Ü <SEP>0,45 <SEP>0,14 <SEP>0,06 
<tb> <SEP>2 <SEP>Ü 45 DEG C <SEP>0,40 <SEP>0,14 <SEP>0,07 
<tb> <SEP>1 <SEP>Ü <SEP>0,27 <SEP>0,13 <SEP>0,05 
 * % Bindung beim Inputwert.
  
<tb></TABLE> 



  In der Figur 2 sind die Ergebnisse des Tests mit ELISA für 56 klinische Seren dargestellt, die in diesem Fall von haemophilen Patienten stammen, und mit im Handel erhältlichen und nichterhältlichen Faktor-VIII-Konzentration behandelt wurden und von Homosexuellen stammen. Aus der Figur ist klar erkennbar, dass eine klare Trennung zwischen Seren, die für Anti-CEM/ CBL-1 reaktiv sind, und nichtreaktiven Seren vorhanden ist. 



  In diesem besonderen Beispiel ist die mittlere optische Dichte von 16 Seren, die reaktiv für CEM/CBL-1-Antikörper sind, 0,085 (0,037 bis 0,327), und die mittlere optische Dichte für 40 Seren, die für diesen Antikörper nicht reaktiv sind, beträgt 1,16 (0,738 bis 1,352). Das Serum a stammt vonn einem terminal kranken Aids-Patienten und ist schwach reaktiv bei IF und den direkten Bindungsassays. Die Seren b und c sind beim erneuten Testen nicht reaktiv. 



  Es wurde genau das gleiche Format in einem Überblick der Bluttransfusionsseren in Grossbritannien verwendet. Bis zum heutigen Zeitpunkt wurden über 12000 Seren von Spendern geprüft. 3 Seren ergaben Screen-Testreaktionen, jedoch fand man beim erneuten Testen, dass nur ein einziger Spender reaktiv war. Das Serum war wiederholt reaktiv, war titrierbar und demonstrierte eine starke Reaktivität bei der Immunofluoreszenz gegenüber infizierten, aber nicht gegenüber nichtinfizierten Zellen. Die Random-Reaktivität von Seren, welche in keiner Beziehung zu CEM/CBL-1-Infektionen standen, war dementsprechend extrem niedrig. Darauffolgende Versuche für die Titration von Seren, welche reaktiv für Anti-HTLV III waren, zeigten, dass die Titer breit die gleichen sind, wenn sie sowohl gemäss dem CEM/CBL-1-ELISA als auch gemäss den direkten Assays geprüft werden.

  Dies wurde durch die darauffolgende Prüfung der Seren, die von Patienten entnommen wurden, welche eine akute Seroconversion nach der primären HTLV-III-Infektion hatten, bestätigt. Wieder war hier grob kein Unterschied im Gehalt oder zum Zeitpunkt der Anfangsreaktivität sowohl bei dem direkten Bindungsassay noch bei dem Konkurrenz-ELISA. Unter Verwendung des gleichen Assays waren Seren von Patienten mit oligo- und panreaktiven Anti-Lymphozyt-Antikörpern und Seren von Patienten mit Autoimmunkrankheiten bei dem glei chen Konkurrenz-ELISA nicht aktiv. Zusammengefasst zeigen diese Werte an, dass die Spezifizität und Empfindlichkeit dieses Konkurrenz-ELISAs für Antikörper für den Aids verwandten Retrovirus hoch sind. 


 Beispiel 4 
 


 Einstufige Konkurrenz-ELISA für Anti-HTLV-I 
 



  Seren und Reagenzien werden auf gleiche Weise, wie bei dem CEM/CBL-1-Immunoassay von Beispiel 3, ausgewählt und hergestellt, mit der Ausnahme, dass Zellen, die mit HTLV-I infiziert sind, für die Antigen-Präparation, und Seren von Patienten, die mit HTLV-I infiziert sind, als Quelle für die Reagenzien verwendet werden. In der Figur 3 ist die optische Dichte dargestellt, die man bei 32 klinischen Seren einschliesslich drei bekannter schwach positiver Kontrollen erhält. Es tritt ein klarer Unterschied zwischen reaktiven und nichtreaktiven Seren auf, wobei die mittlere optische Dichte von 5 reaktiven Seren für diesen Antikörper 0,099 (0,060 bis 0,129) und die mittlere optische Dichte für 24 Seren, die nicht für diesen Antikörper reaktiv sind, 1,64 (1,48 bis 1,83) betragen. Der Test war robust und die Bedingungen können in der Praxis variiert werden.

