JPH01503487A - ヒト免疫不全ウイルスに対する抗体の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト免疫不全ウィルスに対する抗体の検出方法技術分野 本発明は、ＡＩＤＳ及びそれに関連する病気の診断に使用できるヒト免疫不全ウ ィルスの抗体の検出方法と、このウィルスの潜伏性無症候性キャリアの同定方法 に関する。

背景技術 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）が最初に発見及び報告されたのは、１９８１ 年である。その時以来、臨床及び疫学データにより、ＡＩＤＳの発生が世界的に 疫学的段階に達していることが明らかになってきている。ＡＩＤＳの原因物質は 、ＲＮＡレトロウィルス、ヒトＴ−細胞白血病ウィルスタイプＩＩＩ（ＨＴＬＶ −Ｉｌｌ）　（リンパ節疾患関連ウィルス（ＬＡＶ）としても知られている）及 びＡＩＤＳ関連レトロウィルス（Ａ　ＲＶ　）であることが確認され、最近ヒト 免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）と改名された。ＡＩＤＳ患者は、日和見性病原菌 ニューモシスティスカリネイ、カンジダアルビカンス、ヘルペスシンプレックス ウィルスのような広範囲の日和見性感染源に罹患し、そして腫瘍（特にカボジ肉 腫）を患うことが多い。推定では、米国内のＡＩＤＳ患者の数はほぼ１２力月毎 に倍増し続けている。

推定上のＡＩＤＳウィルスＨＩＶは、末梢血液単核細胞、脳を髄液、精液、神経 組織、唾液、涙、そして稀には尿から分離されている。全人口におけるＨ　Ｉ　 Ｖへの感染率を調べるにめに、ＡＩＩ）Ｓウィルスに対する抗体の存在に関する 集団スクリーニングを試みることが提案された。しかし、抗体物質は一般には人 間の血液及び血清の中にしか見つかるないので、このスクリーニングでは被験者 かる血液ま１；は血清のサンプルを採取する必要があった。

様々な血清学的検査法が、ＡＩＤＳ患者やＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）患者や 健康ｔ（つまり無症候性の）ウィルスキャリアの血液中かみＨＩＶに対する抗体 （この抗体の存在は、ＨＩＶ感染の事実を示すものである）を検出するために開 発されてきた。食品医薬品局（ＦＤＡ）公認のＥＬ　Ｉ　ＳＡ　（酵素結合免疫 吸収検定法）や、ＨＩＶに対する抗体の測定用の実験的ウェスタンプロット用具 が、今日利用可能である。これらの用具の中には、ウィルス膜蛋白質（ｇｐ４１ 即＝’ｌ）　Ｅ　Ｎ　Ｖ　）及びウィルス核蛋白質（ｐ２４即ちＣ０ＲＥ）に対 する特定の抗体の検出用の最新の（しかしまだ実験用の）ＥＬＩＳ、Ａ検定用具 や、ＨＩＶの多数の抗原蛋白質の検出用のウェスタンプロット法を利用する用具 がある。更に、ガラス内で培養したＨＩＶ感染細胞のｉｆ１ｍ培養液中からこれ らのウィルス抗原を検出する方法も最近開発されている。

今日の全てのＡＩＤＳ検出法は、ＨＩＶウィルスに対する抗体の存在に関する分 析対象である血液又は血清のサンプルを採取するために、健康な組織を冒す（１ ｎｖｐｓｉνｅ）処置、つまり静脈か動脈かまたは皮下の腔に注射針を刺して血 液のサンプルを抜き取るという処置を採用している。これらの処置は、サンプル を採取及び分析するヘルスケア職員に対する成る程度の危険を伴っている。何故 なら、注射針に不注意に触れることによってＡＩＤＳに罹るおそれがあるからで ある。そのよ、今日ＡＩＤＳに罹る可能性が高いとみなされている人（同性愛者 及び静脈薬使用者）とその危険の高くない被験者とは、検査中にＡＩＤＳに罹る のではないかという根拠のない危惧を抱いていることが多く、そのせいで、針を 使用した血液の抜取りを伴うあらゆる処置を受けることを避けている。

これらの問題は、健康な組織を冒さない方法によってＨＩＶの抗体に関するスク リーニングを行なうことによって克服されるであろう。こうした方法は、集団ス クリーニングでの使用に適しており、従来の健康な組織を冒す血清学的検定法の 固有の欠点を回避するのに適している。

発　明　の　開　示 ＨＩＶに対する抗体をＨｒＶに暴露または感染した者の尿の中から検出できるこ とが、思いがけなく発見された。これはとりわけ驚くべき発見である。何故なら 今日までは、一定の腎臓病患者を除いてはヒトの尿中から抗体を検出することは できないと信じられていたからである。本発明は、被験者がＨＩＶウィルスに感 染しているか否かを尿中からのＨＩＶに対する抗体の検出によって決定する、健 康な組織を冒さない検定法を開示するものである。

従って、本発明の目的のひとつは、健康な組織を侵すことなく病原性物質に対す る抗体に関するスクリーニングを行なう方法を提供することにある。

別の局面では、本発明は、健康な組織を冒すことなく被験者が特定のウィルス性 物質に暴露されたか否かを決定する方法を提供することにある。この方法は、特 定のウィルス性物質に対する免疫のない患者の尿中から該ウィルス性物質に対す る抗体を検出する過程を含んでいる。

