PT85992B

PT85992B - Processo para a preparacao de um agente de determinacao de anticorpos do virus da deficiencia imunitaria humana (hiv) e processo de determinacao de anti-hiv mediante o uso deste agente

Info

Publication number: PT85992B
Application number: PT85992A
Authority: PT
Inventors: Udo Krupka; Thomas Buck; Hans Erwin Pauly
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1986-10-27
Filing date: 1987-10-26
Publication date: 1990-08-31
Also published as: ES2061468T3; FI90801B; MX168853B; DK559187A; NO171754C; DE3636540A1; AU611102B2; EP0265851A2; CA1305411C; PT85992A; FI874676A0; EP0265851A3; ATE101725T1; JPS63128260A; EP0265851B1; NZ222282A; DE3789087D1; NO874453L; NO874453D0; DK559187D0

Description

Memória descritiva referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial» com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Udo Krupka, Dr_o Thomas Buck e Dr. Hans Erwin Pauly, residentes na República Federal Alemã), para: PROCESSO FARÁ A PREPARAÇÃO DE UM AGENTE DE DETERMINAÇÃO DE ANTICORPOS DO VIRUS da deficiência imunitãria HUMANA (HIV) E PROCESSO DE DETERMINAÇÃO DE ΑΝΤΙ-HIV MEDIANTE 0 USO DESTE AGENTE

Memória Descritiva

A presente invenção refere-se a um processo para a determinação imunoquímica de anticorpos específicos em relação a HIV que usa o principio da competição bem como a agentes apropriados para este processo e a respectiva utilização. 0 processo é apropriado para a análise qualitativa e quantitativa com alta sensibilidade de anticorpos específicos em relação a HIV das classes IgG e IgM em humanos.

* Oonsidera-ss como agente causador da ? 2. doença conhecida abreviadamente por SIDA (síndroma de imuno-

deficiência adquirida), que apresenta uma alta taxa de mortalidade, um virus (retrovírus) ou um grupo de vírus infimamente relacionados que é actualmente designado por vírus da imunodeficiência humana (HIV) mas também conhecido por vírus linfotrópico T tipo III (HTLV III) ou Lymphadenopat

Associated Virus (LAV).

vírus pode transmitir-se através de sangue humano ou de preparações de sangue contaminadas e pode ser isolado a partir de secreções de líquido espermático , de líquido lacrimal e de saliva.

A determinação serológica de anticorpos específicos em relação ao HIV foi proposta com o fim de averigurar se um indivíduo teve contacto com o vírus e pode considerar-se como um potencial portador do agente infeccioso. A determinação do instrumental de diagnóstico da SIDA (conjuntamente com outras investigações e com a anamese) na redução do risco de transferência do agente da doença por meio de transfusões, de transplantações de órgãos, de derivados do sangue ou de esperma por exclusão de dadores dos indivíduos positivos em relação a anticorpos. Além disso a determinação de anticorpos de HIV tem grande importância para os chamados grupos de alto risco (homossexuais, toxicodependentes. hemófilos e filhos de mães infectadas) bem como nas investigações epidemiológicas.

Adetecção de anti-HIV por meio do uso da técnica de mancha de Western tal como é descrita, por exemplo, na patente USP 4 520 113 constitui o método de detecção de anticorpos específicos de HIV utilizável actualmente. De acordo com esta técnica, material proteico de HIV inactivado é separado por electroforese de acordo com o peso molecular e em seguida é depositado em papel de nitrocelulose, de preferência por meio de electroforese. Oom o antigene imobilizado deste modo, é possível, de acordo com uma alteA ração da patente USP 4 520 113, em que se usa uma análise de RIA, efectuar uma análise indirecta de ELISA sem perda de

sensibilidade, sendo possível visualizar as bandas em que tem lugar uma reacção imunológica mediante o uso de sistemas de coloração pouco solúveis na reacção enzimática. E possível deste modo distinguir entre bandas coradas específicas de virus e contaminações específicas em relação a antigenes não virais bem como de contaminações de reacções cruzadas ou de reacção não especificas após aferição com o material de comparação correspondente, conseguindo deste modo uma discriminação entre as reacções realmente positivas e as reacções positivas fálsas.