  Es wurde jedoch entschieden, dass man eine Immunoinkubation von 1 Stunde bei 45 DEG C als optimal ansieht. Dies ist parallel zu den Bedingungen für den Nachweis von CEM/CBL-1-Antikörper. 



   Der Test wurde im gleichen Format verwendet, um über 1000 nichtausgewählte britische Blutspender zu untersuchen, und es wurden keine reaktiven Seren identifiziert. Im Gegensatz dazu gab eine selektive Prüfung von etwa 75 Spendern  aus Afrika und der Karibik einen einzigen Donor, der zum ersten Mal seropositiv war. 



  Das obige Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von Seren von Patienten, die mit HTLV-II infiziert waren, als Quelle für die Beschichtung mit Globulin und als Quelle für IgG. Die mit HTLV-II infizierten Zellen wurden als Antigenquelle verwendet. Diese Reagenzien werden auf gleiche Weise, wie zuvor im Beispiel 2 für Anti-HTLV-III-RIA beschrieben, ausgewählt und hergestellt. 


 Beispiel 5 
 


 Herstellung und Verwendung eines Testkits (bzw. Testbesteck bzw. Testerzeugnis - im folgenden wird der Ausdruck Kit verwendet) 
 


 1. Reagenzien 
 



  Eine Polystyrolplatte mit vielen Ausbuchtungen (eine Multiwellplatte), welche 96 Ausbuchtungen enthielt, wurde mindestens auf der Innenoberfläche der Ausbuchtungen mit gereinigtem, in der Wärme behandeltem Antikörper für CBL-1 beschichtet. Der Antikörper stammt aus einem in der Wärme behandelten Serum eines Menschen, welcher mit Aids-Retrovirus infiziert war. Nach dem Beschichten des Polystyrols mit dem Antikörper werden die freien Bindungsstellen mit einem inerten Protein abgeschreckt bzw. abgebunden, in diesem Fall Rinderserumalbumin. Das für die Insolubilisierung auf den Polystyrolplatten verwendete Antigen war CBL-1. Diese wurde zuerst mit dem vericiden  beta -Propiolacton behandelt, und dann wurde eine Suspension von inaktiviertem CBL-1 in TRIS-BSA-Tween-Puffer mit dem behandelten  Polystyrol während etwa 2 Tagen bei Raumtemperatur inkubiert.

  Auf diese Weise wurde das CBL-1 durch indirekte Bindung an den Polystyrolträger über den Antikörper insolubilisiert. Diese Komponente ist die erste Komponente des Testkits. 



  Die zweite Komponente des Testkits wird hergestellt, indem man den gleichen humanen Antikörper, welcher zur Beschichtung des Polystyrols, wie oben beschrieben, verwendet wurde, markierte. Der Antikörper wurde durch Konjugation mit Meerettich-Peroxidase (HRPO) unter Verwendung an sich bekannter Konjugationsverfahren markiert. Der mit HRPO markierte Antikörper wird in einem gefriergetrockneten Zustand gelagert und unmittelbar vor der Verwendung mit einer Suspension in einem wässrigen Verdünnungsmittel rekonstituiert. 