図面の簡単な説明 第１図は本発明の濃縮床サンプルの典型的なウェスタンプロット分析、 第２図はＨＩ　Ｖ感染者の尿中におけるＨＩＶに対する抗体の存在に関する二重 拡散勾配免疫電気泳動分析を示す図である。

発明を実施するための最良の形態 ＡＩＤＳウィルス（ＨＩＶ）の抗体がＡＩＤＳ患者及びＩＩＶ感染者（腎臓に疾 患のない者を含む）の尿の中に存在するということが、思いがけなく発見された 。更に本発明者は、これらの抗体がＩｇＧ、ＩｇＡクラスの免疫グロブリンであ ることを、免疫拡散法によって確認した。この発見は、驚くべきものである。何 故なら、これまでは、抗ウイルス抗体の有意味な滴定量は、腎臓病患者またはポ リオウィルスワクチン接種により免疫性を与えられた者の尿の中にしか存在しな いと考えられていたからである。

フランクリン　Ｅ、　Ｃ，（Ｊ、Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　３８　：　２１ ５９−２１６７．１９５９）は、蛋白質（アルブミン、アルファグロブリン、ベ ータグロブリン及びガンマグロブリンを含む）が健康なヒトの尿の濃縮液の中に 存在していることを発表している。しかし、これらの破片は、成熟した免疫グロ ブリンの６分の１の大きさしかなく、抗体の分子が自然に分解してできた産物で あると考えられた。特異抗体は調査されなかった。

ラーナー　Ａ、Ｍ、他による論文（Ｊ　、Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　４１： ８０５−８１５．１９６２）には、ポリオウィルスワクチン接種により免疫性を 与えられた健康なヒトの尿の中からポリオウィルスに対する抗体が検出されたこ とが報告されている。しかし、抗体を検出された全ての被験者は３回以上ワクチ ン接種を受けたことのある者であり、しかも尿はワクチン接種後すぐに採取及び 分析されている。免疫のない者の尿中における抗ウイルス抗体の存在は、これま で医学文献に報告されていない。

実際、本発明者は、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）または肝炎ウィルスの感染 者の尿の中からこれらのウィルスに対する抗体を検出することはできなかった。

ＣＭＶに関していえば、抗ＨＩＶ抗体の血清滴定量が１＋１．５００ないし１： ２０，０００である。Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ患者の尿の中からは、ＥＬＩＳＡを用いて 検定した場合、抗ＣＭ　Ｖ抗体を検出することはできなかった。

ＨＩＶに対する完全な抗体（または抗体の破片）が感染者の尿中に存在するとい う事実は、これまで医学文献に報告されたことはない。尿中に抗体が検出される のは、通常、免疫性のない腎臓または肝臓病（ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、 肝腎症候群等）患者または多発性骨髄腫、免疫増殖性疾患患者の場合だけである 。

ＨＩＶに対する抗体の尿中における存在量は、血清の中から検出された抗体の量 の約２０分の１であり、現在利用可能な全ての診断法の検出可能最低量よりも少 ない。従って、こうした抗体に関する検定の前に尿を濃縮、すなわち、その体積 を最初の排泄時体積よりも減少させなければならない。一層感度の高い抗体検出 法が利用可能になった場合には、尿の濃縮過程は省略できると考えられる。

本発明の方法は、ＨＩＶＪ％露に関するスクリーニングの被験者の尿のサンプル を採取する過程と、このサンプルを排泄時の２０倍以上に濃縮する過程と、濃縮 したサンプルをＨＩＶに対する抗体の存在に関して検定する過程とを含んでいる 。この検定は、血清中からのこうし１；抗体の検出法としてよく知られた方法を 用いて行なう。理論上は、ｌないし５ミリリツトルという少量の尿があれば抗体 を検出することができる。しかし、現在利用可能な検出法を用いる場合には、４ ０ないし１００ミリリツトルの尿を採取及び検査することが望ましい。濃縮した 尿は、すぐに検査してもよいし、４℃で２４時間以上保存してから検査してもよ いし、冷凍してもよい（しかし冷凍及び解凍により質は悪化する）。

よく知られた多数の濃縮方法のうちのどの方法を用いて尿のサンプルを濃縮して もよい。本発明の方法の実施において用いる濃縮方法の例としては、空気蒸発法 や膜透析や回転脱水法があるが、以下の例１で詳述するように、６０，０００ド ルトンの膜フィルターを備えたミニコンＢ１５濃縮器（マサチューセッツ州ダン ンバースのアミコン社製）を用いるのが好ましい。

また、凍結乾燥法を用いて尿を濃縮してもよい。しかし、この方法では一層大き なＩ（例えば少なくとも２００ミリリツトル）の尿が必要である。

尿のサンプルを十分に濃縮しさえすれば、ＨＩＶに対する抗体の存在に関してそ のサンプルを検定することができる。

「十分な濃縮」とは、尿の濃縮に関して本明細書で使用する場合、排泄時の２０ 倍以上に濃縮することを意味し、好ましくは４０倍ないし２００倍に濃縮するこ とを意味する（排泄時の４０ミリリツトルの尿を２ミリリツトルにまで濃縮すれ ば、２０倍に濃縮したことになる）。また、このサンプルを乾燥凍結及び再懸濁 （例えば等張性の食塩水中で）させてもよいが、しかし上述のようにこれには一 層多量の尿が必要である。このように濃縮したサンプルは、標準的な抗体検出方 法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンプロット法、標識免疫検定法、免疫拡散法 ）を用いることにより、Ｔ（ＴＶ蛋白質に対する抗体に関して検定することがで きる。

本発明の好適な実施例では、よく知られたウェスタンプロット分析法を、抗ＨＩ Ｖ抗体の検出用に採用している。この分析法は、哺乳動物の尿中からＨＩＶに対 する抗体を検出するための現在利用可能な最も信頼性の高い方法であることがわ かっている。一般にこの分析法は、ゲル電気泳動法によって分子量の相違に基づ いて蛋白質（この場合にはＨＩＶ蛋白質）を分離する過程と、分離した蛋白質を 適宜の固体の支持体にトロセルロース製フィルターまたはナイロン製フィルター 等）に移す過程と、ＨＩＶ感染者の血清（または尿）をこの蛋白質と一緒に培養 する過程とを含んでいる。この培養により、血清（または尿）中に存在する特異 ＨＩ　Ｖ抗体が、蛋白質に結合する。それからＨＩＶ抗体を、標識した抗ヒト） （ＩＶ抗体を用いて検出する。この検出法は、感度がよくしかもウィルス性蛋白 質に対する特定の抗体を検出できるので、好ましい方法である。ＥＬＩＳＡ検定 法に固有の偽陽性結果の発生は、ウェスタンプロット分析法を用いることによっ てかなり減少する。

本発明の他の実施例は、酵素結合免疫吸収検定法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）を、）（Ｉ 　Ｖに対する抗体の検出法として用いる。この検定法は、（Ｅ、エングバールに より　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

７０：４１９４３９に記載された通り、）競合的なものであっても非競合的なも のであってもよい。

ＥＬＩＳＡは、免疫学的検定法であり、本発明ではサンプル中に存在する抗体の 定量化のために用いる。この検定法では、色原体（色素を産出する物質）を抗体 検出用に採用し、抗原複合体が生成される。ＥＬ　Ｉ　ＳＡで使用される抗体は 、オルトーフェニレンジアミンやオルト−ジアニシジンのように、色原体と共有 結合する。オルト−フェニレンジアミンは、過酸化物（過酸化水素等）の存在下 で赤橙色の生成物を作り出し、オルト−アニシジンは、過酸化物の存在下で黄橙 色の生成物を作り出す。

これらの色は、特定の波長（オルト−フェニレンジアミンでは４９２ナノメート ル、オルト−アニシジンでは４００ナノメートル）の光を吸収するので、分光光 度計を使って検出及び定量することができる。

非競合的ＥＬ　Ｉ　ＳＡでは、あらゆる抗体と、検出対象の抗体を生み出す生物 種に対する第２の抗体（酵素で標識したもの）とを獲えるために、固定化した抗 原を用いる。もしも例えばヒトの抗体が検出対象であれば、ヤギまたはウサギの 標識抗ヒト抗体を第２抗体とする。抗体の存在量は、結合した第２抗体の量に正 比例する。競合的なＥＬＩＳＡには、未標識抗体（被検生物試料）と酵素標識第 ２抗体とが限られた既知の量の抗原に対して競合する反応が含まれている。この 反応は平衡状態に達するまで続き、未知の抗体の濃度は、結合し７ニ第２の抗体 の量に逆比例する。例えば、もしもサンプルの中に未知の抗体が全く存在してい なければ、全ての標識抗体が抗原と結合するので、増加した色によって示された 高い値が酵素標識の量の測定時に得られる。

この実施例の実施に使用できる市販のＥＬ　Ｉ　ＳＡキットは、アボットラプス 社（イリノイ州シカゴ）からカタログナンバー１０３７の下に入手することがで き、また、ＥＮＶＡＣＯＲ（ヒ二一マン　Ｔ　セル　リンフォトロピックウイル ス　ｌｌｌ５ＥＩＡ、カタログ　Ｎｏ、２７９１−２２、アボット　インターナ ショナル　ディアグノスティック社、ヴアイスバーデン、西ドイツ）として入手 することができる。カタログナンバー１０３７による検定は、以下の例３に記載 のように非競合的ＥＬＩＳＡを用い、ＥＮＶＡＣＯＲによる検定は、以下の例２ に記載のように競合的ＥＬＩＳＡを用いる。これらのキットは、以下の例２及び ３に列挙する部品を含んでおり、Ｔ−Ｔ　Ｉ　Ｖに対する抗体に関する血清（尿 ではない）の検定用に販売されているものである。

本発明の方法の１つの重要な利点は、サンプル（尿）を健康な組織を冒すことな く容易に採取することができ、従って、研究所やヘルスケアの職員が（例えば汚 染された注射針が誤って刺さることにより）Ｉ（Ｉ　Ｖに感染する危険が本質的 になくなることである。

本発明の方法は、迅速に実施することができ、尿のサンプルの濃縮に要する時間 によって迅速化が制限されるだけである。

おおまかにいえば、サンプルを２００倍に濃縮する場合には、濃縮に要する時間 は９０分未満である。２０倍ないし４０倍の濃縮であれば、６０分未満で行なう ことができる。濃縮したサンプルは、それから市販のＨＩＶ用血清検査装置を用 いて分析する。

本発明を、特定の実験例によって一層詳細に説明することにする。

例１：尿の濃縮 血清のサンプル及び６０ないし１００ミリリツトルの尿のサンプルを、次の患者 グループから採取した（そして、患者のプライバシー保護のために数字で識別す ることにした）。即ち、２８人１７）ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫（Ａ　Ｉ　ＤＳ− ＫＳ）患者と、２１人のＡＲＣ患者と、ＨＩＶへの感染の可能性の高い４８人の 無症候者（３７人の同性愛者、静脈投与薬を使用した５人の女性、輸血を受けた １人の女性を含む）と、ＡＩＤＳ関連日和見性感染源（ＡＩＤＳ−ＯＩ）にュー モシスティスヵーリナイやサイトメガロウィルス等）に感染し１こ１６人の患者 とから成るグループである（表１には、識別数字と検定結果を記載している）。

