NO885617L

NO885617L - PROCEDURE FOR DETERMINING HUMAN IMMUNIBLE WEIGHT VIRUS

Info

Publication number: NO885617L
Application number: NO885617A
Authority: NO
Inventors: Alvin E Friedman-Kien; Yunzhen Cao; William Borkowsky
Original assignee: Univ New York
Priority date: 1987-04-17
Filing date: 1988-12-16
Publication date: 1988-12-16
Also published as: MW5888A1; DK697188D0; NO885617D0; MC2013A1; DK697188A

Description

Fremgangsmåte ved påvisning av menneskelig immunsviktvirus. Procedure for detection of human immunodeficiency virus.

Foreliggende oppfinnelse omhandler en metode for påvisningThe present invention relates to a method for detection

av antistoff rettet mot human immunsviktvirus og som kan bli brukt for å diagnostisere AIDS og relaterte lidelser og identifisere latente asyntomatiske bærere for slike infeksjoner. of antibody directed against human immunodeficiency virus and which can be used to diagnose AIDS and related disorders and identify latent asymptomatic carriers of such infections.

Ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) ble opprinnelig igjenn-kjent og rapportert i 1981. Siden den tid har kliniske og epidemiologiske data vist at hyppigheten av AIDS har nådd epidemisk nivå i hele verden. Den forårsakene enhet for AIDS har blitt identifisert som et RNA retrovirus, det humane T-celle leukemivirus type III (HTLV-III) også kjent som lymfadenopaty assosiert virus (LAV) og AIDS-assosiert retrovirus (ARV) er nylig omdøpt til human immunsviktvirus (HIV). AIDS-pasienter kan lide av et brett spektrum opportunistiske infeksjoner så som Pneumocystis carinii, Candida albicans, herpes simplex virus og cytomegalovirus og lider også hyppig av visse tumorer spesielt Kaposi's Sarcoma. Det har blitt vurdert at antall pasienter med AIDS Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) was originally recognized and reported in 1981. Since then, clinical and epidemiological data have shown that the frequency of AIDS has reached epidemic levels throughout the world. The causative entity of AIDS has been identified as an RNA retrovirus, the human T-cell leukemia virus type III (HTLV-III) also known as lymphadenopathy associated virus (LAV) and AIDS-associated retrovirus (ARV) has recently been renamed human immunodeficiency virus ( HIV). AIDS patients can suffer from a wide range of opportunistic infections such as Pneumocystis carinii, Candida albicans, herpes simplex virus and cytomegalovirus and also frequently suffer from certain tumors especially Kaposi's Sarcoma. It has been assessed that the number of patients with AIDS

i De forenede stater fortsetter å fordoble seg omtrent hver tolvte måned. in the United States continues to double approximately every twelve months.

Det antatte AIDS-virus HIV har blitt isolert fra perifere mononukleare celler i blod, cerebrospinal væske, sæd, The putative AIDS virus HIV has been isolated from peripheral mononuclear cells in blood, cerebrospinal fluid, semen,

nøytralt vev, spytt, tårer og sjeldent urin. For å bestemme tilstedeværelse av HIV i den generelle populasjon har det blitt foreslått at masseskjerminger av denne populasjon for tilstedeværelse av antistoff rettet mot AIDS viruset skal bli foretatt. Imidlertid siden antistoffsubstanser generelt finnes kun i humant blod og serum, innbefatter de foreslåtte skjermingsteknikker og erholde en blod- eller serumprøve fra pasienten som skal undersøkes. neutral tissue, saliva, tears and rarely urine. In order to determine the presence of HIV in the general population, it has been proposed that mass screening of this population for the presence of antibodies directed against the AIDS virus should be carried out. However, since antibody substances are generally found only in human blood and serum, suggested screening techniques include obtaining a blood or serum sample from the patient to be examined.

Et antall steriologiske forsøk har blitt utviklet for åA number of stereological tests have been developed to

påvise tilstedeværelsen av antistoff mot HIV (som indikerer eksponering til HIV) i blodet fra pasienter med AIDS, er detect the presence of antibody against HIV (which indicates exposure to HIV) in the blood of patients with AIDS, is

relatert kompleks (ARC) og friske (d.v.s asymtomatiske) virusbærere. FDA-godkjent ELISA (enzymtilknyttet immunosorbent assay) såvel som eksprimentelle Western Blot Kit for måling av antistoff mot HIV er nå tilgjengelige. Disse innebefatter nylige (men fremdeles eksprimentelle) ELISA related complex (ARC) and healthy (i.e. asymptomatic) virus carriers. FDA-approved ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) as well as experimental Western Blot Kits for measuring antibody against HIV are now available. These include recent (but still experimental) ELISAs

assay kit som påviser spesifikke antistoff rettet mot det virale kappeprotein (gp41 eller ENV) og et viralt kjerneprotein (p24 eller CORE) såvel som kit som anvender Western Blot teknologi for å påvise de hovedantigene proteiner til assay kit that detects specific antibodies directed against the viral envelope protein (gp41 or ENV) and a viral core protein (p24 or CORE) as well as kits that use Western Blot technology to detect the main antigenic proteins to

HIV. I tillegg har metoder nylig blitt utviklet for å påvise disse virale antigener i vevskulturvæsker fra HIV infiserte celler dyrket også in vitro. HIV. In addition, methods have recently been developed to detect these viral antigens in tissue culture fluids from HIV-infected cells also grown in vitro.

Alle av de nåværende AIDS påvisningsmetoder anvenderAll of the current AIDS detection methods use

invasive fremgangsmåter for å erholde en blod eller serum prøve som kan analyseres for tilstedeværelse av antistoff mot HIV-viruset det vil si innsetningen av en hul nål eller annen anordning for å trekke ut en væskeprøve fra en åre, arterie eller subkutant område. Disse fremgangsmåter innebefatter en grad av risiko for helsen til personalet som er involvert med å samle opp og analysere disse prøver idet ervervet immunsviktsyndrom muligens kan bli overført via utilsiktet eksponering til en sprøyte eller nål som har blitt anvendt for å erholde en blod eller serumprøve fra en pasient som er smittet med sykdommen. I tillegg har individer som for tiden er ansett å ha en høy risiko for å invasive procedures to obtain a blood or serum sample that can be analyzed for the presence of antibodies against the HIV virus, that is, the insertion of a hollow needle or other device to extract a fluid sample from a vein, artery or subcutaneous area. These procedures involve a degree of risk to the health of personnel involved in collecting and analyzing these samples, as acquired immunodeficiency syndrome can potentially be transmitted via inadvertent exposure to a syringe or needle that has been used to obtain a blood or serum sample from a patient who is infected with the disease. In addition, individuals who are currently considered to have a high risk of

få AIDS, så som homoseksuelle menn og intravenøse stoff-misbrukere samt individer med ikke-høy risiko som bør skjermes, ofte har ubegrunnet frykt for at de kan få get AIDS, such as homosexual men and intravenous drug users as well as non-high-risk individuals who should be screened, often have unfounded fears that they may get

sykdommen mens de blir testet for denne, og følgelig unngå eksponering til enhver testprosedyre som innebefatter å the disease while being tested for it, and consequently avoid exposure to any testing procedure that involves

trekke ut blod eller serum ved å bruke en nål.withdraw blood or serum using a needle.

Visse problemer ville bli overvunnet av en ikke-invasivCertain problems would be overcome by a non-invasive

metode for å skjerme for antistoff mot HIV. En slik metode burde være egnet for bruk i masseavskjerming og unngå de iboende ulemper med de tidligere typer invasive cellologiske teknikker. method to screen for antibodies against HIV. Such a method should be suitable for use in mass screening and avoid the inherent disadvantages of the previous types of invasive cellological techniques.

Oppsummering av oppfinnelsen.Summary of the invention.