  Zusätzlich zu den beiden oben erwähnten Komponenten ist es bevorzugt, in dem Testkit Hilfsreagenzien vorzusehen, so dass alle notwendigen Erkennungsreagenzien und Kontrollreagenzien verfügbar sind. Für diesen Kit, bei dem HRPO als Markierung verwendet wird, ist es zweckdienlich, 3, 3 min , 5, 5 min -Tetramethylbenzidin (TMB) als Substrat für das Enzym zu verwenden, und das TMB wurde in Tablettenform zur Verfügung gestellt, wobei jede Tablette ein ausreichendes Substrat für die 96 Ausbuchtungen ergab. Unmittelbar vor der Verwendung werden die TMB-Tabletten in einer wässrigen Lösung, welche tri-Natriumcitrat und Wasserstoffperoxid enthält, gelöst. Es ist ebenfalls bevorzugt, positive und negative Kontrollseren vorzusehen. Das negative Kontrollserum ist normales humanes Serum, das für den Antikörper für CBL-1 bei diesem Test nicht reaktiv ist.

  Das positive Kontrollserum ist in der Wärme behandeltes Humanserum, welches  für Antikörper für CBL-1 bei dem Testverfahren reaktiv ist. Zusätzlich ist es bevorzugt, ein verkürztes Kontrollserum, ein wärmebehandeltes Humanserum (das an den verkürzten Gehalt im Test) für Antikörper CBL-1 reaktiv ist, und ebenfalls eine Waschlösung, welche Salz und Tween 20 enthält, vorzusehen. 


 2. Verwendung des Testkits 
 



  Unmittelbar vor der Verwendung wird der HRPO-markierte Antikörper rekonstituiert. Der Versuch wird unter Verwendung von 25 Mikroliter Proben von Serum pro Ausbuchtung durchgeführt. Zwei Ausbuchtungen werden mit negativem Kontrollserum und eine mit positivem Kontrollserum beschickt, drei mit verkürztem Kontrollserum (der Ausdruck verkürzt bezieht sich auf den angelsächsischen Ausdruck "cut-off") und die Testproben werden in die verbleibenden Ausbuchtungen gefüllt. 75 Mikroliter Teile des rekonstituierten HRPO-markierten Antikörpers werden in jede Ausbuchtung gegeben, und die Platte mit den Ausbuchtungen wird dann bedeckt und auf einem Heizblock bei 45 DEG C während 1 Stunde oder alternativ bei 20 bis 25 DEG C über Nacht während mindestens 16 Stunden Inkubation inkubiert.

  Gegen Ende der Inkubationszeit wird die Platte gewaschen, und 100 Mikroliter Teile der Substratlösung werden zu jeder Ausbuchtung gegeben. Die Platte wird dann bei 20 Minuten bei 18 bis 25 DEG C inkubiert. Danach entwickelt sich eine blaue Farbe in den Ausbuchtungen, die negative Proben enthalten. 50 Mikroliter Teile von 2M Schwefelsäure werden dann zu jeder Ausbuchtung gegeben, und die blaue Farbe ändert sich zu gelb. Die Absorption jeder Ausbuchtung bei 450 nm wird innerhalb von 30 Minuten nach der Zugabe von Schwefelsäure unter Verwendung eines Ablesegeräts für eine Platte mit Mikroausbuchtungen abgelesen. 


 3. Ergebnisse 
 



  Die Ergebnisse werden auf folgende Weise erhalten. Die mittlere Absorption der drei verkürzten Kontrollsera wird berechnet. Irgendeine Probe, die eine Absorption zeigt, welche gleich oder grösser ist wie die des mittleren verkürzten Kontrollwerts, wird als negativer Antikörper für Aids-Retrovirus innerhalb der Grenzen des Testsystems angesehen. Irgendwelche Proben mit einer Absorption unterhalb von der der mittleren verkürzten Vergleichsprobe oder bis zu 10% über der der mittleren verkürzten Vergleichsprobe wurden erneut geprüft. 



  Irgendwelche Seren, die wiederholt in diesem Test positive Ergebnisse gaben, wurden dann für Bestätigungszwecke unter Verwendung des Immunofluoreszenztests oder Western-Blottingtests erneut geprüft. 



