DD281256A5 - Verfahren zum nachweis von antikoerpern gegen das humane immuninsuffizienz virus (hiv-1) - Google Patents
Verfahren zum nachweis von antikoerpern gegen das humane immuninsuffizienz virus (hiv-1) Download PDFInfo
- Publication number
- DD281256A5 DD281256A5 DD31042887A DD31042887A DD281256A5 DD 281256 A5 DD281256 A5 DD 281256A5 DD 31042887 A DD31042887 A DD 31042887A DD 31042887 A DD31042887 A DD 31042887A DD 281256 A5 DD281256 A5 DD 281256A5
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- hiv
- human
- antibodies
- antibody
- human monoclonal
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikoerpern gegen das humane Immuninsuffizienz Virus * Das Verfahren wird im klinisch-chemischen, im mikrobiologischen und virologischen Labor sowie in den Blutspendezentralen eingesetzt, um bei Personen eine HIV Infektion nachzuweisen oder auszuschlieszen sowie biologische Therapeutika humaner Herkunft zu ueberwachen. Dementsprechend sind die Anwendungsgebiete die Medizin und die Wirkstoffpruefung. Die Erfindung hat zum Ziel, durch Einsatz humaner monoklonaler Antikoerper die Sensitivitaet des Verfahrens auf 100% zu erhoehen. Das Verfahren ist durch einen geringeren Arbeitsaufwand und durch eine kuerzere Dauer gegenueber den bisherigen Verfahren gekennzeichnet.{Nachweisverfahren; Antikoerper; Humanes Immuninsuffizienz-Virus; HIV 1; Labordiagnostik; Mikrobiologie; Virologie; Blutspendezentrale; HIV-Infektion; Medizin; Humaner menschlicher monoklonaler Antikoerper; Sensitivitaet}
Description
Hierzu 4 Seiten Zeichnungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anwendung in der medizinischen Diagnostik. Es kann eingesetzt werden in der klinischchemischen, in der mikrobiologisch-virologischen Diagnostik, im Rahmen epidemiologischer Feldstudien sowie im Blutspende- und Transfusionswesen zur Überwachung von Blut- und Organspendern sowie in der Pharmakaindustrie zur Kontrolle bei der Produktion biologischerTherapeutika.
Der Antikörpernachweis wird routinemäßig mit dem Enzymimmunoassay durchgeführt. An entsprechende Testbestecke werden folgende Anforderungen gestellt:
- höchste Sensitivität
- hohe Spezifität
- einfache Durchführbarkeit
- kurze Testdauer
- schnelle quantitative Auswertung.
Die Enzymimmunoassays zum anti-HIV Antikörpernachweis sind überwiegend nach dem Sandwichprinzip aufgebaut (Weiss, H. St., J. J. Goedert, M. G. Sarngadharan, A. J. Bodner, R. C. GaIIo, W. A. Blattner, JAMA 253, 221-225 [1985]). Dieses Testsystem erfordert ausnahmslos zwei Inkubationsschritte und zwei Waschschritte neben der farbbildenden Substratreaktion. Zusätzlich zwingt es zu hohen Verdünnungen der Serumproben, um unspezifische Adsorptionen von humanem IgG, was unabhängig seiner Spezifität von dem enzymmarkierten anti-human IgG detektiert wird, zu minimieren.