Det har nå uventet blitt oppdaget at antistoff mot HIV kan påvises i urin fra pasienter som har blitt eksponert til eller infisert med HIV. Dette er en spesielt overraskende oppdagelse siden det tidligere var antatt at antistoff ikke kunne bli påvist i human urin bortsett fra hos visse individer som lider av nyresykdom. Foreliggende oppfinnelse beskriver en ikke-invasiv metode for å påvise hvorved en pasient er infisert med HIV-virus ved å påvise tilstedeværelsen av antistoff rettet mot HIV i urin hos en pasient som skal undersøkes for HIV. It has now unexpectedly been discovered that antibodies against HIV can be detected in the urine of patients who have been exposed to or infected with HIV. This is a particularly surprising discovery since it was previously thought that antibody could not be detected in human urine except in certain individuals suffering from kidney disease. The present invention describes a non-invasive method for detecting whereby a patient is infected with the HIV virus by detecting the presence of antibody directed against HIV in the urine of a patient to be examined for HIV.

Det er følgelig et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en ikke-invasiv metode for å skjerme for antistoff rettet mot infiserende enheter. It is therefore an aim of the present invention to provide a non-invasive method of screening for antibody directed against infectious entities.

I et annet aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse en ikke-invasiv metode for å bestemme hvorvidt et individ har blitt eksponert til en spesiell viral enhet. Denne metoden omfatter og påviser tilstedeværelsen av antistoff rettet mot den spesielle virale enhet i urinen hos en pasient som ikke har blitt immunisert mot den spesielle virale enhet. In another aspect, the present invention provides a non-invasive method for determining whether an individual has been exposed to a particular viral entity. This method comprises and detects the presence of antibody directed against the particular viral entity in the urine of a patient who has not been immunized against the particular viral entity.

Disse og andre aspekter av foreliggende oppfinnelse vil bli gjort tydelig for den vanlige fagmann i lys av foreliggende beskrivelse, medfølgende krav og vedlagte tegninger. These and other aspects of the present invention will be made clear to the ordinary person skilled in the art in light of the present description, accompanying claims and attached drawings.

Kort beskrivelse av figurene.Brief description of the figures.

Fig. 1 er en representativ Western Blot analyse av de konsentrerte urinprøver ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 2 er en dobbel difusjonsgradient i munometrisk analyse av HIV-antistoff som er tilstede i urinen hos et HIV-infisert individ. Fig. 1 is a representative Western Blot analysis of the concentrated urine samples according to the present invention. Fig. 2 is a double diffusion gradient immunometric analysis of HIV antibody present in the urine of an HIV-infected individual.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.Detailed description of the invention.

Det har nå uventet blitt oppdaget at antistoff mot AIDS-virus (HIV) er tilstede i urinen hos AIDS-pasienter og HIV-infiserte individer innebefattende individer som ikke lider av nyrelidelser. I tillegg har foreliggende oppfinnere direkte indentifisert disse HIV-antistoff som medlemmer av IgG og IgA klassene av immunoglobeiner ved immunodifusjons-teknikker. Denne oppdagelse er overraskende fordi den tidligere teknikk antyder at meningsfulle titere for antivirale antistoff kun er tilstede i urinen fra pasienter som lider av nyrelidelse eller de som har blitt immunisert ved vaksinering ved poliovirus-vaksine. It has now been unexpectedly discovered that antibodies to the AIDS virus (HIV) are present in the urine of AIDS patients and HIV-infected individuals including individuals who do not suffer from kidney disease. In addition, the present inventors have directly identified these HIV antibodies as members of the IgG and IgA classes of immunoglobulins by immunodiffusion techniques. This discovery is surprising because the prior art suggests that meaningful titers of antiviral antibodies are only present in the urine of patients suffering from kidney disease or those who have been immunized by vaccination with poliovirus vaccine.

Franklin E. C. (J. Clin. Invest 38:2159-2167, 1959) har beskrevet at proteiner innebefåttene albumin, alfa, beta og gamma globuiner er tilstede i konsentrert urin fra normale mennesker. Imidlertid var disse fragmenter kun en sjettedel av størrelsen av ferdig utviklete immunoglobeiner og var antatt å være naturlige nedbrytningsprodukter av antistoff-molekyler. Spesielle antistoff blir ikke undersøkt. Franklin E. C. (J. Clin. Invest 38:2159-2167, 1959) has described that proteins including albumin, alpha, beta and gamma globulins are present in concentrated urine of normal humans. However, these fragments were only one-sixth the size of fully developed immunoglobulins and were believed to be natural breakdown products of antibody molecules. Specific antibodies are not examined.

En artikkel av Lemer, A. M. et al ( J. Clin. Invest. 41:805-815, 1962) beskriver et antistoff mot poliovirus kunne påvises i urinen fra normale individer som hadde blitt immunisert med poliovirus-vaksine. Imidlertid hadde alle av individene med påviselig urin antistoff mottatt minst tre eller flere inokuleringer med denne vaksine, og urinene ble analysert kort tid deretter. Tilstedeværelsen av antivirale antistoff i urinen hos ikke-immuniserte individer har ikke tidligere blitt rapportert i litteraturen. Faktisk var foreliggende oppfinnere ute av stand til å påvise antistoff rettet mot cytomegalovirus (CMV) eller hepatittvirus i urinen fra individer som var kjent for å være infisert med slike virale enheter. I tilfellet med CMV hadde AIDS pasienter med serum titere med 1:1 500 til 1:20 000 av anti-CMVantistoff ikke påviselige anti-CMV urinære antistoff som undersøkt med ELISA. An article by Lemer, A. M. et al (J. Clin. Invest. 41:805-815, 1962) discloses that an antibody against poliovirus could be detected in the urine of normal subjects who had been immunized with poliovirus vaccine. However, all of the subjects with detectable urinary antibody had received at least three or more inoculations with this vaccine, and the urines were analyzed shortly thereafter. The presence of antiviral antibodies in the urine of non-immunized individuals has not previously been reported in the literature. Indeed, the present inventors were unable to detect antibody directed against cytomegalovirus (CMV) or hepatitis virus in the urine of individuals known to be infected with such viral entities. In the case of CMV, AIDS patients with serum titers of 1:1,500 to 1:20,000 of anti-CMV antibody had no detectable anti-CMV urinary antibody as tested by ELISA.

Intakte antistoff (eller fragmenter av antistoff) rettet mot HIV som er tilstede i urinen fra infiserte individer har ikke tidligere blitt rapportert i litteraturen. Urinære antistoff er vanligvis funnet kun i ikke-immuniserte pasienter som lider av lidelser i nyre og/eller lever så som nevrotisk syndrom, glomerulonefritis, hepatorenalt syndrom hos de som lider av multiple myelom, en immunproliferativ lidelse. Intact antibodies (or fragments of antibodies) directed against HIV present in the urine of infected individuals have not previously been reported in the literature. Urinary antibodies are usually found only in non-immunized patients suffering from disorders of the kidney and/or liver such as neurotic syndrome, glomerulonephritis, hepatorenal syndrome in those suffering from multiple myeloma, an immunoproliferative disorder.

Mengden av HIV antistoff som er tilstede i urinen er omtrentlig 2 0 ganger lavere enn den som finnes i serum og er under grensene for påvisning for alle for tiden tilgjengelige diagnostiske teknikker. Følgelig må urinen konsentreres d.v.s. dets volum må reduseres relativt til dets opprinnelige tomvolum før den undersøkes for slike antistoff. Idet mer følsomme metoder for antistoff påvisning blir tilgjengelige er det vurdert at urinkonsentrasjons-trinnet kan fjernes. The amount of HIV antibody present in urine is approximately 20 times lower than that found in serum and is below the limits of detection for all currently available diagnostic techniques. Consequently, the urine must be concentrated, i.e. its volume must be reduced relative to its original void volume before it is examined for such antibodies. As more sensitive methods for antibody detection become available, it is considered that the urine concentration step can be removed.