  Das oben beschriebene Verfahren wurde mit 1600 Routine-Blutbank-Spenderproben mit negativen Ergebnissen getestet. Wurden jedoch andere klinische Proben von Patienten mit klinischer Diagnose von Aids einem Aids verwandten Komplex oder anderen Krankheiten getestet, so erhielt man positive Ergebnisse, und in praktisch jedem Fall erfolgte eine Bestätigung durch den Immunofluoreszenztest und durch einen anderen Enzymimmunoassay.

   Man erhielt die folgenden Ergebnisse. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Title: Tabelle 
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Reaktivität für Seren von Blutspendern und Patienten mit Aids, Aids assoziierten Bedingungen und anderen Krankheiten 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Klinische Gruppe: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Zahl der Proben: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Antikörper positiv mittels dem Testkit: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Es wurde bestätigt, dass der Antikörper positiv ist<a>:

   
<tb> <SEP>Blutspender <SEP>1600 <SEP>0 <SEP>- 
<tb> <SEP>AIDS <SEP>4 <SEP>4 <SEP>4 
<tb> <SEP>AIDS verwandter Komplex <SEP>39 <SEP>39 <SEP>39 
<tb> <SEP>Hohe Risikogruppen <SEP>7 <SEP>7 <SEP>7 
<tb> <SEP>Andere Krankheiten<b> 
<tb> <SEP>Infektiöse Mononucleose <SEP>48 <SEP>0 <SEP>- 
<tb> <SEP>Hepatitis B <SEP>25 <SEP>3<c> <SEP>2 
<tb> <SEP>Syphilis <SEP>117 <SEP>2 <SEP>2 
<tb> <SEP>Rheumatische Arthritis <SEP>9 <SEP>0 <SEP>- 
<tb> <SEP>Andere Infektionen<d> <SEP>37 <SEP>0 <SEP>- 
 <a> Die Bestätigungstests schliessen Immunofluoreszenz und einen anderen Enzymimmunoassay ein.
<b> Es wurden nur positive Proben bestätigt.
<c> Eine Probe positiv bei 2 oder 4 Testverfahren; bestätigt negativ.
<d> Schliesst Rubella (18 Fälle), Parvovirus (9), Cytomegalovirus (5), Toxoplasmose (5) ein.
  
<tb></TABLE> 



  Das Prinzip der Verwendung eines humanen Antiserums für die Bindung von viralem Antigen an die feste Phase ergibt eine feste Phase, die selbst das Muster der viralen Antigene reflektiert. Dies wurde bei Menschen am besten erkannt. Dies kann von Vorteil sein, da hierbei ein gutes "Passen" zwischen dem Gemisch der eingefangenen bzw. erhaltenen Antigene und dem Profil der humanen Antikörper erhalten wird. Weiterhin können die milden Bedingungen, die zur Antigen-Herstellung verwendet wurden, die Konservierung delikater bzw. komplizierter, unförmiger Epitope erlauben, die in dem Gradienten der gereinigten und zerstörten Präparationen, welche bei anderen Festphasenassays verwendet werden, nicht vorhanden sind.

  Es ist jetzt möglich, das Gemisch aus Festphasen-Antigenen einzustellen, indem man die feste Phase mit monoklonalem Murin-Antikörper definierter Spezifizität beschichtet, so dass die immobilisierten Antigene eine vorbestimmte Spezifizität aufweisen. 



  Die hier gezeigten Werte zeigen die überlegene Natur des Tests, wenn ein ausgewählter monoklonaler Antikörper, der mit p25 (einem 25 K Dalton Protein) reagiert, an der festen Phase verwendet wird. Die Vorteile liegen in der geringeren Menge des Antigens, die für einen geeigneten Assay erforderlich ist (Tabelle A) und in der erhöhten Empfindlichkeit des entstehenden Tests, vergleiche Tabelle B, wo gezeigt wird, dass die Endpunktverdünnungen (d.h. niedrige OD-Ablesungen) der individuellen Seren eine höhere Inhibierung bei den monoklonalen, verglichen mit den polyklonalen Tests ergeben. Die Erhöhung der Empfindlichkeit bewirkt,  dass der Test wirksamer im Nachweis für Antikörperproduktion ist, verglichen mit vielen anderen Assays.

