-
Hintergrund
der Erfindung
-
Diese
Erfindung betrifft im allgemeinen Hapten-Peptid-Konjugate, und ausdrücklicher betrifft sie einen verbesserten
Immunoassay zum Nachweisen von HIV-1- und HIV-2 unter Verwendung
von Hapten-Peptid-Konjugaten.
-
Haptene
werden in verschiedenen Immunoassays verwendet, um das Signal, das
durch eine signalerzeugende Verbindung erzeugt wird, die verwendet
wird, um einen Analyten in einer Testprobe nachzuweisen, zu vergrößern oder
zu verstärken,
um somit die Sensitivität
des Assays zu erhöhen.
Der Ausdruck "Hapten" verweist auf ein
partielles Antigen oder Nicht-Protein-Bindungsglied, welches in der Lage ist,
an einen Antikörper
zu binden, aber welches nicht in der Lage ist, Antikörperbildung
auszulösen,
solange es nicht an ein Trägerprotein
gekoppelt ist. Beispiele für
Haptene umfassen Moleküle
wie Biotin oder Anti-Biotin
und Avidin oder Biotin, und dergleichen.
-
Biotinylierte
Peptide sind zum Beispiel hergestellt worden durch Biotinylierung
eines Antigens oder eines Peptids in Lösung mit einem ausgewählten molaren
Einsatz von Biotinylierungsreagenz und Entfernen von freiem Biotin
aus der Rohsonde durch Dialyse. Es gibt jedoch zahlreiche Probleme,
die mit diesem Verfahren der Biotinylierung verbunden sind. Die
biotinylierten Peptide, die durch dieses Verfahren produziert werden, sind
typischerweise eine Mischung von Peptiden, die mit verschiedenen
und einer unterschiedlichen Anzahl von Biotinkomponenten markiert
sind. Weiter ist es, da die Biotinylierung an dem Peptid zufällig erfolgt,
wahrscheinlich, dass einige Peptidmoleküle in der Lösung nicht an jeder Position
biotinyliert werden. Somit ist es wahrscheinlich, dass Peptide,
die mit dem Lösungsbiotinylierungsverfahren
hergestellt werden, in unterschiedlichen Präparaten widersprüchlich funktionieren.
Außerdem
führt,
wenn das biotinylierte Peptid ein Antigen ist, das in einem Immunoassay
verwendet werden soll, das Lösungsbiotinylierungsverfahren
normalerweise zu einer Biotinylierung von Aminosäureresten innerhalb des Antigenepitops,
was dann die Bindung zwischen dem Antigen und dem Antikörper stört. Zusätzlich gibt
es, da sich das Biotin zufällig
an dem Peptidmolekül
anlagert, keine Kontrolle darüber,
wo die Biotinylierung an dem Peptid vorkommt, und die Menge von
Biotin, die an den Peptiden bei der Herstellung von biotinylierten
Peptiden vorhanden ist, ist unbekannt und unkontrollierbar.
-
WO90/08957
offenbart ein Verfahren zum Nachweisen von Antikörpern in einer Körperflüssigkeit
für Screening-
und Diagnosezwecke mittels eines Antikörper-Bindungsproteins, das
kovalent an eine poröse
Matrix gebunden ist, die innerhalb einer transparenten Säule eingeschlossen
ist. Gemäß diesem
Dokument wird ein Testfluid, das Antikörper enthält, in Kontakt gebracht mit
der mit Protein gebundenen Matrix, wodurch das Protein jeden Antikörper immobilisiert,
der in dem Testfluid vorhanden ist. Ein interessierendes zufällig biotinyliertes
Antigen wird in Kontakt gebracht mit dem immobilisierten Antikörper und
bindet daran; Avidin, das kovalent an ein Enzym gebunden ist, wird
mit dem biotinylierten immobilisierten Komplex in Kontakt gebracht
und bindet daran, welcher dann mit einer Substratlösung in
Kontakt gebracht wird, damit ein nachweisbares Produkt erhalten
wird. Ähnlich
offenbaren Voller et al. einen Biotin-Avidin-Sandwich-Test, in welchem die Probe inkubiert
wird, ein Biotin-markierter
Antikörper
hinzugegeben wird und dann ein Avidin-markiertes Enzym hinzugegeben wird.