更に、ＡＩＤＳ以外の病気に罹った１７人の患者（肝硬変及び肝癌患者１人、肝 炎患者１人、狼癒患者３人、糸球体腎炎患者３人、ネフローゼ症候群患者１人、 狼癒腎炎患者１人、心不全患者１人、らい腫らい患者１人、結核患者２人、ＤＭ ネブロパシー患者１人）の尿及び血清と、明らかに正常で健康な３０人の異性愛 者の尿及び血清も採取した。全ての正常な対照とＡＩＤＳ患者とから採取した尿 のサンプルは、よく知られた標準的な尿検査方法を用いて検定したとき、蛋白質 に関して本質的に正常な値を示した。蛋白尿（異常に高い濃度の蛋白質が尿中に 存在すること）を、高い（１５０ミリグラム以上）の濃度の尿蛋白の存在を表示 する「ディツプスティック」を用いて検出した。蛋白尿はディツプスティックの 色の変化によって示されるので、その色の変化を標準と比較することによって蛋 白尿の定量化を行なった。

採取した尿のサンプルを、円錐形のチューブ内に入れ、室温で、毎分１５００回 転の速度で１５分間遠心分離機にかけた。

そして、上澄をデカンテーションして保管し、ベレットを捨てた。

このようにして得た上澄を、６０，０００ドルトンの薄膜を備エタミリコンＢ１ ５濃縮器（マサチューセッツ州ダンパーのアミコン社製）を用いて、排泄時の２ ０倍ないし２００倍に濃縮した。この濃縮器は、６０，０００ダルトンよりも大 きい分子量の物質を全て薄膜フィルターで捕らえると共に溶液を蒸発させことに より、濃縮を行なうものである。この濃縮には、約１時間かかる。（この濃縮器 を用いて尿を２００倍に濃縮するのには、約９０分かかる。）ａ縮した尿のサン プルは、４℃で３０日間保存してもよいし、あるいは直ちに以下の例２ないし５ に記載の検定用に使用してもよい。ウェスタンプロット分析法または免疫拡散法 に関しては、サンプルを２００倍以上に濃縮することが好ましい。各サンプルの 濃縮倍数は、以下の表１１２及び４に列挙した通りである。

九し：濃縮した尿のサンプルのＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定例１の血清サンプル及び濃縮 済み尿サンプルを、ＥＮＶＡＣＯＲ検定キットを用いて、ＥＮＶに対する抗体及 びＣ０ＲＥＨＩＶ抗原に対する抗体の存在に関して検定した（アライン、Ｊ。

Ｐ、他、ランセットＩ　：１２３３−１２３６．１９８６年）。

この検定は、既知の量のＨＩ　Ｖ蛋白質と抗体とをサンプルに加える競合的ＥＬ ＩＳＡである。サンプル中の抗体の存在は、対照抗血清の対照抗体への結合の減 少によって示される。更に、血液のサンプルを同時に採取及び分析した。

この検定用具は、希釈剤（ウシ及びヤギの血清と０．１％のアジ化ナトリウムと を含有）と、Ｈ’ＴＶ膜蛋白質及び核蛋白質に対するポリクローナル抗体（酵素 と共役したもの）と、遺伝子組替えｇｐ４１またはｇｌ）２４ＨＩＶ蛋白質で被 覆したビードと、オルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質と、陽性及び陰性 のＨＩ　ｖ抗体対照とを含んでいる。

５０マイクロリツトルのサンプルまたは対照を、２０マイクロリツトルの希釈剤 及び２００マイクロリツトルのポリクローナル抗体と一緒に培養した。ビードを 、ＨＩＶ膜蛋白質またはＨＩＶ核蛋白質のいずれかに対する抗体を入れた分離ウ ェルに入れた。室温で１６ないし２２時間培養した後、ビードを洗浄して適宜の 反応チューブに移した。３００マイクロリツトルのオルト−フェニレンジアミン 基質を各チューブに加えて、反応を３０分続けさせた後、１ミリリツトルの１規 定硫酸を加えることによって反応を停止させた。こうしてできた溶液の吸光度値 は、アボットラプス社からクアンタムＩ＋、ナンバー３３０３−１１の商品名で 販売されている分光光度計を用いて測定すると、４９２ナノメートルであった。

ＨＩＶｐ２４またはｇｐ４１蛋白質のいずれかに対する抗体の血清または尿中で の存在に関する陽性の結果が、平均陰性対照（メーカーにより提供されたもの） の光学濃度（０，Ｄ、）に平均陽性対照（メーカーにより提供されたもの）の光 学濃度を加えた光学濃度総計の０．５倍以下の吸光度値を示したサンプルの全て について現われた。

本発明によってスクリーニングした患者の識別番号と検定結果とを、表１及び２ に掲載し、表３に要約した。

表１ ６３　男　Ａ、−０２９４ｏ＠ 表３ 濃釘多ろミロの［（ｉＶ　ＥＮＶ抗ケに関するＥＬＩＳＡ検での摘要患者のタイ プ　を清／尿　立漬／尿　ａｌｌ／尿　％　ｌ／尿表１及び２を見ると、ＡＩＤ Ｓ関連カボジ肉腫患者の７１゜４％と、ＡＲＣ患者の８１％と、）１１　Ｖ感染 の可能性の高い者の６９．７％と、日和見性感染源感染者の６８．８％とがＨＩ Ｖの膜蛋白質（ｇｐ４１）に対する抗体を尿の中に持っていることと、こうした 抗体が本発明の方法を用いて検出されたこととがわかる。ＨＩＶの膜蛋白質に対 する抗体が検出された患者の全体でのパーセンテージは、７２．２％であった。

核抗原は、６人の無症候性者の尿の中から検出されただけであった。ＡＩＤＳ以 外の病気に罹った患者と正常で健康な異性愛者の全ての血清及び尿は、ＨＩＶ膜 蛋白質に対する抗体とＨＩＶ核蛋白質に対する抗体との双方に関して陰性であっ た。

例３： 例２で分析した尿のサンプルの一部を、２種類の市販の非競合的ＨＩ　ｖＥ　Ｌ 　Ｉ　Ｓ　Ａ検出キットを用いて再検査した。キット■（イリノイ州シカゴのア ボットラボラトリーズ社製の）（ＴＬＶ　ＩＩＩ　ＥＩＡ用具、Ｌｏｔ　Ｎｏ、 １５９０ＨＲＯＯ）は、食品医薬品局（ＦＤＡ）公認の臨床診断キットである。

キットＩＩ（イリノイ州シカゴのアボットラボラトリーズ社製のＥＩＡ臨床診断 用具、カタログ　Ｎｏ、　１０３７　）は、研究用のキットでこれら２種類の用 具の各々は、ＨＩ　Ｖ抗原で被覆したビードと、でイヨウワサビのペルオキシダ ーゼに共役したヤギの抗ヒト抗体と、陽性の対照と、陰性の対照と、サンプル希 釈剤（ウシ及びヤギの血清を含んだもの）と、ＯＰＤ並びにＯＰＤ希釈剤（クエ ン酸−リン酸塩緩衝剤と０．０２％の過酸化水素を含んだ乙の）と、反応トレイ と、検定チューブとを含んでいる。

ＨＩＶに対する抗体の尿中での存在に関する検定は、次のようにして行％　Ｏ７ １−６１０マイクロリツトルの対照または希釈済みサンプルを、反応トレイの予 め選択し７二複数のウェルの中に夫々配合した。各ウェルには、流体を４００マ イクロリツトルまで入れることができるようになっている。２００マイクロリツ トルのサンプル希釈剤と１個のビードとを、各ウェルに加えｋｃこれらの反応物 質を、４０℃で約１時間培養した。その後、上澄（つまり液体）を捨てて、４な いし６ミリリツトルの蒸留水またはイオンを除去した水でビードを３回洗浄した 。２００マイクロリツトルのヤギの抗ヒト抗体（標識したもの）を加え　゛て、 ４０℃で約２時間培養した。上澄を取り除き、ビードを上述のようにして洗浄し た。ビードを検定チューブに移して３００マイクロリツトルのＯＰＤ基質溶液を 加え、この溶液を約３０分間培養した。１ミリリツトルの１規定の硫酸を加え、 この溶液の吸光度を標準型アボットラプス分光光度計（アボットラプス製のモデ ル３３０３−１１）で測定すると、４９２ナノメートルであった。サンプルが平 均陽性対照の０．５ないし１゜５倍の範囲内にある場合には、陽性の値が表示さ れる。

これらの検定の結果を、以下の表４に掲載しである。

表４ 患者番号　キットｌ　キットＩＩ ＡＩＤＳ−ＫＳ　］−ド　ｉｉＦ　ｉＥＨ’１ＶＬｌｔ　尿ＨＩＶＩｉｉＪ１　 １０２９　４７倍 ３　７１６　４２！ ５　８７１　６７！ ７　９５３　４０倍 ８　５（１０９３４＠ ９　５０１８　４５首 １０　５０５７　３９倍 １１　５０６２　４２倍 １．２　１０２８　４８恒 １３　８２８　４２蒼 １４　５０６１　３７信 １６　２７６　２０信 １７　］、０５６　４０ないし２００倍１９　５０１３　３５ｔ：いし２００信 ２０　５０５０　２０倍 ２１　５０７４　４２を ２２　５０８０　４２伝 ＲＣ ａｏ　８５７　６２ないし２００＠ ３１　９２０　４７倍 ３２　５９８　３５倍 ３３　１００２　４０倍 ３４　１０１５　３５倍 ３５　１０１６　３５倍 ３６　９４９　４０倍 ４０　９５６　１００缶 ４１　８３９　４７倍 ＢＩＶＩ！ｃｙＩ：ｃｉいｉ ５２　１０５９　３２倍 ５３　１（１６７４０倍 ５４　１０５７　２８芒 ５５　１０５５　３２倍 ５７　１０５２　３７舒 ５８　Ａ、−０１４５０倍 ５９　Ａ＋−０７８３３＠ ６０　０６９７５５０　４０倍 ６１　０８２０５３５４４倍 ６２　１０６１　４１倍 ６３　Ａ、−０２９４０倍 ６４　Ａ、−１３６４１＠ ６５　Ａ、−］３８　３９倍 ６６　Ａ、−０４４４１倍 ６７　Ａ１Ｊ４５　４０佳 ６８　Ａ、−１７３４２ｍ ６９　Ａ、−００３４２倍 貼 ９８　６４４　４０ｍ ９９　１０６３　２３倍 １００　１５５　４３倍 １０１　１５６　４０＠ １０２　１５７　４０！ 表４に示した結果は、尿中におけるＨＩＶに対する抗体は、一層感度の高いＥＬ ＩＳＡ検定キット（キット１１）を用いた場合には一層容易に検出できることを 示している。この事実は、血清中の抗体に関しても同じである。これらのサンプ ルの幾つかを、以下の例４に記載のようにウェスタンプロット法を用いて更に分 析した。

例４：濃縮した尿のサンプルのウェスタンプロット分析ＨＩ　Ｖに対する抗体の 存在に関するウェスタンプロット分析を、ＨＩＶ血清−陽性者５９人（表１及び に２に掲載された者の中から選ばれた１８人のＡＩＤ−ＫＳ、２７人のＨＩＶ感 染の可能性の高い者、６人のＡＲＣ，８人のＯ，１，患者）と工ＡＩＤＳ以外の 病気に罹っ１こ患者３０人の尿及び血清のサンプルに対して行なった。この分析 には、市販の用具（プラウエア州つィルミントンのＤｌ：ＰＯ１ｉ丁ＤＥ　Ｎｅ ｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、が販売するバイオチック／デュポン社製 ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩ！ウェスタンプロットキット）を使用した。この用具は、 予め切ったニトロセルロースの薄膜細片（ナトリウム　ドデシル基　硫酸塩／ポ リアクリルアミド　ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し１こ固定 されたウィルス性抗原を、薄膜上にエレクトロプロットしたもの）と、対照血清 （陰性の対照、弱陽性の対照及び強陽性の対照を含んだもの）と、プロット緩衝 剤（３重に緩°衝剤で処理した塩類に５％の脱脂乾燥ミルクを混ぜ、更に、熱不 活性化した健康なりギの血清を含めたもの）と、洗浄緩衝剤（３重に緩衝剤で処 理しに塩類にｔ％ｅｅｎ　−２６洗浄剤を含め１こもの）と、ビオチンヤギ抗ヒ トＩｇＧと、アビジン−セイヨウワサビ　ペルオキシダーゼと、４−クロロ−１ −ナフトール溶液と、過酸化水素と、培養トレイとを含んでいる。

洗浄トレイのウェルの中に入れた２ミリリツトルの洗浄緩衝剤に、薄膜細片を室 温で３０分間浸した。そして、この緩衝剤を流し出して捨て、この細片を２ミリ リツトルのプロット緩衝ル２０マイクルリットルを、この細片及びプロット緩衝 剤の入ったウェルに加え、反応物質を、室温で１晩培養した。その後、ウェルの 中の混合物を吸引して捨て、ウェルを２ミリリツトルの洗浄緩衝剤で１回洗浄し た。そして、新にな２ミリリツトルの洗浄緩衝剤での洗浄を、洗浄してから緩衝 剤を捨てるまでの間に細片を５分間ずつ浸しながら、室温で２回繰り返した。

２ミリリツトルの抗ヒトＩｇＧをウェルに加え、揺動装置または回転装置上で室 温で６０分間培養した。次に、１本の細片につき２ミリリツトルの洗浄緩衝剤で 、細片を５分間洗浄した。

そしてこの洗浄過程を、各過程毎に緩衝剤を捨てながら、室温で更に３回繰り返 した。１本の細片につき２ミリリツトルのアビジン−セイヨウワサビ　ペルオキ シダーゼを加えて、揺動装置または回転装置上で室温で６０分間培養した。細片 を上述のようにして３回洗浄した。４−クロロ−１−ナフトール溶液と過酸化水 素との５０対５０の混合液２ミリリツトルを加え、１０ないし１５分間または色 が現われるまで室温で培養した。細片上に色が現われたことは、ＨＩＶに対する 抗体を含んだ尿にこの細片が触れたことを示している。

これらの細片を、メーカーから供給され７：対照を用いて、ＨＩＶに対する抗体 の存在に関し、陰性（−）つまり抗体不検出か、弱陽Ｌ（±）か、または強陽性 （＋）として記録した。その結果を、表５及び第１図に掲載しである。

表５ ７２Ａ２−１３２４＋＋＋−ｒ−。

７４　Ａｌ−０６０−−−−−−− ７５Ａｌ−１７８＋　＋　÷　＋　十　−中７９　ｖｌＢ　＋　◆　＋　４　− 　↑　４９０１０９８＋＋＋十＋＋＋ １０３　１１０８　＋　−門　＋　１　−　↓１０４　１１１２−−−　＋　＋ 　−十１０５１１１３−−＋＋＋＋４ １１３　４７Ｋ　÷　＋　＋　＋　呼　＋　＋＊・、？計不１１巣 表６ 表５を参照して、ｐｌ７はｐ５５のｐ２４への分裂時に生成される蛋白質構成要 素であり、ｐ２４はウィルス性蛋白質であり、ｐ３１はウィルス性エンドヌクレ アーゼであり、ｐ４１は成熟した膜蛋白質であり、ｐ５１及びｐ６６はウィルス 逆転写酵素の構成要素であり、ｐ５５はウィルス核蛋白質の前駆物質であり、ｐ ｌ６０は膜蛋白質の前駆物質であり、ｐＨｏ／１２０はこのゲル系内を共に遊走 する２つの蛋白質の混合体であり、ｐｌ２０はｐｌら０蛋白質のｇｐ４１への成 長時に生成される蛋白質構成要素であり、ｐＨＯは未だ機能の解明されていない ウィルスの蛋白質構成要素である。

本発明の方法の実施によって得た濃縮済み尿サンプル及び血清サンプルの典型的 なウェスタンプロット分析の一例を、第１図に示しである。第１図を参照して、 レーン２２は陰性対照であり、レーン２３は弱陽性対照であり、レーン２４は強 陽性対照である。右側の数字は、上述の様々なＨＩＶ蛋白質を表わしている。レ ーン１２から１６及び１８から２１は、表５の対応する数字の患者のサンプルで ある。例えば、ＡＲＣ患者Ｎ０゜９５６（第１図のレーン１６）から採取した尿 は、ｐ２４（核）とｐｌ７とを除く全てのＨＩＶ蛋白質に対する抗体を含んでい る。この発見の意義は今日まだ知られていない。

表５のデータ及び表６の要約データかられかる通り、ＨＩＶ抗原に対する抗体は 、この一層感度のよい検定法を用いることにより、濃縮した尿の中から容易に検 出することが８きる。特に、ｐｌ６０に対する抗体は、検査したＨＴＶ血清−陽 性者５９人のうち５５人（９３，２％）から検出された。これらの結果は、本発 明のこの好適な実施例における濃縮済み尿の使用が偽陽性に帰着しないことをも 表わしている。何故なら、特異つ免疫電気泳動分析 濃縮済み尿サンプルＮｏ、９５６　（表１）（これは、ウェスタンプロット分析 によりＨＩＶ抗原に関して陽性と判定され、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより膜蛋白質に対 する抗体を検出されている）を、更に２００倍に濃縮して、二重拡散勾配免疫電 気泳動法（ＤＤＧ−ＩＥＰ）により、Ｊ、Ｖ、チューμがＪ　、　Ａｐｐ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ。

１：３７−５０．１９７９年に記載した通りに分析しに。この患者の血清サンプ ルも、陽性対照として、尿サンプルと並行して採取及び分析した。

概略としては、３マイクロリツトルの尿と血清の複製サンプルの夫々を、市販の ０．５％のアガロース薄膜ゲル（カリフォルニア州ブレアのベツクマンインスツ ルメンツ社製のバラボン）の中で電気泳動させた。ゲルに直角に溝を設置して、 そこに抗血清を入れた。電気泳動は、僅かに改造しｆ；ハイランドパワーパック （カリフォルニア州メサのコスタ社製）によりゲルに４０ミリアンペアの直流を ２０分間流すことによって行なった。

流動緩衝剤は、バルビタール緩衝剤Ｂ−２（０，０７５Ｍ、　ｐＨ８，６であり 、０．２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムを含有）に同量の３．０ｍＭ水性カル シウム乳酸塩溶液を混ぜたものである。

電気泳動の後、予め切ったスリットの間の対応のゲル片を取り除くことにより、 抗血清の溝を仕上げた。そして、通常の平行溝免疫拡散を行なった。抗ヒトｌ１ ＧＳ　ＩｇＭ及びＩｇＡ（カリフォルニア州すンディエゴのベーリングダイアグ ノスティック社製）を５．５マイクログラム／ミリリツトルの濃度で溝に７．５ マイクロリットル加えて、室温で２０分間培養した。その後、ゲルを染色してベ ルシピチン線の発生に関して検査した。

抗ヒト抗体は、陽性対照としての血清サンプル中に含めた。

第２図に示したように、ＩｇＧ（１１）及びＩｇＡ（１３）免疫グロブリンが、 Ｎｏ、９５６の患者の尿サンプル中に同定された。ＩｇＭは、血清中には存在し ていたが、尿（１２）中には現われなかった。しかし、ＩｇＭの大きさく約９０ ０，０００ドルトン）からすれば、このことは驚くにはあたらない。

（１０）は、抗アルブミン抗体が血清サンプルと反応して鋭い識別ベルシビチン 線を構成したものと考えられる（レーン１）。

これらの結果は、ＥＬ　Ｔ　ＳＡ及びウェスタンプロット検出処置に上って得ら れた陽性の結果を裏書きするものであり、その陽性の結果が濃縮済み尿サンプル の使用を原因とする人為構造によるものでないことを表わしている。

ＦＩＧ、　ｉ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （”ＦＦｍ１１８“９″４”１３　ｊ 昭和６３年１２月１６日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、国際出願番号　ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０１３０４２、発明の名称　ヒト免疫 不全ウィルスに対する抗体の検出方法 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国　ニューヨーク　１００１２　ニューヨークワシントン 　スフウェア　サウス　７０氏名　ニューヨーク　ユニパーシティ 国　籍　アメリカ合衆国 ４、代理人 住　所　東京都中央区八重洲２丁目１番５号５、補正書の提出年月日　１９８８ 年８月３０日６、添付書類の目録 ■　補正書の写しく翻訳文）　１通 ７、前記以外の代理人 住　所　東京都中央区八重洲２丁目１番５号東京駅前ビル６階　電話２７５−３ ９２１請求の範囲 ■、哺乳動物の尿のサンプルを採取する過程と、所定量の前記サンプルを、ヒト 免疫不全ウィルスに対する抗体を検出するために検定する過程と、 を含んだ、ヒト免疫不全ウィルスに対する抗体の検出方法。

