NO171754B - Immunokjemisk kompetitiv metode for bestemmelse av antistoffer mot hiv, et proevesett for gjennomfoering av fremgangsmaaten samt anvendelse av proevesettet - Google Patents

Immunokjemisk kompetitiv metode for bestemmelse av antistoffer mot hiv, et proevesett for gjennomfoering av fremgangsmaaten samt anvendelse av proevesettet Download PDF

Info

Publication number
NO171754B
NO171754B NO874453A NO874453A NO171754B NO 171754 B NO171754 B NO 171754B NO 874453 A NO874453 A NO 874453A NO 874453 A NO874453 A NO 874453A NO 171754 B NO171754 B NO 171754B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
hiv
antibodies
solid phase
antibody
marked
Prior art date
Application number
NO874453A
Other languages
English (en)
Other versions
NO171754C (no
NO874453L (no
NO874453D0 (no
Inventor
Udo Krupka
Thomas Buch
Hans Erwin Pauly
Original Assignee
Behringwerke Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Behringwerke Ag filed Critical Behringwerke Ag
Publication of NO874453D0 publication Critical patent/NO874453D0/no
Publication of NO874453L publication Critical patent/NO874453L/no
Publication of NO171754B publication Critical patent/NO171754B/no
Publication of NO171754C publication Critical patent/NO171754C/no

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983Viruses
    • G01N33/56988HIV or HTLV