-
US 4.957.737 offenbart synthetische
Peptide, welche als Reagenzien in Immunoassays für den Nachweis von AIDS-Antikörpern verwendet
werden können.
In diesem Dokument ist die Peptidsequenz, die als Sonde verwendet
wird, an dem terminalen Cysteinrest radioaktiv markiert.
-
Campbell
et al. offenbaren die Verwendung von biotinylierten Wachstumshormon-Releasing-Faktor(GFR)-Analoga;
in ihrer Veröffentlichung
geben sie an, dass die GFR-Bioaktivität relativ intolerant gegenüber N-terminalen
Modifikationen ist, und folglich schließen sie, dass GFR eine Biotinylierung
an einer Stelle entfernt von dem bioaktiven Kern benötigt, um
seine Wachstumshormonausschüttungsaktivität zu erhalten.
-
Es
gibt deshalb einen Bedarf für
verbesserte Hapten-Peptid-Konjugate,
in welchen das Hapten, vorzugsweise Biotin, an einem bekannten und
vorherbestimmten spezifischen Ort oder mehreren Orten auf dem Peptidmolekül angelagert
ist.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung stellt verbesserte Immunoassays bereit zum
Nachweisen von Antikörpern gegen
HIV-1 und HIV-2, die in einer Testprobe vorhanden sein können. Immunoassays
für HIV-1
oder HIV-2, die wie hierin gelehrt verbessert sind, umfassen im
Allgemeinen In-Kontakt-bringen einer Testprobe mit einem Einfangreagenz
für einen
Antikörperanalyten,
worin das Einfangreagenz ein Bindungspaarglied umfasst, das für den interessierenden
Antikörperanalyten
spezifisch ist, das an eine feste Phase gebunden ist, um dadurch eine
erste Mischung zu bilden. Diese erste Mischung wird für eine Zeit
und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind, um Einfangreagenz/Analyt-Komplexe
zu bilden. Diese Komplexe werden dann in Kontakt gebracht mit einem
Hapten-Peptid-Konjugat, das ein Hapten umfasst, das an ein Peptid
angelagert ist, das für die
Analytkomponente des Komplexes spezifisch ist, um eine zweite Mischung
zu bilden. Diese zweite Mischung wird inkubiert, um Einfangreagenz/Analyt/Hapten-Peptid-Konjugat-Komplexe
zu bilden. Dann wird vorzugsweise ein Waschschritt an den Einfangreagenz/Analyt/Hapten-Peptid-Konjugat-Komplexen
durchgeführt, um
alles nicht komplexierte Hapten-Peptid-Konjugat von den Einfangreagenz/Analyt/Hapten-Peptid-Konjugat-Komplexen
abzutrennen. Als nächstes
wird ein Indikatorreagenz, das eine Komponente eines Bindungspaares
umfasst, das für
das Hapten spezifisch ist, welches markiert ist mit einer signalerzeugenden
Komponente, die in der Lage ist, ein messbares Signal zu erzeugen,
mit den Einfangreagenz/Analyt/Hapten-Peptid-Konjugat-Komplexen in Kontakt
gebracht, um eine dritte Mischung zu bilden. Diese dritte Mischung
wird für eine
Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind, um Einfangreagenz/Analyt/Hapten-Peptid-Konjugat/Indikatorreagenz-Komplexe zu bilden.
