NO171754B - Immunokjemisk kompetitiv metode for bestemmelse av antistoffer mot hiv, et proevesett for gjennomfoering av fremgangsmaaten samt anvendelse av proevesettet - Google Patents
Immunokjemisk kompetitiv metode for bestemmelse av antistoffer mot hiv, et proevesett for gjennomfoering av fremgangsmaaten samt anvendelse av proevesettet Download PDFInfo
- Publication number
- NO171754B NO171754B NO874453A NO874453A NO171754B NO 171754 B NO171754 B NO 171754B NO 874453 A NO874453 A NO 874453A NO 874453 A NO874453 A NO 874453A NO 171754 B NO171754 B NO 171754B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hiv
- antibodies
- solid phase
- antibody
- marked
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 18
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 17
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims description 12
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 8
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 4
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 4
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 abstract 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 16
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 9
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220467406 Acyl-coenzyme A thioesterase MBLAC2_E45Q_mutation Human genes 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- NYNRGZULARUZCC-UHFFFAOYSA-N [4-(4-azaniumyl-3,5-dimethylphenyl)-2,6-dimethylphenyl]azanium;dichloride Chemical compound Cl.Cl.CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 NYNRGZULARUZCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Financial Or Insurance-Related Operations Such As Payment And Settlement (AREA)
- Emergency Protection Circuit Devices (AREA)
- Refuse Collection And Transfer (AREA)
- Spinning Or Twisting Of Yarns (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en immunokjemisk, kompetitiv metode for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV under anvendelse av en fastfase bestående av en bærer og dertil bundet hylse- og kjerneproteiner av HIV, oppnådd fra HIV-kulturer og markerte antistoffer, rettet mot hylse- og kjerneproteiner av HIV, hvorved antistoffene konkurrerer om bindingssetene på fastfasen og proteinene er bundet direkte eller via en ikke-immunokjemisk bindende spacer til bæreren.
Oppfinnelsen angår også et prøvesett for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV i den ovenfor beskrevne immunokjemiske kompetitive metode.
Til slutt angår oppfinnelsen anvendelsen av et slikt prøvesett ved en metode som beskrevet for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV.
Metoden er egnet til høysensitiv og spesifikk påvisning og bestemmelse av HIV-spesifikke antistoffer av IgG- og IgM-klassen hos mennesker.
Som frembringer av den for kort tid siden erkjente infektiøse sykdom AIDS (ervervet immunodefekt-syndrom), som har en høy dødlighetsgrad, anses et virus (Retrovirus) henholdsvis en snevert beslektet gruppe av viruser, som i den nyere tid betegnet som Human Immune Deficiency Virus (HIV), men også T-Lymphotropic Virus Type III (HTLV III) eller Lymphadeno-pathy Associated Virus (LAV).
Viruset kan overføres ved hjelp av humanblod og kontaminert blodpreparater og kunne isoleres fra væsker, sædvæske, tårevæske og spytt.
Den serologiske bestemmelse av HIV-spesifikke antistoffer foretas for å klargjøre om et individ hadde kontakt med viruset og er å anse som potensiell bærer av det infektiøse stoff. En vesentlig betydning av antistoff-bestemmelsen består ved siden av anvendelsen som diagnose-instrumentarium for AIDS (sammen med andre undersøkelser og anamnese) i nedsettelsen av risikoen for en overføring av sykdomsfrem-bringeren via transfusjon, organtransplantasjon, blodpreparater eller sperma, ved utelukkelse av avgivere av antistoff-positive personer. Dessuten er HIV-antistoff-bestemmelsen av viktighet hos de som tilhører såkalte risikogrupper (homosek-suelle, narkomane, hemofile, barninfiserte mødre) likeledes som ved epidemiologiske undersøkelser.
Påvisning av anti-HIV under anvendelse av Western Blot-teknikk slik den eksempelvis er omtalt i US-PS 4 520 113, gjelder som den i dag mest følsomme påvisning av HIV-spesif ikke antistoffer. Derved spaltes anriket og inaktivert HIV-proteinmateriale ved hjelp av elektroforese efter molekylvektene og overføres derefter på nitrocellulosepapir, fortrinnsvis elektroforetisk. Med således immobilisert antigen kan det gjennomføres, som modifikasjon til US-PS 4 520 113, hvor det anvendes en RIA, uten tap av følsomhet, en indirekte ELISA i det ved anvendelse av tungtoppløselige farvestoffsystemer ved enzymreaksjonen, er det mulig å visualisere båndene der det har funnet sted en immunreaksjon. Man kan så, efter vurdering mot tilsvarende kontrollmate-riale, skille mellom farvede virus-spesifikke bånd og ikke-virusantigen-spesifikke samt kryss- eller ikke-spesifikt reagerende forurensninger, og derved fullføre en diskriminering mellom ekte- og falsk-positive reaksjoner.
Videre er det kjent en fremgangsmåte som er en kompetitiv ELISA og med hensyn til spesifisitet og følsomhet angivelig oppfyller kriteriene av Western Blot-teknikk ("Xrzte-Zeitung", Nr. 1, 25/26.10.1985, s. 20).