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Financial Or Insurance-Related Operations Such As Payment And Settlement (AREA)
  • Emergency Protection Circuit Devices (AREA)
  • Refuse Collection And Transfer (AREA)
  • Spinning Or Twisting Of Yarns (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en immunokjemisk, kompetitiv metode for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV under anvendelse av en fastfase bestående av en bærer og dertil bundet hylse- og kjerneproteiner av HIV, oppnådd fra HIV-kulturer og markerte antistoffer, rettet mot hylse- og kjerneproteiner av HIV, hvorved antistoffene konkurrerer om bindingssetene på fastfasen og proteinene er bundet direkte eller via en ikke-immunokjemisk bindende spacer til bæreren.
Oppfinnelsen angår også et prøvesett for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV i den ovenfor beskrevne immunokjemiske kompetitive metode.
Til slutt angår oppfinnelsen anvendelsen av et slikt prøvesett ved en metode som beskrevet for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV.
Metoden er egnet til høysensitiv og spesifikk påvisning og bestemmelse av HIV-spesifikke antistoffer av IgG- og IgM-klassen hos mennesker.
Som frembringer av den for kort tid siden erkjente infektiøse sykdom AIDS (ervervet immunodefekt-syndrom), som har en høy dødlighetsgrad, anses et virus (Retrovirus) henholdsvis en snevert beslektet gruppe av viruser, som i den nyere tid betegnet som Human Immune Deficiency Virus (HIV), men også T-Lymphotropic Virus Type III (HTLV III) eller Lymphadeno-pathy Associated Virus (LAV).
Viruset kan overføres ved hjelp av humanblod og kontaminert blodpreparater og kunne isoleres fra væsker, sædvæske, tårevæske og spytt.
Den serologiske bestemmelse av HIV-spesifikke antistoffer foretas for å klargjøre om et individ hadde kontakt med viruset og er å anse som potensiell bærer av det infektiøse stoff. En vesentlig betydning av antistoff-bestemmelsen består ved siden av anvendelsen som diagnose-instrumentarium for AIDS (sammen med andre undersøkelser og anamnese) i nedsettelsen av risikoen for en overføring av sykdomsfrem-bringeren via transfusjon, organtransplantasjon, blodpreparater eller sperma, ved utelukkelse av avgivere av antistoff-positive personer. Dessuten er HIV-antistoff-bestemmelsen av viktighet hos de som tilhører såkalte risikogrupper (homosek-suelle, narkomane, hemofile, barninfiserte mødre) likeledes som ved epidemiologiske undersøkelser.
Påvisning av anti-HIV under anvendelse av Western Blot-teknikk slik den eksempelvis er omtalt i US-PS 4 520 113, gjelder som den i dag mest følsomme påvisning av HIV-spesif ikke antistoffer. Derved spaltes anriket og inaktivert HIV-proteinmateriale ved hjelp av elektroforese efter molekylvektene og overføres derefter på nitrocellulosepapir, fortrinnsvis elektroforetisk. Med således immobilisert antigen kan det gjennomføres, som modifikasjon til US-PS 4 520 113, hvor det anvendes en RIA, uten tap av følsomhet, en indirekte ELISA i det ved anvendelse av tungtoppløselige farvestoffsystemer ved enzymreaksjonen, er det mulig å visualisere båndene der det har funnet sted en immunreaksjon. Man kan så, efter vurdering mot tilsvarende kontrollmate-riale, skille mellom farvede virus-spesifikke bånd og ikke-virusantigen-spesifikke samt kryss- eller ikke-spesifikt reagerende forurensninger, og derved fullføre en diskriminering mellom ekte- og falsk-positive reaksjoner.
Videre er det kjent en fremgangsmåte som er en kompetitiv ELISA og med hensyn til spesifisitet og følsomhet angivelig oppfyller kriteriene av Western Blot-teknikk ("Xrzte-Zeitung", Nr. 1, 25/26.10.1985, s. 20).
I denne fremgangsmåte benyttes ufortynnede prøver. Med den er det samtidig påvisbart HIV-spesifikke antistoffer av IgG-og IgM-klassen. Fremgangsmåten kan gjennomføres med et prøvesett fra firma Wellcome, betegnet som Wellcozyme Anti-HTLV III. For fastfasen anvendes mikrotestplater, hvortil rensede HIV-antistoffer er bundet og på disse immobiliseres immunokjemisk igjen HIV-antigener. Prøvene inkuberes i kavitetene (bølgene) sammen med pepperrotperoksydase-markert anti-HIV. Derved konkurrerer antistoffene mot HIV fra prøven med det markerte anti-HIV om bindestedene av HIV på fastfasen. Mengden i bølgene bundet markert antistoff er omvendt proporsjonal til anti-HIV-konsentrasjonen i prøven.
Meget ofte kunne, ved datidens anvendte prøver, humane leukocyttantigener klasse II (HLA II, særlig DR4 ) gjøres ansvarlig for falsk-positive resultater, idet de stammer fra de for HIV-dyrking vanligvis anvendte humane lymfocytt-cellelinjer og som spesielt kunne føre til falsk-positive resultater ved polytransfuderte pasienter (anti-HLA DR4).
Denne type av "uspesifikke" reaksjoner utelukkes ved den nevnte kompetitive prøvesett til påvisning av HIV-spesifikke antistoffer (Walgate R., Beardsley T. , (1986) "Nature" 320, 96) ved anvendelsen av den humane cellelinje CCRF-CEM til virusdyrkning, da disse celler ikke har HLA av klasse II.
Ble det ved den omtalte kompetitive ELISA anvendt HIV, som var dyrket i den for bedre utbytte kjente H9-cellelinje, så var å fastslå, at ekstremt store menger av virusutgangsmate-riale er nødvendig for på den ene side å rense fangerantistoffer for immobilisering på fastfasen og på den annen side å oppnå den for en maksimal sensitivitet nødvendige metning av de på kunststoffimmobiliserte fangerantistoffer med antigen, at videre den immunadsorptive rensning av humant serum kun forløper utilfredsstillende med henblikk på en forbedring av spesifisiteten når det anvendes på H9-dyrket og dermed med nukleære mitochondriale og leukocyttære antigener kontaminert HIV-antigenmateriale. Videre ble det bare oppnådd meget små utbytter av spesifikke humanantistoffer, hvilket umuliggjør anvendelsen som screeningstest av økonomiske grunner.
Det ble funnet, at den kompetitive metode til påvisning og til bestemmelse av antistoffer mot HIV, så vel av IgM-som IgG-klassen er mulig ved anvendelsen av fastfase, hvortil HIV-antigenene som også kan være forurenset med fra vertscel-lene stammende antigener, anvendes direkte, altså er bundet uten antistofformidlet binding, når det anvendes markerte antistoffer mot HIV, som hverken reagerer med vertscellenes antigener eller med andre antigener fra humanvev.