Para além disso foi descrito um processo de análise ELISA competitiva que preenche os critérios da técnica de mancha de Western (Arzte-Zeitung/Nr. 1,25./26.10.85, pág. 20) no que respeita à especificação e à sensibilidade.

Neste processo utilizam-se amostras não diluídas. Permite detectar simultaneamente anticorpos específicos de HIV das classes IgG e IgM. 0 processo pode ser realizado com um conjunto de análises da companhia Welcome conhecido como Wellcozyme Anti-HTLV III. Para a fase sólida utilizam-se placas de microanálise às quais se encontram I ligados os anticorpos de HIV purificados nos quais, por sua vez, se encontram imobilizados imunoquimicamente os antigenes de HIV. As amostras são incubadas nas cavidades (alvéolos) em conjunto com anti-HIV contendo uma marcação de peroxidase de rábano. Deste modo tem lugar uma competição entre os anticorpos contra HIV e o anti-HIV contendo a marcação em relação aos locais de ligação do HIV na fase sólida. A quantidade dos anticorpos ligados nos alvéolos é inversamente proporcional à concentração de anti-HIV na amostra.

Com grande frequência é possível responsabilizar pelos resultados positivos falsos em outras aaálises utilizadas actualmente os antigenes de leucócitos • humanos da classe II (HLA II, especialmente DR4) que derivam

das linhas de células de linfócitos humanos habitualmente utilizados para a cultura de HIV e que podem provocar resultados positivos falsos especialmente em pacientes submetidos a várias transfusões (anti-HLA DR4).

Este tipo de reacções não específicas são de excluir no conjunto de análise competitiva referida para a detecção de anticorpos específicos de HIV (Walgate R., Beardsley T., (1986) Nature 520 96) devido à utilização da linha de células humanas OCRF-CEM para a pesquisa de vírus, uma vez que estas células não possuem qualquer HLA da classe II.

Quando se utilizou a análise ELISA competitiva descrita HIV cultivado na linha de células H9 conhecida por conduzir a melhores rendimentos, foi averiguado que eram necessárias quantidades de material virai de partida extremamente elevadas tanto com o fim de permitir, por um lado, purificar os anticorpos de detecção para a imobilização sobre a fase sólida como para obter, por outro lado, uma saturação em antigene necessária para uma sensibilidade máxima dos anticorpos de detecção imobilizados no plástico, verificando-se além disso, que a purificação por imunoadsorção de soro humano tendo em consideração uma elevarão da especificidade decorre de forma pouco satisfatória quando se utiliza material antigénico de HIV cultivado em H9 e portanto contaminado com antigenes nucleares, mitocondriais e leucocitários. Para além disso, foram obtidos apenas rendimentos muito reduzidos de anticorpos específicos humanos, tornando impossível a utilização em análises de detecção em quantidade por razões económicas.

Descobriu-se que é possível um processo competitivo para a análise qualitativa e quantidade de anticorpos contra HIV tanto da classe IgM como da classe IgG mediante a utilização duma fase sólida na qual estão ligados directamente, portanto sem a ligação intermédia de anticorpos, antigenes HIV que também podem conter como impurezas

~ antigenes provenientes das células hospedeiras, quando se utilizam anticorpos contra HIV marcados que reagem tanto com antigenes das células hospedeiras como com qualquer antigene proveniente de tecido humano.

objecto da presente invenção é um processo imunoquimico competitivo para a análise qualitativa e quantitativa de anticorpos contra HIV mediante o uso duma fase sólida constituída por um suporte, por proteínas do invólucros e do núcleo de HIV ligadas ao suporte e por anticorpos dirigidos contra as proteínas do invólucro e do núcleo do HIV de tal modo que os anticorpos competem para os locais de ligação à fase sólida caracterizado por as proteínas estarem ligadas ao suporte de modo irreversível directamente ou através dum espaçador de ligação que estabelece uma ligação não imunoquímica.

Os anticorpos marcados usados no processo são de tal modo que não reagem com antigenes duma célula hospedeira isenta de HIV ou dum meio para as células hospedeiras nem com tecidos humanos isentos de HIV.

objecto da presente invenção abrange ainda um agente de análise para a detecção ou para a determinação de anticorpos contra HIV por meio dum processo imunoquímico competitivo mediante o uso dum suporte ao qual estão ligadas proteínas do invólucro e do núcleo de HIV de modo irreversível directamente ou através dum espaçador de ligação que estabelece uma ligação não imunoquímica bem como anticorpos marcados contra as proteínas do invólucro e do núcleo e eventualmente dum agente para a detecção da marcação.