I denne fremgangsmåte benyttes ufortynnede prøver. Med den er det samtidig påvisbart HIV-spesifikke antistoffer av IgG-og IgM-klassen. Fremgangsmåten kan gjennomføres med et prøvesett fra firma Wellcome, betegnet som Wellcozyme Anti-HTLV III. For fastfasen anvendes mikrotestplater, hvortil rensede HIV-antistoffer er bundet og på disse immobiliseres immunokjemisk igjen HIV-antigener. Prøvene inkuberes i kavitetene (bølgene) sammen med pepperrotperoksydase-markert anti-HIV. Derved konkurrerer antistoffene mot HIV fra prøven med det markerte anti-HIV om bindestedene av HIV på fastfasen. Mengden i bølgene bundet markert antistoff er omvendt proporsjonal til anti-HIV-konsentrasjonen i prøven.
Meget ofte kunne, ved datidens anvendte prøver, humane leukocyttantigener klasse II (HLA II, særlig DR4 ) gjøres ansvarlig for falsk-positive resultater, idet de stammer fra de for HIV-dyrking vanligvis anvendte humane lymfocytt-cellelinjer og som spesielt kunne føre til falsk-positive resultater ved polytransfuderte pasienter (anti-HLA DR4).
Denne type av "uspesifikke" reaksjoner utelukkes ved den nevnte kompetitive prøvesett til påvisning av HIV-spesifikke antistoffer (Walgate R., Beardsley T. , (1986) "Nature" 320, 96) ved anvendelsen av den humane cellelinje CCRF-CEM til virusdyrkning, da disse celler ikke har HLA av klasse II.
Ble det ved den omtalte kompetitive ELISA anvendt HIV, som var dyrket i den for bedre utbytte kjente H9-cellelinje, så var å fastslå, at ekstremt store menger av virusutgangsmate-riale er nødvendig for på den ene side å rense fangerantistoffer for immobilisering på fastfasen og på den annen side å oppnå den for en maksimal sensitivitet nødvendige metning av de på kunststoffimmobiliserte fangerantistoffer med antigen, at videre den immunadsorptive rensning av humant serum kun forløper utilfredsstillende med henblikk på en forbedring av spesifisiteten når det anvendes på H9-dyrket og dermed med nukleære mitochondriale og leukocyttære antigener kontaminert HIV-antigenmateriale. Videre ble det bare oppnådd meget små utbytter av spesifikke humanantistoffer, hvilket umuliggjør anvendelsen som screeningstest av økonomiske grunner.
Det ble funnet, at den kompetitive metode til påvisning og til bestemmelse av antistoffer mot HIV, så vel av IgM-som IgG-klassen er mulig ved anvendelsen av fastfase, hvortil HIV-antigenene som også kan være forurenset med fra vertscel-lene stammende antigener, anvendes direkte, altså er bundet uten antistofformidlet binding, når det anvendes markerte antistoffer mot HIV, som hverken reagerer med vertscellenes antigener eller med andre antigener fra humanvev.
I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en immunkjemisk, kompetitiv metode for påvisning og bestemmelser av antistoffer mot HIV, omfattende følgende trinn: a) å binde hylse- og kjerneproteiner av HIV irreversibelt, direkte eller via en ikke-immunkjemisk spacer til en
fastfase,
b) inkubere de således immobiliserte HIV-proteiner med en probe av en biologisk væske og markerte antistoffer mot
HIV,
c) hvorved de markerte antistoffer og de ikke-markerte antistoffer fra proben konkurrerer om bindingssetene på
HIV-proteinene, og
d) derefter gjennomfører bestemmelsen av mengden av bundne markerte antistoffer eller den ikke-bundne andel av de
markerte antitstoffer,
og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at de markerte antistoffer ikke reagerer med antigener fra en HIV-fri vertscelle og et HIV-fritt medium og ikke med et HIV-fritt human-vev, og at de markerte antistoffer er en kombinasjon av minst to forskjellige antistoffer av hvilke en er rettet mot kjerneproteinet p24 og det andre mot hylseproteinet gp41 og/eller gpl20.
Som nevnt ovenfor angår oppfinnelsen også et prøvesett for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV i den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, inneholdende en bærer til hvilken hylse- og kjerneproteiner av HIV, oppnådd fra HIV-kulturer, bindes direkte eller via en ikke-immunkjemisk bindende spacer, markerte antistoffer mot hylse- og kjerneproteiner av HIV og eventuelt reagenser for påvisning av markeringen, og prøvesettet karakteriseres ved at de markerte antistoffer er en kombinasjon av minst to forskjellige antistoffer hvorved et antistoff er rettet mot kjerneproteinet p24 og det eller de andre antistoffer er rettet mot hylseproteinet gp41 og/eller gpl20, og at de markerte antistoffer ikke reagerer med antigener fra en HIV-fri vertscelle eller med et HIV-fritt medium og heller ikke med humanvev.
Til slutt angår oppfinnelsen som nevnt ovenfor anvendelsen av et slikt prøvesett i en fremgangsmåte for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV.