Kompetitive Enzymimmunoassays zum anti-HIV Antikörpernachweis reduzieren durch gleichzeitige Inkubation von Humanserum und enzymmarkierten anti-HIV Antikörpern die Testdauer um etwa die Hälfte und erfordern nur einen Waschschritt. Als enzymmarkierte Antikörper finden entweder gereinigte anti-HIV Antikörper von HIV infizierten Personen oder immunisierten Tieren oder aber monoklonale anti-HIV Antikörper von der Maus Verwendung. Da geeignete polyklonale Antikörpernurin begrenztem Umfang zur Verfügung stehen und ihre Reinigung aufwendig ist, sind die Teste auf dieser Basis immer nur für einen begrenzten Zeitraum standardisierbar. Außerdem können die enzymmarkierten polyklonalen Antikörper, die gegen die verschiedenen Virusstrukturproteine gerichtet sind, je nach der individuellen Immunantwort der zu untersuchenden Person in unterschiedlichen Ausmaßen gehemmt werden, so daß die Trennschärfe der bisherigen Verfahren auf der Basis der Antikörperkompetition mit polyklonalen Antikörpern nicht den gestellten Anforderungen genügt. Deshalb wird auf monoklonale anti-HIV Antikörper von der Maus ausgewichen. Es ist jedoch nicht sicher, ob die tierischen Antikörper auf Grund genetischer Differenzen in der Immunantwort im Vergleich zum Menschen exakt die selbe Feinspezifität (Epitopspezifität) wie die humanen Antikörper HlV-infizierter Personen aufweisen. Eine solche Identität ist bei Kompetitionstesten, bei denen monoklonale Antikörper durch Patientenantikörper an der Antrgenbindung gehindert werden, zur Erlangung einer höchstmöglichen Testsensivität Voraussetzung.
Gegenwärtig weist kein Testsystem eine Sensitivität von > 99,8% auf. Darüber hinaus sinkt bei den bisherigen Testen mit zunehmender Sensitivität die Spezifität ab.
Ziel der Erfindung
Es Ist das Ziel der Erfindung, durch ein Verfahren mit humanen monoklonalen anti-HIV Antikörpern, die vorwiegend gegen das Transmembranprotein des Virus gerichtet sind, das bei natürlicher Virusinfektion zuerst eine Antikörperantwort induziert, die selbst bei Ausbildung des Vollbilds eines erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS) noch nachweisbar bleibt (Allain, J.-P., D.A.Paul, Y.Laurian, D.Senn: The Lancet II, 1233-1236 [86]) die Spezifität und Sensitivität bisheriger Verfahren zu übertreffen und den Arbeitsaufwand sowie die Bearbeitungszeit gegenüber den bisherigen Verfahren zu verringern.
Das Wesen der Erfindung zielt darauf hin, die Nachteile der bekannten Verfahren zu beseitigen. Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß ein humaner monoklonaler Antikörper, hergestellt durch Fusion von peripheren Blutlymphozyten eines symptomlosen HlV-lnfizierten mit der Heteromyelomzellinie CB-F7 (Charite der Humboldt-Universität zu Berlin), vorzugsweise der humane monoklonale Antikörper CB-HIV1 anti-gp41, aus dem Zellkulturüberstand auf einen Anteil von 15-20% des Gesamtproteingehaltes angereichert und anschließend mit Markerenzymen, vorzugsweise Meerrettich-Peroxydase oder alkalischer Phosphatase, nach bekannten Kopplungsverfahren markiert wird.
Unter der Berücksichtigung, daß die Begleitproteine in dem Antikörperpräparat nahezu ausschließlich Rinder-lgG von der gleichen Molmasse wie der humane monoklonale Antikörper sind, wird die Antikörpermarkierung nach Wilson und Nakane (Immunofluorescence and related staining techniques [Hrsg. Knapp/Holubar/Wick.] Elsevier, Amsterdam, 215-221 [1978]) im molaren Verhältnis von Gesamt-lgG zu Peroxidase von 1:4 durchgeführt. Die Reinigung des Konjugates kann durch bekannte Verfahren wie Salzpräzipitation, Gelfiltration oder Affinitätschromatographie erfolgen.