Constitui uma vantagem o facto de a sensibilidade do processo da presente invenção corresponder à sensibilidade da técnica de mancha de Western, uma vez que mesmo amostras com títulos de em anticorpos contra HIV . reduzidos provocam uma inibição significativa da ligação dos í anticorpos marcados, o que, por exemplo por meio do uso de

marcadores enzimáticos, permite uma avaliação visual do desenvolvimento da coloração e permite uma discrimnação das amostras positivas e negativas com um poder de separação extraordinariamente elevado que também abrange seguramente conversões precoces de soro causadas por anticorpos IgM específicos de HIV de modo a evitar a ocorrência de interferências e dos consequentes resultados positivos falsos por antigenes leucocitários humanos (HLA), antigenes nucleares ou antigenes mitocondriais de tal modo que se torna supérflua uma verificação por meio de antigenes de comparação como habitualmente provenientes das células hospedeiras para comprovação se um resultado positivo é específico, que se garanta uma determinação segura de anticorpos específicos de HIV em soro, plasma de citrato, de heparina ou de EDTA bem como em plasmas recalcificados de origem humana e que uma inactivação das amostras durante 30 min a 55°C (inactivação de HIV) e mesmo durante 10 h a 60°C (inactivação do virus da hepatina B) não conduz a resultados falsos positivos.

Para a fase sólida podem ser produzidas preparações antigénicas de HIV obtendo em primeiro lugar células T positivas em relaçãe a HIV conforme descrito em W085/o4897 e obtendo-se uma preparação antigénica de HIV como apresentado em USP 4 520 113. De acordo com esta técnica propaga-se em primeiro lugar o HIV após transmissão na linha de células T humanas H9 por meio duma cultura conjunta com linfécitos dum paciente com SIDA e em seguida separa-se por ultra-centrifugação do sobrenadante da cultura de células hospedeiras. Após eliminação dos resíduos celulares e da gordura, purifica-se o material virai por meio duma centrifugação com gradiente de densidade de sucrose e em seguida inactiva-se por meio de adição de ^Triton e por tratamento por calor.

Como materiais de suporte para a fase sólida são apropriados plásticos, como polistireno, cloreto

de polivinilo, poliamida, e outros polímeros sintéticos, polímeros naturais como celulose bem como polímeros naturais derivatizados, como acetato de celulose e nitrocelulose e ainda suportes à base de vidro, especialmente sob a forma de fibras de vidro.

Os suportes podem ter a forma de esferas, cilindros, pequenos tubos e de plascas de mioroanálise, Igualmente são apropriados corpos com a forma de película, como tiras de papel, pequenas placas ou membranas, As superfícies do suporte podem ser permeáveis a soluções aquosas mas também podem ser impermeáveis.

São considerados preferidos suportes como esferas, pequenos tubos, tiras de papel e membranas» Considera-se preferido duma forma especial o suporte constituído por placas de microanálise.

A fase sólida é preparada de tal modo que a preparação antigénica de HIV é ligada de forma irreversível ao suporte.

Uma ligação irreversível no sentido dado na presente invenção é constituída por exemplo por

1) uma ligação de absorção que não seja cindida por agentes imunoquímicos, como anticorpos de elevado afinidade^ nem pelos agentes usados no processo, como sejam anticorpos marcados e soluções de diluição ou tampão,

2) uma ligação de bioafinidade mediada por um espaçador de ligação não imunoquímico, sendo o espaçador constituído por biotina e avidina ou por outros pares de receptores e ligandos,

3) uma ligação covalente directa

4) uma ligação covalente msdihda através dum espaçador químico bifuncional.

Considera-se preferido uma ligação covalente no caso de utilização de suportes permeáveis à água e uma ligação de absorção tanto no caso de utilização de suportes permeáveis como impermeáveis à água.

Considera-se especialmente preferida a ligação directa por absorção de preparações antigánicas de HIV a um suporte de polistireno tratado por meio de radiação gama.