Det er fordelaktig at sensitiviteten for oppfinnelsens fremgangsmåte tilsvarer ømfintligheten for Western Blot-teknikk, da selv prober med lave HIV-antistofftitere fører til en signifikant inhibering av bindingen for de markerte antistoffer, noe som for eksempel ved anvendelse av en enzymmarkør tillater en visuell bedømmelse av farvestoff-utviklingen og en diskriminering av positive og negative prober med usedvanlig høy skilleskarphet, slik at også tidlige seroomdanninger, forårsaket av HIV-spesifikke IgM-antistoffer, sikkert kan erkjennes, slik at ingen inter-ferenser og derved falsk-positive resultater, forårsaket på grunn av humane leukocyttantigener (HLA), nukleære antigener eller mitochondriale antigener opptrer, at en prøving, uansett om et positivt resultat er spesifikt ved hjelp av vanlige kontrollantigener fra vertscellen er overflødig, og at, i sera, citrat-, heparin- og EDTA-plasma samt i rekalsi-fiserte plasma av human opprinnelse en sikker bestemmelse av HIV-spesifikke antistoffer er sikret og en inaktivering av probene ved 30 minutter og 55°C (HIV-inaktivering) og selv ved 10 timer og 60°C (hepatitt B-virus-inaktivering) ikke fører til falsk-positive resultater.
For fastfasen egnede antigenpreparater av HIV kan fremstilles, ved at det i første rekke oppnås HIV-positive permanente T-celler som omtalt i W085/04897 og et HIV-antigenpreparat som vist i US-PS 4 520 113. Derved propageres i første rekke HIV efter transmisjon på den humane T-cellelinje H9 ved kokultivering med lymfocytter av en AIDS-pasient og separeres derefter ved ultrasentrifugeringen fra vertscellekulturoverstående. Efter fjerning av celleskorper og fett, renses virusmaterialet over en sukrose-densitets-gradient-sentrifugering og inaktiveres derefter ved tilsetning av "Triton" og varmebehandling.
Som bærer for fastfasen egner seg kunststoffer som polystyren, polyvinylklorid, polyamid og andre syntetiske polymerer, naturlige polymerer som cellulose, samt derivati-serte naturlige polymerer som celluloseacetat og nitrocellu-lose, videre glass, spesielt glassfibere.
Bæreren kan ha form av kuler, staver, smårør og mikroprøve-plater. Flate strukturer som strimmelpapir, småplater og membraner er likeledes egnet. Bærerens overflate kan være både gjennomtrengelig og ugjennomtrengelig for vandige oppløsninger.
Foretrukne bærere er kuler, smårør, strimmelpapir og membraner. Spesielt foretrukne bærere er mikroprøveplater.
Fastfasen fremstilles idet et antigenpreparat av HIV bindes irreversibelt til bæreren.
En irreversibel binding innen oppfinnelsens ramme foreligger for eksempel ved 1) en adsorptiv binding som ikke spaltes ved immunokjemiske midler, som høyaffine antistoffer og heller ikke ved de i fremgangsmåten anvendte midler, som markerte antistoffer, fortynnings- og bufferoppløsninger, 2) en over en ikke immunokjemisk bindende spacerformidler, bioaffin binding, i det spaceren kan bestå av biotin og avidin eller av andre par av reseptorer og ligander,
3) en kovalent direkte binding
4) en kovalent, ved hjelp av en kjemisk bifunksjonell spacerformidlet binding.
Foretrukket er den kovalente bindingen i tilfelle anvendelse av vanngjennomtrengelige bærere, samt den adsorptive binding i tilfelle anvendelse av vanngjennomtrengelig som også vannugjennomtrengelige bærere.
Spesielt foretrukket er den direkte adsorptive binding av HIV-antigenpreparatene til med ^-stråler behandlet polystyren som bærer.
For markering av egnede antistoffer velges på grunn av resul-tatene av Western Blot-analyse av sera av AIDS-pasienter.
Til minimering av risikoen av en falsk-negativ diagnose må det, efter dagens kunnskap i en fremgangsmåte til erkjennelse av Pre-AIDS og AIDS, være gitt påvisningsmuligheten av minst to antistoffspesifisiteter, nemlig den for en kjerneprotein og et hylseprotein.
Egnede kombinasjoner og spesifisiteter er for eksempel slike som erkjenner 1. det som p24 betegnede kjerneprotein og det som gp41 betegnede hylseprotein eller
2. p24 og det som gp 120 betegnede hylseprotein.
Påvisning av ytterligere antistoffspesifisiteter, nemlig slike for de som pl8, p30, p55 betegnede kjerneproteiner og de som p53 og p65 betegnet ElV-polymeraser, betyr en ekstra avsikring av påvisning av anti-HIV-positive prøver.
For å utelukke en falsk positiv diagnose, bør de for markeringen foreskrevne antistoffer ikke ha spesifisiteter som erkjenner bestanddeler av humant vev, som for eksempel leukocyttantigener, nukleære og mitochondriale proteiner.
For markering kan det anvendes antistoffer av AIDS-pasienter, når de oppfyller de ved Western Blot-teknikken fastslåtte tidligere omtalte kriterier.
Videre kan det anvendes polyklonale antistoffer, utvunnet fra sera av med HIV immuniserte dyr, når disse efter absorpsjon av spesifisitetene erkjenner bestanddelen av vertscellen og kulturmediet, efter undersøkelse i Western Blot oppfyller de nevnte kriterier.
Monoklonale antistoffer er likeledes egnet. Det må da minst anvendes to i en av de nevnte kombinasjoner av spesifisiteter, altså for eksempel i kombinasjonen anti-p24 og anti-gp41.
Som markører kan det anvendes radioaktive isotomer, fluore-scerende kjemiluminescerende farvestoffer samt enzymer, hvis påvisning er mulig ved kromogene, luminogene eller fluorogene substratsystemer.
Markeringen foregår ved fremgangsmåter som er omtalt som teknikkens stand for de nevnte markører.
