DE69632535T2

DE69632535T2 - Peptide zur detektion von hiv-1

Info

Publication number: DE69632535T2
Application number: DE69632535T
Authority: DE
Inventors: P. Dominique BRIDON; S.-Y. Isaac SZE; J. David DAGHFAL; D. Keeve JAFFE; L. Tracey COLPITTS
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: DE69632535D1; EP0832113A2; WO1996040763A2; JPH11507635A; WO1996040763A3; JP3889045B2; EP0832113B1; CA2222994A1; ES2220982T3; US5800983A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Peptide, die zur Detektion von HIV-1-Antikörpern nützlich sind, und insbesondere auf die Detektion von HIV-1-Subtyp-O Antikörpern durch Verwendung einer Aminosäuresequenz der HIV-1 gp41-immunodominanten Region (IDR), welche zwei Punktmutationen enthält, eine an Position 604 und eine an Position 610 der HIV-1-Subtyp B gp160-Sequenz (die Numerierung entspricht dem HIV-1-Stamm LAI, veröffentlicht in Myers et al., infra).
Derzeit gibt es sechs anerkannte Subtypen (sogenannte "Stämme" ("clades")) von HIV-1, welche mit A, B, C, D, E und F bezeichnet werden, wie in Myers et al. beschrieben, Human Retroviruses and AIDS, 1993: A compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM) (1993).
J. Lauwagie et al. offenbaren in "Genetic diversity of the envelope glycoprotein from human immunodeficiency virus type I isolates of African origin", Journal of Virology, Januar 1995, Bd. 69, S. 263–271 die genetische Vielfalt der humanen Immunodefekt Virus Typ I-Isolate, einschließlich HIV-1 Subtyp B und Subtyp O.
Kürzlich wurden zusätzliche Subtypen G und H beschrieben. Vgl. zum Beispiel Janssens et al. AIDS Research and Human Retroviruses 10: 877 (1994); und Myers et al., supra. Von zunehmend besonderer Bedeutung ist die Entdeckung einer ausgesprochen divergierenden Gruppe von HIV-1-Sequenzen, welche als "O" bezeichnet werden. Der HIV-1-Subtyp O wurde 1987 erstmals beschrieben und mit "O" bezeichnet, was für "Outlier" steht, da herausgefunden wurde, daß er nur etwa 50% Sequenzidentität auf der Nucleinsäureebene des env-Gens mit den anderen Subtypen von HIV-1 besitzt. Diese anderen, oben genannten Subtypen besitzen etwa 75% Sequenzidentität auf Nucleinsäurebene des env-Gens zueinander. Die frühesten Berichte über die Sequenz von Viren des O-Typs legten nahe, daß auf dem phylogenetischen Stammbaum SIVCPZGAB näher benachbart zu den anderen HIV-1-Gruppen liegt, als die Gruppe O; d. h., daß dieser Schimpansenvirus zwischen der Gruppe M und Gruppe O liegt. Siehe zum Beispiel Gürtler et al., J. Virology, 68: 1581–1585 (1994); Vanden Haesevelde et al., J. Virology, 68: 1586–1596 (1994); De Leys et al., J. Virology, 64: 1207–1216 (1990); De Leys et al., U.S. Patent Nr. 5,304,466; Gürtler et al., Europäische Patentveröffentlichung Nr. 0591914 A2. Die Sequenzen der Gruppe O sind die bis dato am meisten divergierenden der beschriebenen HIV-1-Sequenzen, während Subtyp B der am häufigsten vorkommende Subtyp von HIV-1 ist.
Die HIV-Serologie ist größtenteils mittels der Aminosäuresequenzen der exprimierten viralen Proteine (Antigene) charakterisiert worden, insbesondere derjenigen, welche den Kern und die Hülle umfassen. Antigene, welche sich strukturell und funktional ähneln, jedoch unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen, bedingen Antikörper, welche sich ähnlich sein können, jedoch in ihrer Spezifität für das Antigen nicht identisch sind. Ein Beispiel ist der antigene Unterschied zwischen HIV-1 und HIV-2 gp41 IDR, welcher auf vielfältige Weise ausgenutzt werden kann, um serologisch zwischen einzelnen Individuen zu unterscheiden, die HIV-1 und/oder HIV-2 ausgesetzt sind. Vgl. zum Beispiel Hunt et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 6: 883898 (1990); Gnaan et al., Science, 237: 1346–1349 (1987); Cot et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 4: 239–241 (1988); Hunt et al., US-Patent _______ (4656.US.CI) und die WO 90/07119, die synthetische HIV-ähnliche Polypeptide offenbart, welche auf der immunodominanten Region von gp41 des HIV-1 basieren. Auf ähnliche Art und Weise sind HIV-1-Viren der Gruppe O aufgrund der Antigenität und serologisch von anderen HIV-1-Subtypen unterscheidbar. Loussert-Ajaka et al., The Lancet, 343: 1393–1394 (1994); Gürtler et al., J. Virology, 68: 1581–1585 (1994); Vanden Haesevelde et al., J. Virology, 68: 1586–1596 (1994); De Leys et al., J. Virology, 64 (supra.); U.S. Patent 5,304,466; Gürtler et al., EPA Veröffentlichung 0591914 A2.
Die Fähigkeit, HIV-1 Subtyp O zu detektieren, hat sich als zunehmend wichtig auf dem Gebiet der Blutbanken erwiesen. In einer Untersuchung wurde festgestellt, daß kommerziell erhältliche Assays, welche zur Detektion von HIV-1 Subtyp B geeignet sind, nicht fähig waren, eine Gruppe von 9 HIV-1 Subtyp O positiven Proben zu detektieren (L. Loussert-Ajaka et al., The Lancet, 343: 1393–1394 (1994).
Darüber hinaus beschreiben die EP 0 591 914 und EP 673 948 Peptidantigene aus MVP-5180/91 (HIV-1 Subtyp O) und ihre Verwendung bei der Detektion von Anti-HIV-Antikörpern.
Obwohl die Zahl der tatsächlich bestätigten Fälle von Infektion durch HIV-1 Subtyp O in ihrer Anzahl und geografisch begrenzt ist, bestehen Hinweise, daß dieser Subtyp sich ausgehend von Kamerun, dem Ausgangsort des Virus, auf benachbarte Länder ausbreitet, wie beispielsweise Äquatorialguinea.
Es wäre von Vorteil, ein Reagens bereit zu stellen, das in einem Assay zur Detektion der Anwesenheit von HIV-1 Subtyp O-Antikörpern in einer Testprobe verwendet werden könnte.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid mit einer Punktmutation in der HIV-1 Subtyp B IDR an Position 604 bereit. Genauer ist der Polypeptidpunkt an Position 604 ein Lysin (K). Das Polypeptid wird mittels SEQUENZ I. D. Nr. 2 gekennzeichnet. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Polypeptid mit einer Punktmutation in der HIV-1 Subtyp B IDR an Position 610 bereit. Genauer ist der Polypeptidpunkt an Position 610 ein Tyrosin (Y). Das Polypeptid wird mittels SEQUENZ I. D. Nr. 3 gekennzeichnet. Weiterhin wird ein Polypeptid mit zwei einzelnen Punktmutationen in der HIV-1 Subtyp B IDR an den Positionen 604 und 610 bereitgestellt. Die genannte Punktmutation an Position 604 ist ein Lysin (K), und die Punktmutation an Position 610 ist ein Tyrosin (Y). Das Polypeptid wird mittels SEQUENZ I. D. Nr. 4 gekennzeichnet. Weiterhin werden die Polypeptide SEQUENZ I. D. Nr. 2, SEQUENZ I. D. Nr. 3 und SEQUENZ I. D. Nr. 4 bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Immunoassay zum Detektieren der Anwesenheit von HIV-Antikörpern bereit durch Inkontaktbringen der Testprobe mit einer festen Phase, an die ein HIV-1-Polypeptid, mit einer Punktmutation zwischen den Positionen 593 und 611, geknüpft ist und Inkubieren über einen Zeitraum hinweg bei Bedingungen, welche die Bildung von Polypeptid/Antikörper-Komplexen erlauben; Inkontaktbringen der Polypeptid/Antikörper-Komplexe mit einem Indikatorreagens, umfassend einen Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars eines HIV-Antikörpers, der an eine signalerzeugende Verbindung geknüpft ist, die in der Lage ist, ein meßbares Signal zu generieren, und Inkubieren über einen Zeitraum hinweg und bei Bedingungen, welche die Bildung von Polypeptid/Antikörper/Indikatorreagens-Komplexen erlauben; Bestimmen der Anwesenheit von HIV-Antikörpern mittels Detektieren des meßbaren Signals. Die Punktmutation liegt an Position 604 oder Position 610 vor. Oder die Punktmutationen können an den Positionen 604 und 610 vorliegen. Die feste Phase ist gewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Wandungen von Reaktionsmulden, Probenröhrchen, Polystyrolkügelchen, magnetischen Kügelchen, Nitrocellulosestreifen, Membranen, Mikroteilchen, wie beispielsweise Latexteilchen, roten Blutkörperchen und Durazyten eines Schafes (oder eines anderen Tieres). Die signalerzeugende Verbindung des Indikatorreagens ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus Chromogenen, Enzymen, lumineszenten Verbindungen, chemolumineszenten Verbindungen, radioaktiven Elementen und direkt sichtbaren Markierungen. Der spezifische Bindungspaarbestandteil des Indikatorreagens ist vorzugsweise antihumanes IgG.
Die vorliegende Erfindung stellt einen verbesserten Immunoassay zum Detektieren von HIV-Antikörpern in einer Testprobe bereit, umfassend das Inkontaktbringen der Testprobe mit einem HIV-1-Polypeptid und Detektieren der Anwesenheit des Antikörpers, worin die Verbesserung die Verwendung oder Anwendung eines Polypeptids umfaßt, welches eine Punktmutation zwischen den Positionen 593 und 611 der HIV-1 gp160-Sequenz besitzt.
Weiterhin ist ein diagnostisches Testkit vorgesehen, welches in der Lage ist, HIV-Antikörper zu detektieren, worin das Testkit einen Behälter umfaßt, enthaltend ein Polypeptid mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ I. D. Nr. 2, SEQUENZ I. D. Nr. 3 und SEQUENZ I. D. Nr. 4.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die relativen Reaktivitäten durch ELISA der SEQUENZ I. D. Nr. 1 (
), SEQUENZ I. D. Nr. 2 (
), SEQUENZ I. D. Nr. 3 (
) und SEQUENZ I. D. Nr. 4 (
) für Probe #193.
2 zeigt die relativen Reaktivitäten durch ELISA der SEQUENZ I. D. Nr. 1 (
), SEQUENZ I. D. Nr. 2 (
), SEQUENZ I. D. Nr. 3 (
) und SEQUENZ I. D. Nr. 4 (
) für Probe #267.
3 zeigt die relativen Reaktivitäten durch ELISA der SEQUENZ I. D. Nr. 1 (
), SEQUENZ I. D. Nr. 2 (
), SEQUENZ I. D. Nr. 3 (
) und SEQUENZ I. D. Nr. 4 (
) für Probe #341.
4 zeigt die relativen Reaktivitäten durch ELISA der SEQUENZ I. D, Nr. 1 (
), SEQUENZ I. D. Nr. 2 (
), SEQUENZ I. D. Nr. 3 (
) und SEQUENZ I. D. Nr. 4 (
) für Probe #655.
5 zeigt die relativen Reaktivitäten durch ELISA der SEQUENZ I. D, Nr. 2 (
) und SEQUENZ I. D. Nr. 3 (
) für Probe M.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wir haben zwei Aminosäurepositionen in der gp41-immunodominanten Region (IDR) von HIV-1 Subtyp B identifiziert, an denen spezifische Aminosäuresubstitutionen kritisch für die Detektion der Anwesenheit von HIV-1 Subtyp O sind. Wir entwickelten und synthetisierten Hybridpeptide, welche mindestens eine dieser beiden Restemodifikationen in eine Peptidsequenz mit HIV-1 Subtyp B-Charakteristika einbrachten.
Diese Hybridpeptide sind fähig zur Reaktion mit Anti-HIV-1 Subtyp O-Antikörpern, welche in einer Reihe von bestätigten HIV-1 Subtyp O-Testproben vorliegen, wobei einige der Proben nicht reaktiv waren, wenn die unmodifizierte Subtyp B-Sequenz (SEQUENZ I. D. Nr. 1) verwendet wurde. Diese Peptide werden in der Sequenzauflistung als SEQUENZ I. D. Nr. 2, SEQUENZ I. D. Nr. 3 und SEQUENZ I. D. Nr. 4 gezeigt. Diese Sequenzen besitzen Punktmutationen entweder an einer oder an beiden Positionen 604 und 610 (Numerierung entsprechend dem Stamm LAI, supra.) einer 19 Aminosäuresequenz des HIV-1 Subtyps B gp41.
Die folgenden Begriffe besitzen die folgenden Bedeutungen, soweit nicht anders angegeben:
Der Begriff "Testprobe" bezieht sich auf einen Bestandteil des Körpers eines Individuums, der die Quelle des Analyten darstellt (wie beispielsweise interessierende Antikörper und Antigene). Diese Bestandteile sind im Stand der Technik wohl bekannt. Die Testproben schließen biologische Proben ein, welche durch die hierin beschriebenen Verfahren getestet werden können, und umfassen menschliche und tierische Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Gesamtblut, Serum, Plasma, cerebrospinale Flüssigkeit, Urin, Lymphflüssigkeit und vielfältige äußerliche Sekretionen des Respirations-, Intestinal- oder Genitalurinaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, weiße Blutzellen, Myelome und dergleichen; und biologische Flüssigkeiten, wie beispielsweise Zellkulturüberstände; fixierte Gewebepräparate; und fixierte Zellpräparate.
"Analyt", wie hierin verwendet, ist die Substanz, die in der Testprobe vorliegen kann und detektiert werden soll. Der Analyt kann jedwede Substanz sein, für die ein natürlich vorkommendes spezifisches Bindungsglied (wie beispielsweise ein Antikörper) existiert oder für die ein spezifisches Bindungsglied hergestellt werden kann. Somit ist ein Analyt eine Substanz, welche an einen oder mehrere spezifische Bindungsglieder in einem Assay binden kann. "Analyt" schließt weiterhin jedwede antigene Substanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen daraus ein. Als ein Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars kann der Analyt durch natürlich vorkommende spezifische Bindungspartner (Paare) detektiert werden, wie zum Beispiel die Verwendung von intrinsic-factor-Protein als Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars für die Bestimmung von Vitamin B₁₂, die Verwendung von Folat-Bindeprotein, um Folsäure zu bestimmen, oder die Verwendung eines Lectins als Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars zur Bestimmung eines Kohlenhydrats. Der Analyt kann ein Protein, ein Peptid, eine Aminosäure, ein Nucleotidziel und ähnliches einschließen.
Die vorliegende Erfindung sieht Assays vor, welche spezifische Bindungsglieder verwenden. Ein "spezifisches Bindungsglied", wie hierin verwendet wird, ist ein Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars. Dies bedeutet zwei unterschiedliche Moleküle, wobei eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Dementsprechend können zusätzlich zu Antigen- und Antikörper-spezifischen Bindungspaaren herkömmlicher Immunoassays andere spezifische Bindungspaare Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nucleotidsequenzen, Effektor- und Rezeptormoleküle, Co-Faktoren und Enzyme, Enzyminhibitoren und Enzyme und ähnliches einschließen. Darüber hinaus können spezifische Bindungspaare Bestandteile einschließen, die Analoga der ursprünglichen spezifischen Bindungsglieder sind, zum Beispiel ein Analytanalogon. Immunoreaktive spezifische Bindung von Folat-bindendem Protein zur Bestimmung von Folsäure oder die Verwendung eines Lectins als Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars zur Bestimmung eines Kohlenhydrats. Der spezifische Bindungspaarbestandteil kann ein Protein einschließen, ein Peptid, eine Aminosäure, ein Ziel-Nucleotid und ähnliches. Darüber hinaus können spezifische Bindungspaare Bestandteile einschließen, die Analoga der ursprünglichen spezifischen Bindungsglieder sind, zum Beispiel ein Analytanalogon. Immunoreaktive spezifische Bindungsglieder schließen Antigene, Antigenfragmente, Antikörper und Antikörperfragmente, sowohl monoklonal als auch polyklonal, und Komplexe daraus ein, einschließlich diejenigen, welche durch rekombinante DNA-Moleküle gebildet werden. Der Begriff "Hapten", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein partielles Antigen oder ein Nichtprotein-Bindungsglied, der zur Bindung an einen Antikörper fähig ist, der jedoch nicht in der Lage ist, die Bildung von Antikörpern auszulösen, es sei denn, er ist an ein Trägerprotein geknüpft.
Das "Indikatorreagens" umfaßt eine "signalerzeugende Verbindung" (Markierung), die mit einem spezifischen Bindungsglied für HIV konjugiert (verknüpft) ist, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals fähig ist und ein solches erzeugt, das mittels externer Mittel detektierbar ist. "Spezifisches Bindungsglied", wie hierin verwendet, bedeutet ein Glied (einen Bestandteil) eines spezifischen Bindungspaars. Dies bedeutet zwei unterschiedliche Moleküle, worin eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Zusätzlich dazu, daß es an einen Antikörperbestandteil eines spezifischen Bindungspaars für HIV bindet, kann das Indikatorreagens weiterhin ein Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars sein, einschließlich entweder Hapten-Antihapten-Systeme, wie beispielsweise Biotin oder Antibiotin, Avidin oder Biotin, ein Kohlenhydrat oder ein Lectin, eine komplementäre Nucleotidsequenz, ein Effektor- oder Rezeptormolekül, ein Enzym-Cofaktor und ein Enzym, ein Enzyminhibitor oder ein Enzym, und ähnliches. Ein immunoreaktives spezifisches Bindungsglied kann ein Antikörper, ein Antigen oder ein Antikörper/Antigen-Komplex sein, der fähig ist zur Bindung an HIV, wie bei einem Sandwich-Assay, an das Einfangreagens, wie bei einem kompetitiven Assay, oder an das zusätzliche spezifische Bindungsglied, wie bei einem indirekten Assay.
Die vielfältigen betrachteten "signalerzeugenden Verbindungen" (Markierungen) schließen Chromogene, Katalysatoren, wie beispielsweise Enzyme, lumineszente Verbindungen, wie beispielsweise Fluorescein und Rhodamin, chemolumineszente Verbindungen, wie beispielsweise Dioxetane, Acridine, Phenanthridine und Luminol, radioaktive Elemente und direkt sichtbare Markierungen ein. Beispiele für Enzyme schließen alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, beta-Galactosidase und ähnliche ein. Die Auswahl einer spezifischen Markierung ist nicht kritisch, diese sollte jedoch fähig sein, entweder ein Signal selbst oder in Verbindung mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen zu erzeugen.
"Feste Phasen" ("feste Träger") sind dem Fachmann bekannt und schließen die Wandungen von Reaktionsmulden, Teströhrchen, Polystyrolkügelchen, magnetische Kügelchen, Nitrocellulosestreifen, Membranen, Mikroteilchen, wie beispielsweise Latexteilchen, rote Blutzellen, Durazyten des Schafes (oder eines anderen Tieres) und andere ein. Die "feste Phase" ist nicht kritisch und kann durch den Fachmann ausgewählt werden. Somit sind Latexteilchen, Mikroteilchen, magnetische oder nichtmagnetische Kügelchen, Membranen, Plastikröhrchen, Wandungen von Mikrotitervertiefungen, Glas- oder Siliconchips, rote Blutzellen und Durazyten des Schafes (oder eines geeigneten Tieres) allesamt geeignete Beispiele. Geeignete Verfahren zur Immobilisierung von Peptiden auf festen Phasen schließen ionische, hydrophobe, kovalente Wechselwirkungen und dergleichen ein. Eine "feste Phase", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliches Material, das unlöslich ist oder mittels einer nachfolgenden Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Die feste Phase kann aufgrund ihrer intrinsischen Fähigkeit, das Einfangmittel anzuziehen und zu immobilisieren ausgewählt werden. Alternativ dazu kann die feste Phase einen zusätzlichen Rezeptor enthalten, der die Fähigkeit besitzt, das Einfangmittel anzuziehen und zu immobilisieren. Der zusätzliche Rezeptor kann eine geladene Substanz einschließen, die in Bezug auf das Einfangmittel selbst oder in Bezug auf eine geladene Substanz, die mit dem Einfangmittel konjugiert ist entgegengesetzt geladen ist. Als weitere Alternative kann das Rezeptormolekül ein jegliches spezifisches Bindungsglied sein, der an die feste Phase immobilisiert (geknüpft) ist und der die Fähigkeit besitzt, das Einfangmittel mittels einer spezifischen Bindungsreaktion zu immobilisieren. Das Rezeptormolekül erlaubt die indirekte Bindung des Einfangmittels an ein Festphasenmaterial vor der Durchführung des Assays oder während der Durchführung des Assays. Die feste Phase kann somit ein Kunststoff sein, ein Kunststoffderivat, magnetisches oder nichtmagnetisches Metall, Glas oder die Siliconoberfläche eines Teströhrchens, eine Mikrotitermulde, Blatt, Kügelchen, Mikroteilchen, Chip, rote Blutzellen des Schafes (oder eines anderen geeigneten Tieres), Durazyten sein sowie andere Konfigurationen, die einem mit durchschnittlichem Fachwissen bekannt sind.
Es wird in Betracht gezogen und liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung, daß die feste Phase weiterhin jegliches geeignete poröse Material mit ausreichender Porosität umfassen kann, um den Zugang von Detektionsantikörpern zuzulassen, und einer ausreichenden Oberflächenaffinität, um Antigene zu binden. Mikroporöse Strukturen sind im allgemeinen bevorzugt, jedoch können auch Materialien mit Gelstruktur in ihrem hydratisierten Zustand verwendet werden. Diese Materialien können in geeigneten Ausformungen verwendet werden, wie beispielsweise als Filme, Blätter oder Platten, oder sie können auf geeignete inerte Träger geklebt oder laminiert sein, wie beispielsweise Papier, Glas, Plastikfolien oder Gewebe.
Andere Ausführungsformen, die vielfältige andere feste Phasen verwenden, werden auch in Betracht gezogen und liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Zum Beispiel können Ioneneinfangverfahren zur Immobilisierung eines immobilisierbaren Reaktionskomplexes mit einem negativ geladenen Polymer gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beschrieben in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 150,278, korrespondierend zur EP Veröffentlichung 0326100 und der US-Patentanmeldung Nr. 375,029 (EP-Veröffentlichung Nr. 0406473), um eine schnelle immunochemische Reaktion in der Lösungsphase zu bewirken. Ein immobilisierbarer Immunkomplex wird vom Rest der Reaktionsmischung mittels ionischer Wechselwirkungen zwischen dem negativ geladenen Polyanion/Immunkomplex und der zuvor behandelten, positiv geladenen porösen Matrix getrennt und mittels Verwendung vielfältiger zuvor beschriebener signalerzeugender Systeme detektiert, eingeschlossen die, in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 921,979, korrespondierend zur EP-Veröffentlichung Nr. 0 273,115, bei chemolumineszenten Signalmessungen beschriebenen.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verfahren für die Verwendung in Systemen angepasst werden, welche die Mikroteilchentechnologie verwenden, eingeschlossen automatisierte und semiautomatisierte Systeme, worin die feste Phase ein Mikroteilchen/einen Mikropartikel umfaßt (magnetisch oder nichtmagnetisch). Solche Systeme schließen die in den anhängigen US-Patentanmeldungen 425,651 und 425,643 beschriebenen ein, welche jeweils den veröffentlichten EP-Anmeldungen EP 0 425 633 und EP 0 424 634 entsprechen.
Die Verwendung der Probenraster-Mikroskopie (Scanning-Probe-Microscopy SPM) für Immunoassays ist weiterhin eine Technologie, auf die die erfindungsgemäßen Peptide leicht anwendbar sind. Bei der Probenraster-Mikroskopie, insbesondere bei der Atomkraftmikroskopie (atomic force microscopy), ist die Einfangphase, beispielsweise mindestens eins der hierin offenbarten Peptide, mit einer festen Phase verbunden, eine Testprobe, von der angenommen wird, daß sie den interessierenden Antikörper enthält, wird mit der festen Phase in Kontakt gebracht, und ein Probenraster-Mikroskop wird verwendet, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu detektieren, welche möglicherweise auf der Oberfläche der festen Phase vorliegen können. Die Verwendung der Tunnelrastermikroskopie umgeht den Bedarf für Markierungen, welche üblicherweise bei vielen Immunoassay-Systemen verwendet werden müssen, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu detektieren. Solch ein System wird in der anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 662,147 beschrieben. Die Verwendung der SPM, um spezifische Bindungsreaktionen zu beobachten, kann auf vielen Wegen erfolgen. Eine Möglichkeit ist, einen Bestandteil eines spezifischen Bindungspartners (Analyt-spezifische Substanz, die ein hierin offenbartes Peptid ist) an eine für das Scannen geeignete Oberfläche zu knüpfen. Die Verknüpfung der spezifischen Analytsubstanz kann mittels Adsorption an ein Test-Stück erfolgen, welches eine feste Phase einer Kunststoff- oder Metalloberfläche umfaßt, gemäß Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Oder mittels kovalenter Verknüpfung eines spezifischen Bindungspartners (Analyt-spezifische Substanz) an ein Test-Stück, wobei dieses Test-Stück eine feste Phase aus derivatisiertem Kunststoff, Metall, Silicon oder Glas umfaßt. Kovalente Verknüpfungsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Weiterhin können Polyelektrolytwechselwirkungen angewendet werden, um einen spezifischen Bindungspartner auf einer Oberfläche eines Test-Stücks zu immobilisieren, mittels Techniken und Chemikalien, wie in den anhängigen US-Patentanmeldungen Nr. 150,278, eingereicht am 29. Januar 1988, Nr. 375,029, eingereicht am 7. Juli 1989 beschrieben. Nach dem Verknüpfen eines spezifischen Bindungsglieds kann die Oberfläche weiter mit Materialien, wie beispielsweise Serum, Proteinen oder anderen Blockierungsmitteln, behandelt werden, um eine nichtspezifische Bindung zu minimieren. Die Oberfläche kann weiterhin entweder am Ort der Herstellung oder zum Zeitpunkt der Verwendung gescannt werden, um ihre Eignung für Assayzwecke sicherzustellen. Es wird davon ausgegangen, daß das Scanningverfahren die spezifischen Bindungseigenschaften des Test-Stücks nicht verändert.
Es wird in Betracht gezogen, daß die für den Assay verwendeten Reaktionsmittel in Form eines Test-Kits bereitgestellt werden können, mit einem oder mehreren Behältern, wie beispielsweise Glasfläschchen oder Flaschen, wobei jeder Behälter ein einzelnes Reaktionsmittel enthält, wie beispielsweise ein Peptid oder eine Mischung aus Peptiden, oder ein Indikatorreagens, falls im Assay verwendet. Andere Bestandteile, wie beispielsweise Puffer, Kontrollen und ähnliches, die dem Fachmann bekannt sind, können in solche Testkits eingeschlossen werden.
Es können Assayformate entwickelt werden, welche die hierin beschriebenen Peptide als Antigene bei Immunoassays, Immunogene für die Antikörperproduktion und ähnliches verwenden. Bei einem Assayformat zur Detektion der Anwesenheit eines Antikörpers gegen einen spezifischen Analyt (zum Beispiel HIV-1) in einer humanen Testprobe wird die humane Testprobe mit einer festen Phase, welche mit mindestens einem wie hierin offenbarten HIV-Peptid beschichtet ist, in Kontakt gebracht und inkubiert. Falls für das Analyt spezifische Antikörper in der Testprobe vorliegen, werden diese einen Komplex mit dem Peptid bilden und an der festen Phase anhaften. Nach der Komplexbildung wird ungebundenes Material und Reaktionsmittel mittels Waschen der festen Phase entfernt. Diese Komplexe werden anschließend mit einem Indikatorreagens in Kontakt und zur Reaktion gebracht und über einen Zeitraum hinweg und bei Bedingungen inkubiert, so daß sich zweite Komplexe bilden. Die Anwesenheit von an das Peptid gebundenen Antikörpern in der Testprobe wird mittels Detektion des erzeugten Signals bestimmt. Ein Signal oberhalb eines Sperrwerts gibt einen Hinweis auf an den Analyt gebundene Antikörper, die in der Testprobe vorliegen. Bei vielen Indikatorreagenzien, wie beispielsweise Enzymen, ist die Menge an vorliegendem Antikörper proportional zum erzeugten Signal. Abhängig von der Art der Testprobe kann die Testprobe mit einem geeigneten Puffermittel verdünnt werden, konzentriert oder ohne weitere Manipulation mit der festen Phase in Kontakt gebracht werden ("rein"). Zum Beispiel ist es gewöhnlich von Vorzug, Serum- oder Plasmaproben einem Assay zu unterwerfen, welche zuvor verdünnt wurden, oder Proben, wie beispielsweise Urin, zu konzentrieren, um die Anwesenheit und/oder Menge der vorliegenden Antikörper zu bestimmen.
Zusätzlich dazu kann mehr als ein Peptid in dem zuvor beschriebenen Assayformat verwendet werden, um auf die Anwesenheit von Antikörper gegen ein spezifisches infektiöses Mittel zu testen, mittels Verwendung von Peptiden gegen vielzählige antigene Epitope des viralen Genoms des zu untersuchenden infektiösen Mittels. Somit kann es von Vorzug sein, Peptide zu verwenden, die Epitope innerhalb einer spezifischen viralen antigenen Region enthalten, sowie Epitope aus anderen antigenen Regionen des viralen Genoms, um Assays vorzusehen, die eine gesteigerte Empfindlichkeit besitzen und möglicherweise größere Spezifität als dies der Fall ist, wenn ein Peptid nur eines Epitops verwendet wird. Solch ein Assay kann als ein Bestätigungsassay verwendet werden. Bei diesem spezifischen Assayformat wird eine bekannte Menge einer Testpprobe mit einer bekannten Menge (Mengen) mindestens eines festen Trägers, beschichtet mit mindestens einem hierin offenbarten Peptid, über einen Zeitraum hinweg und bei Bedingungen in Kontakt gebracht, ausreichend zur Bildung von Peptid/Antikörper-Komplexen. Diese Komplexe werden anschließend mit einer bekannten Menge (Mengen) eines geeigneten Indikatorreagens (Reagenzien) über einen Zeitraum hinweg und bei Bedingungen in Kontakt gebracht, so daß eine Reaktion stattfindet. Ein Signal wird erzeugt und dieses resultierende Signal wird mit einer negativen Testprobe verglichen, um die Anwesenheit von Antikörpern gegen den Analyt in der Testprobe zu bestimmen. Es wird weiter in Betracht gezogen, daß bei der Verwendung bestimmter fester Phasen, wie beispielsweise Mikroteilchen, jedes bei dem Assay verwendete Peptid an ein anderes Mikroteilchen geknüpft sein kann, und eine Mischung dieser Mikroteilchen mittels Kombinieren der vielfältigen beschichteten Mikroteilchen hergestellt werden kann, die für jeden Assay optimiert werden kann.
Abwandlungen der oben beschriebenen Assayformate schließen den Einschluß mindestens eines der hierin offenbarten synthetischen Peptide sowie für unterschiedliche Analyte spezifische rekombinante Proteine oder synthetische Peptide ein, die an dieselben oder unterschiedliche feste Phasen geknüpft sind, zur Detektion der Anwesenheit von Antikörpern gegen jeden der Analyte (zum Beispiel ein hierin offenbartes synthetisches Peptid, spezifisch für bestimmte antigene Regionen von HIV-1, beschichtet auf dieselbe oder eine unterschiedliche feste Phase mit rekombinanten Proteinen, spezifisch für eine bestimmte antigene Region (Regionen) eines anderen infektiösen Mittels, um die Anwesenheit entweder des einen (oder beider) infektiöser Mittel zu detektieren).
In einem darüber hinaus weiteren Assayformat sind Peptide, welche antigene Epitope enthalten, geeignet für kompetitive Assays, wie zum Beispiel Neutralisationsassays. Um einen Neutralisationsassay durchzuführen, wird ein Peptid, welches ein Epitop einer antigenen Region von HIV-1 darstellt, solubilisiert und mit einem Probenverdünnungsmittel auf eine Endkonzentration von zwischen 0,5 bis 50,0 μg/ml vermischt. Eine bekannte Menge der Testprobe (zum Beispiel 10 μl), entweder verdünnt oder nicht verdünnt, wird zu einer Reaktionsmulde gegeben, gefolgt von beispielsweise 400 μl des Probenverdünnungsmittels, welches ein hierin offenbartes Peptid enthält. Falls gewünscht, kann die Mischung für ungefähr 15 Minuten bis 2 Stunden vorinkubiert werden. Anschließend wird eine mit dem hierin beschriebenen Peptid beschichtete feste Phase zu der Reaktionsmulde gegeben und eine Stunde lang bei ungefähr 40°C inkubiert. Nach dem Waschen wird eine bekannte Menge eines Indikatorreagens, beispielsweise 200 μl einer Peroxidase, welche mit anti-humanem IgG der Ziege markiert ist, in einem Konjugatverdünnungsmittel zugegeben und für etwa eine Stunde bei 40°C inkubiert. Nach dem Waschen wird ein Enzymsubstrat, falls ein Enzymkonjugat wie beschrieben verwendet wird, zu der Mischung zugegeben, zum Beispiel OPD-Substrat, und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 N Schwefelsäure zu der Reaktionsmulde abgestoppt. Die Absorbtion wird bei 492 nm gemessen. Testproben, welche Antikörper gegen das spezifische Peptid enthalten, erzeugen ein vermindertes Signal, bedingt durch die kompetitive Bindung des Peptids an diese Antikörper in Lösung. Der Prozentsatz der kompetitiven Bindung kann berechnet werden mittels Vergleich des Absorptionswerts der Probe in Anwesenheit des Peptids mit dem Absorptionswert der Probe, ermittelt in Abwesenheit eines Peptids bei gleicher Verdünnung. Somit ist die Differenz der erzeugten Signale der Probe in Anwesenheit des Peptids und der Testprobe in Abwesenheit des Peptids der Meßwert, der verwendet wird, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers zu bestimmen.
Bei einem anderen Assayformat können die erfindungsgemäßen Peptide in Immunodot-Blotassay-Systemen verwendet werden. Das Immunodot-Blotassay-System verwendet eine Reihe von gereinigten rekombinanten Polypeptiden oder synthetischen Peptiden, die sich in einem Array auf einem festen Nitrocelluloseträger befinden. Der vorbereitete feste Träger wird mit der Testprobe in Kontakt gebracht und fängt spezifische Antikörper (spezifische Bindungsglieder) gegen das rekombinante Protein und/oder die synthetischen Peptiden (andere spezifische Bindungsglieder), um spezifische Bindungsgliedpaare zu bilden. Die eingefangenen Antikörper werden mittels Reaktion mit einem Indkatorreagens detektiert. Vorzugsweise wird die konjugatspezifische Reaktion unter Verwendung eines Reflexionsoptikaufbaus innerhalb eines Geräts quantifiziert, welches in der US-Patentanmeldung Nr. 07/227,408, eingereicht am 02. August 1988 beschrieben wurde. Die verwandte US-Patentanmeldung Nr. 07/227,586 sowie 07/277.590 (beide eingereicht am 02. August 1988) beschriebben weiterhin spezifische Verfahren und ein Gerät, geeignet zur Durchführung eines Immunodotierungsblotassays, sowie das US-Patent Nr. 5,075,077 (US-Serien-Nr. 07/227,272, eingereicht am 02. August 1988), welches den gleichen Eigentümer hat und hierin mittels Bezugnahme mit einbezogen ist. Kurz gesagt, wird eine auf Nitrocellulose basierende Testkartusche mit mehreren antigenen Peptiden behandelt. Jedes Peptid befindet sich in einer spezifischen Reaktionszone auf der Testkartusche. Nachdem sämtliche antigenen Polypeptide auf die Nitrocellulose verbracht wurden, werden überschüssige Bindungsstellen auf der Nitrocellulose blockiert. Die Testkartusche wird anschließend mit der Testprobe in Kontakt gebracht, so daß jedes antigene Peptid in jeder Reaktionszone mit der Testprobe, welche die geeigneten Antikörper enthält, reagieren wird. Nach der Reaktion wird die Testkartusche gewaschen und jegliche Antigen/Antikörper-Reaktionen mittels geeigneter bekannter Reaktionsmittel identifiziert. Wie in den hierin aufgeführten Patenten und Patentanmeldungen beschrieben, ist das gesamte Verfahren für die Automation geeignet. Die Anmeldungsbeschreibungen, die sich auf das Verfahren und die Gerätschaft zur Durchführung eines Immunoblockierungs-Blotassays beziehen, sind hierin mittels Bezugnahme miteinbezogen.
Hierin offenbarte Peptide können wie folgt zur Detektion von Antikörpern gegen ein spezifisches Antigen eines Analyten in einer Testprobe in Assays verwendet werden, welche einen ersten und einen zweiten festen Träger verwenden. Bei diesem Assayformat wird ein erstes Aliquot einer Testprobe mit einem ersten festen Träger, welcher mit einem ersten Peptid, spezifisch für ein Analyt beschichtet ist, über einen Zeitraum hinweg und bei Bedingungen in Kontakt gebracht, die ausreichen, die Bildung von Peptid/Analyt-Antikörperkomplexen zu erlauben. Anschließend werden diese Komplexe mit einem Indikatorreagens, welches spezifisch für das Peptid ist, in Kontakt gebracht. Das durch das Indikatorreagens erzeugte Signal, falls vorhanden, wird detektiert, um die Anwesenheit eines Antikörpers gegen das in der Testprobe vorliegende Peptid zu bestimmen. Nachfolgend wird die Anwesenheit eines anderen antigenen Determinanten desselben Analyts mittels Inkontaktbringen eines zweiten Aliquots einer Testprobe mit einem zweiten festen Träger bestimmt, welcher mit einem synthetischen Peptid oder einem rekombinanten Protein für den zweiten Antikörper beschichtet ist, über einen Zeitraum hinweg und bei Bedingungen, welche ausreichen, um die Bildung von rekombinantem Protein oder synthetischem Peptid/zweiten Antikörperkomplexen zu erlauben. Die Komplexe werden mit einem zweiten Indikatorreagens in Kontakt gebracht, welches spezifisch für den Antikörper des Komplexes ist. Das durch das Indikatorreagens erzeugte Signal wird detektiert, um die Anwesenheit eines Antikörpers in der Testprobe zu bestimmen, wobei die Anwesenheit eines Antikörpers gegen entweder einen Analyt, oder beide, die Anwesenheit von Antianalyt in der Testprobe anzeigt. Es wird auch in Betracht gezogen, daß die festen Träger simultan getestet werden können.
Es können Haptene verwendet werden, um das erzeugte Signal zu verstärken und somit die Empfindlichkeit des Assays zu verbessern. Die Verwendung von Haptenen ist im Stand der Technik bekannt. Es ist in der Betrachtung miteingeschlossen, daß Haptene auch bei Assays verwendet werden können, die hierin offenbarte Peptide verwenden, um die Leistung des Assays zu verbessern.
Ein anderes Assayverfahren zur Detektion von Antikörpern in einer Testprobe gemäß der vorliegenden Erfindung schließt Verfahren der Durchflußzytometrie sowie Teilchenzählungsverfahren ein. Zum Beispiel werden Analyte, welche Antikörperbestandteile eines spezifischen Bindungspaares sind, bei der Teilchenzählung durch Mischen eines Aliquots der Testprobe, von der angenommen wird, daß sie einen spezifischen Antikörper enthält, mit Mikropartikeln, welche mit einem Einfangreagens das spezifisch für solch einen Antikörper ist beschichtet sind, wie beispielsweise mindestens ein hierin offenbartes Peptid, welches zur Bindung an den betrachteten Antikörper als den anderen Bestandteil des spezifischen Bindungspaares geeignet ist, quantifiziert. Falls der Antikörper in der Testprobe vorliegt, wird dieser an einige mit dem Einfangreagens beschichteten Mikropartikeln binden und es werden sich Agglutinate bilden. Die Analytkonzentration ist invers proportional zur gezählten Zahl der nicht agglutinierten Teilchen. Vergleiche zum Beispiel Rose et al., Hrgb., Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3. Auflage, Kapitel 8, Seiten 43–48, American Society of Microbiology, Washington, D. C. (1986).
Durchfußzytometrische Verfahren, welche elektronische und optische Signale von beleuchteten Zellen und Teilchen erfassen, erlauben die Bestimmung von Zelloberflächencharakteristika, dem Zellvolumen und der Zellgröße. Antikörper, welche beispielsweise in einer Testprobe vorliegen, werden an ein hierin offenbartes Peptid gebunden und mittels eines fluoreszenten Farbstoffs detektiert, welcher entweder direkt mit dem Peptid konjugiert ist, oder über eine zweite Reaktion zugegeben wird. Unterschiedliche Farbstoffe, welche bei unterschiedlichen Wellenlängen anregbar sind, können entweder mit einem oder mehreren, für unterschiedliche Analyte spezifischen Peptiden verwendet werden, so daß mehr als ein Analyt aus einer Probe detektiert werden kann. Bei der Fluoreszenz-Flußzytometrie wird eine Suspension von Teilchen, typischerweise Zellen in einer Testprobe, durch eine Flußzelle transportiert, in der die einzelnen Teilchen der Probe mit einem oder mehreren fokussierten Lichtstrahlen zum Leuchten angeregt werden. Ein oder mehrere Detektoren bestimmen die Wechselwirkung zwischen den Lichtstrahlen und den markierten Teilchen, die durch die Flußzelle fließen. Üblicherweise sind einige der Detektoren so ausgelegt, daß sie Fluoreszenzemissionen messen, während andere Detektoren die Streuungsintensität oder Pulsdauer messen. Somit kann jedes Teilchen, das durch die Flußzelle wandert, in einen Eigenschaftsraum kartiert werden, dessen Achsen die Emissionsfarben, Lichtintensitäten oder andere Eigenschaften darstellen, d. h. Streuung, wie gemessen durch die Detektoren. In einem Fall kartieren die unterschiedlichen Teilchen der Probe in getrennte und sich nicht überlappende Regionen des Eigenschaftsraums wodurch es möglich wird, jedes Teilchen basierend auf seiner Kartierung in dem Eigenschaftsraum zu analysieren. Um die Testprobe für die Flußzytometrieanalyse vorzubereiten, pipettiert der Bediener manuell ein Volumen der Testprobe aus dem Probenröhrchen in ein Analyseröhrchen. Es wird ein Volumen des gewünschten Fluorochrom-markierten Peptids zugegeben. Die Probe/Peptidmischung wird anschließend über einen Zeitraum und bei Bedingungen inkubiert, die ausreichen, um die Bindung von Antikörper/Peptid zu erlauben. Nach Inkubation, und falls notwendig, fügt der Bediener ein Volumen RNS-Lysemittel zu, um jegliche RBCs in der Probe zu zerstören. Nach der Lyse wird die Probe zentrifugiert und gewaschen, um überschüssige Verunreinigungen aus dem Lyseschritt zu entfernen. Der Zentrifugations/Waschschritt kann mehrmals wiederholt werden. Die Probe wird in einem Volumen eines Fixierungsmittels resuspendiert und die Probe anschließend durch das Fluoreszenzflußzytometrie-Gerät geleitet. Ein Verfahren und ein Gerät zur Durchführung der automatisierten Fluß-Analyse wird in der in Miteigentum befindlichen US-Patentanmeldung Nr. 08/283,379 beschrieben, welche hierin mittels Bezugnahme miteinbezogen ist. Es liegt innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, daß in den hierin beschriebenen Verfahren, dass markierte oder gelabelte Mikrokügelchen für in vitro-diagnostische Anwendungen verwendet und eingesetzt werden können. Es liegt weiterhin innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, daß andere Zellen oder Teilchen, eingeschlossen Bakterien, Viren, Durozyten usw. mit den PNAs oder einer Morpholinoverbindung, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, markiert oder gelabelt und bei flußzytometrischen Verfahren verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung wird nun mittels Beispielen beschrieben werden, welche der Veranschaulichung dienen, jedoch nicht den Geist und den Umfang der Erfindung einschränken sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1, Synthese von Peptiden
Alle Peptide wurden auf einem ABI-Peptidsynthesizer, Modell 431A, unter Verwendung von FMOC-Chemie, Standardzyklen und DCC-HOBt-Aktivierung synthetisiert. Spaltungs- und Deprotektionsbedingungen sind wie folgt: das Harz wurde zu 20 ml Trifluoressigsäure, 0,3 ml Wasser, 0,2 ml Ethandithiol, 0,2 ml Thioanisol und 100 mg Phenol gegeben und bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden gerührt. Das Harz wurde anschließend mittels Saugfiltration filtriert und das Peptid durch Fällung der TFA-Lösung mit Ether, gefolgt von Filtration, erhalten. Jedes Peptid wurde mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Wasser/Acetonitril/0,1% TFA-Gradienten aufgereinigt und lyophilisiert. Das Produkt wurde mittels Massenspektrometrie bestätigt.