Os anticorpos apropriados são seleccionados para a marcação com base nos resultados da análise por mancha de Western do soro de pacientes com SIDA.

A fim de minimizar o risco dum diagnóstico negativo falso torna-se necessário, de acordo com o estado actual da técnica, que, num processo para o reconhecimento de pré-SIDA e de SIDA, seja dada a possibilidade de detecção de pelo menos duas especificidades de anticorpos, nomeadamente os anticorpos para uma protdna nuclear e os para uma proteína | do invólucro,

Consideram-se combinações apropriadas do ponto de vista da especificidade por exemplo aquelas em que se reconhecem

1. a proteína nuclear denominada por p24 e a proteína do invólucro denominada por SP41 ou

2. as proteínas do invólucro denominadas por p24 e por gP12O.

A detecção de outras especificidades, • nomeadamente as das proteínas nucleares denominadas por pl8.

p30 e ρ55 e as polimerases de HIV denominadas por p53 e p65 significa uma certificação adicional da detecção de amostras positivas em relação a anti-HIV.

A fim de excluir um diagnóstico positivo falso, os anticorpos que se pretende marcar não devem ter qualquer especificidade que reconheça componentes de tecidos humanos, como, por exemplo, antigenes leucocitários, e proteínas nucleares ou mitocondriais.

Para a marcação podem usar-se anticorpos de pacientes com SIDA se estes preenchem os critérios descritos anteriormente por análise de acordo com a técnica de mancha de Western.

Para além disso, podem usar-se anticorpos policlonais obtidos a partir de soro de animais imunizados com HIV quando estes, após absorção das especificidades que reconhecem os componentes de tecidos humanos e do meio de cultura, preenchem os referidos critérios de acordo com a análise da mancha de Western.

T_ambém são apropriados anticorpos monoclonais. Neste caso devem ser usados pelo menos dois anticorpos . numa das combinações de especificidades referidas, por exemplo na combinação anti-p24 e anti-gp41.

Como marcadores podem ser usados isotopos radioactivos, corantes fluorescentes ou quimioluminescentes bem como enzimas cuja detecção seja possível por meio de sistemas de substratos cromogénicos, luminogénicos ou fluorogénicos.

A marcação é levada a efeito de acordo com processos descritos para os referidos marcadores de acordo com o estado da técnica.

No caso da marcação dos anticorpos com peroxidase pode ser usada a técnica de periodato de acordo com N_akane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem, 22, 1084-1090, ou um processo segundo Ishikawa et al., 1983, J. Immunoassay 4, 209-327, no qual os compostos participantes na reacção são acoplados com um reagente heterobifuncional.

processo da presente invenção pode ser realizado por exemplo por

a) adição simultânea da amostra e duma solução do anticorpo marcado ou eventualmente em primeiro lugar da amostra e depois dum período conhecido duma solução do anticorpo marcado, eliminação da solução depois dum determinado tempo de incubação e lavagem dos alvéolos com um tampão seguida de medição da marcação nos alvéolos ou

b) adição em primeiro lugar duma solução contendo o anticorpo marcado, eliminação depois dum tempo determinado de incobação da solução e lavagem dos alvéolos com um tampão, secagem eventual das microplacas, adição em seguida da amostra diluída e incubação durante um tempo determinado, retirando-se em seguida a amostra dos alvéolos e medindo-se a marcação na amostra, nas cavidades (alvéolos) duma placa de microanálise que contém ligada uma preparação antigénica de HIV como anteriormente descrito.

processo da presente invenção pode também ser levado a efeito mediante a utilização dum elemento de diagnóstico que contenha a fase sólida e os reagentes necessários em parte ou no todo sob forma seca.

O exemplo que se segue destina-se a apresentar uma forma de concretização da invenção sem de qual- 10 -

quer modo limitar com isso o respectivo âmbito.

Ey emolo

1. Ligação de antigene de HIV a placas de microanálise

Una preparação antigenica de HIV preparada de acordo com a patente USP 4 520 113, purificada por centrifugação com gradiente de densidade de sucrose e inactivada por calor foi pré-diluída com carbonato de sódio a 100 mmol/1 a pH 9, 6 até 50 jag/ml de proteína. A partir desta diluição foi construiJa uma série dupla de diluições no mesmo tampão com 10 diluições, obtendo-se portanto uma série com as concentrações 50; 25/ 12,5; 6,25, 3,12; 1,56; 0,78; 0,39; 0,2 e 0,1 T_omaram-se 100 ul de cada diluição d depositaram-se em 16 alvéolos de placas de microanálise tipo B da companhia Nu.nc, R_oskilde, Dinamarca. Ag microplacas cheias com as diluições foram deixadas em repouso durante 18 horas a 20°C, em seguida aspiraram-se as soluções dos alvéolos e lavaram-se os alvéolos 3 a 4 vezes com 200 ul duma solução de 10 g/1 de albumina de soro de bovino a pH 7,4 (PSB) por sucessivas operações de enchimento e aspiração e finalmente secaram-se as microplacas sobre gel de sílica a 20°C.

2. P_reparação dum anticorpo contra HIV marcado com peroxidase

Soro dum paciente com SIDA seleccionada pela técnica de mancha de Western que contém especificidades de anticorpos para as proteínas nucleares pl8, p24, p30 e p55, para as proteínas do invólucro p41 e 9pl2O bem como para as polimerases de HIV p53 e p65 foi fraccionado por cromatografia em DEAE-celulose. Para este fim submeteu-se o soro a diálise

contra tampão de Na^PO^/Naf^PO^, a pH 7,0 e adicionou-se a uma coluna cheia com DEAE-celulose de 32 (Whatman) e equilibrada com o mesmo tampão. A fracção de IgG obtida na passagem foi dialisada contra PBS e ajustada a 4 mg/ml de proteína.

Uma nova análise pela técnica de mancha de Western revelou que todas as especificidades de anticorpos mencionados acima se encontravam ainda na fracção de IgG.

A fracção de IgG foi em seguida feita reagir com N-gama-maleimidobutililoxissucinimida (GMBS), obtida da companhia Béhring Diagnostica, como descrito por Tanamori et al», 1983 em J. Immunol. Meth. 62, 123-131. Tratou-se cloridrato de 2-iminotiolano (Sigma, na de cat. I 6256) com peroxidase de rábano (POD) obtida da companhia Boehringer Manriheim, nfi de cat. 413470, como descrito por King et al. 1978 em Biochem. 17, 1499-1506. A partir do conjugado GMBS-IgG e do conjugado iminotiolano-POD preparou-se um conjugado IgG-POD conforme descrito por T_anamori.

A solução obtida do conjugado IgG-POD tinha um conteúdo em proteína de 440 ug/ml. A proporção entre a POD e a IgG foi determinada, tendo-se obtido o valor de 2,5. A solução foi por fim diluída até 500 ng/ml com uma solução de soro fetal de vitela a 5o ml/1, monolaurato de polioxietileno-(20)-sorbitano (RTwenn 20) em PBS e recebeu a designação de anti-HIV-POD.

3. Obtenção duma preparação TMB-substrato.

Para a detecção de anti-HIV-POD utilizou-se um sistema de substratos ou uma composição de substratos contendo peróxido de hidrogénio e tetrametilbenzidina (TMB) formada a partir de duas soluções base.

S_olução de base lt Dissolveu-se dicloridrato de TMB com agitação em água bidestilada numa concentração de 5 g/1, isto e de 16 mmol/1 e ajustou-se a pH - 12 -

1,5 com ácido clorídrico 5 normal. A esta solução adicionou-se penicilina G com agitação até uma ooncentração final de 200 mg/1, ou seja? de 0,56 mmol/1.

S_olução de base 2: A 900 ml de água bidestilada adicionou-se 1,4 ml de ácido acético glacial, 1,5 ml de NaOH normal e 250 mg, ou seja 3 mmol de H₂O₂sob a forma de aducto de peréxido de hidrogénio com ureia. Após dissolução completa preencheu-se o volume a 1 1 com água bidestilada.

P_reparação de substrato de TMB: Misturaram-se entre si uma parte em volume da solução de base 1 e 10 partes em volume da s olução de base 2.

Optimização do processo

Diluiram-se, 16 soros que se tinha verificado serem negativos em relação a HIV de acordo com a técnica de mancha de Western, com solução de anti-HIV-POD numa proporção de 1:5 (1 parte em volume de soro para 4 partes em volume dm anti-HIV-POD).

Adicionaram-se 125 ul da solução diluída em todos os alvéolos das microplacas tratadas com preparação antigénica de HIV e incubou-se durante lha 27°C. as soluções diluídas foram retiradas por aspiração e os alvéolos foram lavados quatro vezes com uma solução de R Tween 20 a 1 g/1 em PBS por sucessivas operações de enchimento e de aspiração. Em seguida adicionaram-se a cada alvéolo 100_xul de preparação de substraco de TMB e incubou-se durante 30 minutos a 22°C. A incubação foi terminada por adição a cada alvéolo de 100 jil de ácido sulfúrico 1 normal. A extinção da solução foi medida contra PBS a 450 nm.

As soluções dos alvéolos que tinham sido revestidos com antigene de HIV a 3,12 jug/ml apresentaram uma E45O entre 1,68 e 1,74. As soluções dos alvéolos que tinham sido revestidos com antigene de HIV a 1,56 /ig/ml apresentaram uma E450 entre 1,38 e 1,45.

Trataram-se então os alvéolos da microplaca do modo anteriormente descrito com uma preparação artigenica de HIV exclusivamente da concentração de 2,5 >ig/ml« A determinação da E45O dos 16 soros dos alvéolos tratados com a preparação antigénica de HIV deu para o mesmo período de e nsaio um valor médio de 1,56 ± 0,05.

Uma vez que se prevê apropriado na determinação de anti-HIV a adopção dum valor limite de E superior a 0,8 para as amostras negativas em relação a anti-HIV e de E inferior a 0,8 para amostras positivas em relação a anti-HIV (o valor limite e definido como metade da extinção média de amostras confirmadas como positivas), foi escolhida a concentração de 2,5 pg/ml de preparação antigénica de HIV para a preparação de microplacas no tratamento dos alvéolos também designado como revestimento.

Também foram utilizados em todas as determinações de anti-HIV os reagentes usados nas experiências prévias até aqui descritas, nomeadamente o anti-HIV-POD, a preparação de substrato de TMB e a solução de 1 g/1 de Tween 20 em PBS, no que se segue designado por tampão de lavagem.

5. Determinação do art icorpo humanos contra HIV

a) Adicionaram-se 25 _yul de soro ou de plasma e 100 /11 de anti-HIV-POD nos alvéolos da microplaca de anti-HIV e incubou-se durante lha 37°C. 0 conteúdo dos alvéolos foi retirado por aspiração e os

alvéolos foram lavados quatro vezes com tampão de lavagem. Adicionaram-se em cada alvéolo 100 ^ul da preparação do substrato de TMB, incubou-se durante 30 min a uma temperatura de 20 a 22°C e terminou-se a incubação por adição de 100 μιΐ de ácido sulfúrico 1 normal. A 450 da solução fo medida contra um branco de PBS.

F_oram consideradas como positivas em relação a anti-HIV as amostras que apresentam uma 450 inferior a 0,30, como situadas no limite as amostras cuja E45O se situava num domínio de 0,31 a 0, 80 e como negativas para anti-HIV as amostras com uma E45O superior a 0,81.

DE 420 amostras que eram positivas de acordo com a técnica de mancha de Western, verificou-se que 419 amostras eram realmente positivas.

A partir de 1986 amostras de plasma ou de soro de pessoas saudáveis ou com outros estados patológicos, foram obtidos os dados apresentados no Quadro 1.

QUADRO 1

	n	Amostras posi- Amostras ; tivas ou no petidas
limite	positivas
Colectivo normal	1150	0	0
Amostras de grupos de risco	329	5	2
Lupus erythematodes	30	0	0
Soros com anticorpos contra
antigenes leucocitários	29	0	0
antigenes nucleares	5	0	0
antigenes mitocondriais	5	0	0
Soros HBsAg-positivos	16	0	0
Soros positivos anti-HBV	17	0	0
Soros com valores elevados de
triglicerídeos	5	0	0
bilirrubina	5	0	0
Soros hemolíticos	5	0	0
Soros dos próprios dadores
Soros	100	0	0
Plasmas com citrato	100	0	0
Plasmas com heparina	100	0	0

As 5 amostras dos dadores de grupos de alto risco que inicialmente tinham apresentado reacções positivas ou no limite foram adicionalmente analisadas pela técnica de mancha de Western. Neste ensaio só foram também positivas duas amostras que de acordo com o processo da presente invenção tinham dado resultados positivos na repetição.

Os resultados mostram portanto que há uma boa concordância entre o processo da presente invenção e a técnica de mancha de Western.

Diluiram-se amostras de 50 /11 de sangue integral com 50 ,ul de água destilada contendo 20 g/1 de

Triton x 100 e O, 2 mol/1 de citrato trissodico e depositaram-se 50 ul deste lisado nos alvéolos de placas de microanálise. Após uma incubação de 1 h a 37°C seguiu-se a adição de 100 /11 de anti-HIV-POD com nova incubação de 1 h a 37°C. 0 conteúdo dos alvéolos foi retirado por aspiração e os alvéolos foram lavados cinco vezes com tampão de lavagem. Adicionaram-se a cada alvéolo 100 /11 de preparação de substracto de TMB, incubou-se durante 30 min a uma temperatura de 20 a 25°C e terminou-se a reacção por adição de 100jlI de ácido sulfúrico 1 normal. A extinção das soluções foi medida a 450 nm contra um branco de PBS ( 450).

A análise das amostras foi efectuada como descrito em 5 a). A partir de 51 e de 5 amostras de sangue que tinham sido classificadas como positivas e como fracamente positivas, respectivamente, de acordo com a técnica de mancha de Western, todas as amostras foram confirmadas igualmente como positivas.

A partir de 226 amostras de sangue que tinham dado reacção negativa em relação a soro anti-Ηΐν também

todas as amostras foram confirmadas como negativas. Deste modo torna-se nítido que o processo da presente invenção apresenta uma foa concordância com o método tomado como referência da técnica de mancha de Western,

c) Depositaram-se amostras de 50 jul de soro ou de plasma ou de 50 ul de lisado de sangue integral, preparadas como descrito em 5 b) com 100 ul duma solução de 5 jig/ml de IgG-POD, preparada por diluição do conjugado IgG-POD descrito no exemplo 2 de 440 ug/ml até 5 ug/ml com a solução já descrita contendo soro fetal de vitela e ^RTween 20 em PBS, nos alvéolos da placa de microanálise e incubou-se durante 10 minutos a 45°C.

Em seguida lavaram-se os alvéolos 5 vezes com tampão de lavagem. Seguidamente adicionaram-se a cada alvéolo 100 ul de preparação de substrato de TMB e incubou-se durante 5 min a uma temperatura de 20 a 22°C.

T rminou-se a incubação por adição de ácido sulfúrico e normal. A determinação foi efectuada como descrito em 5 a).

A partir de 51 e de 5 amostras de sangue que tinham sido classificadas como positivas e como fracamente positivas respectivamente, de acordo com a técnica de mancha de Western, todas as amostras foram confirmadas igualmente como positivas.

A partir de 225 amostras de sangue que tinham dado reacção negativa em relação a soro anti-HIV também todas as amostras foram confirmadas como negativas.

D_este modo tornou-se nítido que a variante processual da presente invenção constitui um processo rápido com uma boa concordância com o método tomado para referência da técnica de mancha de Western no que se refere à sensibilidade e à especificidade.

-18 d)

Depositaram-se nos alvéolos duma microplaca anti-HIV 100 _zul de anti-HIV-POD e incubou-se durante lha 37°C, eliminou-se o anti-HIV-POD por aspiração e lavaram-se os alvéolos quatro vezes com tampão de lavagem. As microplacas de anti-HIV tratadas deste modo foram secas sobre gel de sílica a uma temperatura de 20 a 22°C.

Em seguida depositaram-se nos alvéolos 25 ^1 de amostra e 100 ;ul duma solução de 10 g/1 de albumina de soro de bovino em tris de 50 mmol/1 com 0 pH ajustado a 7,4. Após incubação a 37°0 durante 1 h, tomou-se 0 conteúdo de cada alvéolo e depositau-se num alvéolo duma placa de microanálise não revestido, em seguida tratou-se com 100 ul de preparação de substrato de TMB, deixou-se em repouso a mistura durante 30 min a uma temperatura de 20 a 22°C e tratou-se com 100 ul de ácido sulfúrico 1

E normal. Por fim mediu-se a 450 contra PBS.

No Quatro 2 apresentam-se os valores médios de E

450 de determinações em triplicado para amostras que tinham sido classificadas como anti-HIV-negativas, como no valor limite ou como anti-HIV-positivas de acordo com 0 processo descrito em a).

QUADRO 2

Amostras anti-	1	0,140	0,148	0,136
-HlV-negativas	2	0,218	0,206	0,205
	3	0,267	0,279	0,270
	4	0,275	0,274	0,272
Amostras no	5	0,609	0,454	0,457
valor limite	6	0,308	0,316	0,351
Amostras anti-	7	0,769	0,674	0,773
-HlV-positivas	8	0,891	0,865	0,820
	9	1,202	0,953	0,863
	10	1,678	2,020	2,202 .
	0 Quadro	2 mostra que,	de modo diferen
te do apresentado em	a) a c),	aqui a extinção	nas amostras,
anti-HIV-negativas é	reduzida	e nas amostras	anti-HIV-posi-
tivas é alta. 0 valoi	• limite para as	amostras	i anti-HIV-nega-

Ε tivas a 450 é neste caso também fixado em 0,30.

Claims

Processo para a preparação de um agente de análise para detecção e para determinação de anticorpos contra o vírus da deficiência imunitária humana (HIV) por um processo competitivo imunoquímico, caracterizado por se ligarem a um suporte proteínas do invólucro e do núcleo de HIV ôe modo irreversível seja directamente seja através dum espaçador que e stabeleça uma ligação não imunoquímica, incorporando também anticorpos marcados contra proteínas do invólucro e do núcleo de HIV que não reagem com antigenes de uma célula hospedeira isenta de HIV nem com um meio isento de HIV nem ainda com tecidos humanos e incorporando também eventualmente reagentes para detecção das marcações.

_ 2ê Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os anticorpos se apresentarem alternativamente

a) sob a forma dum componente separado da fase sólida ou

b) sob a forma dum componente ligad© imunoquimicamente à fase sólida.

- 5« Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente de análise ser constituído por um elemento no qual estão contidos integralmente ou em parte tanto a fase sólida como os reagentes sob forma seca destinados à detecção e à determinação.

_ 4ê _

Processo de acordo com a reivindicação

1, caracterizado por o agente de análise ser constituído por um elemento no qual estão situados tanto a fase sólida como os anticorpos marcados sob forma seca alternativamente

a) sob a forma dum componente separado da fase sólida ou

b) sob a forma dum componente ligado imunoquimicamente à fase sólida contendo adicionalmente os restantes reagentes eventualmente sob forma seca.

Processo competitivo imunoquímico para a detecção e para a determinação de anticorpos contra o HIV mediante o uso de uma fase sólida constituída por um suporte e por proteínas do invólucro e do núcleo de HIV ligadas ao referido suporte e por anticorpos marcados dirigidos contra proteínas do invólucro e do núcleo de HIV, competindo os referidos anticorpos em relação aos sítios de ligação à fase sólida, caractârizado por as proteínas se encontrarem ligadas ao suporte de modo irreversível, seja directamente se· ja através dum espaçador que estabelece uma ligação não imunoquímica.

Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por os anticorpos marcados não reagirem com antigenes de uma célula hospedeira isenta de HIV nem com um meio isento de HIV nem ainda tecidos humanos isentos de HIV.

_ 7& _

Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por os anticorpos marcados reagirem pelo menos seja

I) com a proteína do núcleo designado por p24 e com a proteína do invólucro designado por gp41 ou

II) com a proteína do núeleo designado por p24 e com a proteína do invólucro designado por gp 120.

- 8& Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por os anticorpos marcados serem constituídos por uma mistura de 2 ou de mais anticorpos monoclonais, contendo a mistura anticorpos dirigidos seja

I) contra as proteínas p24 do núcleo e gp41 do invólucro ou

II) contra as proteínas p24 do núcleo e gpl20 do invólucro.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 27 de Outubro de 1986, sob ο η² P 36 36 540.8.

Lisboa, 26 de Outubro de 1987