I tilfelle markering av antistoffer med peroksydase kan man anvende periodat-teknikken ifølge Nakane et al., 1974, "J. Histochem. Cytochem." 22, 1084-1090, eller en fremgangsmåte ifølge Ishikawa et al., 1983, "J. Immunoassay" 4, 209-327, hvori partnerne sammenknyttes med et heterobifunksjonelt reagens.
Oppfinnelsens fremgangsmåte kan for eksempel gjennomføres ved at man til kavitetene eller bølgene på en mikroprøveplate, som bundet inneholder et ovenfor beskrevet HIV-antigenpreparat,
a) samtidig setter prøven og en oppløsning av det markerte antistoff, eventuelt først prøven og efter en viss tid en
oppløsning av det markerte antistoff, efter en bestemt inkubasjonstid fjerner oppløsningen og vasker bølgene med en buffer og derefter måler markeringen i bølgene, eller
b) først setter en oppløsning inneholdende det markerte antistoff, efter en viss inkubasjonstid fjerner oppløsningen
og vasker bølgene med en buffer, eventuelt tørker mikroprøveplatene, derefter tilsetter den fortynnede prøve og inkuberer det hele i et bestemt tidsrom, derefter fjerner prøven fra bølgene og måler markeringen i prøvene.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også gjennomføres ved anvendelse av et diagnostisk element som inneholder fastfasen og i tørrform en del eller også alle nødvendige reagenser.
Følgende eksempel angir en utførelsesform av oppfinnelsen.
EKSEMPEL
1. Binding av HIV-antigen til mikroprøveplater.
Et ifølge US-PS 4 520 113 fremstilt, over sukrose-densitetsgradient-sentrifugering rensede og varmeaktiverte antigenpreparater av HIV ble forfortynnet med 100 mmol/1 natriumbikarbonat, pH 9,6 på 50 jjg/ml protein. Av denne fortynning ble det anlagt en to gangers fortynningsrekke i den samme buffer med 10 fortynninger, altså dannet en rekke med konsentrasjonene 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56, 0,78, 0,39, 0,2 og 0,1 Mg/ml. 100 jjl av en hver fortynning ble fylt i 16 bølger av mikroprøveplater, type B fra firma Nunc, Roskilde, Danmark. De med fortynningene fylte prøveplater ble hensatt i 18 timer ved 20° C, da ble oppløsningene i bølgene frasuget og bølgene vasket 3-4 ganger med 200 pl av en oppløsning av 10 g/l storfeserumalbumin i fosfatbufret fysiologisk koksaltoppløsning, pH 7,4 (PBS) ved fylling og avsugning og prøveplatene derefter tørket over kieselgel ved 20°C.
2. Fremstilling av et peroksydase-markert antistoff mot HIV
Et ifølge Western Blot-teknikk valgt serum av en AIDS-pasient som inneholdt antistoffspesifisiteter, for Core-proteiner pl8, p24, p30 og p55 og hylseproteinene gp41 og gpl20 samt for HIV-polymerasene p53 og p65, ble fraksjon-ert ved kromatografi på DEAE-cellulose. Dertil ble serumet dialysert mot buffer av 30 mmol/1 Na2HPC>4/NaH2P04» pH 7,5 og hatt på en søyle fylt med DEAE cellulose DE 32 (Whatman) og ekvilibrert med samme buffer. Den gjennom-løpte dannede IgG-fraksjon ble dialysert mot PBS og innstilt på 4 mg/ml protein.
En ytterligere undersøkelse i Western blot-teknikken viste at alle ovenfor anførte antistoff-spesifisiteter ble gjenfunnet i IgG-fraksjonen.
IgG-fraksjonen ble derefter omsatt med N-^-maleimido-butylyloksysuksinimid (GMBS), oppnådd fra firma Behring Diagnostics, som omtalt av Tanamori et al., 1983 i "J. Immunol. Meth." 62, 123-131. 2-iminotioanhydroklorid (firma Sigma, kat. nr. I 6256) ble omsatt med pepperrotperoksydase (POD), oppnådd av firma Boehringer Mannheim, kat. nr. 413470, som omtalt av King et al. 1978 i "Biochem." 17, 1499-1506. Av GMBS-IgG-konjugatet og iminotiolan-POD-konjugatet ble det fremstilt et IgG-POD-konjugat som omtalt av Tanamori.
Den dannede oppløsning av IgG-POD-konjugatet hadde et proteininnhold på 440 pg/ml. Forholdet mellom POD og IgG ble bestemt med 2,5. Oppløsningen ble derefter fortynnet på 500 ng/ml IgG-POD med en oppløsning av 50 ml/l fetalt kalveserum, 5 g/l polyoksyetylen-(20)-sorbitan-monolaurat ("Tween" 20) i PBS og fikk betegnelsen anti-HIV-POD.
3. Fremstilling av en TMB-substrattilberedning.
Til påvisning av anti-HIV-POD ble det anvendt et substrat-system eller en substratblanding inneholdende hydrogenper-oksyd og tetrametylbenzidin (TMB), som ble fremstilt av to stamoppløsninger.
Stamoppløsning 1: TMB-dihydroklorid ble under omrøring oppløst i en konsentrasjon på 5 g/l, det vil si på 16 mmol/1 i to ganger destillert vann og med 5N saltsyre innstilt på pH 1,5. Til denne oppløsning ble det satt penicillin G under omrøring til en sluttkonsentrasjon på 200 mg/l, det vil si på 0,56 mmol/1.