Die Gegenwart des Analyten, sofern vorhanden, wird bestimmt durch
Nachweisen des messbaren Signals, das durch die signalerzeugende
Verbindung erzeugt wird. Die Verbesserung für den Assay umfasst In-Kontakt-bringen
des Einfangreagenz/Analyt-Komplexes mit einem Hapten-Peptid-Konjugat, das eine
Aminoacylrestsequenz umfasst, die hierin als Sequenzidentifikationsnummer
1-5 bezeichnet wird, welche mit mindestens einem und vorzugsweise
zwei N-terminalen Haptenen an der/den a- und/oder e-Position(en)
markiert ist.
-
Außerdem wird
eine Zusammensetzung bereitgestellt, die nützlich ist zum Nachweisen von
Anti-HIV-1- oder Anti-HIV-2-Antikörpern, die
in einer Testprobe vorhanden sein können. Die Zusammensetzung umfasst
ein im Wesentlichen reines N-terminales hapteniertes Peptid, welches
gewählt
ist aus irgendeiner beliebigen der Sequenzen, die hierin als Sequenzidentifikationsnummer
1-5 bezeichnet werden. Zusätzlich
stellt die Erfindung einen Testkit bereit, der mindestens ein Hapten-Peptid-Konjugat-Reagenz
umfasst. Dieses Hapten-Peptid-Konjugat-Reagenz
umfasst im Allgemeinen ein im Wesentlichen reines N-terminales hapteniertes Peptid,
welches aus irgendeiner beliebigen der Sequenzen gewählt ist,
die hierin als Sequenzidentifikationsnummern 1-5 bezeichnet werden,
die in einem geeigneten Puffer gelöst oder sonstwie suspendiert
sind.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
1 ist
eine schematische Skizze eines Biotinylierungsprozesses.
-
2 zeigt
eine Auftragung von S/R-Verhältnissen über Peptidkonzentrationsdosiswirkungen
einer Cameroon-Probe auf biotinylierte HIV-1-gp41-Antigene.
-
3 zeigt
eine halblogarithmische Auftragung (plot) von Zählungen vs. Peptidkonzentrationsdosiswirkungen
von HIV-Proben zu
Sequenzidentifikationsnummer 6.
-
Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
-
Sofern
nichts anderes angegeben ist, haben die folgenden Ausdrücke die
folgenden Bedeutungen:
Der Ausdruck "synthetisches Peptid", wie er hierin verwendet wird, bedeutet
eine polymere Form von Aminosäuren
beliebiger Länge,
welche chemisch synthetisiert werden können durch Verfahren, die dem
routinierten Praktiker gut bekannt sind. Diese synthetischen Peptide
sind in verschiedenen Anwendungen nützlich.
-
Ein
synthetisches Peptid oder "Antigen" ist "immunologisch reaktiv" mit einem Antikörper, wenn
es an einen Antikörper
bindet aufgrund der Antikörpererkennung
eines spezifischen Epitops, das innerhalb des Peptids enthalten
ist. Immunologische Reaktivität
kann bestimmt werden durch Antikörperbindung,
ausdrücklicher durch
die Kinetik der Antikörperbindung,
und/oder durch Konkurrenz bei der Bindung unter Verwendung eines bekannten
Peptids/bekannter Peptide, die ein Epitop enthalten, gegen welches
der Antikörper
gerichtet ist, als Konkurrent(en). Die Verfahren zum Bestimmen,
ob ein Peptid immunologisch reaktiv ist mit einem Antikörper, sind
auf dem Gebiet bekannt.
-
Der
Ausdruck "Individuum", wie er hierin verwendet
wird, verweist auf Wirbeltiere, insbesondere Mitglieder der Säugetierspezies,
und umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Haustiere, Sporttiere,
Primaten und Menschen; ausdrücklicher
verweist der Ausdruck auf Primaten/Affen und Menschen.