I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en immunkjemisk, kompetitiv metode for påvisning og bestemmelser av antistoffer mot HIV, omfattende følgende trinn: a) å binde hylse- og kjerneproteiner av HIV irreversibelt, direkte eller via en ikke-immunkjemisk spacer til en
fastfase,
b) inkubere de således immobiliserte HIV-proteiner med en probe av en biologisk væske og markerte antistoffer mot
HIV,
c) hvorved de markerte antistoffer og de ikke-markerte antistoffer fra proben konkurrerer om bindingssetene på
HIV-proteinene, og
d) derefter gjennomfører bestemmelsen av mengden av bundne markerte antistoffer eller den ikke-bundne andel av de
markerte antitstoffer,
og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at de markerte antistoffer ikke reagerer med antigener fra en HIV-fri vertscelle og et HIV-fritt medium og ikke med et HIV-fritt human-vev, og at de markerte antistoffer er en kombinasjon av minst to forskjellige antistoffer av hvilke en er rettet mot kjerneproteinet p24 og det andre mot hylseproteinet gp41 og/eller gpl20.
Som nevnt ovenfor angår oppfinnelsen også et prøvesett for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV i den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, inneholdende en bærer til hvilken hylse- og kjerneproteiner av HIV, oppnådd fra HIV-kulturer, bindes direkte eller via en ikke-immunkjemisk bindende spacer, markerte antistoffer mot hylse- og kjerneproteiner av HIV og eventuelt reagenser for påvisning av markeringen, og prøvesettet karakteriseres ved at de markerte antistoffer er en kombinasjon av minst to forskjellige antistoffer hvorved et antistoff er rettet mot kjerneproteinet p24 og det eller de andre antistoffer er rettet mot hylseproteinet gp41 og/eller gpl20, og at de markerte antistoffer ikke reagerer med antigener fra en HIV-fri vertscelle eller med et HIV-fritt medium og heller ikke med humanvev.
Til slutt angår oppfinnelsen som nevnt ovenfor anvendelsen av et slikt prøvesett i en fremgangsmåte for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV.
Det er fordelaktig at sensitiviteten for oppfinnelsens fremgangsmåte tilsvarer ømfintligheten for Western Blot-teknikk, da selv prober med lave HIV-antistofftitere fører til en signifikant inhibering av bindingen for de markerte antistoffer, noe som for eksempel ved anvendelse av en enzymmarkør tillater en visuell bedømmelse av farvestoff-utviklingen og en diskriminering av positive og negative prober med usedvanlig høy skilleskarphet, slik at også tidlige seroomdanninger, forårsaket av HIV-spesifikke IgM-antistoffer, sikkert kan erkjennes, slik at ingen inter-ferenser og derved falsk-positive resultater, forårsaket på grunn av humane leukocyttantigener (HLA), nukleære antigener eller mitochondriale antigener opptrer, at en prøving, uansett om et positivt resultat er spesifikt ved hjelp av vanlige kontrollantigener fra vertscellen er overflødig, og at, i sera, citrat-, heparin- og EDTA-plasma samt i rekalsi-fiserte plasma av human opprinnelse en sikker bestemmelse av HIV-spesifikke antistoffer er sikret og en inaktivering av probene ved 30 minutter og 55°C (HIV-inaktivering) og selv ved 10 timer og 60°C (hepatitt B-virus-inaktivering) ikke fører til falsk-positive resultater.
For fastfasen egnede antigenpreparater av HIV kan fremstilles, ved at det i første rekke oppnås HIV-positive permanente T-celler som omtalt i W085/04897 og et HIV-antigenpreparat som vist i US-PS 4 520 113. Derved propageres i første rekke HIV efter transmisjon på den humane T-cellelinje H9 ved kokultivering med lymfocytter av en AIDS-pasient og separeres derefter ved ultrasentrifugeringen fra vertscellekulturoverstående. Efter fjerning av celleskorper og fett, renses virusmaterialet over en sukrose-densitets-gradient-sentrifugering og inaktiveres derefter ved tilsetning av "Triton" og varmebehandling.
Som bærer for fastfasen egner seg kunststoffer som polystyren, polyvinylklorid, polyamid og andre syntetiske polymerer, naturlige polymerer som cellulose, samt derivati-serte naturlige polymerer som celluloseacetat og nitrocellu-lose, videre glass, spesielt glassfibere.
Bæreren kan ha form av kuler, staver, smårør og mikroprøve-plater. Flate strukturer som strimmelpapir, småplater og membraner er likeledes egnet. Bærerens overflate kan være både gjennomtrengelig og ugjennomtrengelig for vandige oppløsninger.
Foretrukne bærere er kuler, smårør, strimmelpapir og membraner. Spesielt foretrukne bærere er mikroprøveplater.
Fastfasen fremstilles idet et antigenpreparat av HIV bindes irreversibelt til bæreren.
En irreversibel binding innen oppfinnelsens ramme foreligger for eksempel ved 1) en adsorptiv binding som ikke spaltes ved immunokjemiske midler, som høyaffine antistoffer og heller ikke ved de i fremgangsmåten anvendte midler, som markerte antistoffer, fortynnings- og bufferoppløsninger, 2) en over en ikke immunokjemisk bindende spacerformidler, bioaffin binding, i det spaceren kan bestå av biotin og avidin eller av andre par av reseptorer og ligander,
3) en kovalent direkte binding
4) en kovalent, ved hjelp av en kjemisk bifunksjonell spacerformidlet binding.
Foretrukket er den kovalente bindingen i tilfelle anvendelse av vanngjennomtrengelige bærere, samt den adsorptive binding i tilfelle anvendelse av vanngjennomtrengelig som også vannugjennomtrengelige bærere.
Spesielt foretrukket er den direkte adsorptive binding av HIV-antigenpreparatene til med ^-stråler behandlet polystyren som bærer.
For markering av egnede antistoffer velges på grunn av resul-tatene av Western Blot-analyse av sera av AIDS-pasienter.
Til minimering av risikoen av en falsk-negativ diagnose må det, efter dagens kunnskap i en fremgangsmåte til erkjennelse av Pre-AIDS og AIDS, være gitt påvisningsmuligheten av minst to antistoffspesifisiteter, nemlig den for en kjerneprotein og et hylseprotein.
Egnede kombinasjoner og spesifisiteter er for eksempel slike som erkjenner 1. det som p24 betegnede kjerneprotein og det som gp41 betegnede hylseprotein eller
2. p24 og det som gp 120 betegnede hylseprotein.
Påvisning av ytterligere antistoffspesifisiteter, nemlig slike for de som pl8, p30, p55 betegnede kjerneproteiner og de som p53 og p65 betegnet ElV-polymeraser, betyr en ekstra avsikring av påvisning av anti-HIV-positive prøver.
For å utelukke en falsk positiv diagnose, bør de for markeringen foreskrevne antistoffer ikke ha spesifisiteter som erkjenner bestanddeler av humant vev, som for eksempel leukocyttantigener, nukleære og mitochondriale proteiner.
For markering kan det anvendes antistoffer av AIDS-pasienter, når de oppfyller de ved Western Blot-teknikken fastslåtte tidligere omtalte kriterier.
Videre kan det anvendes polyklonale antistoffer, utvunnet fra sera av med HIV immuniserte dyr, når disse efter absorpsjon av spesifisitetene erkjenner bestanddelen av vertscellen og kulturmediet, efter undersøkelse i Western Blot oppfyller de nevnte kriterier.
Monoklonale antistoffer er likeledes egnet. Det må da minst anvendes to i en av de nevnte kombinasjoner av spesifisiteter, altså for eksempel i kombinasjonen anti-p24 og anti-gp41.
Som markører kan det anvendes radioaktive isotomer, fluore-scerende kjemiluminescerende farvestoffer samt enzymer, hvis påvisning er mulig ved kromogene, luminogene eller fluorogene substratsystemer.
Markeringen foregår ved fremgangsmåter som er omtalt som teknikkens stand for de nevnte markører.
I tilfelle markering av antistoffer med peroksydase kan man anvende periodat-teknikken ifølge Nakane et al., 1974, "J. Histochem. Cytochem." 22, 1084-1090, eller en fremgangsmåte ifølge Ishikawa et al., 1983, "J. Immunoassay" 4, 209-327, hvori partnerne sammenknyttes med et heterobifunksjonelt reagens.
Oppfinnelsens fremgangsmåte kan for eksempel gjennomføres ved at man til kavitetene eller bølgene på en mikroprøveplate, som bundet inneholder et ovenfor beskrevet HIV-antigenpreparat,
a) samtidig setter prøven og en oppløsning av det markerte antistoff, eventuelt først prøven og efter en viss tid en
oppløsning av det markerte antistoff, efter en bestemt inkubasjonstid fjerner oppløsningen og vasker bølgene med en buffer og derefter måler markeringen i bølgene, eller
b) først setter en oppløsning inneholdende det markerte antistoff, efter en viss inkubasjonstid fjerner oppløsningen
og vasker bølgene med en buffer, eventuelt tørker mikroprøveplatene, derefter tilsetter den fortynnede prøve og inkuberer det hele i et bestemt tidsrom, derefter fjerner prøven fra bølgene og måler markeringen i prøvene.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også gjennomføres ved anvendelse av et diagnostisk element som inneholder fastfasen og i tørrform en del eller også alle nødvendige reagenser.
Følgende eksempel angir en utførelsesform av oppfinnelsen.
EKSEMPEL
1. Binding av HIV-antigen til mikroprøveplater.
Et ifølge US-PS 4 520 113 fremstilt, over sukrose-densitetsgradient-sentrifugering rensede og varmeaktiverte antigenpreparater av HIV ble forfortynnet med 100 mmol/1 natriumbikarbonat, pH 9,6 på 50 jjg/ml protein. Av denne fortynning ble det anlagt en to gangers fortynningsrekke i den samme buffer med 10 fortynninger, altså dannet en rekke med konsentrasjonene 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56, 0,78, 0,39, 0,2 og 0,1 Mg/ml. 100 jjl av en hver fortynning ble fylt i 16 bølger av mikroprøveplater, type B fra firma Nunc, Roskilde, Danmark. De med fortynningene fylte prøveplater ble hensatt i 18 timer ved 20° C, da ble oppløsningene i bølgene frasuget og bølgene vasket 3-4 ganger med 200 pl av en oppløsning av 10 g/l storfeserumalbumin i fosfatbufret fysiologisk koksaltoppløsning, pH 7,4 (PBS) ved fylling og avsugning og prøveplatene derefter tørket over kieselgel ved 20°C.
2. Fremstilling av et peroksydase-markert antistoff mot HIV
Et ifølge Western Blot-teknikk valgt serum av en AIDS-pasient som inneholdt antistoffspesifisiteter, for Core-proteiner pl8, p24, p30 og p55 og hylseproteinene gp41 og gpl20 samt for HIV-polymerasene p53 og p65, ble fraksjon-ert ved kromatografi på DEAE-cellulose. Dertil ble serumet dialysert mot buffer av 30 mmol/1 Na2HPC>4/NaH2P04» pH 7,5 og hatt på en søyle fylt med DEAE cellulose DE 32 (Whatman) og ekvilibrert med samme buffer. Den gjennom-løpte dannede IgG-fraksjon ble dialysert mot PBS og innstilt på 4 mg/ml protein.
En ytterligere undersøkelse i Western blot-teknikken viste at alle ovenfor anførte antistoff-spesifisiteter ble gjenfunnet i IgG-fraksjonen.
IgG-fraksjonen ble derefter omsatt med N-^-maleimido-butylyloksysuksinimid (GMBS), oppnådd fra firma Behring Diagnostics, som omtalt av Tanamori et al., 1983 i "J. Immunol. Meth." 62, 123-131. 2-iminotioanhydroklorid (firma Sigma, kat. nr. I 6256) ble omsatt med pepperrotperoksydase (POD), oppnådd av firma Boehringer Mannheim, kat. nr. 413470, som omtalt av King et al. 1978 i "Biochem." 17, 1499-1506. Av GMBS-IgG-konjugatet og iminotiolan-POD-konjugatet ble det fremstilt et IgG-POD-konjugat som omtalt av Tanamori.
Den dannede oppløsning av IgG-POD-konjugatet hadde et proteininnhold på 440 pg/ml. Forholdet mellom POD og IgG ble bestemt med 2,5. Oppløsningen ble derefter fortynnet på 500 ng/ml IgG-POD med en oppløsning av 50 ml/l fetalt kalveserum, 5 g/l polyoksyetylen-(20)-sorbitan-monolaurat ("Tween" 20) i PBS og fikk betegnelsen anti-HIV-POD.
3. Fremstilling av en TMB-substrattilberedning.
Til påvisning av anti-HIV-POD ble det anvendt et substrat-system eller en substratblanding inneholdende hydrogenper-oksyd og tetrametylbenzidin (TMB), som ble fremstilt av to stamoppløsninger.
Stamoppløsning 1: TMB-dihydroklorid ble under omrøring oppløst i en konsentrasjon på 5 g/l, det vil si på 16 mmol/1 i to ganger destillert vann og med 5N saltsyre innstilt på pH 1,5. Til denne oppløsning ble det satt penicillin G under omrøring til en sluttkonsentrasjon på 200 mg/l, det vil si på 0,56 mmol/1.
Stamoppløsning 2: til 900 ml to ganger destillert vann ble det satt 1,4 ml iseddik, 1,5 ml IN NaOH og 250 mg, det vil si 3 mmol H2O2 som urinstoff-hydrogenperoksydaddukt. Efter fullstendig oppløsning ble det oppfylt med to ganger destillert vann til 1 1.
TMB-substrattilberedning: en volumdel av stamoppløsning 1 og 10 volumdeler av stamoppløsning 2 ble blandet med hverandre.
4. Optimering av fremgangsmåten
16 sera som ifølge Western Blot-teknikken var blitt
bekreftet som HIV-negative, ble fortynnet med anti-HIV-POD 1:5 (1 volumdel serum pluss 4 volumdeler anti-HIV-POD).
Fra alle bølger av de med HIV-antigenpreparater behandlede mikroprøveplatene ble det tatt 125 pl av fortynningen og inkubert i 1 time ved 27°C. Fortynningen ble frasuget og bølgene vasket 4 ganger med en oppløsning av 1 g/l "Tween" 20 i PBS med fylling og frasuging. Derefter ble det til hver bølge satt 100 pl TMB-substrattilberedning og inkubert i 30 minutter ved 20-22°C. Inkubasjonen ble avsluttet ved tilsetning av 100 pl IN svovelsyre. Oppløsningens ekstinksjon ble målt mot PBS ved 450 nm.
Oppløsningen av bølgene, som var blitt belagt med 3,12 pg/ml HIV-antigen viste en E450 mellom 1,68 og 1,74. Oppløsningene av de med 1,56 pg/ml HIV-antigen belagte bølger viste en E450 mellom 1,38 og 1,45.
Det ble derefter behandlet bølger av mikroprøveplater på den ovenfor omtalte måte med et HIV-antigenpreparat av utelukkende 2,5 pg/ml. Vurderingen av de 16 sera i den med 2,5 pg/ml HIV-antigenpreparatbehandlede bølge ga ved samme forsøksforløp en midlere E45Q på 1,56 ± 0,05.
Da ved bestemmelsen av anti-HIV en grenseverdifastlegning på E større enn 0,8 for anti-HIV-negative og på E mindre enn 0,8 for anti-HIV-positive prøver anses som gunstig (grenseverdien er definert som halvparten av den midlere ekstinksjon av som negativt bekreftede prøver), ble for fremstilling av mikroprøveplater til bestemmelse av anti-HIV (anti-HIV-prøveplate) ved behandling av bølgene som også betegnes som belegg, valgt konsentrasjonen på 2,5 pg/ml HIV-antigenpreparat.
Det ble også ved alle nedenfor omtalte bestemmelser av anti-HIV benyttet de i ovenfor omtalte forforsøk anvendte reagenser, nemlig anti-HIV-POD TMB-substratttiberedningen og den i den videre som vaskebuffer betegnede oppløsning på 1 g/l "Tween" 20 i PBS.
5. Bestemmelse av humane antistoffer mot HIV
a) 25 pl serum eller plasma og 100 pl anti-HIV-POD ble fylt i bølger av anti-HIV-prøveplater og inkubert i 1
time ved 37°C. Innholdet av bølgene ble fjernet ved frasugning og bølgene vasket 4 ganger med vaskebuffer. Det ble til hver bølge satt 100 pl TMB-substrattilberedning, inkubert i 30 minutter ved 20-22°C og inkubasjonen ble avsluttet ved tilsetning av 100 pl IN svovelsyre. E450 av den farvede oppløsning ble målt mot en blindverdi av PBS.
Som anti-HIV-positiv ble slike prøver innordnet som frembragte en E450 på mindre enn 0,30, som anti-HIV-grenseverdiprøver, hvis E45Q lå i området på 0,31 til 0,80 og som anti-HIV-negative prøver som frembragte en E450 over 0,81.
Av 420 prøver, som i Western Blot-teknikk var positiv anti-HIV, ble 419 prøver likeledes funnet som positive.
Av 1 896 plasma- eller serumprøver fra sunne personer eller fra prøveobjekter som tilkjennega andre patolo-tiske tilstander, oppnådde man de i tabell 1 angitte resultater.
De 5 prøver fra risikogruppen, som reagerte initialt positivt eller grenseverdi, ble i tillegg undersøkt med Western Blot-teknikken. Herav var også bare de to prøver positive, som efter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen var blitt funnet som gjentatt positiv. Funnene viser således en god overensstemmelse mellom fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og Western Blot-teknikken.
b) Prøver av 50 pl fullblod ble fortynnet med 50 pl destillert vann inneholdende 20 g/l "Triton" x 100 og
0,2 mol/l trinatriumcitrat og 50 pl av dette lysat ble satt til bølger på anti-EIV-prøveplater. Efter en inkubasjon i 1 time ved 37° C foregikk tilsetningen av 100 ml anti-HIV-POD med efterfølgende inkubasjon og igjen 1 time ved 37°C. Bølgenes innhold ble fjernet ved frasugning, og bølgene vasket 5 ganger med vaskebuffer. Det ble til hver bølge satt 100 pl TMB-substrattilberedning inkubert i 30 minutter ved 20-25°C og reaksjonen avsluttet ved tilsetning av 100 pl IN svovelsyre. Oppløsningenes ekstinksjon ble målt ved 450 nm mot en blindverdi av PBS (E450).
Prøvenes vurdering foregikk som omtalt under punkt 5
a). Av 51 henholdsvis 5 blodprøver, som som serum i Western Blot-teknikken var positive eller svakt
positive, ble alle prøvene likeledes funnet positive.
Av 226 blodprøver, som som serum reagerte anti-HIV-negativt, ble alle prøvene likeledes funnet som negative. Derved tydeliggjøres, at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen stemmer godt overens med den som referansemetode gjeldende Western Blot-teknikk.
c) Prøver av 50 pl serum eller plasma eller av 50 pl lysat av fullblod fremstilt som omtalt i punkt 5 b)
ble med 100 pl av en oppløsning av 5 pg/ml IgG-POD fremstilt ved fortynning av det i eksempel 2 omtalte IgG-POD-konjugat av 440 pg/ml til 5 pg/ml med den allerede omtalte oppløsning inneholdende fetalt kalveserum og "Tween" 20 i PBS, fylt i bølgene av mikroprøveplater og inkubert i 10 minutter ved 45°C.
Derefter ble bølgene vasket 5 ganger med vaskebuffer. Derefter ble det til hver bølge satt 100 pl TMB-substrattilberedning og inkubert i 5 minutter ved 20-22°C. Inkubasjonen ble avsluttet ved tilsetning av IN svovelsyre. Vurderingen foregikk som omtalt under punkt 5 a).
Av 51 henholdsvis 5 prøver, som som serum i Western Blot-teknikken var positive henholdsvis svakt positive, ble alle prøver likeledes funnet positive.
Av 225 prøver som reagerte anti-EIV-negativt, ble alle prøvene likeledes funnet negative.
Dermed blir det tydelig at varianten ifølge oppfinnelsen av en hurtig fremgangsmåte med hensyn til sensitivitet og spesifisitet stemmer godt overens med den som referansemetode gjeldende Western Blot-teknikk. d) I bølgene av anti-HIV-prøveplater ble det fylt 100 pl anti-HIV-POD og inkubert i 1 time ved 37°C, anti-HIV-POD frasuges og bølgene vaskes 4 ganger med vaskebuffer. De således behandlede anti-HIV-prøveplater ble tørket over kieselgel ved 20-22°C.
Derefter ble det til bølgene satt 25 pl prøve og 100 pl av en oppløsning av 10 g/l storfeserumalbumin i 50 mmol/1 Tris, innstilt med HC1 på pH 7,4. Efter inkubasjon ved 37°C i 1 time, ble bølgenes innhold tatt ut og i bølgene satt en ikke belagt prøveplate, der blandet med 100 pl TMB-substrattilberedning, blandingen hensatt i 30 minutter ved 20-22°C og blandet med 100 pl IN svovelsyre. E450 ble derefter målt mot PBS.
Middelverdien E450 av tre gangers bestemmelse pr. prøve er angitt i tabell 2 for prøver, som efter den under punkt a) omtalte fremgangsmåte og er registrert som anti-HIV-negativ, som anti-HIV-grenseverdi og som anti-HIV-positiv.
Tabell 2 viser, at til forskjell fra utførelsesformene a) til c) er ekstinksjonen ved anti-HIV-negative prøver lav og ved anti-HIV-positive prøver høy. Grenseverdien for anti-HIV-negative prøver ved E450 er også her 0,30.

Claims (9)

1. Immunkjemisk, kompetitiv metode for påvisning og bestemmelser av antistoffer mot HIV, omfattende følgende trinn: a) å binde hylse- og kjerneproteiner av HIV irreversibelt, direkte eller via en ikke-immunkjemisk spacer til en fastfase, b) inkubere de således immobiliserte HIV-proteiner med en probe av en biologisk væske og markerte antistoffer mot HIV, c) hvorved de markerte antistoffer og de ikke-markerte antistoffer fra proben konkurrerer om bindingssetene på HIV-proteinene, og d) derefter gjennomfører bestemmelsen av mengden av bundne markerte antistoffer eller den ikke-bundne andel av de markerte antitstoffer, karakterisert ved at de markerte antistoffer ikke reagerer med antigener fra en HIV-fri vertscelle og et HIV-fritt medium og ikke med et HIV-fritt human-vev, og at de markerte antistoffer er en kombinasjon av minst to forskjellige antistoffer av hvilke en er rettet mot kjerneproteinet p24 og det andre mot hylseproteinet gp41 og/eller gpl20.
2. Immunkjemisk metode ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet som skal bestemmes og det markerte antistoff samtidig settes til fastfasen.
3. Immunokjemisk metode ifølge krav 1, karakterisert ved at det markerte antistoff først settes til de til fastfasen bundne proteiner og at proben med antistoffene som skal påvises settes til fastfasen efter en inkubasjonstid og eventuelt efter fjerning av væskefasen og vasking av fastfasen.
4. Immunokjemisk metode ifølge krav 1, karakterisert ved at man først inkuberer fastfasen med proben som inneholder antistoffet som skal bestemmes og så, eventuelt efter fjerning av væskefasen og vasking av fastfasen, tilsetter det markerte antistoff.
5. Prøvesett for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV i en immunkjemisk, kompetitiv fremgangsmåte ifølge krav 1, inneholdene en bærer til hvilken hylse- og kjerneproteiner av HIV, oppnådd fra HIV-kulturer, bindes direkte eller via en ikke-immunkjemisk bindende spacer, markerte antistoffer mot hylse- og kjerneproteiner av HIV og eventuelt reagenser for påvisning av markeringen, karakterisert ved at de markerte antistoffer er en kombinasjon av minst to forskjellige antistoffer hvorved et antistoff er rettet mot kjerneproteinet p24 og det eller de andre antistoffer er rettet mot hylseproteinet gp41 og/eller gpl20, og at de markerte antistoffer ikke reagerer med antigener fra en HIV-fri vertscelle eller med et HIV-fritt medium og heller ikke med humanvev.
6. Prøvesett ifølge krav 5, karakterisert ved at det markerte antistoff foreligger som en fra fastfasen adskilt bestanddel.
7. Prøvesett ifølge krav 5 eller 6, karakterisert ved at det markerte antistoff foreligger som en til fastfasen immunkjemisk bundet bestanddel.
8. Prøvesett ifølge minst et av kravene 5 til 7, karakterisert ved at det består av et element som helt eller delvis inneholder fastfase og I tørr form de for påvisning og bestemmelse nødvendige reagenser.
9. Anvendelse av et prøvesett ifølge minst ett av kravene 5 til 8 i en fremgangsmåte for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV.
NO874453A 1986-10-27 1987-10-26 Immunokjemisk kompetitiv metode for bestemmelse av antistoffer mot hiv, et proevesett for gjennomfoering av fremgangsmaaten samt anvendelse av proevesettet NO171754C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19863636540 DE3636540A1 (de) 1986-10-27 1986-10-27 Verfahren zur bestimmung von anti-hiv, mittel dazu und ihre verwendung in diesem verfahren

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO874453D0 NO874453D0 (no) 1987-10-26
NO874453L NO874453L (no) 1988-04-28
NO171754B true NO171754B (no) 1993-01-18
NO171754C NO171754C (no) 1993-04-28

Family

ID=6312576

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO874453A NO171754C (no) 1986-10-27 1987-10-26 Immunokjemisk kompetitiv metode for bestemmelse av antistoffer mot hiv, et proevesett for gjennomfoering av fremgangsmaaten samt anvendelse av proevesettet

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0265851B1 (no)
JP (1) JPS63128260A (no)
AT (1) ATE101725T1 (no)
AU (1) AU611102B2 (no)
CA (1) CA1305411C (no)
DE (2) DE3636540A1 (no)
DK (1) DK559187A (no)
ES (1) ES2061468T3 (no)
FI (1) FI90801C (no)
MX (1) MX168853B (no)
NO (1) NO171754C (no)
NZ (1) NZ222282A (no)
PT (1) PT85992B (no)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173400A (en) * 1983-09-15 1992-12-22 Institut Pasteur Antibody detection of antibodies to viral proteins in serum
US5217861A (en) * 1983-09-15 1993-06-08 Institut Pasteur Antigen of a human retrovirus, namely p18 protein of human immunodeficiency virus (HIV), compositions containing the antigen, a diagnostic method for detecting acquired immune deficiency syndrome (AIDS) and pre-AIDS and a kit therefor
US5374519A (en) * 1983-12-05 1994-12-20 Institut Pasteur Oligopeptides comprising p18 protein of human immunodeficiency virus (HIV), compositions comprising peptides of p18 protein of HIV, and diagnostic kits and methods for detecting acquired immune deficiency syndrome (AIDS)
EP0356007A3 (en) * 1988-07-22 1991-07-03 Medical Research Council Antigenic determinants
DE69028561T2 (de) * 1989-03-09 1997-04-17 Abbott Lab Immunoassay zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV
DE3911361A1 (de) * 1989-04-07 1990-10-11 Behringwerke Ag Verfahren zur bestimmung von antikoerpern gegen erreger von infektionskrankheiten in koerperfluessigkeiten, mittel dazu und ihre verwendung in diesem verfahren
JPH0471378U (no) * 1990-11-02 1992-06-24
CA2059317A1 (en) * 1991-01-15 1992-07-16 Yi Zeng Immuno-enzymatic test for detection of hiv-1 antibody
WO1992018865A1 (en) * 1991-04-11 1992-10-29 Cedars-Sinai Medical Center Immunoassay for the detection of hiv specific igm
ES2187947T5 (es) 1997-03-10 2014-01-29 Roche Diagnostics Gmbh Procedimiento para la detección simultánea de antígenos de HIV y anticuerpos de HIV
DE19952982B4 (de) * 1999-11-03 2004-01-29 Acgt Progenomics Ag Verfahren zur gerichteten Verpackung von molekularen Substanzen in Proteinhüllen
US6818392B2 (en) 2000-12-06 2004-11-16 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus and uses thereof
JP4895727B2 (ja) * 2006-08-28 2012-03-14 シスメックス株式会社 抗hiv抗体検出試薬、試薬キット、試薬の製造方法、及び抗hiv抗体の検出方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0136798A3 (en) * 1983-08-25 1986-02-19 Biotech Research Laboratories Inc. Titre plate and assay kit for detection of antibodies in human serum and their production and use
NZ211860A (en) * 1984-04-23 1990-10-26 Us Health Method for detection of hiv; test kit
GB8501473D0 (en) * 1985-01-21 1985-02-20 Pasteur Institut Cloned dna sequences
CA1341482C (en) * 1984-10-31 2005-05-10 Paul A. Luciw Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses
AU579715B2 (en) * 1985-02-26 1988-12-08 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Detection of human t-cell leukemia virus type iii
AU580425B2 (en) * 1985-05-24 1989-01-12 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Competitive elisa for the detection of antibodies
DE3674555D1 (de) * 1985-12-20 1990-10-31 Abbott Lab Immuntest fuer antikoerper gegen htlv-iii.