Stamoppløsning 2: til 900 ml to ganger destillert vann ble det satt 1,4 ml iseddik, 1,5 ml IN NaOH og 250 mg, det vil si 3 mmol H2O2 som urinstoff-hydrogenperoksydaddukt. Efter fullstendig oppløsning ble det oppfylt med to ganger destillert vann til 1 1.
TMB-substrattilberedning: en volumdel av stamoppløsning 1 og 10 volumdeler av stamoppløsning 2 ble blandet med hverandre.
4. Optimering av fremgangsmåten
16 sera som ifølge Western Blot-teknikken var blitt
bekreftet som HIV-negative, ble fortynnet med anti-HIV-POD 1:5 (1 volumdel serum pluss 4 volumdeler anti-HIV-POD).
Fra alle bølger av de med HIV-antigenpreparater behandlede mikroprøveplatene ble det tatt 125 pl av fortynningen og inkubert i 1 time ved 27°C. Fortynningen ble frasuget og bølgene vasket 4 ganger med en oppløsning av 1 g/l "Tween" 20 i PBS med fylling og frasuging. Derefter ble det til hver bølge satt 100 pl TMB-substrattilberedning og inkubert i 30 minutter ved 20-22°C. Inkubasjonen ble avsluttet ved tilsetning av 100 pl IN svovelsyre. Oppløsningens ekstinksjon ble målt mot PBS ved 450 nm.
Oppløsningen av bølgene, som var blitt belagt med 3,12 pg/ml HIV-antigen viste en E450 mellom 1,68 og 1,74. Oppløsningene av de med 1,56 pg/ml HIV-antigen belagte bølger viste en E450 mellom 1,38 og 1,45.
Det ble derefter behandlet bølger av mikroprøveplater på den ovenfor omtalte måte med et HIV-antigenpreparat av utelukkende 2,5 pg/ml. Vurderingen av de 16 sera i den med 2,5 pg/ml HIV-antigenpreparatbehandlede bølge ga ved samme forsøksforløp en midlere E45Q på 1,56 ± 0,05.
Da ved bestemmelsen av anti-HIV en grenseverdifastlegning på E større enn 0,8 for anti-HIV-negative og på E mindre enn 0,8 for anti-HIV-positive prøver anses som gunstig (grenseverdien er definert som halvparten av den midlere ekstinksjon av som negativt bekreftede prøver), ble for fremstilling av mikroprøveplater til bestemmelse av anti-HIV (anti-HIV-prøveplate) ved behandling av bølgene som også betegnes som belegg, valgt konsentrasjonen på 2,5 pg/ml HIV-antigenpreparat.
Det ble også ved alle nedenfor omtalte bestemmelser av anti-HIV benyttet de i ovenfor omtalte forforsøk anvendte reagenser, nemlig anti-HIV-POD TMB-substratttiberedningen og den i den videre som vaskebuffer betegnede oppløsning på 1 g/l "Tween" 20 i PBS.
5. Bestemmelse av humane antistoffer mot HIV
a) 25 pl serum eller plasma og 100 pl anti-HIV-POD ble fylt i bølger av anti-HIV-prøveplater og inkubert i 1
time ved 37°C. Innholdet av bølgene ble fjernet ved frasugning og bølgene vasket 4 ganger med vaskebuffer. Det ble til hver bølge satt 100 pl TMB-substrattilberedning, inkubert i 30 minutter ved 20-22°C og inkubasjonen ble avsluttet ved tilsetning av 100 pl IN svovelsyre. E450 av den farvede oppløsning ble målt mot en blindverdi av PBS.
Som anti-HIV-positiv ble slike prøver innordnet som frembragte en E450 på mindre enn 0,30, som anti-HIV-grenseverdiprøver, hvis E45Q lå i området på 0,31 til 0,80 og som anti-HIV-negative prøver som frembragte en E450 over 0,81.
Av 420 prøver, som i Western Blot-teknikk var positiv anti-HIV, ble 419 prøver likeledes funnet som positive.
Av 1 896 plasma- eller serumprøver fra sunne personer eller fra prøveobjekter som tilkjennega andre patolo-tiske tilstander, oppnådde man de i tabell 1 angitte resultater.
De 5 prøver fra risikogruppen, som reagerte initialt positivt eller grenseverdi, ble i tillegg undersøkt med Western Blot-teknikken. Herav var også bare de to prøver positive, som efter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen var blitt funnet som gjentatt positiv. Funnene viser således en god overensstemmelse mellom fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og Western Blot-teknikken.
b) Prøver av 50 pl fullblod ble fortynnet med 50 pl destillert vann inneholdende 20 g/l "Triton" x 100 og
0,2 mol/l trinatriumcitrat og 50 pl av dette lysat ble satt til bølger på anti-EIV-prøveplater. Efter en inkubasjon i 1 time ved 37° C foregikk tilsetningen av 100 ml anti-HIV-POD med efterfølgende inkubasjon og igjen 1 time ved 37°C. Bølgenes innhold ble fjernet ved frasugning, og bølgene vasket 5 ganger med vaskebuffer. Det ble til hver bølge satt 100 pl TMB-substrattilberedning inkubert i 30 minutter ved 20-25°C og reaksjonen avsluttet ved tilsetning av 100 pl IN svovelsyre. Oppløsningenes ekstinksjon ble målt ved 450 nm mot en blindverdi av PBS (E450).
Prøvenes vurdering foregikk som omtalt under punkt 5
a). Av 51 henholdsvis 5 blodprøver, som som serum i Western Blot-teknikken var positive eller svakt
positive, ble alle prøvene likeledes funnet positive.
Av 226 blodprøver, som som serum reagerte anti-HIV-negativt, ble alle prøvene likeledes funnet som negative. Derved tydeliggjøres, at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen stemmer godt overens med den som referansemetode gjeldende Western Blot-teknikk.
c) Prøver av 50 pl serum eller plasma eller av 50 pl lysat av fullblod fremstilt som omtalt i punkt 5 b)
ble med 100 pl av en oppløsning av 5 pg/ml IgG-POD fremstilt ved fortynning av det i eksempel 2 omtalte IgG-POD-konjugat av 440 pg/ml til 5 pg/ml med den allerede omtalte oppløsning inneholdende fetalt kalveserum og "Tween" 20 i PBS, fylt i bølgene av mikroprøveplater og inkubert i 10 minutter ved 45°C.
Derefter ble bølgene vasket 5 ganger med vaskebuffer. Derefter ble det til hver bølge satt 100 pl TMB-substrattilberedning og inkubert i 5 minutter ved 20-22°C. Inkubasjonen ble avsluttet ved tilsetning av IN svovelsyre. Vurderingen foregikk som omtalt under punkt 5 a).
Av 51 henholdsvis 5 prøver, som som serum i Western Blot-teknikken var positive henholdsvis svakt positive, ble alle prøver likeledes funnet positive.
Av 225 prøver som reagerte anti-EIV-negativt, ble alle prøvene likeledes funnet negative.
Dermed blir det tydelig at varianten ifølge oppfinnelsen av en hurtig fremgangsmåte med hensyn til sensitivitet og spesifisitet stemmer godt overens med den som referansemetode gjeldende Western Blot-teknikk. d) I bølgene av anti-HIV-prøveplater ble det fylt 100 pl anti-HIV-POD og inkubert i 1 time ved 37°C, anti-HIV-POD frasuges og bølgene vaskes 4 ganger med vaskebuffer. De således behandlede anti-HIV-prøveplater ble tørket over kieselgel ved 20-22°C.
Derefter ble det til bølgene satt 25 pl prøve og 100 pl av en oppløsning av 10 g/l storfeserumalbumin i 50 mmol/1 Tris, innstilt med HC1 på pH 7,4. Efter inkubasjon ved 37°C i 1 time, ble bølgenes innhold tatt ut og i bølgene satt en ikke belagt prøveplate, der blandet med 100 pl TMB-substrattilberedning, blandingen hensatt i 30 minutter ved 20-22°C og blandet med 100 pl IN svovelsyre. E450 ble derefter målt mot PBS.
Middelverdien E450 av tre gangers bestemmelse pr. prøve er angitt i tabell 2 for prøver, som efter den under punkt a) omtalte fremgangsmåte og er registrert som anti-HIV-negativ, som anti-HIV-grenseverdi og som anti-HIV-positiv.
Tabell 2 viser, at til forskjell fra utførelsesformene a) til c) er ekstinksjonen ved anti-HIV-negative prøver lav og ved anti-HIV-positive prøver høy. Grenseverdien for anti-HIV-negative prøver ved E450 er også her 0,30.
Claims (9)
1.
Immunkjemisk, kompetitiv metode for påvisning og bestemmelser av antistoffer mot HIV, omfattende følgende trinn: a) å binde hylse- og kjerneproteiner av HIV irreversibelt, direkte eller via en ikke-immunkjemisk spacer til en fastfase, b) inkubere de således immobiliserte HIV-proteiner med en probe av en biologisk væske og markerte antistoffer mot HIV, c) hvorved de markerte antistoffer og de ikke-markerte antistoffer fra proben konkurrerer om bindingssetene på HIV-proteinene, og d) derefter gjennomfører bestemmelsen av mengden av bundne markerte antistoffer eller den ikke-bundne andel av de markerte antitstoffer,
karakterisert ved at
de markerte antistoffer ikke reagerer med antigener fra en HIV-fri vertscelle og et HIV-fritt medium og ikke med et HIV-fritt human-vev, og at de markerte antistoffer er en kombinasjon av minst to forskjellige antistoffer av hvilke en er rettet mot kjerneproteinet p24 og det andre mot hylseproteinet gp41 og/eller gpl20.
2.
Immunkjemisk metode ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet som skal bestemmes og det markerte antistoff samtidig settes til fastfasen.
3.
Immunokjemisk metode ifølge krav 1, karakterisert ved at det markerte antistoff først settes til de til fastfasen bundne proteiner og at proben med antistoffene som skal påvises settes til fastfasen efter en inkubasjonstid og eventuelt efter fjerning av væskefasen og vasking av fastfasen.
4.
Immunokjemisk metode ifølge krav 1, karakterisert ved at man først inkuberer fastfasen med proben som inneholder antistoffet som skal bestemmes og så, eventuelt efter fjerning av væskefasen og vasking av fastfasen, tilsetter det markerte antistoff.
5.