Die Disulfid-Bindungsbildung wurde mittels Autooxidationsbedingungen wie folgt erreicht. Das Peptid wurde in einer minimalen Menge DMSO (ungefähr 10 ml) vor Zugabe von Puffer (0,1 M Tris, pH 6,2) auf eine Konzentration von 0,3–0,8 mg/ml gelöst. Die Reaktion wurde mittels HPLC bis zur vollständigen Bildung der Disulfidbindung überwacht, gefolgt von präparativer Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Wasser/Acetonitril/0,1% TFA-Gradienten und Lyophilisierung. Das Produkt wurde mittels Massenspektrometrie bestätigt. Alle Peptide enthielten eine Disulfidschleife, gebildet zwischen den zwei Cystein(C)-Resten.
Beispiel 2: EIA
A. Probenbeschaffung. Die Subtyp-O-Proben "M" und "E" gehörten zu der ursprünglichen französischen Reihe von neun bestätigten Subtyp-O-Proben; sie entsprechen den Proben #7 und #2, respektive (I. Loussert-Ajaka et al., The Lancet, 343: 1393–1394 (1994)). Die Proben DUR, FAN und MAA waren andere Subtyp O-Proben der Französischen Regierung.
Die Proben #2901 und HA112 wurden jeweils bezogen über die Professoren Lutz Gürtler in München und Hartmut Hampl in Berlin, Deutschland. Proben #193, #267, #341 und #655 wurden aus Äquatorialguinea bezogen und es wurde durch PCR bestätigt, daß sie echte Subtyp-O-Proben sind.
B. EIA. Die synthetischen Peptide wurden zuerst in 0,1 M Morpholinoethansulfonsäure (MES)-Puffer, pH 5,5 auf eine Konzentration von 20 μM gelöst. Für den Beschichtungsschritt wurden 200 μl unterschiedlicher Verdünnung (0- bis 5-fach) der 20 μM-Lösungen (in 0,1 M MES-Puffer, pH 5,5) jedes Peptids zu den Mulden von Microtiter^TM (Dynatech Immunolon 4 Polystyrol)-Platten gegeben. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurden die Platten mit einer Waschlösung, umfassend 0,5% fettfreie Trockenmilch in TBST (Tris-Puffersaline, 0,01 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20^®, pH 8) gewaschen. Der Blockierungsschritt bedurfte der Zugabe von 300 μl 10% fettfreier Trockenmilch in TBST-Lösung zu jeder Mulde, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur. Die Platten wurden anschließend mit der Waschlösung gewaschen, bevor 150 μl der Serum/Plasma-Proben, 150-fach verdünnt in 10% Milch-TBST, zu jeder Mulde gegeben wurden. Nach Inkubation für zwei Stunden bei Raumtemperatur wurden die Platten erneut mit der Waschlösung gewaschen und anschließend zu jeder Mulde 100 μl eines 16.000-fach verdünnten Konjugats (Ziegen-Antihuman-IgG-Meerrettichperoxidase (HRPO), 1 mg/ml, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) in 10% fettfreier Trockenmilch-TBST gegeben. Nach einstündiger Inkubation wurden die Platten mit der Waschlösung gewaschen. Die Farbentwicklung wurde durch die Zugabe von 100 μl einer Lösung von ortho-Phenylendiamin (OPD) in Wasserstoffperoxid zu jeder Mulde und zehnminütiger Inkubation erreicht. Die Farbentwicklungsreaktion wurde mit 100 μl 1 N Schwefelsäure gestoppt und die Absorption mit einem Dynatech MR5000-Plattenleser bei 490 nm und 630 nm Wellenlänge bestimmt. Die relativen Intensitäten von A₄₉₀–A₆₃₀ der Mulden waren proportional zum Wirkungsgrad, mit dem ein bestimmtes Peptid mit eine bestimmten Serum/Plasma-Probe reagierte.
Beispiel 3. Vergleichsanalyse der S zu K-Substitution und der T zu Y-Substitution
Dieses Beispiel verdeutlicht die Wichtigkeit der S zu K-Substitution (SEQUENZ I. D. Nr. 2) für die Detektion einiger HIV-1 Subtyp-O-Proben (#2901, #267 und #655), die Wichtigkeit der T zu Y-Substitution (SEQUENZ I. D. Nr. 3) bei der Detektion einiger anderer HIV-1 Subtyp-O-Proben (#193, "E" und HA112) und daß beide SEQUENZ I. D. Nr. 2 und SEQUENZ I. D. Nr. 3 im allgemeinen überragend in ihrer Funktion im Vergleich zu SEQUENZ I. D. Nr. 1 sind.
Der Assay wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Es wird darauf hingewiesen, daß die verwendete Peptidkonzentration für die Beschichtung der Mulden 20 μM betrug und die Verdünnungen der Serum/Plasma-Proben folgendermaßen waren: 150-fach für #193, #267, #341, #655, HA112 und DUR; 450-fach für #2901, Proben "E" und FAN; 750-fach für die Probe MAA; und 1500-fach für die Probe "M". Bestätigte negative humane HIV-Proben wurden als negative Kontrollen für diese Untersuchung verwendet.
Die in den Tabellen 1, 2 und 3 gezeigten Absorptionswerte wurden als A₄₉₀–A₆₃₀ berechnet.
TABELLE 1
TABELLE 2
TABELLE 3
Beispiel 4. Vergleichsanalyse der S zu K- und T zu Y-Di-Substitution
Dieses Beispiel hat gezeigt, daß das S zu K- und T zu Y- di-substituierte Peptid (SEQUENZ I. D. Nr. 4) merklich in seiner Leistung gegenüber SEQUENZ I. D. Nr. 1 bei der Detektion von 10 aus insgesamt 11 Subtyp-O-Proben überlegen war.