-
Der
Ausdruck "Analyt-haltige
Körperkomponente" oder "Testprobe" verweist auf eine
Komponente eines Körpers
eines Individuums, welche die Quelle für den interessierenden Antikörperanalyten
ist. Diese Komponenten sind auf dem Gebiet gut bekannt. Diese Testproben
umfassen biologische Proben, welche getestet werden können durch
die Verfahren der vorliegenden Erfindung, die hierin beschrieben
werden, und umfassen humane und animalische Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Serum,
Plasma, Zerebrospinalflüssigkeit,
Harn, Lymphfluide, Aszites-Fluid und verschiedene externe Sekretionen
des Respirations-, Intestinal- und Urogenitaltraktes, Tränen, Speichel,
Milch, weiße
Blutkörperchen,
Myeloma und dergleichen; biologische Fluide wie Zellkulturüberstände; feste
Gewebeproben; und feste Zellproben oder irgendwelche anderen Körperbestandteile.
-
Die
verbesserten Hapten-Peptid-Konjugate, die hierin offenbart werden,
können
verwendet werden, um eindeutige und verbesserte Assays zu entwickeln,
wie hierin beschrieben, um die Gegenwart von Anti-HIV-1- oder Anti-HIV-2-Antikörper nachzuweisen
oder zu bestätigen.
Die Hapten-Peptid-Konjugate können außerdem verwendet
werden in Kombination mit anderen Haptenkonjugaten, die ein Hapten
umfassen und, zum Beispiel, natürliche
Virusantigene und/oder rekombinante Proteine.
-
"Analyt", wie hierin verwendet,
ist die Substanz, die nachzuweisen ist, welche in der Testprobe
vorhanden sein kann. Der Analyt kann jede beliebige Substanz sein,
für welche
es ein natürlich
vorkommendes spezifisches Bindungsglied gibt (zum Beispiel ein Antikörper), oder
für welche
ein spezifisches Bindungsglied hergestellt werden kann. Somit ist
ein Analyt eine Substanz, die an ein oder mehrere spezifische Bindungsglieder in
einem Assay binden kann. "Analyt" kann außerdem alle
antigenen Substanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen davon
einschließen.
Als ein Glied eines spezifischen Bindungspaares kann der Analyt
mittels natürlich
vorkommender spezifischer Bindungspartner (Paare) nachgewiesen werden
wie die Verwendung von Intrinsic factor-Protein als ein Glied eines
spezifischen Bindungspaares für
die Bestimmung von Vitamin B12, die Verwendung von Folatbindungsprotein,
um Folsäure
zu bestimmen, oder die Verwendung eines Lecithins als ein Glied
eines spezifischen Bindungspaares für die Bestimmung eines Kohlenhydrats.
Der Analyt kann außerdem
ein Protein, ein Peptid, eine Aminosäure, ein Nucleotidtarget und
dergleichen einschließen.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt Assays bereit, welche spezifische Bindungsglieder
nutzen. Ein "spezifisches
Bindungsglied",
wie hierin verwendet, ist ein Glied eines spezifischen Bindungspaares.
Das heißt, zwei
unterschiedliche Moleküle,
wo eines der Moleküle
durch chemische oder physikalische Mittel an das zweite Molekül spezifisch
bindet. Deshalb können
zusätzlich
zu Antigen- und Antikörperspezifischen
Bindungspaaren von gewöhnlichen
Immunoassays andere spezifische Bindungspaare Biotin und Avidin,
Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nucleotidsequenzen, Effektor-
und Rezeptormoleküle,
Cofaktoren und Enzyme, Enzymhemmer und Enzyme, und dergleichen einschließen. Außerdem können spezifische
Bindungspaare Glieder einschließen,
die Analoga der ursprünglichen
spezifischen Bindungsglieder sind, zum Beispiel ein Analyt-Analog.
Das spezifische Bindungspaarglied kann ein Protein, ein Peptid,
eine Aminosäure,
ein Nucleotidtarget und dergleichen einschließen. Außerdem können spezifische Bindungspaare
Glieder einschließen, die
Analoga der ursprünglichen
spezifischen Bindungsglieder sind, zum Beispiel ein Analyt-Analog.