Also Published As

Publication number Publication date
ES2061468T3 (es) 1994-12-16
FI90801B (fi) 1993-12-15
PT85992B (pt) 1990-08-31
MX168853B (es) 1993-06-11
DK559187A (da) 1988-04-28
NO171754C (no) 1993-04-28
DE3636540A1 (de) 1988-04-28
AU611102B2 (en) 1991-06-06
EP0265851A2 (de) 1988-05-04
CA1305411C (en) 1992-07-21
PT85992A (de) 1987-11-01
FI874676A0 (fi) 1987-10-23
EP0265851A3 (en) 1989-11-29
ATE101725T1 (de) 1994-03-15
JPS63128260A (ja) 1988-05-31
EP0265851B1 (de) 1994-02-16
NZ222282A (en) 1990-09-26
DE3789087D1 (de) 1994-03-24
NO874453L (no) 1988-04-28
NO874453D0 (no) 1987-10-26
DK559187D0 (da) 1987-10-26
FI90801C (fi) 1994-03-25
FI874676A (fi) 1988-04-28
AU8012687A (en) 1988-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5077198A (en) Diagnostic kit and method for rapid detection of antibodies
CA1268419A (en) Immunoassay for htlv-iii antigens
JP2626721B2 (ja) Htlv―3の蛋白質の分離、エイズおよび前エイズ条件を持つ患者の血清中htlv―3に対する抗体の血清学的検出、およびhtlv―3およびその蛋白質を使用した免疫分析によるhtlv―3感染の検出
US5705331A (en) HIV nucleocapsid protein capture assay and method of use
EP0067182B1 (en) Method and test kit for detecting antigens and antibodies
EP0330694A4 (en) Test device and method of preparing same, assay kit and method for the simultaneous detection of two htlv or hiv antibodies
NO171754B (no) Immunokjemisk kompetitiv metode for bestemmelse av antistoffer mot hiv, et proevesett for gjennomfoering av fremgangsmaaten samt anvendelse av proevesettet
DK174032B1 (da) Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler
WO1998023771A9 (en) A new eia test using non-dentured hiv antigen for early detection of hiv infection
JPH0731198B2 (ja) 試験キットおよび免疫リガンドの測定方法
US20090104650A1 (en) Infectious diseases testing of menstrual fluid, endometrial/menstrual cells, amniotic fluid, umbilical cord blood or other samples
JPH11148936A (ja) イムノアッセイ及びそれを行うキット
US5122446A (en) Method for detecting antibodies to human immunodeficiency virus
WO1991013360A1 (en) NEW HIV p24 PEPTIDES, DIAGNOSTIC ANTIGENS AND DISCRIMINATIVE IMMUNOASSAY METHOD
CA1340405C (en) Method for detecting antibodies to human immunodeficiency virus
US5268299A (en) Diluent composition useful in the detection of antibodies in assays
WO2009035706A1 (en) Infectious disease testing of menstrual fluid, endometrial /menstrual cells, amniotic fluid, umbilical cord blood or other samples
AU645970B2 (en) A method for the determination of antibodies against organisms causing infectious diseases in body fluids, agents for this purpose and the use thereof in this method
EP0495465A2 (en) Immuno-enzymatic test for the detection of viral antibody
EP0302154A1 (en) Detection of HIV and anti-lymphocyte antibodies
WO1998027231A1 (en) Method and composition for the diagnosis of equine infectious anemia virus disease by using the recombinant capsid protein virus (p26)
Nielsen et al. Antigen-antibody reaction in solution in capture competition immunoassay for human immunodeficiency virus antibodies
NO885617L (no) Fremgangsmaate ved paavisning av menneskelig immunsviktvirus

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees

Free format text: LAPSED IN APRIL 2002