Im kompetitiven Enzymimmunoassay zum Nachweis einer HIV-Infektion werden Humanserum und Peroxidase markierter humaner monoklonaler anti-gp41 Antikörper im definierten Volumenverhältnis (1:3) miteinander gemischt und anschließend mit insolubilisiertem rekombiniertem gp 160 (Envelope Gen Produkt) oder mit gp41 (env Genprodukt, Transmembranprotein) bzw. einem rekombinierten Fusionsprotein gp41/p 24 (p 24, gag Gen Produkt) oder synthetischen Peptiden, 20-60, vorzugsweise 45min zwischen 20-400C, vorzugsweise 37°C, inkubiert. Nach Reaktionsablauf werden ungebundene Serum- und Konjugatbestandteile durch Spülung mit Lösungen bekannter Zusammensetzung entfernt und der an der Festphase gebundene Immunkomplex in Substratlösung inkubiert. Bei Abwesenheit von anti-gp41 Antikörpers im zu untersuchenden Serum wird auf Grund der ungehinderten Bindung des enzymmarkierten humanen monoklonalen anti-gp41 Antikörpern durch die Substratreaktion maximale Produktbildung erzielt. Bei vorhandenen anti-gp41 Antikörpern im zu untersuchenden Humanserum wird in Abhängigkeit von deren Konzentration die Bindung des enzymmarkierten humanen monoklonalen anti-gp 41 Antikörpers im unterschiedlichen Ausmaß gehemmt und die Produktbildung während der Substratreaktion signifikant verringert. Das farbige Produkt wird photometrisch quantifiziert.
Methode
25 μΙ unverdünnter humaner Serumproben werden mit 75,0 μΙ Peroxidasemarkiertem humanen monoklonalen anti-gp41 Antikörper, eingestellt auf eine Konzentration von 6,5 μg IgG/ml, gemischt und unmittelbar danach in die mit rgp 160 » beschichteten Kavitäten einer Polystyron-Mikrotestplatte (MTP) dosiert. Das Gemisch wird 45 ± 5min bei 37 ± 0C im Brutschrank inkubiert. Anschließend wird der Inhalt der Kavitäten abgesaugt, und die Kavitäten werden 5mal mit 300 μΙ PBS, 0,1%Tween 20 gespült. Im Anschluß werden 50,0μΙ Substratlösung, 20mmol/l O-Phenylendihydrochlorid, 5,5mmol/l H2C^ in 0,1 mol/l ZitratpufferpH5,0in die Kavitäten dosiert. Die Substratreaktion wird nach 10 ± 1 min Reaktionszeit bei 20-250C durch Zugabe von 50,0μΙ2ηηοΙ/Ι Schwefelsäure 0,05mol/l Natriumsulfit terminiert. Die Extinktionen werden im Vertikalphotometer bichromatisch (Λ492, \690nm) vermessen. Aus den ermittelten Extinktionswerten wird die prozentuale Bindungshemmung berechnet. Der Extinktionsmittelwert aus der Dreifachbestimmung des negativ reagierenden Kontrollserums (NKS) entspricht 0,0% Bindungshemmung, der Extinktionswert 0,0 entspricht 100,0% Bindungshemmung. Ein Humanserum wird bei einer Bindungshemmung >30% als anti-HIV Antikörper-haltig definiert.
Ergebnis
Unter Berücksichtigung dieses Grenzwertes reagierte nur eine Serumprobe von 100 Serumproben gesunder Blutspender initial positiv, bei Wiederholungsuntersuchungen jedoch eindeutig negativ. 102 Seren von 102 HlV-infizierten Personen (asymptomatische Antikörperträger, Patienten mit Lymphadenopathiesyndrom und mit AIDS) wurden initial alle als reaktiv (anti-gp41 Antikörper-haltig) bestimmt.
Das Nachweisverfahren einer HIV-Infektion auf der Basis eines humanen monoklonalen anti HIV-1 Antikörpers weist damit eine Spezifität von 99% und eine Sensitivität von 100% auf.