Der Assay wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Es wird angemerkt, daß die verwendete Peptidkonzentration für die Beschichtung der Mulden 20 μM betrug und die Verdünnungen der Serum/Plasma-Proben wie folgt waren: 150-fach für #193, #267, #341, #655, HA112 und DUR; 450-fach für #2901, Proben "E" und FAN; 750-fach für die Probe MAA; und 1500-fach für die Probe "M". Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden negative humane HIV-Proben als negative Kontrollen für diese Untersuchung verwendet.
Die in den Tabellen 4, 5 und 6 gezeigten Werte waren Absorptionswerte (A₄₉₀–A₆₃₀)
TABELLE 4
TABELLE 5
TABELLE 6
Beispiel 5. Titrationsuntersuchungen
A. Experimentelles Protokoll. Die relative Immunoreaktivität für synthetische HIV-Peptide wurde unter Verwendung von 96-Muldenplatten gemessen, jeweils beschichtet mit 100 μl der folgenden, wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Peptide für 16 Stunden bei 4°C: Consensus B (SEQUENZ I. D. Nr. 1), B/O-7 (SEQUENZ I. D. Nr. 2), B/O-8 (SEQUENZ I. D. Nr. 3) und B/O-2 (SEQUENZ I. D. Nr. 4). Die Peptide wurden bei den folgenden Konzentrationen untersucht: 500 μM, 50 μM, 5 μM, 0,5 μM, 0,05 μM und 0,005 μM. Der für die Anwendung verwendete Puffer dieser Peptide war 100 mM Morpholinoethansulfonsäure, pH 5,5. Die Peptid-beschichteten Mulden wurden dreimal mit Waschpuffer gewaschen, bestehend aus 8 mM Natriumphosphat, 2 mM Kaliumphosphat, 140 mM Natriumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid, 0,05% Tween-20, 0,1% Rinderserumalbumin, pH 7,4.
Die Wandungen wurden für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 9% (Gew./Vol.) fettarmem Carnation^® Milchpulver in Phosphatpuffersaline blockiert: 8 mM Natriumphosphat, 2 mM Kaliumphosphat, 140 mM Natriumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid, pH 7,4. Die Wandungen wurden 3-mal mit Waschpuffer gewaschen.
Humane Serumproben (#193, #267, #341, #655 und "M") wurden 150-fach mit 4,5% fettarmem Carnation Milchpulver (Gew./Vol.) in PBS verdünnt. Einhundert μl dieser Proben wurden in den Mulden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die Wandungen wurden 3-mal mit Waschpuffer gewaschen.
Antikörper-positive Proben, welche den HIV-Antikörper-Peptidantigenkomplex enthielten, wurden unter Verwendung von Meerrettichperoxidase, konjugiert mit Ziegen-Antihuman-IgG, detektiert. Einhundert μl des HRPO-Ziegen-Antihuman-IgG-Konjugats, verdünnt 1 : 5000 in Waschpuffer, wurden zu jeder Mulde gegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Die Mulden wurden anschließend 3-mal mit Waschpuffer gewaschen und die Konzentration der HIV-Antikörper mittels Absorptionsmessungen bei 405 nm ermittelt, nach Exposition der Mulden gegenüber 100 μl ABTS-Lösung (2,2'-Azinobis-[3-ethylbenzothizolin-6-sulfonsäure]diammoniumsalz) von Pierce.
B. Datenanalyse. Die Absorptionsdaten bei 405 nm wurden auf SEQUENZ I. D. Nr. 4 normalisiert und die relativen Reaktivitäten gegen den Logarithmus der zur Beschichtung der Mulden verwendeten Peptidkonzentration aufgetragen. Die Daten wurden in eine, eine sigmoide Kurve beschreibende Gleichung eingesetzt, wie zu finden im Origin-Programm der Microcal Inc. y = (A1 – A2)/{1 + (x/x0)^p} + A2 worin x₀ der Mittelpunkt der Kurve ist, p die Rate, A₁ der Ursprungspunkt von y und A₂ der Endpunkt von y ist.
C. Ergebnisse. Die 1, 2, 3 und 4 zeigen, daß die Peptidkonzentration von 20 μM ausreicht, um ein Sättigungssignal zu erzeugen, wodurch die vorhergehenden Daten in den Beispielen 3 und 4 bestätigt werden.
SEQUENZLISTE

Claims

Polypeptid mit einer Punktmutation in der HIV-1 Subtyp B IDR, mit der Sequenz gemäß Sequenz ID Nummer 2:
Polypeptid mit einer Punktmutation in der HIV-1 Subtyp B IDR, mit der Sequenz gemäß Sequenz ID Nummer 3:
Polypeptid mit zwei Punktmutationen in der HIV-1 Subtyp B IDR, mit der Sequenz gemäß Sequenz ID Nummer 4:
Ein Immunoassay zum Detektieren der Anwesenheit von HIV Subtyp O Antikörpern in einer Testprobe, der folgendes umfaßt: a) Inkontaktbringen der Testprobe mit einer festen Phase, an die ein HIV-1 Polypeptid gemäß Ansprüchen 1–3 angeheftet wurde, um eine erste Mischung zu bilden, und Inkubieren der ersten Mischung für einen Zeitraum und bei Bedingungen, die ausreichend sind, um Polypeptid/Antikörper-Komplexe zu bilden; b) Inkontaktbringen der Polypeptid/Antikörper-Komplexe mit einem Indikatorreagens, das ein Glied eines spezifischen Bindungspaares umfaßt, welches an eine signalerzeugende Verbindung angeheftet ist, die in der Lage ist, ein messbares Signal zu erzeugen, um eine zweite Mischung zu bilden, und Inkubieren der zweiten Mischung für einen Zeitraum und bei Bedingungen, die ausreichend sind, um Polypeptid/Antikörper/Indikatorreagens-Komplexe zu bilden; und c) Bestimmen der Anwesenheit von HIV Subtyp O Antikörpern in der Testprobe durch Detektieren des messbaren Signals.
Der Immunoassay gemäß Anspruch 4, worin die feste Phase aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus den Wandungen von Reaktionsmulden einer Reaktionsplatte, Teströhrchen, Polystyrolkügelchen, magnetischen Kügelchen, Nitrocellulosestreifen, Membranen, Mikropartikeln, wie beispielsweise Latexpartikeln, roten Blutkörperchen und Durazyten eines Schafes (oder eines anderen Tieres).
Der Immunoassay gemäß Anspruch 4, worin das Indikatorreagens eine signalerzeugende Verbindung umfasst, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Chromogenen, Enzymen, lumineszenten Verbindungen, chemilumineszenten Verbindungen, radioaktiven Elementen und direkt sichtbaren Markierungen.
Der Immunoassay gemäß Anspruch 4, worin das spezifische Bindungspaarglied des Indikatorreagens anti-humanes IgG ist.
Ein Immunoassay zum Detektieren eines HIV Subtyp O Antikörpers in einer Testprobe, umfassend das Inkontaktbringen der Testprobe mit einem HIV-1-Polypeptid und Detektieren der Anwesenheit des Antikörpers, worin die Verbesserung die Verwendung eines Polypeptids gemäß Ansprüchen 1–3 umfasst.
Ein diagnostischer Test-Kit, geeignet zur Detektion von HIV Subtyp O Antikörpern, der einen Behälter umfaßt, der ein Polypeptid mit einer Sequenz enthält, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Sequenz ID Nummer 2, Sequenz ID Nummer 3 und Sequenz ID Nummer 4 besteht.