Prøvesett for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV i en immunkjemisk, kompetitiv fremgangsmåte ifølge krav 1, inneholdene en bærer til hvilken hylse- og kjerneproteiner av HIV, oppnådd fra HIV-kulturer, bindes direkte eller via en ikke-immunkjemisk bindende spacer, markerte antistoffer mot hylse- og kjerneproteiner av HIV og eventuelt reagenser for påvisning av markeringen, karakterisert ved at de markerte antistoffer er en kombinasjon av minst to forskjellige antistoffer hvorved et antistoff er rettet mot kjerneproteinet p24 og det eller de andre antistoffer er rettet mot hylseproteinet gp41 og/eller gpl20, og at de markerte antistoffer ikke reagerer med antigener fra en HIV-fri vertscelle eller med et HIV-fritt medium og heller ikke med humanvev.
6.
Prøvesett ifølge krav 5, karakterisert ved at det markerte antistoff foreligger som en fra fastfasen adskilt bestanddel.
7.
Prøvesett ifølge krav 5 eller 6, karakterisert ved at det markerte antistoff foreligger som en til fastfasen immunkjemisk bundet bestanddel.
8.
Prøvesett ifølge minst et av kravene 5 til 7, karakterisert ved at det består av et element som helt eller delvis inneholder fastfase og I tørr form de for påvisning og bestemmelse nødvendige reagenser.
9.
Anvendelse av et prøvesett ifølge minst ett av kravene 5 til 8 i en fremgangsmåte for påvisning og bestemmelse av antistoffer mot HIV.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19863636540 DE3636540A1 (de) | 1986-10-27 | 1986-10-27 | Verfahren zur bestimmung von anti-hiv, mittel dazu und ihre verwendung in diesem verfahren |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO874453D0 NO874453D0 (no) | 1987-10-26 |
NO874453L NO874453L (no) | 1988-04-28 |
NO171754B true NO171754B (no) | 1993-01-18 |
NO171754C NO171754C (no) | 1993-04-28 |
Family
ID=6312576
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO874453A NO171754C (no) | 1986-10-27 | 1987-10-26 | Immunokjemisk kompetitiv metode for bestemmelse av antistoffer mot hiv, et proevesett for gjennomfoering av fremgangsmaaten samt anvendelse av proevesettet |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0265851B1 (no) |
JP (1) | JPS63128260A (no) |
AT (1) | ATE101725T1 (no) |
AU (1) | AU611102B2 (no) |
CA (1) | CA1305411C (no) |
DE (2) | DE3636540A1 (no) |
DK (1) | DK559187A (no) |
ES (1) | ES2061468T3 (no) |
FI (1) | FI90801C (no) |
MX (1) | MX168853B (no) |
NO (1) | NO171754C (no) |
NZ (1) | NZ222282A (no) |
PT (1) | PT85992B (no) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5173400A (en) * | 1983-09-15 | 1992-12-22 | Institut Pasteur | Antibody detection of antibodies to viral proteins in serum |
US5217861A (en) * | 1983-09-15 | 1993-06-08 | Institut Pasteur | Antigen of a human retrovirus, namely p18 protein of human immunodeficiency virus (HIV), compositions containing the antigen, a diagnostic method for detecting acquired immune deficiency syndrome (AIDS) and pre-AIDS and a kit therefor |
US5374519A (en) * | 1983-12-05 | 1994-12-20 | Institut Pasteur | Oligopeptides comprising p18 protein of human immunodeficiency virus (HIV), compositions comprising peptides of p18 protein of HIV, and diagnostic kits and methods for detecting acquired immune deficiency syndrome (AIDS) |
EP0356007A3 (en) * | 1988-07-22 | 1991-07-03 | Medical Research Council | Antigenic determinants |
DE69028561T2 (de) * | 1989-03-09 | 1997-04-17 | Abbott Lab | Immunoassay zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV |
DE3911361A1 (de) * | 1989-04-07 | 1990-10-11 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von antikoerpern gegen erreger von infektionskrankheiten in koerperfluessigkeiten, mittel dazu und ihre verwendung in diesem verfahren |
JPH0471378U (no) * | 1990-11-02 | 1992-06-24 | ||
CA2059317A1 (en) * | 1991-01-15 | 1992-07-16 | Yi Zeng | Immuno-enzymatic test for detection of hiv-1 antibody |
WO1992018865A1 (en) * | 1991-04-11 | 1992-10-29 | Cedars-Sinai Medical Center | Immunoassay for the detection of hiv specific igm |
ES2187947T5 (es) | 1997-03-10 | 2014-01-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Procedimiento para la detección simultánea de antígenos de HIV y anticuerpos de HIV |
DE19952982B4 (de) * | 1999-11-03 | 2004-01-29 | Acgt Progenomics Ag | Verfahren zur gerichteten Verpackung von molekularen Substanzen in Proteinhüllen |
US6818392B2 (en) | 2000-12-06 | 2004-11-16 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus and uses thereof |
JP4895727B2 (ja) * | 2006-08-28 | 2012-03-14 | シスメックス株式会社 | 抗hiv抗体検出試薬、試薬キット、試薬の製造方法、及び抗hiv抗体の検出方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0136798A3 (en) * | 1983-08-25 | 1986-02-19 | Biotech Research Laboratories Inc. | Titre plate and assay kit for detection of antibodies in human serum and their production and use |
NZ211860A (en) * | 1984-04-23 | 1990-10-26 | Us Health | Method for detection of hiv; test kit |
GB8501473D0 (en) * | 1985-01-21 | 1985-02-20 | Pasteur Institut | Cloned dna sequences |