Claims (4)
- Patentanspruch:1. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen das humane Immuninsuffizienz Virus (HIV-1) mittels eines kompetitiven Enzymimmunoassays, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Inkubations- und Waschschritt mit einem enzymmarkierten humanen monoklonalen Antikörper, der gegen eine immundominante Region des env-Genproduktes von HIV-1 gerichtet ist, durch seine Bindungshemmung HIV-Infektionen innerhalb von 60 Minuten nachgewiesen werden.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymmarkierung des humanen monoklonalen Antikörpersa) mit Meerrettich-Peroxidaseb) mit alkalischer Phosphatase
vorgenommen wird. - 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der humane monoklonale Antikörper gegen das Transmembranprotein gp41 von HIV-1 gerichtet ist.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Anwesenheit von anti-gp41 Antikörpern im zu untersuchenden Humanserum zu der Bindungshemmung führt.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DD31042887A DD281256A5 (de) | 1987-12-14 | 1987-12-14 | Verfahren zum nachweis von antikoerpern gegen das humane immuninsuffizienz virus (hiv-1) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DD31042887A DD281256A5 (de) | 1987-12-14 | 1987-12-14 | Verfahren zum nachweis von antikoerpern gegen das humane immuninsuffizienz virus (hiv-1) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DD281256A5 true DD281256A5 (de) | 1990-08-01 |
Family
ID=5595067
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DD31042887A DD281256A5 (de) | 1987-12-14 | 1987-12-14 | Verfahren zum nachweis von antikoerpern gegen das humane immuninsuffizienz virus (hiv-1) |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DD (1) | DD281256A5 (de) |
-
1987
- 1987-12-14 DD DD31042887A patent/DD281256A5/de not_active IP Right Cessation
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0770679B1 (de) | HCV-spezifische Peptide, Mittel dazu und ihre Verwendung | |
EP0673948B1 (de) | Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung | |
DE69535601T3 (de) | Nukleotiden-sequenzen aus retroviren-antigenen hiv-i gruppe (oder untergruppe) o | |
EP0972198B2 (de) | Verfahren zur simultanen bestimmung von hiv-antigenen und hiv-antikörpern | |
EP0944838A1 (de) | ANTIGENSPEZIFISCHER IgG-NACHWEIS | |
EP0265851B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Anti-HIV, Mittel dazu und ihre Verwendung in diesem Verfahren | |
DE3690028C2 (de) | Verfahren und Testkit für die Analyse einer biologischen Probe auf Antikörper gegen Retroviren | |
JPH01503487A (ja) | ヒト免疫不全ウイルスに対する抗体の検出方法 | |
DE69632535T2 (de) | Peptide zur detektion von hiv-1 | |
DD281256A5 (de) | Verfahren zum nachweis von antikoerpern gegen das humane immuninsuffizienz virus (hiv-1) | |
EP0402757A2 (de) | Festphasenimmunoassay und Testbesteck zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern | |
DE69929468T2 (de) | VERBESSERTE SPEZIFITÄT IN DER DETEKTION DER ANTI-RUBELLA IgM ANTIKÖRPER | |
US4879211A (en) | Rapid immunoagglutination test for presence of HIV in body fluids | |
EP0781998B1 (de) | Immunologische Bestimmungsmethode | |
DE4120281C2 (de) | Immunchemisches Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von mehreren verschiedenen Antikörperspezifitäten, Peptidmischungen und Test dazu | |
DE602005005999T2 (de) | Modifizierte hiv-1-peptide und ihre verwendung beim nachweisen von anti-hiv-antikörper | |
DE4112743C2 (de) | Synthetische Core-Peptide zur Bestimmung von HCV-Antikörpern und HCV-Antigenen, Mittel dazu und ihre Verwendung in diesen Nachweis-Verfahren | |
DE69729655T2 (de) | Immunoenzymatischer assay für die diagnose von infektiöser pferdeanämie-viren-krankheit mit hilfe des rekombinanten virusproteins rgp90 | |
EP0583689B1 (de) | Immunchemisches Verfahren zum Nachweis eines Analyten | |
EP0595211A1 (de) | Verfahren zur simultanen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern | |
DE69635753T2 (de) | Verbesserte hapten-peptidkonjugaten zum nachweis von anti-hiv-1 oder anti-hiv-2 antikörpern | |
DE4034982C2 (de) | Synthetische Polypeptide zur Bestimmung von HCV-Antikörpern und HCV-Antigenen, Mittel dazu und ihre Verwendung in diesen Nachweis-Verfahren | |
DD272134B5 (de) | Verfahren zum simultanen Nachweis von Antigen und spezifischen Antikoerpern | |
DE19727943A1 (de) | Verfahren zur simultanen Bestimmung von HIV-Antigenen und HIV-Antikörpern | |
RU2488832C1 (ru) | Способ комплексной диагностики инфекционных заболеваний человека путем твердофазного иммуноферментного анализа |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |