NO885617L - Fremgangsmaate ved paavisning av menneskelig immunsviktvirus - Google Patents

Fremgangsmaate ved paavisning av menneskelig immunsviktvirus

Info

Publication number
NO885617L
NO885617L NO885617A NO885617A NO885617L NO 885617 L NO885617 L NO 885617L NO 885617 A NO885617 A NO 885617A NO 885617 A NO885617 A NO 885617A NO 885617 L NO885617 L NO 885617L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibodies
antibody
urine
urine sample
immunodeficiency virus
Prior art date
Application number
NO885617A
Other languages
English (en)
Other versions
NO885617D0 (no
Inventor
Alvin E Friedman-Kien
Yunzhen Cao
William Borkowsky
Original Assignee
Univ New York
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/040,013 external-priority patent/US4865966A/en
Application filed by Univ New York filed Critical Univ New York
Publication of NO885617L publication Critical patent/NO885617L/no
Publication of NO885617D0 publication Critical patent/NO885617D0/no

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Fremgangsmåte ved påvisning av menneskelig immunsviktvirus.
Foreliggende oppfinnelse omhandler en metode for påvisning
av antistoff rettet mot human immunsviktvirus og som kan bli brukt for å diagnostisere AIDS og relaterte lidelser og identifisere latente asyntomatiske bærere for slike infeksjoner.
Ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) ble opprinnelig igjenn-kjent og rapportert i 1981. Siden den tid har kliniske og epidemiologiske data vist at hyppigheten av AIDS har nådd epidemisk nivå i hele verden. Den forårsakene enhet for AIDS har blitt identifisert som et RNA retrovirus, det humane T-celle leukemivirus type III (HTLV-III) også kjent som lymfadenopaty assosiert virus (LAV) og AIDS-assosiert retrovirus (ARV) er nylig omdøpt til human immunsviktvirus (HIV). AIDS-pasienter kan lide av et brett spektrum opportunistiske infeksjoner så som Pneumocystis carinii, Candida albicans, herpes simplex virus og cytomegalovirus og lider også hyppig av visse tumorer spesielt Kaposi's Sarcoma. Det har blitt vurdert at antall pasienter med AIDS
i De forenede stater fortsetter å fordoble seg omtrent hver tolvte måned.
Det antatte AIDS-virus HIV har blitt isolert fra perifere mononukleare celler i blod, cerebrospinal væske, sæd,
nøytralt vev, spytt, tårer og sjeldent urin. For å bestemme tilstedeværelse av HIV i den generelle populasjon har det blitt foreslått at masseskjerminger av denne populasjon for tilstedeværelse av antistoff rettet mot AIDS viruset skal bli foretatt. Imidlertid siden antistoffsubstanser generelt finnes kun i humant blod og serum, innbefatter de foreslåtte skjermingsteknikker og erholde en blod- eller serumprøve fra pasienten som skal undersøkes.
Et antall steriologiske forsøk har blitt utviklet for å
påvise tilstedeværelsen av antistoff mot HIV (som indikerer eksponering til HIV) i blodet fra pasienter med AIDS, er
relatert kompleks (ARC) og friske (d.v.s asymtomatiske) virusbærere. FDA-godkjent ELISA (enzymtilknyttet immunosorbent assay) såvel som eksprimentelle Western Blot Kit for måling av antistoff mot HIV er nå tilgjengelige. Disse innebefatter nylige (men fremdeles eksprimentelle) ELISA
assay kit som påviser spesifikke antistoff rettet mot det virale kappeprotein (gp41 eller ENV) og et viralt kjerneprotein (p24 eller CORE) såvel som kit som anvender Western Blot teknologi for å påvise de hovedantigene proteiner til
HIV. I tillegg har metoder nylig blitt utviklet for å påvise disse virale antigener i vevskulturvæsker fra HIV infiserte celler dyrket også in vitro.
Alle av de nåværende AIDS påvisningsmetoder anvender
invasive fremgangsmåter for å erholde en blod eller serum prøve som kan analyseres for tilstedeværelse av antistoff mot HIV-viruset det vil si innsetningen av en hul nål eller annen anordning for å trekke ut en væskeprøve fra en åre, arterie eller subkutant område. Disse fremgangsmåter innebefatter en grad av risiko for helsen til personalet som er involvert med å samle opp og analysere disse prøver idet ervervet immunsviktsyndrom muligens kan bli overført via utilsiktet eksponering til en sprøyte eller nål som har blitt anvendt for å erholde en blod eller serumprøve fra en pasient som er smittet med sykdommen. I tillegg har individer som for tiden er ansett å ha en høy risiko for å
få AIDS, så som homoseksuelle menn og intravenøse stoff-misbrukere samt individer med ikke-høy risiko som bør skjermes, ofte har ubegrunnet frykt for at de kan få
sykdommen mens de blir testet for denne, og følgelig unngå eksponering til enhver testprosedyre som innebefatter å
trekke ut blod eller serum ved å bruke en nål.
Visse problemer ville bli overvunnet av en ikke-invasiv
metode for å skjerme for antistoff mot HIV. En slik metode burde være egnet for bruk i masseavskjerming og unngå de iboende ulemper med de tidligere typer invasive cellologiske teknikker.
Oppsummering av oppfinnelsen.
Det har nå uventet blitt oppdaget at antistoff mot HIV kan påvises i urin fra pasienter som har blitt eksponert til eller infisert med HIV. Dette er en spesielt overraskende oppdagelse siden det tidligere var antatt at antistoff ikke kunne bli påvist i human urin bortsett fra hos visse individer som lider av nyresykdom. Foreliggende oppfinnelse beskriver en ikke-invasiv metode for å påvise hvorved en pasient er infisert med HIV-virus ved å påvise tilstedeværelsen av antistoff rettet mot HIV i urin hos en pasient som skal undersøkes for HIV.
Det er følgelig et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en ikke-invasiv metode for å skjerme for antistoff rettet mot infiserende enheter.
I et annet aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse en ikke-invasiv metode for å bestemme hvorvidt et individ har blitt eksponert til en spesiell viral enhet. Denne metoden omfatter og påviser tilstedeværelsen av antistoff rettet mot den spesielle virale enhet i urinen hos en pasient som ikke har blitt immunisert mot den spesielle virale enhet.
Disse og andre aspekter av foreliggende oppfinnelse vil bli gjort tydelig for den vanlige fagmann i lys av foreliggende beskrivelse, medfølgende krav og vedlagte tegninger.
Kort beskrivelse av figurene.
Fig. 1 er en representativ Western Blot analyse av de konsentrerte urinprøver ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 2 er en dobbel difusjonsgradient i munometrisk analyse av HIV-antistoff som er tilstede i urinen hos et HIV-infisert individ.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.
Det har nå uventet blitt oppdaget at antistoff mot AIDS-virus (HIV) er tilstede i urinen hos AIDS-pasienter og HIV-infiserte individer innebefattende individer som ikke lider av nyrelidelser. I tillegg har foreliggende oppfinnere direkte indentifisert disse HIV-antistoff som medlemmer av IgG og IgA klassene av immunoglobeiner ved immunodifusjons-teknikker. Denne oppdagelse er overraskende fordi den tidligere teknikk antyder at meningsfulle titere for antivirale antistoff kun er tilstede i urinen fra pasienter som lider av nyrelidelse eller de som har blitt immunisert ved vaksinering ved poliovirus-vaksine.
Franklin E. C. (J. Clin. Invest 38:2159-2167, 1959) har beskrevet at proteiner innebefåttene albumin, alfa, beta og gamma globuiner er tilstede i konsentrert urin fra normale mennesker. Imidlertid var disse fragmenter kun en sjettedel av størrelsen av ferdig utviklete immunoglobeiner og var antatt å være naturlige nedbrytningsprodukter av antistoff-molekyler. Spesielle antistoff blir ikke undersøkt.
En artikkel av Lemer, A. M. et al ( J. Clin. Invest. 41:805-815, 1962) beskriver et antistoff mot poliovirus kunne påvises i urinen fra normale individer som hadde blitt immunisert med poliovirus-vaksine. Imidlertid hadde alle av individene med påviselig urin antistoff mottatt minst tre eller flere inokuleringer med denne vaksine, og urinene ble analysert kort tid deretter. Tilstedeværelsen av antivirale antistoff i urinen hos ikke-immuniserte individer har ikke tidligere blitt rapportert i litteraturen. Faktisk var foreliggende oppfinnere ute av stand til å påvise antistoff rettet mot cytomegalovirus (CMV) eller hepatittvirus i urinen fra individer som var kjent for å være infisert med slike virale enheter. I tilfellet med CMV hadde AIDS pasienter med serum titere med 1:1 500 til 1:20 000 av anti-CMVantistoff ikke påviselige anti-CMV urinære antistoff som undersøkt med ELISA.
Intakte antistoff (eller fragmenter av antistoff) rettet mot HIV som er tilstede i urinen fra infiserte individer har ikke tidligere blitt rapportert i litteraturen. Urinære antistoff er vanligvis funnet kun i ikke-immuniserte pasienter som lider av lidelser i nyre og/eller lever så som nevrotisk syndrom, glomerulonefritis, hepatorenalt syndrom hos de som lider av multiple myelom, en immunproliferativ lidelse.
Mengden av HIV antistoff som er tilstede i urinen er omtrentlig 2 0 ganger lavere enn den som finnes i serum og er under grensene for påvisning for alle for tiden tilgjengelige diagnostiske teknikker. Følgelig må urinen konsentreres d.v.s. dets volum må reduseres relativt til dets opprinnelige tomvolum før den undersøkes for slike antistoff. Idet mer følsomme metoder for antistoff påvisning blir tilgjengelige er det vurdert at urinkonsentrasjons-trinnet kan fjernes.
Metoden ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter å erholde en urinprøve som er utstøtt av en pasient som skal under-søkes for eksponering for HIV-konsentrere urinprøven ved å redusere volumet til en slik prøve minst ca. 20 ganger i forhold til dens opprinnelige (utskilte) volum og undersøke den konsentrerte prøve for tilstedeværelsen av antistoff mot HIV. Assayet utføres ved å bruke teknikker som er velkjente for påvisning av tilstedeværelsen av slike antistoff i serum. Selv om i teorien så lite som 1-5 liter urin kunne undersøkes for tilstedeværelse av antistoffene som ønskes å bli påvist ved å bruke for tiden tilgjengelige metoder for antistoff-påvisning er 40-100 ml urin ønsket gjennvunnet fra pasienten som skal undersøkes og brukt i assayprosedyren. Den konsentrerte urin kan bli brukt umidelbart, lagret i 24 timer eller lengre ved 4"C før bruk og kan være frosset (men brytes ned ved gjenntatt frysing og tining).
Enhver av de mange metoder som er velkjente for fagmannen kan bli brukt for å konsentrere (redusere volumet) av urinprøven som skal analyseres. Eksempler på teknikker som kan bli brukt ved utføring av metoden ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter men er ikke begrenset til luftinn-damping membrandialyse, rotasjonsinndamping og fortrinnsvis ved å bruke en Minicon B15 konsentrator (Amicon, Danvers, MA) med et 60 000 dalton membranfilter som angitt i eksempel 1 nedenfor. Urin kan også konsentreres ved frysetørking men dette krever større volumer (f.eks. minst 200 ml).
Når urinprøven har blitt vesentlig konsentrert kan den undersøkes for tilstedeværelse av antistoff mot HIV. Som brukt heri med hensyn til urinvolumreduksjonen betyr vesentlig konsentrert en volumreduksjon på minst 20 ganger med hensyn til det opprinnelige (utskilte) urinvolum og fortrinnsvis mellom ca. 40 ganger og 200 ganger, med hensyn til urinvolumreduksjonen d.v.s. en reduksjon i volum fra et opprinnelig (utskilte) volum på 40 ml til et endelig volum på 2 ml er en 2 0 gangers reduksjon. Prøvene kan også fryse-tørkes og resuspenderes (i f.eks. isotont fysiologisk saltvann) i ethvert ønsket volum, men som nevnt ovenfor krever dette større volumer, prøven således erholdt kan undersøkes for antistoff mot HIV-proteiner ved å bruke standard antistoff påvisningsteknikker innebefattende som ikke-begrensende eksempel ELISA Western Blotting radioimmuno assay og immunodiffusjon.
I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse anvendes den velkjente Western Blot analysemetode for påvisning av anti-HIV-antistoff. Denne teknikk har blitt funnet å være den mest pålitelige av de for tiden tilgjengelige metoder for påvisning av HIV-antistoff i urinen fra pattedyr. Teknikken omfatter generelt å separere proteiner (i dette tilfellet HIV-proteiner) ved gelelektroforese på basis av molekylvekt, overføre de avskilte proteiner til en egnet fast støtte (såsom et nitrocellulosefilter eller alternativt et nylonfilter) og inkubere serumet (eller urinen) fra et HIV- smittet individ med de separerte proteiner. Dette forårsaker at spesifikke HIV-antistoff som er tilstede i serumet (eller urinen) binder seg til sine respektive proteiner. HIV-antistoff blir så påvist ved å bruke merket antihuman HIV-antistoff. Denne metode for å påvise antistoff mot HIV er foretrukket på grunn av dens sensitivitet og det faktum at spesifikke antistoff mot virale proteiner blir undersøkt. Hyppigheten for falske positive resultater som er iboende når ELISA assays anvendes reduseres vesentlig ved å bruke Western Blot analyse.
En alternativ utførelsesform av foreliggende oppfinnelse anvender et enzym tilknyttet immunosorbent assay (ELISA) som mulighet for påvisning av antistoff som er spesifikke mot HIV. ELISA assays for påvisning av antistoff mot HIV-virus kan enten være kompetetiv eller ikke-kompetetiv (som beskrevet av E. Engvall i Methods in Enz<y>molo<q>y, 70: 419439, innebefattet heri per referanse).
ELISA metoder er immunoassays som brukes (i dette tilfellet) for å mengdebestemme mengden av antistoff som er tilstede i en prøve som skal analyseres. Forsøkene anvender et kromogen (en fargedannende substans) for å påvise antistoffet: danne et antigenkompleks. Antistoff brukt i ELISA er kovalent bundet til disse kromogener så som orto-fenylendiamin eller ortodiansidin hvor førstnevnte danner et rødgyldent produkt i nærvær av et peroksyd (så som hydrogenperoksyd) og sistnevnte et guloransjefarget produkt i nærvær av et paroksyd. Disse farger absorberer lys ved spesielle bølgelengder (ortofenylendiamin ved 492 nm og ortodianisidin ved 400nm) og påvises og mengdebestemmes ved å bruke et spektrofotometer.
Ikke-kompetetive ELISA-forsøk anvender et immobilisert antigen for å fange ethvert antistoff og et enzymmerket andre antistoff rettet mot stoffet i hvilket forsøksanti-stoff har blitt dannet. Dersom f.eks. humane antistoff blir målt så er geite eller kanin antihuman antistoff de merkete andre antistoff. Mengden av antistoff som er tilstede er direkte proposjonal med mengden av bunnet merket andre antistoff. Kompetetive ELISA metoder omfatter en reaksjon hvori umerket (den biologiske prøve som skal undersøkes) og enzymmerkete antistoff konkurrerer om en begrenset kjent mengde antigen. I dette tilfellet utføres reaksjonen intill likevekt oppnåes og konsentrasjonen av ukjent antistoff er inverst proposjonal med mengden av bunnet enzymmerket antistoff. F.eks. dersom det ikke er noen antistoff i den ukjente prøve vil alle av de merkete antistoff binde seg til antigenet og en høy verdi angitt med en øket farge vil erholdes når mengden av merket enzym som er tilstede blir målt.
Kommersielt tilgjengelige ELISA assay kit som kan bli brukt ved anvendelse av de forskjellige utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse er tilgjengelige fra Abbott Labs (Chicago, IL) under katalognummer 1037 og som ENVACOR (human T celle lymfotrop virus III, EIA, katalog nr. 2791-22, Abbott International Diagnostics, Weisbaden Vest Tyskland). 1037 assayet anvender et ikke-kompetetivt ELISA (som beskrevet i eksempel 3 nedenfor) mens ENVACOR testen bruker et kompetetivt ELISA som (beskrevet i eksempel 2 nedefor). Disse kit inneholder komponentene som er listet i eksemplene 2 og 3 nedenfor og er foreslått for bruk i undersøkelse av serum (ikke urin) for antistoff mot HIV.
En viktig fordel ved metoden ifølge foreliggende oppfinnelse er at den biologiske prøve som skal analyseres (urin) lett kan erholdes ved ikke-invasive teknikker og følgelig er risikoen for å overføre en HIV-infeksjon til laboratoriet og helsepersonell (f.eks. via tilfeldig gjennomhulling med en forurenset nål) i hovedsak eliminert.
Metoden ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres raskt, kun begrenset av tiden det tar å konsentrere urinprøven som skal undersøkes. I en bred sammenheng kan dette bli gjort i en tidsperiode på mindre en 90 minutter når prøvene skal konsentreres 2 00 ganger. Konsentrering av urinen 20 til 40 ganger kan utføres på mindre enn 60 minutter. Prøven kan så analyseres ved å bruke de komersielle tilgjengelige HIV serum testkit.
Oppfinnelsen er videre beskrevet nedenfor i spesielle utførelses eksempler som er tiltenkt å illustrere oppfinnelsen uten å begrense dens bredde.
Eksempel 1: Urin konsentrasjon
Serumprøver og 60-100 ml urin ble samlet opp (og kodet numerisk for pasient konfidensialitet) fra de følgende pasientgrupper: 28 AIDS assosierte Kaposi's sarcoma (AIDS-KS) pasienter; 21 ARC pasienter; 48 asymptomatiske HIV infiserte individer av høyrisikogruppe innebefattende (37 homoseksuelle menn, 5 kvinnelige intravenøse stoffbrukere og 1 kvinnelig transfusjonsmottaker); og 16 pasienter som led av AIDS relaterte opportunistiske infeksjoner (AIDS-OI) så som Pneumocystic Carinii og sytomegalovirus (tabell 1 inneholder spesiell pasientidentifikasjon og assay resultater) . I tillegg ble 17 ikke-AIDS smittete pasienters urin og serum, innebefattende pasienter diagnostisert til å ha cirhosis og hepatoma (1), hepatit (3), Lupus (3), glomerul-onephritis (3), neprotic syndrom (1), Lupus-nephritis (1), hjertesvikt (1), Lepromatøs spedalskhet (1), tuberkulose (2) og DM nephropaty (1) pluss prøver fra 3 0 tilsynelatende normale friske heteroseksuelle erholdt. Urinprøvene som ble erholdt fra alle de normale kontroller og AIDS pasienter oppviste i hovedsak normale verdier for proteiner når de blir undersøkt ved å bruke standard urin analyseteknikker velkjente i faget. Proteinuria (tilstedeværelsen av unormal høye konsentrasjoner av protein i urinen) blir rutinemessig påvist ved å bruke en "dyppestav" som registrerer tilstedeværelse av høye (over 150 mg) konsentrasjoner av urinært protein. Dette er indikert av en fargeforandring på dyppestaven når den sammenlignes med standarder for mengde-bestemmelse.
De oppsamlete urinprøver ble sentrifugert i koniske rør ved 1500 RPM i 15 minutter ved romtemperatur. Supernatanten ble dekantert og oppbevart og pellerten ble kastet.
Supernatanten erhold ovenfor ble konsentrert mellom 20 og 2 00 ganger med hensyn til volumet av den opprinnelige urinprøve samlet opp fra pasienten som skal undersøkes ved å bruke en Minicon B15 konsentrator med en 60 000 dalton membran (Amicon Danvers, MA). Konsentratoren virker ved å holde tilbake enhver substans som har større enn 60 000 dalton i molekylvekt på membranfilteret mens oppløsningen inndampes. Dette tar omtrentlig 1 time. (For å konsentrere urinvolumet 200 ganger (200X) fra et opprinnelig eller utgangsvolum d.v.s til 1/200 av dets startvolum ved å bruke Minicon apparaturen tar omtrent 90 minutter). Den konsentrerte urinprøve kan lagres ved 4°C i opp til 30 dager før bruk eller bli brukt umiddelbart for forsøk som beskrevet i eksemplene 2 til 5 nedefor. For Western Blot analyse eller immunodiffusjonsstudier er prøvevolumene fortrinnsvis videre konsentrert 200 ganger d.v.s til 1/200 av startvolumet. Graden av konsentrasjon for hver prøve er angitt i tabellene 1, 2 og 4 nedefor.
Eksempel 2: ELISA assay av konsentrerte urinprøver
Serumet og de konsentrerte urinprøver samlet opp i eksempel 1 ble undersøkt for tilstedeværelse av antistoff mot ENV og CORE HIV antigen som beskrevet (Allain, J.P. et al Lancet 1:1233-1236, 1986 innebefattet per referanse) ved å bruke et Abbott Envacore assay kit. Dette er et kompetetivt ELISA hvor kjente mengder av HIV-proteiner og antistoff tilsettes sammen med prøven som skal undersøkes. Tilstedeværelsen av antistoff i prøven er indikert ved en reduksjon i bindingen av kontrollantisera med kontrollantistoffet. Produsentens instruksjoner ble fulgt nøyaktig som angitt. I tillegg ble blodprøver samlet opp og analysert samtidig.
Kittet inneholder et prøvefortynningsmiddel (inneholdende bovin og geitesera samt 0,1 % natrium azid), enzymkonjugert polyclonale antistoff mot HIV kappe og kjerneproteiner, kuler belagt med rekombinant gp41 eller gp24 og HIV-proteiner, ortofenylendiamin (OPD) substrat, en positiv og en negativ HIV-antistoffkontroll og instruksjoner for bruk.
Femti mikroliter av prøvene som skal undersøkes eller kontrollene ble inkubert med 20 ml fortynningsmiddel fremskaffet av forhandler og 200 ml av enzymkonjugert polyklonalt antistoff mot HIV, kappe eller kjerneproteiner. Kuler belagt med rekombinant gp41 eller p24 HIV-proteiner ble tilsatt separate brønner inneholdende enten HIV ENV eller CORE antistoffer. Etter 16 til 22 timers inkubering ved romtemperatur ble kulene vasket og overført til passende reaksjonsrør. 3 00 mikroliter ortofenylendiamin substrat ble så tilsatt hvert rør og reaksjonen tillatt å fortsette i 3 0 minutter før tilsetning av 1 ml IN H2S04for å stoppe reaksjonen. Absorbans verdier av oppløsningen ble målt ved 492 nm ved å bruke et spektrofotometer solgt av Abbott Labs under navnet Quantum II nr. 3303-11. Et positivt resultat for tilstedeværelsen av urin eller serum antistoff til hver av HIV p24 eller gp41 proteinene ble angitt som en prøve med absorbansverdier lik eller mindre enn 0,5 ganger summen av den optiske tetthet (O.D.) av gjennomsnittelig negativ kontroll (fremskaffet av forhandler) optisk tetthet (O.D.) pluss O.D. for gjennomsnittelig positiv kontroll (fremskaffet av forhandler) som målt i det ovennevnte.
En tabellmessig identifikasjon av pasientene skjermet med foreliggende oppfinnelse og assay resultatene er angitt i
tabellene 1 og 2 og oppsummert i tabell 3.
Under referanse til tabell 1 og 2 kan det finnes at 71,4% av de AIDS induserte Kaposi's sarcoma pasienter, 81% av ARC pasientene, 69,7% av pasientene i høyrisikogruppen og 68,8% av pasientene som lider av opportunistiske infeksjoner hadde antistoff mot ENV proteinene (gp41) av HIV tilstede i sin urin og at slike antistoff ble påvist ved å bruke metodene ifølge foreliggende oppfinnelse. Den totale prosentvise mengde av pasienter med påviselige ENV antistoff var 72,2%. Kjerneantigenet ble kun påvist i urinen fra 6 individer og disse var i den asymtomatiske infiserte høyrisikogruppe. Alle av ikke AIDS sykdom pasientene hadde normal sunn urin fra heteroseksuelle og serum var negativ for antistoff mot begge HIV-proteiner.
Eksempel 3
Et undersett av urinprøvene analysert i eksempel 1 ble undersøkt på nytt ved å bruke to kommersielt tilgjengelige ikke-kompetetive HIV ELISA påvisningssett. Kit 1 (HTLV III EIA kit, Lot nr. 1590HR00, Abbott Laboratories, Chicago, IL) er et FDA-godkjent klinisk diagnostisk kit; kit II (EIA Clinical Diagnostic Kit, katalog nr. 1037, Abbott Laboratories, Chicago, IL) er tiltenkt for undersøkende bruk alene.
Hver av kittene inneholder HIV antigenbelagte kuler, geiteantihuman antistoff konjugert til pepperrotperoksidase, en positiv kontroll, en negativ kontroll, prøvefortynnings-middel inneholdende vin og geiteserum, OPD og et OPD fortynningsmiddel inneholdende sitratfosfat buffer og 0,02% hydrogen peroksyd, reaksjonsbrett, assayrør og instruksjoner for bruk.
Assayet får tilstedeværelsen i urin fra en passient som skal undersøkes for antistoff mot HIV utføres som følger. 10 mikroliter kontroll eller fortynnet prøve innføres i på forhånd utvalgte brønner av reaksjonsbrettet. Hver brønn kan holde opp til 400 mikroliter væske. 200 mikroliter prøvefor-tynningsmiddel og en kule tilsettes per brønn. Reaksjonene inkuberes i ca. 1 time ved 40°C. Deretter kastes superlatanten (d.v.s væsken) og kulen vaskes 3 ganger ved 4-6 ml destilert eller deionisert vann. Tohundre mikroliter merket geiteantihumanantistoff blir så tilsatt og inkubert ved 40°C i ca. 2 timer. Superlatanten fjernes og kulen vaskes som ovenfor. Kulen overføres til et assayrør, 300 mikroliter OPD substratoppløsning tilsettes og oppløsningen inkuberes i ca. 3 0 minutter. 1 ml IN svovelsyre tilsettes og absorbansen til oppløsningen bestemmes ved 492 nm i et standard Abbott Labs spektrofotometer (modell 3303-11 tilgjengelig fra Abbott Labs). En positiv verdi er angitt dersom en prøve ligger innenfor området 0,5 til 1,5 ganger gjennomsnittelig positiv kontroll.
Resultatene av disse forsøk er vist nedenfor i tabell 4.
Resultatene presentert i tabell 4 viser at urin antistoff mot HIV er lettere påviselige når det anvendes et mer sensitivt ELISA assay kit (kit II). Dette er det samme som for serum antistoff. Et begrenset antall av disse prøver ble videre analysert ved å bruke Western Blot teknikken som beskrevet nedenfor i eksempel 4.
Eksempel 4: Western Blot analyse av konsentrerte urinprøver
Western Blot analyse for tilstedeværelsen av antistoff mot HIV ble utført på urin og serumprøvene samlet opp fra 59 HIV sero-positive (innebefattende 18 AIDS-KS, 27 høyrisiko individer, 6 ARC og 8 0.1. pasienter valgt ut fra de angitt i tabell 1 og 2 ovenfor) og 3 0 ikke-AIDS sykdom pasienter. Et kommersielt tilgjengelig kit (Biotech/DuPont HTLV-III Western Blot Kit, tilgjengelig fra E.I. DuPont De Nemuors & Co., Inc., Wilmington, DE) ble brukt for å foreta analysen. Kittet inneholder på forhånd skårede nitrocellulosemembran strimler med immobliserte virale antigener som har blitt separert med natrium dodecylsulfat/polyakrylamid gel elktroforese (SDS-PAGE) og elektroblottet på membranen; kontroll sera, innebefattende en negativ kontroll, en svak positivkontroll og en sterkt positiv kontroll, blotting buffer (Tris bufret saltvann med 5% ikke-fett inneholdende tørrmelk og også inneholdende varmeaktivert normalt geiteserum); vaskebuffer (Tris bufret saltvann inneholdende tween-2 0 detergent); biotinylert geite antihuman IgG; avidin-pepperrot peroksydase; 4-klor-l-naftol i oppløsning; hydrogen peroksyd og et inkuberingsbrett. Kittet ble brukt nøyaktig i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet nedenfor.
Assayet omfatter å bløte strimlene i 2 ml vaskebuffer i en brønn i vaskebrettet i 3 0 minutter ved romtemperatur; væsken blir så trukket av og kastet. Strimmelene vaskes derpå med 2 ml blotting buffer i 5 til 10 minutter ved romtemperatur. 20 mikroliter av en 200 gangers konsentrert urinprøve tilsettes brønnene inneholdende strimlene og blotting buffer og reaktanten inkuberes over natten ved romtemperatur. Deretter aspireres og kastes blandingen i brønnene og brønnene vaskes en gang med 2 ml vaskebuffer. Ytterligere 2 ml's vasker (med vaskebuffer) ble utført ved romtemperatur ved å tillate 5 minutters bløtgjøring mellom hver vaske og kast av vasken etterpå.
Nitrocellulose strimlene fremkalles som følger. 2 ml biotynilert geit antihuman IgG tilsettes hver brønn og tillates å inkubere i 60 minutter ved romtemperatur på en gyngende eller roterende anordning. Strimlene blir så vasket med 2 ml vaskebuffer per strimmel i 5 minutter; dette trinn blir så gjentatt ytterligere 3 ganger ved romtemperatur og med å kaste vasken etter hver bruk. 2 ml per strimmel med avidinpepperrot peroksydase tilsettes og inkuberes i 3 0 minutter i romtemperatur på en gyngende eller roterende anordning. Strimlene vaskes 3 ganger som ovenfor. 2 ml av en 50:50 blanding av 4-klor-l-naftol og hydrogen peroksyd tilsettes derpå og inkuberes i 10 til 15 minutter eller intill fargen utvikler seg ved romtemperatur. Tilstedeværelsen av farge på strimmelen indikerer at strimmelen har blitt eksponert til en biologisk væske (d.v.s urin) inneholdende antistoff mot HIV.
Strimlene blir så vurdert for tilstedeværelse av antistoff mot HIV som negativ (-) d.v.s. ingen antistoff mot HIV er påvist, svakt positiv (±) eller sterkt positiv (+) ved å bruke kontrollene fremskaffet av forhandler som referanse. Resultatene er presentert i tabell 5 og fig. 1. Under henvisning til tabell 5 er pl7 en proteinkomponent dannet ved spaltning av p55 til p24, p24 er det virale kjerneprotein, p31 er den virale endonuklease, p41 er det ferdigutviklet kappeprotein, p51 og p66 er komponenter av den virale reverstranskriptase, p55 er en prekursor til det virale kjerneprotein og pl60 er en prekursor til kappeproteinet; pllO/120 er en blanding av 2 proteiner som vandrer sammen i dette gelsystemet: pl20 er en proteinkomponent dannet ved prossesering av pl60 proteinet til gp41; pllO er en proteinkomponent av viruset hvis funksjon for tiden er ukjent.
Ett eksempel på en typisk Western Blot analyse av den konsentrerte urin og serumprøven erholdt ved å utføre metoden ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i figur 1. Under referanse til figur 1 er brønn 22 den negative kontroll, brønn 23 den svakt positive kontroll og brønn 24 den sterke positive kontroll hvor tallene til høyre representerer de forskjellige HIV-proteiner beskrevet ovenfor. Ovenliggende linjer 12-16 og 18-21 er de tilsvarende pasienter som referert til tabell 5 ovenfor. F.eks. inneholdt urin erholdt fra pasient nr. 956 (fig. 1 brønn 16) som lider av ARC antistoff rettet mot alle av HIV-proteinene bortsett fra p24 (kjerne) og pl7. Betydningen av dette funn er for tiden ukjent.
Som det kan observeres fra dataene i tabell 5 og oppsummert i tabell 6 kan antistoff mot HIV antigener lett bli funnet (når det er tilstede) i de konsentrerte urinprøver ved å bruke denne mer følsomme teknikk. Spesielt kunne antistoff mot p 160 i den konsentrerte urin bli påvist i 55 av 59 HIV positive individer som er undersøkt (93,2%). Disse resultater viser også at bruken av konsentrert urin i denne foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen ikke fører til falske positiver siden spesifikke virale proteiner bli identifisert.
Eksempel 4:Dobbel difusjon gradient immunoelektoforetisk analyse av HIV-antistoff inneholdende urinprøver.
Konsentrert urinprøve nr. 956 (tabell I) som viste seg positiv for HIV antigener ved å bruke Western Blot analyse og antistoff rettet mot kappeproteinet ved å bruke ELISA ble ytterligere konsentrert 200 ganger og analysert med dobbeldiffusjon gradient immunoelektoforese (DDG-IEP) som beskrevet av J. V. Chuba i J. App. Biochem., 1: 37-50, 1979 (innebefattet per referanse). Serum prøver fra denne pasient ble samlet opp og analysert i parallell med pasienturin-prøvene som en positiv kontroll.
Kort ble like prøver av 3 mikroliter av henholdsvis urin og serum underkastet elektoforese i kommersielt fremstilte 0,5% agarose tynn sjikts geler (Paragon, Beckman Instrument Brea, CA). Brønner ble plassert i rette vinkler på gelene for tilsetning av antisera. Elektroforese ble utført ved å utsette gelene i 20 minutter for likestrøm og en lett modifisert Hyland Power Pack (Costa Mesa, CA) ved 4 0mA innstilling. Løpebufferen inneholdt barbital buffer B-2 (0,075M, pH 8,6; inneholdende 0,2% (w/v) natriumazid) blandet med et likt volum 3,0 mM vandig kalsium laktat oppløsning.
Etter elektoforese ble antiserabrønnene avsluttet ved fjerning av de tilsvarende segment av gelen mellom de på forhånd skårete spalter og konversjonell parallell brønn immunodiffusjon ble utført. 7,5 mikroliter og antihuman IgG, IgM og IgA (Behring Diagnostics, San Diego, CA) ble ved en konsentrasjon ved 5,5 pg tilsatt brønnene og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. Deretter ble brønnene farget og undersøkt for utvikling av utfellingslinjer. Antialbumin antistoff ble innebefattet i serumprøvene som en positiv kontroll.
Som vist i fig. 2 ble IgG (11) og IgA (13) immunoglobeiner identifisert i urinprøven fra pasient nr. 956. IgM opptrådde ikke i urinen (12) selv om den var tilstede i serum. Dette er ikke overraskende på grunn av den store størrelse av dette immunoglobein (ca. 900 000 dalton). Antialbumin antistoff reagerte med serumprøvene som ventet (10) ved å danne en skarpt utfellingslinje for identitet (brønn 1). Disse resultater bekrefter de positive resultater erholdt fra ELISA og Western Blot påvisningsprosedyrene og viser at de ikke var grunnet artifakter forårsaket av bruken av konsentrerte urinprøver.
Ovenfor nevnte oppfinnelse har blitt beskrevet i form av foretrukne utførelsesformer. Det vil være innlysende for den vanlige fagmann at mange tilsetninger utelatelser og substitusjoner kunne foretaes uten å fravike fra ovnen og bredden av oppfinnelsen som krevet nedenfor.

Claims (19)

1. Fremgangsmåte for påvisning av antistoff mot human immunsvik virus, karakterisert ved at den omfatter å samle opp urinprøve fra et pattedyr og undersøke en på forhånd bestemt mengde av denne urinprøve for å påvise tilstedeværelsen av antistoff mot det humane immunsvikt-viruset.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter å justere volumet av urinprøven til et på forhånd bestemt nivå før utføringen av påvisningstrinnet.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at justeringstrinnet omfatter å redusere volumet av urinprøven minst 2 0 ganger i forhold til det opprinnelige volum av urinprøven som utskilt av pattedyret som skal undersøkes.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter å utføre forsøkstrinnet med et enzymtilknyttet immunosorbent assay.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter å påvise antistoffene ved å bruke Western Blot analyse.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter å påvise antistoffene ved å bruke immunodiffusjon.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene omfatter antistoff rettet mot human immunsviktvirus virale proteiner.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at antistoffene er rettet mot human immunsviktvirus viralt protein gp41.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene omfatter antistoff rettet mot human immunsviktvirus viralt protein p24.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at antistoffene omfatter antistoff rettet mot human immunsvik virus viralt protein pl60.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene er IgG.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene er IgA.
13. Fremgangsmåte for påvisning av tilstedeværelsen av en viral enhet i et pattedyr som ikke har blitt immunisert mot denne enhet, karakterisert ved at den omfatter å samle opp en utskilt urinprøve fra pattedyret og justere volumet av denne prøve til et forhåndbestemt volum for å påvise tilstedeværelsen av antistoff rettet mot den virale enhet.
14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den omfatter å redusere volumet av urinprøven før undersøkelsen.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den omfatter å konsentrere urinprøven minst 20 ganger i forhold til det utskilte volum.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den virale enhet omfatter human immunsviktvirus.
17. Fremgangsmåte for påvisning av tilstedværelse av antistoff mot human immunsviktvirus i et menneske, karakterisert ved at den omfatter å samle opp en urinprøve utskilt av pasienten og undersøke urin-prøven for tilstedeværelse av antistoff mot human immunsviktvirus .
18. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene omfatter minst et stoff valgt fra gruppen bestående av pl7, p24, gp41, p31, gp41, p51, p55, p66,pll0, pl20 og pl60.
19. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at antistoffene omfatter minst et stoff valgt fra gruppen bestående av pl7, p24, gp41, p31, gp41, p51, p55, p66, pllO, pl20 og pl60.
NO885617A 1987-04-17 1988-12-16 Fremgangsmaate ved paavisning av menneskelig immunsviktvirus NO885617D0 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/040,013 US4865966A (en) 1987-04-17 1987-04-17 Method for detecting antibodies to human immunodeficiency virus
PCT/US1988/001304 WO1988008039A1 (en) 1987-04-17 1988-04-15 Method for detecting antibodies to human immunodeficiency virus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO885617L true NO885617L (no) 1988-12-16
NO885617D0 NO885617D0 (no) 1988-12-16

Family

ID=26716652

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO885617A NO885617D0 (no) 1987-04-17 1988-12-16 Fremgangsmaate ved paavisning av menneskelig immunsviktvirus

Country Status (4)

Country Link
DK (1) DK697188A (no)
MC (1) MC2013A1 (no)
MW (1) MW5888A1 (no)
NO (1) NO885617D0 (no)

Also Published As

Publication number Publication date
NO885617D0 (no) 1988-12-16
MC2013A1 (fr) 1990-02-16
MW5888A1 (en) 1989-06-14
DK697188A (da) 1989-02-16
DK697188D0 (da) 1988-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0216191B1 (en) Immunoassay for htlv-iii antigens
Grauballe et al. Optimized enzyme‐linked immunosorbent assay for detection of human and bovine rotavirus in stools: Comparison with electron‐microscopy, immunoelectro‐osmophoresis, and fluorescent antibody techniques
De Wolf et al. Risk of AIDS related complex and AIDS in homosexual men with persistent HIV antigenaemia.
Mabey et al. Human retroviral infections in The Gambia: prevalence and clinical features
Kelen et al. Rapid detection of Australia/SH antigen and antibody by a simple and sensitive technique of immunoelectronmicroscopy
Simmonds et al. HIV antigen and antibody detection: variable responses to infection in the Edinburgh haemophiliac cohort
US5122446A (en) Method for detecting antibodies to human immunodeficiency virus
US4865966A (en) Method for detecting antibodies to human immunodeficiency virus
CA1305411C (en) Method for the determination of anti-hiv, means therefore and theiruse in this method
VARNIER et al. Whole blood collection on filter paper is an effective means of obtaining samples for human immunodeficiency virus antibody assay
EP0196873B1 (en) Diagnostic testing for micro-organisms
Cot et al. Dual HIV-1 and HIV-2 infection in West Africa supported by synthetic peptide analysis
NO885617L (no) Fremgangsmaate ved paavisning av menneskelig immunsviktvirus
Goudsmit et al. Circulation of HIV antigen in blood according to stage of infection, risk group, age and geographic origin
CA2011783A1 (en) Immunoassay for antibodies to hiv
US6872396B2 (en) Specificity in the detection of anti-rubella IGM antibodies
Katzenstein et al. Clinical and laboratory characteristics of HIV-1 infection in Zimbabwe
KR960005366B1 (ko) 후천성 면역결핍 증후군(aids) 관련 바이러스에 대한 항체 검출용 시약
EP0495465A2 (en) Immuno-enzymatic test for the detection of viral antibody
RU2032907C1 (ru) Способ определения антител к вирусу иммунодефицита человека
Lyons, SF, McGillivray, GM, Copping, AP & Schoub Limitations of enzyme of enzyme immunoassay tests for detection of HTLV-III/LAV antibodies
KR910004213B1 (ko) Atlv 항체의 측정시약 및 측정방법
AP341A (en) Immunoassay for the detection of HIV specific IgM.
Acaye et al. Evaluation of performance of reused HIVCHEK 1+ 2 test blocks which have shown negative result: a reliable method for rural hospital?
EP0445650A2 (en) Detection of anti-hiv antibodies