Immunreaktive spezifische Bindungsglieder umfassen Antigene, Antigenfragmente,
Antikörper
und Antikörperfragmente,
sowohl monoklonale als auch polyklonale, und Komplexe davon, einschließlich solche,
die gebildet werden durch rekombinante DNA-Moleküle. Der Ausdruck "Hapten", wie er hierin verwendet
wird, verweist auf ein partielles Antigen oder Nicht-Protein-Bindungsglied,
welches in der Lage ist, an einen Antikörper zu binden, aber welches
nicht in der Lage ist, Antikörperbildung
auszulösen,
solange es nicht an ein Trägerprotein
gekoppelt ist.
-
Ein "Einfangreagenz", wie hierin verwendet,
verweist auf ein unmarkiertes spezifisches Bindungsglied, welches
entweder spezifisch ist für
den Analyten wie in einem Sandwich-Assay, für das Indikatorreagenz oder für den Analyten
wie in einem kompetitiven Assay, oder für ein spezifisches Hilfsbindungsglied,
welches selbst spezifisch ist für
den Analyten, wie in einem indirekten Assay. Das Einfangreagenz
kann direkt oder indirekt an ein Festphasenmaterial gebunden werden
vor der Durchführung
des Assays oder während
der Durchführung des
Assays, wodurch die Abtrennung immobilisierter Komplexe aus der
Testprobe ermöglicht
wird.
-
Die "feste Phase" ist nicht kritisch
und kann jede Art von Material sein, welches von einem Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren
ausgewählt
werden kann. Der Ausdruck "feste
Phase" wird in einem
breiten Sinn verwendet und verweist auf jedes Material, das unlöslich ist,
oder durch eine nachfolgende Reaktion unlöslich gemacht werden kann.
Somit sind poröse
und nicht poröse
Materialien, Latex- oder Polystyrolpartikel, magnetische oder nicht
magnetische Mikropartikel, Kügelchen,
Membranen, Kunststoffröhrchen,
Wände von
Mikrotitervertiefungen und gebräunte
rote Blutkörperchen
vom Schaf alles geeignete Beispiele. Die Größe, Abmessungen und Form der
festen Phase sind im Allgemeinen nicht kritisch bei der praktischen
Ausführung der
Verfahren, die hierin offenbart werden.
-
Geeignete
Verfahren zum Immobilisieren von Antigenen auf festen Phasen umfassen
ionische, hydrophobe, kovalente Wechselwirkungen und dergleichen;
eine Vielzahl von Methodologien kann bezüglich der Anwendung nützlicher
fester Phasen angewendet werden. Das Einfangreagenz kann entweder
passiv oder aktiv an der festen Phase gebunden werden. Passive Beschichtung,
wie hierin verwendet, bedeutet nicht kovalente Bindung oder nicht
kovalente Anlagerung zwischen dem Einfangreagenz und der festen
Phase. Aktive Beschichtung bedeutet Bewirken einer kovalenten Bindung
zwischen dem Einfangreagenz und dem festen Träger. Allgemein wird eine solche
kovalente Bindung gebildet entweder durch das Carboxyl- oder das
Amino-terminale Ende eines Antigens, oder durch eine freie Carboxy-
oder Aminogruppe innerhalb des Proteins, die an eine geeignete funktionelle
Gruppe auf der Oberfläche
der festen Phase binden. Solche festen Phasen mit solchen funktionellen
Gruppen werden als derivatisiert bezeichnet. Aktive Beschichtung
kann außerdem die
Verwendung von Linkerverbindungen umfassen, um die Bildung einer
kovalenten Bindung zwischen dem Antigen und dem festen Träger zu bewirken.