Metoden ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter å erholde en urinprøve som er utstøtt av en pasient som skal under-søkes for eksponering for HIV-konsentrere urinprøven ved å redusere volumet til en slik prøve minst ca. 20 ganger i forhold til dens opprinnelige (utskilte) volum og undersøke den konsentrerte prøve for tilstedeværelsen av antistoff mot HIV. Assayet utføres ved å bruke teknikker som er velkjente for påvisning av tilstedeværelsen av slike antistoff i serum. Selv om i teorien så lite som 1-5 liter urin kunne undersøkes for tilstedeværelse av antistoffene som ønskes å bli påvist ved å bruke for tiden tilgjengelige metoder for antistoff-påvisning er 40-100 ml urin ønsket gjennvunnet fra pasienten som skal undersøkes og brukt i assayprosedyren. Den konsentrerte urin kan bli brukt umidelbart, lagret i 24 timer eller lengre ved 4"C før bruk og kan være frosset (men brytes ned ved gjenntatt frysing og tining). The method according to the present invention comprises obtaining a urine sample which is excreted by a patient who is to be examined for exposure to HIV, concentrating the urine sample by reducing the volume of such a sample by at least approx. 20 times its original (secreted) volume and examine the concentrated sample for the presence of antibody to HIV. The assay is performed using techniques well known for detecting the presence of such antibodies in serum. Although in theory as little as 1-5 liters of urine could be examined for the presence of the antibodies that are desired to be detected by using currently available methods for antibody detection, 40-100 ml of urine is desired to be recovered from the patient to be examined and used in the assay procedure. The concentrated urine can be used immediately, stored for 24 hours or longer at 4°C before use and can be frozen (but decomposes by repeated freezing and thawing).

Enhver av de mange metoder som er velkjente for fagmannen kan bli brukt for å konsentrere (redusere volumet) av urinprøven som skal analyseres. Eksempler på teknikker som kan bli brukt ved utføring av metoden ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter men er ikke begrenset til luftinn-damping membrandialyse, rotasjonsinndamping og fortrinnsvis ved å bruke en Minicon B15 konsentrator (Amicon, Danvers, MA) med et 60 000 dalton membranfilter som angitt i eksempel 1 nedenfor. Urin kan også konsentreres ved frysetørking men dette krever større volumer (f.eks. minst 200 ml). Any of the many methods well known to those skilled in the art can be used to concentrate (reduce the volume) of the urine sample to be analyzed. Examples of techniques that may be used in carrying out the method of the present invention include but are not limited to air evaporation membrane dialysis, rotary evaporation and preferably using a Minicon B15 concentrator (Amicon, Danvers, MA) with a 60,000 dalton membrane filter as indicated in example 1 below. Urine can also be concentrated by freeze-drying, but this requires larger volumes (e.g. at least 200 ml).

Når urinprøven har blitt vesentlig konsentrert kan den undersøkes for tilstedeværelse av antistoff mot HIV. Som brukt heri med hensyn til urinvolumreduksjonen betyr vesentlig konsentrert en volumreduksjon på minst 20 ganger med hensyn til det opprinnelige (utskilte) urinvolum og fortrinnsvis mellom ca. 40 ganger og 200 ganger, med hensyn til urinvolumreduksjonen d.v.s. en reduksjon i volum fra et opprinnelig (utskilte) volum på 40 ml til et endelig volum på 2 ml er en 2 0 gangers reduksjon. Prøvene kan også fryse-tørkes og resuspenderes (i f.eks. isotont fysiologisk saltvann) i ethvert ønsket volum, men som nevnt ovenfor krever dette større volumer, prøven således erholdt kan undersøkes for antistoff mot HIV-proteiner ved å bruke standard antistoff påvisningsteknikker innebefattende som ikke-begrensende eksempel ELISA Western Blotting radioimmuno assay og immunodiffusjon. When the urine sample has been significantly concentrated, it can be examined for the presence of antibodies against HIV. As used herein with respect to the urine volume reduction, substantially concentrated means a volume reduction of at least 20 times with respect to the original (excreted) urine volume and preferably between approx. 40 times and 200 times, with regard to the urine volume reduction, i.e. a reduction in volume from an initial (secreted) volume of 40 ml to a final volume of 2 ml is a 20-fold reduction. The samples can also be freeze-dried and resuspended (in e.g. isotonic physiological saline) in any desired volume, but as mentioned above this requires larger volumes, the sample thus obtained can be examined for antibody to HIV proteins using standard antibody detection techniques including as non-limiting example ELISA Western Blotting radioimmuno assay and immunodiffusion.

I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse anvendes den velkjente Western Blot analysemetode for påvisning av anti-HIV-antistoff. Denne teknikk har blitt funnet å være den mest pålitelige av de for tiden tilgjengelige metoder for påvisning av HIV-antistoff i urinen fra pattedyr. Teknikken omfatter generelt å separere proteiner (i dette tilfellet HIV-proteiner) ved gelelektroforese på basis av molekylvekt, overføre de avskilte proteiner til en egnet fast støtte (såsom et nitrocellulosefilter eller alternativt et nylonfilter) og inkubere serumet (eller urinen) fra et HIV- smittet individ med de separerte proteiner. Dette forårsaker at spesifikke HIV-antistoff som er tilstede i serumet (eller urinen) binder seg til sine respektive proteiner. HIV-antistoff blir så påvist ved å bruke merket antihuman HIV-antistoff. Denne metode for å påvise antistoff mot HIV er foretrukket på grunn av dens sensitivitet og det faktum at spesifikke antistoff mot virale proteiner blir undersøkt. Hyppigheten for falske positive resultater som er iboende når ELISA assays anvendes reduseres vesentlig ved å bruke Western Blot analyse. In a preferred embodiment of the present invention, the well-known Western Blot analysis method is used for the detection of anti-HIV antibody. This technique has been found to be the most reliable of the currently available methods for detecting HIV antibody in mammalian urine. The technique generally involves separating proteins (in this case HIV proteins) by gel electrophoresis on the basis of molecular weight, transferring the separated proteins to a suitable solid support (such as a nitrocellulose filter or alternatively a nylon filter) and incubating the serum (or urine) from an HIV- infected individual with the separated proteins. This causes specific HIV antibodies present in the serum (or urine) to bind to their respective proteins. HIV antibody is then detected using labeled antihuman HIV antibody. This method of detecting antibodies against HIV is preferred because of its sensitivity and the fact that specific antibodies against viral proteins are being investigated. The frequency of false positive results that is inherent when ELISA assays are used is significantly reduced by using Western Blot analysis.

En alternativ utførelsesform av foreliggende oppfinnelse anvender et enzym tilknyttet immunosorbent assay (ELISA) som mulighet for påvisning av antistoff som er spesifikke mot HIV. ELISA assays for påvisning av antistoff mot HIV-virus kan enten være kompetetiv eller ikke-kompetetiv (som beskrevet av E. Engvall i Methods in Enz<y>molo<q>y, 70: 419439, innebefattet heri per referanse). An alternative embodiment of the present invention uses an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) as a possibility for detecting antibodies that are specific against HIV. ELISA assays for the detection of antibody to HIV virus can be either competitive or non-competitive (as described by E. Engvall in Methods in Enz<y>molo<q>y, 70: 419439, incorporated herein by reference).

ELISA metoder er immunoassays som brukes (i dette tilfellet) for å mengdebestemme mengden av antistoff som er tilstede i en prøve som skal analyseres. Forsøkene anvender et kromogen (en fargedannende substans) for å påvise antistoffet: danne et antigenkompleks. Antistoff brukt i ELISA er kovalent bundet til disse kromogener så som orto-fenylendiamin eller ortodiansidin hvor førstnevnte danner et rødgyldent produkt i nærvær av et peroksyd (så som hydrogenperoksyd) og sistnevnte et guloransjefarget produkt i nærvær av et paroksyd. Disse farger absorberer lys ved spesielle bølgelengder (ortofenylendiamin ved 492 nm og ortodianisidin ved 400nm) og påvises og mengdebestemmes ved å bruke et spektrofotometer. ELISA methods are immunoassays that are used (in this case) to quantify the amount of antibody present in a sample to be analyzed. The tests use a chromogen (a colour-forming substance) to detect the antibody: forming an antigen complex. Antibodies used in ELISA are covalently bound to these chromogens such as ortho-phenylenediamine or orthodianisidine where the former forms a reddish-golden product in the presence of a peroxide (such as hydrogen peroxide) and the latter a yellow-orange colored product in the presence of a peroxide. These colors absorb light at specific wavelengths (orthophenylenediamine at 492 nm and orthodianisidine at 400 nm) and are detected and quantified using a spectrophotometer.

Ikke-kompetetive ELISA-forsøk anvender et immobilisert antigen for å fange ethvert antistoff og et enzymmerket andre antistoff rettet mot stoffet i hvilket forsøksanti-stoff har blitt dannet. Dersom f.eks. humane antistoff blir målt så er geite eller kanin antihuman antistoff de merkete andre antistoff. Mengden av antistoff som er tilstede er direkte proposjonal med mengden av bunnet merket andre antistoff. Kompetetive ELISA metoder omfatter en reaksjon hvori umerket (den biologiske prøve som skal undersøkes) og enzymmerkete antistoff konkurrerer om en begrenset kjent mengde antigen. I dette tilfellet utføres reaksjonen intill likevekt oppnåes og konsentrasjonen av ukjent antistoff er inverst proposjonal med mengden av bunnet enzymmerket antistoff. F.eks. dersom det ikke er noen antistoff i den ukjente prøve vil alle av de merkete antistoff binde seg til antigenet og en høy verdi angitt med en øket farge vil erholdes når mengden av merket enzym som er tilstede blir målt. Non-competitive ELISA assays use an immobilized antigen to capture any antibody and an enzyme-labeled second antibody directed against the substance in which the test antibody has been formed. If e.g. human antibodies are measured, then goat or rabbit antihuman antibodies are the labeled other antibodies. The amount of antibody present is directly proportional to the amount of bottom labeled second antibody. Competitive ELISA methods include a reaction in which unlabeled (the biological sample to be examined) and enzyme-labeled antibody compete for a limited known amount of antigen. In this case, the reaction is carried out until equilibrium is reached and the concentration of unknown antibody is inversely proportional to the amount of bound enzyme-labelled antibody. E.g. if there is no antibody in the unknown sample, all of the labeled antibodies will bind to the antigen and a high value indicated by an increased color will be obtained when the amount of labeled enzyme present is measured.

Kommersielt tilgjengelige ELISA assay kit som kan bli brukt ved anvendelse av de forskjellige utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse er tilgjengelige fra Abbott Labs (Chicago, IL) under katalognummer 1037 og som ENVACOR (human T celle lymfotrop virus III, EIA, katalog nr. 2791-22, Abbott International Diagnostics, Weisbaden Vest Tyskland). 1037 assayet anvender et ikke-kompetetivt ELISA (som beskrevet i eksempel 3 nedenfor) mens ENVACOR testen bruker et kompetetivt ELISA som (beskrevet i eksempel 2 nedefor). Disse kit inneholder komponentene som er listet i eksemplene 2 og 3 nedenfor og er foreslått for bruk i undersøkelse av serum (ikke urin) for antistoff mot HIV. Commercially available ELISA assay kits that can be used in the application of the various embodiments of the present invention are available from Abbott Labs (Chicago, IL) under catalog number 1037 and as ENVACOR (human T cell lymphotropic virus III, EIA, catalog no. 2791-22 , Abbott International Diagnostics, Weisbaden West Germany). The 1037 assay uses a non-competitive ELISA (as described in Example 3 below) while the ENVACOR test uses a competitive ELISA as (described in Example 2 below). These kits contain the components listed in Examples 2 and 3 below and are suggested for use in testing serum (not urine) for antibody to HIV.

En viktig fordel ved metoden ifølge foreliggende oppfinnelse er at den biologiske prøve som skal analyseres (urin) lett kan erholdes ved ikke-invasive teknikker og følgelig er risikoen for å overføre en HIV-infeksjon til laboratoriet og helsepersonell (f.eks. via tilfeldig gjennomhulling med en forurenset nål) i hovedsak eliminert. An important advantage of the method according to the present invention is that the biological sample to be analyzed (urine) can be easily obtained by non-invasive techniques and consequently the risk of transmitting an HIV infection to the laboratory and healthcare personnel (e.g. via accidental puncture with a contaminated needle) essentially eliminated.

Metoden ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres raskt, kun begrenset av tiden det tar å konsentrere urinprøven som skal undersøkes. I en bred sammenheng kan dette bli gjort i en tidsperiode på mindre en 90 minutter når prøvene skal konsentreres 2 00 ganger. Konsentrering av urinen 20 til 40 ganger kan utføres på mindre enn 60 minutter. Prøven kan så analyseres ved å bruke de komersielle tilgjengelige HIV serum testkit. The method according to the present invention can be carried out quickly, limited only by the time it takes to concentrate the urine sample to be examined. In a broad context, this can be done in a time period of less than 90 minutes when the samples are to be concentrated 200 times. Concentration of the urine 20 to 40 times can be performed in less than 60 minutes. The sample can then be analyzed using the commercially available HIV serum test kits.

Oppfinnelsen er videre beskrevet nedenfor i spesielle utførelses eksempler som er tiltenkt å illustrere oppfinnelsen uten å begrense dens bredde. The invention is further described below in particular embodiment examples which are intended to illustrate the invention without limiting its scope.

Eksempel 1: Urin konsentrasjonExample 1: Urine concentration

Serumprøver og 60-100 ml urin ble samlet opp (og kodet numerisk for pasient konfidensialitet) fra de følgende pasientgrupper: 28 AIDS assosierte Kaposi's sarcoma (AIDS-KS) pasienter; 21 ARC pasienter; 48 asymptomatiske HIV infiserte individer av høyrisikogruppe innebefattende (37 homoseksuelle menn, 5 kvinnelige intravenøse stoffbrukere og 1 kvinnelig transfusjonsmottaker); og 16 pasienter som led av AIDS relaterte opportunistiske infeksjoner (AIDS-OI) så som Pneumocystic Carinii og sytomegalovirus (tabell 1 inneholder spesiell pasientidentifikasjon og assay resultater) . I tillegg ble 17 ikke-AIDS smittete pasienters urin og serum, innebefattende pasienter diagnostisert til å ha cirhosis og hepatoma (1), hepatit (3), Lupus (3), glomerul-onephritis (3), neprotic syndrom (1), Lupus-nephritis (1), hjertesvikt (1), Lepromatøs spedalskhet (1), tuberkulose (2) og DM nephropaty (1) pluss prøver fra 3 0 tilsynelatende normale friske heteroseksuelle erholdt. Urinprøvene som ble erholdt fra alle de normale kontroller og AIDS pasienter oppviste i hovedsak normale verdier for proteiner når de blir undersøkt ved å bruke standard urin analyseteknikker velkjente i faget. Proteinuria (tilstedeværelsen av unormal høye konsentrasjoner av protein i urinen) blir rutinemessig påvist ved å bruke en "dyppestav" som registrerer tilstedeværelse av høye (over 150 mg) konsentrasjoner av urinært protein. Dette er indikert av en fargeforandring på dyppestaven når den sammenlignes med standarder for mengde-bestemmelse. Serum samples and 60-100 ml of urine were collected (and coded numerically for patient confidentiality) from the following patient groups: 28 AIDS-associated Kaposi's sarcoma (AIDS-KS) patients; 21 ARC patients; 48 asymptomatic high-risk HIV-infected individuals including (37 homosexual men, 5 female intravenous drug users and 1 female transfusion recipient); and 16 patients suffering from AIDS-related opportunistic infections (AIDS-OI) such as Pneumocystic Carinii and cytomegalovirus (Table 1 contains specific patient identification and assay results). In addition, the urine and serum of 17 non-AIDS infected patients, including patients diagnosed to have cirrhosis and hepatoma (1), hepatitis (3), Lupus (3), glomerulonephritis (3), neprotic syndrome (1), Lupus -nephritis (1), heart failure (1), lepromatous leprosy (1), tuberculosis (2) and DM nephropathy (1) plus samples from 30 apparently normal healthy heterosexuals obtained. The urine samples obtained from all of the normal controls and AIDS patients showed essentially normal values for proteins when examined using standard urine analysis techniques well known in the art. Proteinuria (the presence of abnormally high concentrations of protein in the urine) is routinely detected using a "dipstick" that detects the presence of high (over 150 mg) concentrations of urinary protein. This is indicated by a color change on the dipstick when compared to standards for quantity determination.