２、前記検定過程の前に前記サンプルを所定レベルにまで調節する請求の範囲第 １項記載の方法。

３、前記サンプルを最初の排泄時体積の２０分の１以下に減少させる請求の範囲 第２項記載の方法。

４、前記検定を酵素結合免疫吸収検定法を用いて行なう請求の範囲第１項記載の 方法。

５、前記抗体をウェスタンプロット分析法を用いて検出する請求の範囲第１項記 載の方法。

６、前記抗体を免疫拡散法を用いて検出する請求の範囲第１項記載の方法。

７、前記抗体はヒト免疫不全ウィルスウィルス性蛋白質に対する抗体を含んだ請 求の範囲第１項記載の方法。

８、前記抗体はヒト免疫不全ウィルスウィルス性蛋白質ｇｐ４１に対する抗体で ある請求の範囲第７項記載の方法。

９、前記抗体はヒト免疫不全ウィルスウィルス性蛋白質ｐ２４に対する抗体を含 んだ請求の範囲第１項記載の方法。

１０、前記抗体はヒト免疫不全ウィルスウィルス性蛋白質ｐ１６０に対する抗体 を含んだ請求の範囲第７項記載の方法。

１１、前記抗体は免疫グロブリンＧである請求の範囲第１項記載の方法。

１２、前記抗体は免疫グロブリンＡである請求の範囲第１項記載の方法。

１３、検出対象のウィルス性物質に対する免疫のない哺乳動物の尿のサンプルを 採取する過程と、 前期サンプルの体積を、前記ウィルス性物質に対する抗体の検出のために、所定 体積に調節する過程とを含んだ、哺乳動物の体内のウィルス性物質の検出方法。

１４、前記検出の前に前記サンプルの体積を減少させる請求の範囲第１３項記載 の方法。

１５、前記サンプルを排泄時の２０倍以上に濃縮する請求の範囲第１３項記載の 方法。

１Ｇ、前記ウィルス性物質はヒト免疫不全ウィルスを含んだ請求の範囲第１３項 記載の方法。

１７、ヒトの尿のサンプルを採取する過程と、前記サンプルをヒト免疫不全ウィ ルスに対する抗体の存在に関して検定する過程とを含んだ、ヒトの体内における ヒト免疫不全ウィルスに対する抗体の検出方法。

１８、前記抗体はｐｌ？、ｐ２４、ｇｐ４１．ｐ３１．ｇｐ４１、ｐ５ｉ、ｐ５ ５、ｐ６６、ｐｚｏ、ｐ１２０及びｐ１６０のうちの少なくとも１種類を含んで いる請求の範囲第１項記載の方法。

１９、前記抗体はｐ１７、ｐ２４、ｇｐ４１．ｐ３１．ｇｐ４１゜ｐ５１、ｐ５ ５、ｐ６６、ｐｌｌｏ、ｐ１２０及びｐ１６０のうちの少なくとも１種類を含ん でいる請求の範囲第１６項記載の方法。

国際調査報告

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の尿のサンプルを採取する過程と、前記サンプルを、ヒト免疫不全 ウイルスに対する抗体の存在に関して分析する過程と を含んだ、ヒト免疫不全ウイルスに感染した哺乳動物のスクリーニング方法。
2. ２．前記スクリーニングの前に前記サンプルの体積を減少させる請求の範囲第１ 項記載の方法。
3. ３．前記サンプルを最初の排泄時体積の２０分の１以下に減少させる請求の範囲 第２項記載の方法。
4. ４．酵素結合免疫吸収検定法を用いてスクリーニングを行なう請求の範囲第１項 記載の方法。
5. ５．ウエスタンブロット分析法を用いてスクリーニングを行なう請求の範囲第１ 項記載の方法。
6. ６．免疫拡散法を用いてスクリーニングを行なう請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記抗体はヒト免疫不全ウイルスのウイルス性蛋白質に対する抗体である請 求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記抗体はヒト免疫不全ウイルスのウイルス性蛋白質ｇｐ４１に対する抗体 である請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．前記抗体はヒト免疫不全ウイルスのウイルス性蛋白質ｐ２４に対する抗体で ある請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．前記抗体はヒト免疫不全ウイルスウイルス性蛋白質ｐ１６０に対する抗体 である請求の範囲第７項記載の方法。
11. １１．前記抗体は免疫グロブリンＧである請求の範囲第１項記載の方法。
12. １２．前記抗体は免疫グロブリンＡである請求の範囲第１項記載の方法。
13. １３．検出対象のウイルス性物質に対する免疫のない哺乳動物の尿のサンプルを 該ウイルス性物質に対する抗体の存在に関して検定する過程を含んだ、哺乳動物 の体内におけるウイルス性物質の検出方法。
14. １４．前記検定の前に前記サンプルを十分に濃縮する請求の範囲第１３項記載の 方法。
15. １５．前記サンプルを排泄時の体積に対して２０倍以上に濃縮する請求の範囲第 １３項記載の方法。
16. １６．ヒトの尿のサンプルをヒト免疫不全ウイルスに対する抗体の存在に関して 検定する過程を含んだ、ヒトの体内におけるヒト免疫不全ウイルスに対する抗体 の検出方法。
17. １７．尿のサンプルを採取する過程と、前記サンプルをヒト免疫不全ウイルスに 対する抗体の存在に関して分析する過程と を含んだ、ヒト免疫不全ウイルスに対する抗体の検出方法。
18. １８．前記分析過程の前に前記サンプルの体積を減少させる請求の範囲第１７項 記載の方法。
19. １９．前記サンプル最初の排泄時体積の２０分の１以下に減少させる請求の範囲 第１８項記載の方法。