  Zusätzlich vermeidet die Verwendung von Murin-Antikörper an der festen Phase das potentielle Problem der rheumatoidartigen Faktoren-Kreuzvernetzung zwischen festem Phasen Human-IgG und Human-IgG-Konjugat in dem homologen Assay. Praktisch wurden wenige Sera identifiziert, welche konsistent einen grösseren Grad der Inhibierung bei dem Assay auf monoklonaler Grundlage zeigen, verglichen mit dem Assay auf polyklonaler Grundlage. Dieses Phänomen beruht wahrscheinlich auf dem geringen Gehalt und der niedrigen Titerreaktivität, welche Konjugate an die feste Phase in nicht spezifischer Weise nur in dem homologen Assay bindet.

  Dies oder ein ähnliches Phänomen kann ebenfalls eine weitere unerwartete Tatsache erklären, dass die Verteilung der optischen Dichtereaktivität der normalen Seren wesentlich enger in dem Assay auf monoklonaler Grundlage ist als bei dem gleichzeitig durchgeführten polyklonalen Assay. 



  Da es sich als einfach erwiesen hat, einen monoklonalen Antikörper für ein retrovirales gag-Genprodukt zu verwenden, erhält man im wesentlichen einen Konkurrenzassay für die humane Anti-HTLV-III-Kernantwort, und es ist wahrscheinlich, dass die Verwendung von Antikörper für definierte env-Produkte die Entwicklung analoger Assays für Antikörper für ausgewählte Envelope-Antigene erlaubt.

  Dies wird eine wesentlich genauere Untersuchung der humanen Antwort auf unterschiedliche Virus-Antigene erlauben, welches von Wichtigkeit bei klinischen, prognostischen und Infektions-Kontrolluntersuchungen sein kann. 
<tb><TABLE> Columns=7 
<tb>Title: Tabelle A 
<tb>Head Col 01 to 07 AL=L: Titration von CEM/CBL-1-Antigen an polyklonalen und monoklonalen festen Phasen. 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Antigenverdünnung: 
<tb>SubHead Col 02 to 07 AL=L: Beschichtung der festen Phase 
<tb>SubHead Col 02 to 04 AL=L: Polyklonal 
<tb>SubHead Col 05 to 07 AL=L:

  Monoklonal 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>neg.: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>verkürzt*: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>pos.: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>neg.: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>verkürzt: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>pos.: 
<tb> <SEP>10 <SEP>1,34** <SEP>0,69 <SEP>0,05 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT 
<tb> <SEP>20*** <SEP>1,14 <SEP>0,45 <SEP>0,03 <SEP>1,85 <SEP>0,86 <SEP>0,11 
<tb> <SEP>30 <SEP>0,82 <SEP>0,42 <SEP>0,03 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT 
<tb> <SEP>40 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT <SEP>1,50 <SEP>0,37 <SEP>0,09 
<tb> <SEP>60 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT <SEP>1,36 <SEP>0,38 <SEP>0,08 
<tb> <SEP>80 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT <SEP>1,23 <SEP>0,28 <SEP>0,07 
<tb> <SEP>100 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT*** <SEP>1,18 <SEP>0,27 <SEP>0,07 
 * verkürzt - schwach positiv Vergleich
** OD bei 450 nm im Standardbedingungstest für Anti-CEM/CBL-1
*** "Arbeits"-Titer für die Antigen-Präparation
NT = nicht getestet
  
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> 

   Columns=4 
<tb>Title: Tabelle B 
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: OD 450 nm Verdünnung von 19 Sera, titriert auf 50% Inhibierungs-Endpunkt, geprüft mit polyklonaler und monoklonaler fester Phase. 
<tb>SubHead Col 01 to 02 AL=L: Serum 
<tb>SubHead Col 03 to 04 AL=L: Beschichtung der festen Phase 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Polyklonal: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Monoklonal:

   
<tb> <SEP>Vergleich positiv <SEP>0,08 <SEP>0,09 
<tb> <SEP>Verkürzt <SEP>0,76 <SEP>0,55 
<tb> <SEP>Negativ <SEP>1,39 <SEP>1,42 
<tb> <SEP>Haemophil <SEP>1 <SEP>1,08 <SEP>0,86 
<tb> <SEP>2 <SEP>0,95 <SEP>0,77 
<tb> <SEP>3 <SEP>1,01 <SEP>0,77 
<tb> <SEP>4 <SEP>1,04 <SEP>0,74 
<tb> <SEP>Aids <SEP>1 <SEP>0,63 <SEP>0,48 
<tb> <SEP>2 <SEP>0,93 <SEP>0,71 
<tb> <SEP>3 <SEP>0,85 <SEP>0,52 
<tb> <SEP>4 <SEP>0,70 <SEP>0,56 
<tb> <SEP>PGL
(persistent allgemeine Lymphadenopathie) <SEP>1 <SEP>0,84 <SEP>0,62 
<tb> <SEP>2 <SEP>0,84 <SEP>0,58 
<tb> <SEP>3 <SEP>0,73 <SEP>0,56 
<tb> <SEP>4 <SEP>0,60 <SEP>0,48 
<tb> <SEP>Drogenabhängig <SEP>1 <SEP>0,50 <SEP>0,44 
<tb> <SEP>2 <SEP>0,66 <SEP>0,50 
<tb> <SEP>3 <SEP>0,95 <SEP>0,73 
<tb> <SEP>4 <SEP>0,85 <SEP>0,63 
<tb> <SEP>Gesund <SEP>1 <SEP>0,50 <SEP>0,41 
<tb> <SEP>2 <SEP>0,56 <SEP>0,42 
<tb> <SEP>3 <SEP>0,69 <SEP>0,49 
<tb></TABLE> 



   In den obigen Beispielen wird der Assay durch Bestimmung der Markierung, die mit der festen Phase assoziiert ist, durchgeführt. Da jedoch auch der Markierungsgehalt, der mit dem Ausgangsserum assoziiert ist, bestimmt werden kann, ist es ebenfalls möglich, die Reduktion in der radioaktiven Zählung oder dem Enzymgehalt, der mit der flüssigen Phase assoziiert ist, nachdem ein bekanntes markiertes Serum und die Testseren in Kontakt mit dem Festphasen-Antigen gebracht wurden, und die Verringerung in dem Gehalt der Markierung der flüssigen Phase, die als Mass für den Antikörpergehalt im Testserum verwendet wird, zu bestimmen. 



  Die Vorteile des gleichzeitigen Konkurrenzassays können unter den folgenden Überschriften zusammengefasst werden. 


 Antigenherstellung 
 



  Obgleich in Beispiel 2 die Verwendung gereinigter HTLV-III-Viren beschrieben wird, erlaubt die verstärkte Bindung, die durch die Verwendung des immobilisierten Antikörpers kommt, die Verwendung einer rohen Zell-Lysatpräparation zum Beschichten, wenn sie alleine vorliegt, wobei ein solches Antigen nicht direkt auf irgendwelche nützliche Weise an eine feste Phase bindet. Diese Stufe entfernt die Beschränkung, dass hochgereinigtes Antigen für die Herstellung diagnostischer Tests verwendet werden muss, und dadurch wird ihre Herstellung leichter. Dies ist ein Vorteil, welcher für die direkten Assays nicht anwendbar ist, wo eine gesamte humane Globulinbeschichtung ein nicht vermeidbares Signal mit der fertigen Anti-Human-Globulinmarkierung ergeben würde. 


 Format bzw. Grösse 
 



  Die Verwendung eines Volumens an nichtverdünntem Serum bietet einen grossen Vorteil für Bluttransfusionszentren, wo, wenn eine Anfangsverdünnung erforderlich wäre, die Arbeitsbelastung grösser wäre. Das Verhältnis zwischen Serum und enzymmarkiertem Volumen kann innerhalb des Bereiches von 1:1 bis 1:10 mit nur geringer Änderung in dem Testergebnis variiert werden. Das Optimum beträgt 1:3, wobei 25  mu l Serum und 75  mu l Enzymmarkierung verwertet werden, und man erhält eine gute Differenzierung zwischen positiven und negativen Seren. Die Assayzeit kann auf 1 Stunde oder weniger unter Verwendung der ELISA-Technik verkürzt werden. 


 Empfindlichkeit 
 



  Ein Mass für die Empfindlichkeit irgendeines Assays für Aids-Antikörper wird durch das Verhältnis der Seren, die aus terminal kranken Patienten mit Aids entnommen werden müssen, welches positiv verbleibt, bestimmt. Bei direkten Assays scheint es so zu sein, dass eine unterschiedliche Zahl der Patienten ihre Antikörperreaktivität verlieren. Dies tritt nicht bei dem Konkurrenzassay auf, was nahelegt, dass die Empfindlichkeit des Konkurrenzassays so gut oder besser ist wie die eines der derzeit verwendeten Assays. 


 Spezifizität 
 



  Von einem Konkurrenzassay erwartet man nicht, dass grosse Probleme bei einer falschen positiven Reaktivität auftritt. Der Einschluss von Lymphozyt-Membran-Antigenen in den Envelope von HTLV-Virionen führt sicher zur falschen Reaktivität, wie die Anwesenheit von Aggregaten von IgG, welche nicht spezifisch an der festen Phase kleben. Ein solches Phänomen  ergibt keine Erhöhung der Reaktivität bei dem Konkurrenzassay. Nichtspezifische Affekte variabler Proteinkonzentrationen können durch Auswahl geeigneter Serum/Markierungsverhältnisse (1:3, wie oben) minimal gehalten werden und durch Verwendung der Verkürzung von über 50% Inhibierung. Sera, welche eine Inhibierung von Markierungsbindung gleich oder grösser als das des inneren Kontrollserums ergeben, werden als Screen-Test positiv angesehen. Der Test sollte jedoch wiederholt werden.

  Aufgrund der niedrigen Werte für falsche Reaktivität, die auf unter 1 bei 5000 angenommen wird, ist es unwahrscheinlich, dass falsche positive Reaktionen bei dem Konkurrenz-ELISA numerisch grosse Schwierigkeiten ergeben, wie dies bei anderen direkten Assays der Fall ist. Dies gilt insbesondere dort, wo die direkten Assays ohne Kontroll-Antigen durchgeführt werden. Man nimmt an, dass dies bei Transfusionszentren der Fall sein wird, da die Verwendung von Kontroll-Antigen die Erfordernisse für Reagenzien beim direkten Assay verdoppeln würden. 


 Zusammenfassung 
 



   Die Kombination eines einfachen Formats, hoher Empfindlichkeit und hoher Spezifizität bewirkt, dass der Konkurrenzassay ideal für die Screenung von Blutspenden und für diagnostische Verwendung geeignet ist. Zusätzlich kann er dort, wo Zentren einen direkten Assay für Anti-HTLV-III verwenden, besser sein, um die Serumreaktivität zu bestimmen für die Retestung im Konkurrenzassay, anstatt dass man die Seren den arbeitsaufwendigeren und weniger empfindlichen Western-Blotting-Tests unterwirft, die von der FDA in den Vereinigten Staaten empfohlen werden. 

Claims (18)

1. Verfahren für die Analyse einer biologischen Probe auf Antikörper für Retroviren, dadurch gekennzeichnet, dass man die biologische Probe in Kontakt mit (a) einem insolubilisierten Antigen, welches Retrovirus-Antigen, gebunden an Globulin, enthält, wobei das Globulin selbst an einen inerten festen Träger gebunden ist, und (b) einem Immunoglobulin, welches einen spezifischen Antikörper für die Retrovirus-Antigene enthält, und welches mit einem nichtradioaktiven Erkennungsmarkierungsmittel markiert ist, bringt, und die flüssige Phase von der festen Phase abtrennt und die Menge an Erkennungsmarkierungsmittel, die entweder mit der flüssigen oder der festen Phase assoziiert ist, bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Retrovirus humaner T-lymphotroper Retrovirus CBL-1 ist.

3.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Retrovirus humaner T-lymphotroper Retrovirus HTLV-III, humaner T-leukämischer Retrovirus HTLV-II oder humaner T-leukämischer Retrovirus HTLV-I ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe Serum oder Plasma von humanem Blut ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Retrovirus humaner T-lymphotroper Retrovirus CBL-1 oder humaner T-lymphotroper Retrovirus HTLV-III ist, und dass das Immunoglobulin, das mit dem Erkennungsmittel markiert ist, Immunoglobulin von einem menschlichen Patienten ist, der asymptomatisch mit Aids-Retrovirus infiziert ist, aber einen normalen Immunoglobulingehalt aufweist.

6.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungsmarkierungsmittel ein Enzymmarkierungsmittel ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Globulin, welches an den Träger gebunden ist, ein monoklonaler Antikörper ist, der Retrovirus-Antigen zu binden vermag.

8. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es (a) eine erste Komponente, welche ein insolubilisiertes Antigen ist, welches Retrovirus-Antigene, gebunden an Globulin, enthält, wobei das Globulin selbst an einen inerten festen Träger gebunden ist, und (b) eine zweite Komponente, welche ein Immunoglobulin ist, das einen spezifischen Antikörper für die Retrovirus-Antigene enthält, und welches mit einem nichtradioaktiven Erkennungsmarkierungsmittel markiert ist, umfasst.

9.

Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Retrovirus humaner T-lymphotroper Virus CBL-1 ist.

10. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Retrovirus humaner T-lymphotroper Virus HTLV-III, humaner T-leukämischer Virus HTLV-II oder humaner T-leukämischer Virus HTLV-I ist.

11. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Retrovirus humaner T-lymphotroper Retrovirus CBL-1 oder humaner T-lymphotroper Retrovirus HTLV-III ist und dass das Immunoglobulin von einem humanen Patienten stammt, der asymptomatisch mit dem Aids-Retrovirus infiziert ist, aber einen normalen Immunoglobulingehalt aufweist.

12. Kit nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungsmarkierungsmittel ein Enzymmarkierungsmittel ist.

13.

Kit nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das an den Träger gebundene Globulin ein monoklonaler Antikörper ist, welcher sich an das Retrovirus-Antigen zu binden vermag.

14. Humaner T-lymphotroper Retrovirus CBL-1, äthiologisch verwandt zu AIDS, hinterlegt in CCRF-CEM-Zellen bei NCACC unter der Nr. 85 011 101, zur Verwendung im Verfahren nach Anspruch 2.

15. Leukämische T-Zellen CCRF-CEM, welche humanen T-lymphotropen Retrovirus CBL-1 nach Anspruch 14 beherbergen.

16. Insolubilisierte humane T-lymphotrope Retrovirus-CBL-1-Antigene, gebunden an Globulin, wobei das Globulin selbst an einen inerten festen Träger gebunden ist, wobei die CBL-1-Antigene in CCRF-CEM-Zellen bei NCACC unter der Nr. 85 011 101 hinterlegt sind, als Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2.

17.

Insolubilisierte Antigene nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Globulin Globulin eines humanen Patienten, der asymptomatisch mit AIDS-Retrovirus infiziert ist, aber einen normalen Immunoglobulingehalt aufweist, ist.

18. Insolubilisierte Antigene nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Globulin ein monoklonaler Antikörper ist, der Retrovirus-Antigen zu binden vermag.