De oppsamlete urinprøver ble sentrifugert i koniske rør ved 1500 RPM i 15 minutter ved romtemperatur. Supernatanten ble dekantert og oppbevart og pellerten ble kastet. The collected urine samples were centrifuged in conical tubes at 1500 RPM for 15 minutes at room temperature. The supernatant was decanted and saved and the pellet was discarded.

Supernatanten erhold ovenfor ble konsentrert mellom 20 og 2 00 ganger med hensyn til volumet av den opprinnelige urinprøve samlet opp fra pasienten som skal undersøkes ved å bruke en Minicon B15 konsentrator med en 60 000 dalton membran (Amicon Danvers, MA). Konsentratoren virker ved å holde tilbake enhver substans som har større enn 60 000 dalton i molekylvekt på membranfilteret mens oppløsningen inndampes. Dette tar omtrentlig 1 time. (For å konsentrere urinvolumet 200 ganger (200X) fra et opprinnelig eller utgangsvolum d.v.s til 1/200 av dets startvolum ved å bruke Minicon apparaturen tar omtrent 90 minutter). Den konsentrerte urinprøve kan lagres ved 4°C i opp til 30 dager før bruk eller bli brukt umiddelbart for forsøk som beskrevet i eksemplene 2 til 5 nedefor. For Western Blot analyse eller immunodiffusjonsstudier er prøvevolumene fortrinnsvis videre konsentrert 200 ganger d.v.s til 1/200 av startvolumet. Graden av konsentrasjon for hver prøve er angitt i tabellene 1, 2 og 4 nedefor. The supernatant obtained above was concentrated between 20 and 200 times with respect to the volume of the original urine sample collected from the patient to be examined using a Minicon B15 concentrator with a 60,000 dalton membrane (Amicon Danvers, MA). The concentrator works by retaining any substance greater than 60,000 daltons in molecular weight on the membrane filter while the solution is evaporated. This takes approximately 1 hour. (To concentrate the volume of urine 200 times (200X) from an original or starting volume i.e. to 1/200 of its starting volume using the Minicon apparatus takes about 90 minutes). The concentrated urine sample may be stored at 4°C for up to 30 days prior to use or used immediately for testing as described in Examples 2 through 5 below. For Western Blot analysis or immunodiffusion studies, the sample volumes are preferably further concentrated 200 times, i.e. to 1/200 of the starting volume. The degree of concentration for each sample is indicated in Tables 1, 2 and 4 below.

Eksempel 2: ELISA assay av konsentrerte urinprøverExample 2: ELISA assay of concentrated urine samples

Serumet og de konsentrerte urinprøver samlet opp i eksempel 1 ble undersøkt for tilstedeværelse av antistoff mot ENV og CORE HIV antigen som beskrevet (Allain, J.P. et al Lancet 1:1233-1236, 1986 innebefattet per referanse) ved å bruke et Abbott Envacore assay kit. Dette er et kompetetivt ELISA hvor kjente mengder av HIV-proteiner og antistoff tilsettes sammen med prøven som skal undersøkes. Tilstedeværelsen av antistoff i prøven er indikert ved en reduksjon i bindingen av kontrollantisera med kontrollantistoffet. Produsentens instruksjoner ble fulgt nøyaktig som angitt. I tillegg ble blodprøver samlet opp og analysert samtidig. The serum and concentrated urine samples collected in Example 1 were assayed for the presence of antibody to ENV and CORE HIV antigen as described (Allain, J.P. et al Lancet 1:1233-1236, 1986 incorporated by reference) using an Abbott Envacore assay kit . This is a competitive ELISA where known amounts of HIV proteins and antibody are added together with the sample to be examined. The presence of antibody in the sample is indicated by a reduction in the binding of the control antisera to the control antibody. The manufacturer's instructions were followed exactly as stated. In addition, blood samples were collected and analyzed at the same time.

Kittet inneholder et prøvefortynningsmiddel (inneholdende bovin og geitesera samt 0,1 % natrium azid), enzymkonjugert polyclonale antistoff mot HIV kappe og kjerneproteiner, kuler belagt med rekombinant gp41 eller gp24 og HIV-proteiner, ortofenylendiamin (OPD) substrat, en positiv og en negativ HIV-antistoffkontroll og instruksjoner for bruk. The kit contains a sample diluent (containing bovine and goat sera and 0.1% sodium azide), enzyme-conjugated polyclonal antibody against HIV envelope and core proteins, beads coated with recombinant gp41 or gp24 and HIV proteins, orthophenylenediamine (OPD) substrate, one positive and one negative HIV antibody test and instructions for use.

Femti mikroliter av prøvene som skal undersøkes eller kontrollene ble inkubert med 20 ml fortynningsmiddel fremskaffet av forhandler og 200 ml av enzymkonjugert polyklonalt antistoff mot HIV, kappe eller kjerneproteiner. Kuler belagt med rekombinant gp41 eller p24 HIV-proteiner ble tilsatt separate brønner inneholdende enten HIV ENV eller CORE antistoffer. Etter 16 til 22 timers inkubering ved romtemperatur ble kulene vasket og overført til passende reaksjonsrør. 3 00 mikroliter ortofenylendiamin substrat ble så tilsatt hvert rør og reaksjonen tillatt å fortsette i 3 0 minutter før tilsetning av 1 ml IN H2S04for å stoppe reaksjonen. Absorbans verdier av oppløsningen ble målt ved 492 nm ved å bruke et spektrofotometer solgt av Abbott Labs under navnet Quantum II nr. 3303-11. Et positivt resultat for tilstedeværelsen av urin eller serum antistoff til hver av HIV p24 eller gp41 proteinene ble angitt som en prøve med absorbansverdier lik eller mindre enn 0,5 ganger summen av den optiske tetthet (O.D.) av gjennomsnittelig negativ kontroll (fremskaffet av forhandler) optisk tetthet (O.D.) pluss O.D. for gjennomsnittelig positiv kontroll (fremskaffet av forhandler) som målt i det ovennevnte. Fifty microliters of the samples to be tested or the controls were incubated with 20 ml of diluent supplied by the dealer and 200 ml of enzyme-conjugated polyclonal antibody against HIV, envelope or core proteins. Beads coated with recombinant gp41 or p24 HIV proteins were added to separate wells containing either HIV ENV or CORE antibodies. After 16 to 22 hours of incubation at room temperature, the beads were washed and transferred to appropriate reaction tubes. 300 microliters of orthophenylenediamine substrate was then added to each tube and the reaction allowed to proceed for 30 minutes before adding 1 mL of IN H 2 SO 4 to stop the reaction. Absorbance values of the solution were measured at 492 nm using a spectrophotometer sold by Abbott Labs under the name Quantum II No. 3303-11. A positive result for the presence of urine or serum antibody to each of the HIV p24 or gp41 proteins was indicated as a sample with absorbance values equal to or less than 0.5 times the sum of the optical density (O.D.) of the average negative control (provided by dealer). optical density (O.D.) plus O.D. for mean positive control (vendor supplied) as measured in the above.

En tabellmessig identifikasjon av pasientene skjermet med foreliggende oppfinnelse og assay resultatene er angitt i A tabular identification of the patients protected by the present invention and the assay results are indicated in

tabellene 1 og 2 og oppsummert i tabell 3. tables 1 and 2 and summarized in table 3.

Under referanse til tabell 1 og 2 kan det finnes at 71,4% av de AIDS induserte Kaposi's sarcoma pasienter, 81% av ARC pasientene, 69,7% av pasientene i høyrisikogruppen og 68,8% av pasientene som lider av opportunistiske infeksjoner hadde antistoff mot ENV proteinene (gp41) av HIV tilstede i sin urin og at slike antistoff ble påvist ved å bruke metodene ifølge foreliggende oppfinnelse. Den totale prosentvise mengde av pasienter med påviselige ENV antistoff var 72,2%. Kjerneantigenet ble kun påvist i urinen fra 6 individer og disse var i den asymtomatiske infiserte høyrisikogruppe. Alle av ikke AIDS sykdom pasientene hadde normal sunn urin fra heteroseksuelle og serum var negativ for antistoff mot begge HIV-proteiner. With reference to Tables 1 and 2, it can be found that 71.4% of the AIDS-induced Kaposi's sarcoma patients, 81% of the ARC patients, 69.7% of the patients in the high-risk group and 68.8% of the patients suffering from opportunistic infections had antibody against the ENV proteins (gp41) of HIV present in his urine and that such antibodies were detected using the methods according to the present invention. The total percentage of patients with detectable ENV antibodies was 72.2%. The core antigen was only detected in the urine of 6 individuals and these were in the asymptomatic infected high-risk group. All of the non-AIDS patients had normal healthy urine from heterosexuals and serum was negative for antibodies against both HIV proteins.

Eksempel 3Example 3

Et undersett av urinprøvene analysert i eksempel 1 ble undersøkt på nytt ved å bruke to kommersielt tilgjengelige ikke-kompetetive HIV ELISA påvisningssett. Kit 1 (HTLV III EIA kit, Lot nr. 1590HR00, Abbott Laboratories, Chicago, IL) er et FDA-godkjent klinisk diagnostisk kit; kit II (EIA Clinical Diagnostic Kit, katalog nr. 1037, Abbott Laboratories, Chicago, IL) er tiltenkt for undersøkende bruk alene. A subset of the urine samples analyzed in Example 1 was re-examined using two commercially available non-competitive HIV ELISA detection kits. Kit 1 (HTLV III EIA kit, Lot No. 1590HR00, Abbott Laboratories, Chicago, IL) is an FDA-approved clinical diagnostic kit; kit II (EIA Clinical Diagnostic Kit, Catalog No. 1037, Abbott Laboratories, Chicago, IL) is intended for investigative use only.

Hver av kittene inneholder HIV antigenbelagte kuler, geiteantihuman antistoff konjugert til pepperrotperoksidase, en positiv kontroll, en negativ kontroll, prøvefortynnings-middel inneholdende vin og geiteserum, OPD og et OPD fortynningsmiddel inneholdende sitratfosfat buffer og 0,02% hydrogen peroksyd, reaksjonsbrett, assayrør og instruksjoner for bruk. Each of the kits contains HIV antigen-coated beads, goat antihuman antibody conjugated to horseradish peroxidase, a positive control, a negative control, sample diluent containing wine and goat serum, OPD and an OPD diluent containing citrate phosphate buffer and 0.02% hydrogen peroxide, reaction tray, assay tube and instructions for use.

Assayet får tilstedeværelsen i urin fra en passient som skal undersøkes for antistoff mot HIV utføres som følger. 10 mikroliter kontroll eller fortynnet prøve innføres i på forhånd utvalgte brønner av reaksjonsbrettet. Hver brønn kan holde opp til 400 mikroliter væske. 200 mikroliter prøvefor-tynningsmiddel og en kule tilsettes per brønn. Reaksjonene inkuberes i ca. 1 time ved 40°C. Deretter kastes superlatanten (d.v.s væsken) og kulen vaskes 3 ganger ved 4-6 ml destilert eller deionisert vann. Tohundre mikroliter merket geiteantihumanantistoff blir så tilsatt og inkubert ved 40°C i ca. 2 timer. Superlatanten fjernes og kulen vaskes som ovenfor. Kulen overføres til et assayrør, 300 mikroliter OPD substratoppløsning tilsettes og oppløsningen inkuberes i ca. 3 0 minutter. 1 ml IN svovelsyre tilsettes og absorbansen til oppløsningen bestemmes ved 492 nm i et standard Abbott Labs spektrofotometer (modell 3303-11 tilgjengelig fra Abbott Labs). En positiv verdi er angitt dersom en prøve ligger innenfor området 0,5 til 1,5 ganger gjennomsnittelig positiv kontroll. The assay obtains the presence in urine of a patient to be examined for antibody against HIV is carried out as follows. 10 microliters of control or diluted sample are introduced into pre-selected wells of the reaction tray. Each well can hold up to 400 microliters of liquid. 200 microliters of sample diluent and one pellet are added per well. The reactions are incubated for approx. 1 hour at 40°C. The superlatent (i.e. the liquid) is then discarded and the bead is washed 3 times with 4-6 ml of distilled or deionized water. Two hundred microliters of labeled goat antihuman antibody is then added and incubated at 40°C for approx. 2 hours. The superlatent is removed and the sphere is washed as above. The bead is transferred to an assay tube, 300 microliters of OPD substrate solution is added and the solution is incubated for approx. 30 minutes. 1 mL of 1N sulfuric acid is added and the absorbance of the solution is determined at 492 nm in a standard Abbott Labs spectrophotometer (model 3303-11 available from Abbott Labs). A positive value is indicated if a sample lies within the range of 0.5 to 1.5 times the average positive control.

Resultatene av disse forsøk er vist nedenfor i tabell 4. The results of these experiments are shown below in Table 4.

Resultatene presentert i tabell 4 viser at urin antistoff mot HIV er lettere påviselige når det anvendes et mer sensitivt ELISA assay kit (kit II). Dette er det samme som for serum antistoff. Et begrenset antall av disse prøver ble videre analysert ved å bruke Western Blot teknikken som beskrevet nedenfor i eksempel 4. The results presented in table 4 show that urinary antibodies against HIV are more easily detectable when a more sensitive ELISA assay kit (kit II) is used. This is the same as for serum antibody. A limited number of these samples were further analyzed using the Western Blot technique as described below in example 4.

Eksempel 4: Western Blot analyse av konsentrerte urinprøver Example 4: Western Blot analysis of concentrated urine samples

Western Blot analyse for tilstedeværelsen av antistoff mot HIV ble utført på urin og serumprøvene samlet opp fra 59 HIV sero-positive (innebefattende 18 AIDS-KS, 27 høyrisiko individer, 6 ARC og 8 0.1. pasienter valgt ut fra de angitt i tabell 1 og 2 ovenfor) og 3 0 ikke-AIDS sykdom pasienter. Et kommersielt tilgjengelig kit (Biotech/DuPont HTLV-III Western Blot Kit, tilgjengelig fra E.I. DuPont De Nemuors & Co., Inc., Wilmington, DE) ble brukt for å foreta analysen. Kittet inneholder på forhånd skårede nitrocellulosemembran strimler med immobliserte virale antigener som har blitt separert med natrium dodecylsulfat/polyakrylamid gel elktroforese (SDS-PAGE) og elektroblottet på membranen; kontroll sera, innebefattende en negativ kontroll, en svak positivkontroll og en sterkt positiv kontroll, blotting buffer (Tris bufret saltvann med 5% ikke-fett inneholdende tørrmelk og også inneholdende varmeaktivert normalt geiteserum); vaskebuffer (Tris bufret saltvann inneholdende tween-2 0 detergent); biotinylert geite antihuman IgG; avidin-pepperrot peroksydase; 4-klor-l-naftol i oppløsning; hydrogen peroksyd og et inkuberingsbrett. Kittet ble brukt nøyaktig i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet nedenfor. Western Blot analysis for the presence of antibody against HIV was performed on urine and serum samples collected from 59 HIV sero-positive (including 18 AIDS-KS, 27 high-risk individuals, 6 ARC and 8 0.1. patients selected from those listed in Table 1 and 2 above) and 30 non-AIDS disease patients. A commercially available kit (Biotech/DuPont HTLV-III Western Blot Kit, available from E.I. DuPont De Nemuors & Co., Inc., Wilmington, DE) was used to perform the assay. The kit contains pre-scored nitrocellulose membrane strips with immobilized viral antigens that have been separated by sodium dodecyl sulfate/polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and electroblotted onto the membrane; control sera, including a negative control, a weak positive control and a strong positive control, blotting buffer (Tris buffered saline with 5% non-fat containing dry milk and also containing heat-activated normal goat serum); wash buffer (Tris buffered saline containing tween-20 detergent); biotinylated goat antihuman IgG; avidin-horseradish peroxidase; 4-chloro-1-naphthol in solution; hydrogen peroxide and an incubation tray. The kit was used exactly according to the manufacturer's instructions as described below.

Assayet omfatter å bløte strimlene i 2 ml vaskebuffer i en brønn i vaskebrettet i 3 0 minutter ved romtemperatur; væsken blir så trukket av og kastet. Strimmelene vaskes derpå med 2 ml blotting buffer i 5 til 10 minutter ved romtemperatur. 20 mikroliter av en 200 gangers konsentrert urinprøve tilsettes brønnene inneholdende strimlene og blotting buffer og reaktanten inkuberes over natten ved romtemperatur. Deretter aspireres og kastes blandingen i brønnene og brønnene vaskes en gang med 2 ml vaskebuffer. Ytterligere 2 ml's vasker (med vaskebuffer) ble utført ved romtemperatur ved å tillate 5 minutters bløtgjøring mellom hver vaske og kast av vasken etterpå. The assay involves soaking the strips in 2 ml of wash buffer in a well of the wash tray for 30 minutes at room temperature; the liquid is then drawn off and discarded. The strips are then washed with 2 ml of blotting buffer for 5 to 10 minutes at room temperature. 20 microliters of a 200 times concentrated urine sample is added to the wells containing the strips and blotting buffer and the reactant is incubated overnight at room temperature. The mixture is then aspirated and discarded into the wells and the wells are washed once with 2 ml of wash buffer. Additional 2 ml washes (with wash buffer) were performed at room temperature by allowing 5 minutes of soaking between each wash and discarding the wash afterwards.

Nitrocellulose strimlene fremkalles som følger. 2 ml biotynilert geit antihuman IgG tilsettes hver brønn og tillates å inkubere i 60 minutter ved romtemperatur på en gyngende eller roterende anordning. Strimlene blir så vasket med 2 ml vaskebuffer per strimmel i 5 minutter; dette trinn blir så gjentatt ytterligere 3 ganger ved romtemperatur og med å kaste vasken etter hver bruk. 2 ml per strimmel med avidinpepperrot peroksydase tilsettes og inkuberes i 3 0 minutter i romtemperatur på en gyngende eller roterende anordning. Strimlene vaskes 3 ganger som ovenfor. 2 ml av en 50:50 blanding av 4-klor-l-naftol og hydrogen peroksyd tilsettes derpå og inkuberes i 10 til 15 minutter eller intill fargen utvikler seg ved romtemperatur. Tilstedeværelsen av farge på strimmelen indikerer at strimmelen har blitt eksponert til en biologisk væske (d.v.s urin) inneholdende antistoff mot HIV. The nitrocellulose strips are developed as follows. 2 ml of biotinylated goat antihuman IgG is added to each well and allowed to incubate for 60 minutes at room temperature on a rocking or rotating device. The strips are then washed with 2 ml wash buffer per strip for 5 minutes; this step is then repeated a further 3 times at room temperature and with the washing thrown away after each use. 2 ml per strip of avidin horseradish peroxidase is added and incubated for 30 minutes at room temperature on a rocking or rotating device. The strips are washed 3 times as above. 2 ml of a 50:50 mixture of 4-chloro-1-naphthol and hydrogen peroxide is then added and incubated for 10 to 15 minutes or until color develops at room temperature. The presence of color on the strip indicates that the strip has been exposed to a biological fluid (i.e. urine) containing antibody to HIV.

Strimlene blir så vurdert for tilstedeværelse av antistoff mot HIV som negativ (-) d.v.s. ingen antistoff mot HIV er påvist, svakt positiv (±) eller sterkt positiv (+) ved å bruke kontrollene fremskaffet av forhandler som referanse. Resultatene er presentert i tabell 5 og fig. 1. Under henvisning til tabell 5 er pl7 en proteinkomponent dannet ved spaltning av p55 til p24, p24 er det virale kjerneprotein, p31 er den virale endonuklease, p41 er det ferdigutviklet kappeprotein, p51 og p66 er komponenter av den virale reverstranskriptase, p55 er en prekursor til det virale kjerneprotein og pl60 er en prekursor til kappeproteinet; pllO/120 er en blanding av 2 proteiner som vandrer sammen i dette gelsystemet: pl20 er en proteinkomponent dannet ved prossesering av pl60 proteinet til gp41; pllO er en proteinkomponent av viruset hvis funksjon for tiden er ukjent. The strips are then assessed for the presence of antibody against HIV as negative (-), i.e. no antibody to HIV is detected, weakly positive (±) or strongly positive (+) using the dealer supplied controls as a reference. The results are presented in table 5 and fig. 1. Referring to Table 5, p17 is a protein component formed by cleavage of p55 to p24, p24 is the viral core protein, p31 is the viral endonuclease, p41 is the mature envelope protein, p51 and p66 are components of the viral reverse transcriptase, p55 is a precursor to the viral core protein and pl60 is a precursor to the coat protein; pllO/120 is a mixture of 2 proteins that travel together in this gel system: p120 is a protein component formed by processing the p160 protein into gp41; pllO is a protein component of the virus whose function is currently unknown.

Ett eksempel på en typisk Western Blot analyse av den konsentrerte urin og serumprøven erholdt ved å utføre metoden ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i figur 1. Under referanse til figur 1 er brønn 22 den negative kontroll, brønn 23 den svakt positive kontroll og brønn 24 den sterke positive kontroll hvor tallene til høyre representerer de forskjellige HIV-proteiner beskrevet ovenfor. Ovenliggende linjer 12-16 og 18-21 er de tilsvarende pasienter som referert til tabell 5 ovenfor. F.eks. inneholdt urin erholdt fra pasient nr. 956 (fig. 1 brønn 16) som lider av ARC antistoff rettet mot alle av HIV-proteinene bortsett fra p24 (kjerne) og pl7. Betydningen av dette funn er for tiden ukjent. One example of a typical Western Blot analysis of the concentrated urine and serum sample obtained by carrying out the method according to the present invention is shown in Figure 1. With reference to Figure 1, well 22 is the negative control, well 23 the weak positive control and well 24 the strong positive control where the numbers on the right represent the different HIV proteins described above. Above lines 12-16 and 18-21 are the corresponding patients as referred to table 5 above. E.g. contained urine obtained from patient No. 956 (Fig. 1 well 16) suffering from ARC antibody directed against all of the HIV proteins except p24 (core) and pl7. The significance of this finding is currently unknown.

Som det kan observeres fra dataene i tabell 5 og oppsummert i tabell 6 kan antistoff mot HIV antigener lett bli funnet (når det er tilstede) i de konsentrerte urinprøver ved å bruke denne mer følsomme teknikk. Spesielt kunne antistoff mot p 160 i den konsentrerte urin bli påvist i 55 av 59 HIV positive individer som er undersøkt (93,2%). Disse resultater viser også at bruken av konsentrert urin i denne foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen ikke fører til falske positiver siden spesifikke virale proteiner bli identifisert. As can be observed from the data in Table 5 and summarized in Table 6, antibody to HIV antigens can be easily found (when present) in the concentrated urine samples using this more sensitive technique. In particular, antibody against p 160 in the concentrated urine could be detected in 55 of 59 HIV positive individuals examined (93.2%). These results also show that the use of concentrated urine in this preferred embodiment of the invention does not lead to false positives since specific viral proteins are identified.