CA1341482C (en) * | 1984-10-31 | 2005-05-10 | Paul A. Luciw | Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses |
AU579715B2 (en) * | 1985-02-26 | 1988-12-08 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Detection of human t-cell leukemia virus type iii |
AU580425B2 (en) * | 1985-05-24 | 1989-01-12 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Competitive elisa for the detection of antibodies |
DE3674555D1 (de) * | 1985-12-20 | 1990-10-31 | Abbott Lab | Immuntest fuer antikoerper gegen htlv-iii. |
-
1986
- 1986-10-27 DE DE19863636540 patent/DE3636540A1/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-10-23 ES ES87115527T patent/ES2061468T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-23 EP EP87115527A patent/EP0265851B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-23 NZ NZ222282A patent/NZ222282A/xx unknown
- 1987-10-23 AT AT87115527T patent/ATE101725T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-10-23 FI FI874676A patent/FI90801C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-10-23 DE DE87115527T patent/DE3789087D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-10-26 CA CA000550259A patent/CA1305411C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-26 MX MX008976A patent/MX168853B/es unknown
- 1987-10-26 DK DK559187A patent/DK559187A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-10-26 PT PT85992A patent/PT85992B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-10-26 NO NO874453A patent/NO171754C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-10-26 JP JP62268375A patent/JPS63128260A/ja active Pending
- 1987-10-26 AU AU80126/87A patent/AU611102B2/en not_active Ceased
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2061468T3 (es) | 1994-12-16 |
FI90801B (fi) | 1993-12-15 |
PT85992B (pt) | 1990-08-31 |
MX168853B (es) | 1993-06-11 |
DK559187A (da) | 1988-04-28 |
NO171754C (no) | 1993-04-28 |
DE3636540A1 (de) | 1988-04-28 |
AU611102B2 (en) | 1991-06-06 |
EP0265851A2 (de) | 1988-05-04 |
CA1305411C (en) | 1992-07-21 |
PT85992A (de) | 1987-11-01 |
FI874676A0 (fi) | 1987-10-23 |
EP0265851A3 (en) | 1989-11-29 |
ATE101725T1 (de) | 1994-03-15 |
JPS63128260A (ja) | 1988-05-31 |
EP0265851B1 (de) | 1994-02-16 |
NZ222282A (en) | 1990-09-26 |
DE3789087D1 (de) | 1994-03-24 |
NO874453L (no) | 1988-04-28 |
NO874453D0 (no) | 1987-10-26 |
DK559187D0 (da) | 1987-10-26 |
FI90801C (fi) | 1994-03-25 |
FI874676A (fi) | 1988-04-28 |
AU8012687A (en) | 1988-04-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5077198A (en) | Diagnostic kit and method for rapid detection of antibodies | |
CA1268419A (en) | Immunoassay for htlv-iii antigens | |
JP2626721B2 (ja) | Htlv―3の蛋白質の分離、エイズおよび前エイズ条件を持つ患者の血清中htlv―3に対する抗体の血清学的検出、およびhtlv―3およびその蛋白質を使用した免疫分析によるhtlv―3感染の検出 | |
US5705331A (en) | HIV nucleocapsid protein capture assay and method of use | |
EP0067182B1 (en) | Method and test kit for detecting antigens and antibodies | |
EP0330694A4 (en) | Test device and method of preparing same, assay kit and method for the simultaneous detection of two htlv or hiv antibodies | |
NO171754B (no) | Immunokjemisk kompetitiv metode for bestemmelse av antistoffer mot hiv, et proevesett for gjennomfoering av fremgangsmaaten samt anvendelse av proevesettet | |
DK174032B1 (da) | Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler | |
WO1998023771A9 (en) | A new eia test using non-dentured hiv antigen for early detection of hiv infection | |
JPH0731198B2 (ja) | 試験キットおよび免疫リガンドの測定方法 | |
US20090104650A1 (en) | Infectious diseases testing of menstrual fluid, endometrial/menstrual cells, amniotic fluid, umbilical cord blood or other samples | |
JPH11148936A (ja) | イムノアッセイ及びそれを行うキット | |
US5122446A (en) | Method for detecting antibodies to human immunodeficiency virus | |
WO1991013360A1 (en) | NEW HIV p24 PEPTIDES, DIAGNOSTIC ANTIGENS AND DISCRIMINATIVE IMMUNOASSAY METHOD | |
CA1340405C (en) | Method for detecting antibodies to human immunodeficiency virus | |
US5268299A (en) | Diluent composition useful in the detection of antibodies in assays | |
WO2009035706A1 (en) | Infectious disease testing of menstrual fluid, endometrial /menstrual cells, amniotic fluid, umbilical cord blood or other samples | |
AU645970B2 (en) | A method for the determination of antibodies against organisms causing infectious diseases in body fluids, agents for this purpose and the use thereof in this method | |
EP0495465A2 (en) | Immuno-enzymatic test for the detection of viral antibody | |
EP0302154A1 (en) | Detection of HIV and anti-lymphocyte antibodies | |
WO1998027231A1 (en) | Method and composition for the diagnosis of equine infectious anemia virus disease by using the recombinant capsid protein virus (p26) | |
Nielsen et al. | Antigen-antibody reaction in solution in capture competition immunoassay for human immunodeficiency virus antibodies | |
NO885617L (no) | Fremgangsmaate ved paavisning av menneskelig immunsviktvirus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN APRIL 2002 |