Eksempel 4:Dobbel difusjon gradient immunoelektoforetisk analyse av HIV-antistoff inneholdende urinprøver. Example 4: Double diffusion gradient immunoelectrophoretic analysis of HIV antibody containing urine samples.

Konsentrert urinprøve nr. 956 (tabell I) som viste seg positiv for HIV antigener ved å bruke Western Blot analyse og antistoff rettet mot kappeproteinet ved å bruke ELISA ble ytterligere konsentrert 200 ganger og analysert med dobbeldiffusjon gradient immunoelektoforese (DDG-IEP) som beskrevet av J. V. Chuba i J. App. Biochem., 1: 37-50, 1979 (innebefattet per referanse). Serum prøver fra denne pasient ble samlet opp og analysert i parallell med pasienturin-prøvene som en positiv kontroll. Concentrated urine sample No. 956 (Table I) that tested positive for HIV antigens using Western Blot analysis and antibody directed against the coat protein using ELISA was further concentrated 200 times and analyzed by double diffusion gradient immunoelectrophoresis (DDG-IEP) as described by J.V. Chuba in J. App. Biochem., 1: 37-50, 1979 (incorporated by reference). Serum samples from this patient were collected and analyzed in parallel with the patient urine samples as a positive control.

Kort ble like prøver av 3 mikroliter av henholdsvis urin og serum underkastet elektoforese i kommersielt fremstilte 0,5% agarose tynn sjikts geler (Paragon, Beckman Instrument Brea, CA). Brønner ble plassert i rette vinkler på gelene for tilsetning av antisera. Elektroforese ble utført ved å utsette gelene i 20 minutter for likestrøm og en lett modifisert Hyland Power Pack (Costa Mesa, CA) ved 4 0mA innstilling. Løpebufferen inneholdt barbital buffer B-2 (0,075M, pH 8,6; inneholdende 0,2% (w/v) natriumazid) blandet med et likt volum 3,0 mM vandig kalsium laktat oppløsning. Briefly, equal samples of 3 microliters of urine and serum, respectively, were subjected to electrophoresis in commercially prepared 0.5% agarose thin-layer gels (Paragon, Beckman Instrument Brea, CA). Wells were placed at right angles to the gels for addition of antisera. Electrophoresis was performed by exposing the gels for 20 min to direct current and a slightly modified Hyland Power Pack (Costa Mesa, CA) at a 40mA setting. The running buffer contained barbital buffer B-2 (0.075M, pH 8.6; containing 0.2% (w/v) sodium azide) mixed with an equal volume of 3.0 mM aqueous calcium lactate solution.

Etter elektoforese ble antiserabrønnene avsluttet ved fjerning av de tilsvarende segment av gelen mellom de på forhånd skårete spalter og konversjonell parallell brønn immunodiffusjon ble utført. 7,5 mikroliter og antihuman IgG, IgM og IgA (Behring Diagnostics, San Diego, CA) ble ved en konsentrasjon ved 5,5 pg tilsatt brønnene og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. Deretter ble brønnene farget og undersøkt for utvikling av utfellingslinjer. Antialbumin antistoff ble innebefattet i serumprøvene som en positiv kontroll. After electrophoresis, the antisera wells were terminated by removing the corresponding segment of the gel between the pre-cut slits and conversional parallel well immunodiffusion was performed. 7.5 microliters and antihuman IgG, IgM and IgA (Behring Diagnostics, San Diego, CA) at a concentration of 5.5 µg were added to the wells and incubated for 20 minutes at room temperature. The wells were then stained and examined for the development of precipitation lines. Antialbumin antibody was included in the serum samples as a positive control.

Som vist i fig. 2 ble IgG (11) og IgA (13) immunoglobeiner identifisert i urinprøven fra pasient nr. 956. IgM opptrådde ikke i urinen (12) selv om den var tilstede i serum. Dette er ikke overraskende på grunn av den store størrelse av dette immunoglobein (ca. 900 000 dalton). Antialbumin antistoff reagerte med serumprøvene som ventet (10) ved å danne en skarpt utfellingslinje for identitet (brønn 1). Disse resultater bekrefter de positive resultater erholdt fra ELISA og Western Blot påvisningsprosedyrene og viser at de ikke var grunnet artifakter forårsaket av bruken av konsentrerte urinprøver. As shown in fig. 2, IgG (11) and IgA (13) immunoglobulins were identified in the urine sample from patient no. 956. IgM did not appear in the urine (12) although it was present in the serum. This is not surprising because of the large size of this immunoglobulin (about 900,000 daltons). Antialbumin antibody reacted with the serum samples as expected (10) by forming a sharp precipitate line for identity (well 1). These results confirm the positive results obtained from the ELISA and Western Blot detection procedures and show that they were not due to artifacts caused by the use of concentrated urine samples.

Ovenfor nevnte oppfinnelse har blitt beskrevet i form av foretrukne utførelsesformer. Det vil være innlysende for den vanlige fagmann at mange tilsetninger utelatelser og substitusjoner kunne foretaes uten å fravike fra ovnen og bredden av oppfinnelsen som krevet nedenfor. The above-mentioned invention has been described in the form of preferred embodiments. It will be obvious to those of ordinary skill in the art that many additions, omissions and substitutions could be made without departing from the spirit and scope of the invention as claimed below.

Claims

1. Method for detecting antibody against human immunodeficiency virus, characterized in that it comprises collecting a urine sample from a mammal and examining a predetermined amount of this urine sample to detect the presence of antibody against the human immunodeficiency virus.

2. Method according to claim 1, characterized in that it comprises adjusting the volume of the urine sample to a predetermined level before performing the detection step.

3. Method according to claim 2, characterized in that the adjustment step comprises reducing the volume of the urine sample at least 20 times in relation to the original volume of the urine sample secreted by the mammal to be examined.

4. Method according to claim 1, characterized in that it comprises carrying out the experimental step with an enzyme-linked immunosorbent assay.

5. Method according to claim 1, characterized in that it includes detecting the antibodies by using Western Blot analysis.

6. Method according to claim 1, characterized in that it comprises detecting the antibodies by using immunodiffusion.

7. Method according to claim 1, characterized in that the antibodies comprise antibodies directed against human immunodeficiency virus viral proteins.

8. Method according to claim 7, characterized in that the antibodies are directed against human immunodeficiency virus viral protein gp41.

9. Method according to claim 1, characterized in that the antibodies comprise antibodies directed against the human immunodeficiency virus viral protein p24.

10. Method according to claim 7, characterized in that the antibodies comprise antibodies directed against human immunodeficiency virus viral protein pl60.

11. Method according to claim 1, characterized in that the antibodies are IgG.

12. Method according to claim 1, characterized in that the antibodies are IgA.

13. Method for detecting the presence of a viral entity in a mammal that has not been immunized against this entity, characterized in that it comprises collecting a excreted urine sample from the mammal and adjusting the volume of this sample to a predetermined volume to detect the presence of antibody directed against the viral entity.

14. Method according to claim 13, characterized in that it comprises reducing the volume of the urine sample before the examination.

15. Method according to claim 13, characterized in that it comprises concentrating the urine sample at least 20 times in relation to the secreted volume.

16. Method according to claim 13, characterized in that the viral unit comprises human immunodeficiency virus.

17. Method for detecting the presence of antibody against human immunodeficiency virus in a person, characterized in that it comprises collecting a urine sample secreted by the patient and examining the urine sample for the presence of antibody against human immunodeficiency virus.

18. Method according to claim 1, characterized in that the antibodies comprise at least one substance selected from the group consisting of p17, p24, gp41, p31, gp41, p51, p55, p66, p110, p120 and p160.

19. Method according to claim 16, characterized in that the antibodies comprise at least one substance selected from the group consisting of p17, p24, gp41, p31, gp41, p51, p55, p66, p110, p120 and p160.