Das Bindungsmittel kann als Teil der festen Phase eingelagert werden
oder darauf derivatisiert werden, bevor das Einfangreagenz, normalerweise
ein Antigen, hinzugegeben wird. Die Verwendung von heterobifunktionellen
Verbindungen, wie Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat)
oder Sulfo-SIAB (Sulfosuccinimidyl-(4-iodacetyl)aminobenzoat), oder
homobifunktionellen Verbindungen, wie Sulfo-DST (Disulfosuccinimidyltartrat)
oder Sulfo-EGS (Ethylenglykolbis [sulfosuccinimidyl-succinat]),
ermöglicht
es, dass mehr spezifische/ortsgerichtete kovalente Bindung vorkommt.
Die Zugabe der Linkerverbindung kann außerdem einen Spacerarm einschließen, welcher es
ermöglichen
würde,
dass das Antigen freier mit Antikörpern reagiert, während es
an die feste Phase angelagert ist. Linkergruppenchemie ist dem Fachmann
gut bekannt.
-
Ein
geeignetes "Indikatorreagenz" umfasst eine signalerzeugende
Verbindung (Marker), welche in der Lage ist, ein messbares Signal
zu erzeugen, das durch ein externes Mittel, das an ein spezifisches
Bindungsglied konjugiert (angelagert) ist, nachweisbar ist. Die
verschiedenen "signalerzeugenden
Verbindungen" (Marker),
die betrachtet werden, umfassen Chromogene, Katalysatoren wie Enzyme,
lumineszente Verbindungen wie Fluorescein und Rhodamin, chemilumineszente
Verbindungen wie Luminol, Dioxetane, Acridiniumverbindungen und
Phenanthridiniumverbindungen, radioaktive Elemente und direkt sichtbare
Marker. Beispiele für Enzyme
umfassen alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, Beta-Galactosidase
und dergleichen. Die Auswahl eines einzelnen Markers ist nicht kritisch,
aber er wird in der Lage sein, ein Signal entweder selbst oder in
Zusammenhang mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen zu produzieren.
-
Ein
Analyt, welcher in einer Testprobe vorhanden sein kann, kann in
Assays nachweisbar sein durch die Verwendung eines Hapten-Peptid-Konjugats,
das hierin offenbart wird. Außerdem
können
als eines der Reagenzien des Assays unterschiedliche synthetische
Peptide, die in der Lage sind, unterschiedliche Epitope eines Analyten,
wie ein Virus oder Bakterien, zu identifizieren und spezifisch daran
zu binden, in Assayformaten verwendet werden. Haptenierte Peptide
der vorliegenden Erfindung können
für Bindungs-,
Verknüpfungs-
oder Signalamplifikationszwecke, die auf dem Gebiet gut bekannt
sind, verwendet werden.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Verbesserung für einen Assay, der ausgelegt
ist, die Gegenwart eines Anti-HIV-1-
oder Anti-HIV-2-Antikörperanalyten
nachzuweisen, bereitgestellt. Die Assays, welche danach wie hierin
gelehrt verbessert sind, werden typischerweise folgendermaßen ausgeführt. Eine
Testprobe wird mit einem Einfangreagenz des Analyten in Kontakt
gebracht, worin dieses Einfangreagenz ein Bindungspaarglied umfasst,
das für
den interessierenden Antikörperanalyten
spezifisch ist, das an die feste Phase gebunden ist, um dadurch
eine erste Mischung zu bilden. Da der Analyt ein Antikörper ist,
kann das Einfangreagenz ein rekombinantes Antigen, ein synthetisches
Peptid oder ein Lysatpräparat
sein, welches spezifisch an den Analyten bindet. Die erste Mischung
wird für
eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind,
um Einfangreagenz/Analyt-Komplexe
zu bilden. Diese so gebildeten Komplexe werden dann mit einem Hapten-Peptid-Konjugat
in Kontakt gebracht, um eine zweite Mischung zu bilden. Diese zweite
Mischung wird für
eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind,
um Einfangreagenz/Analyt/Hapten-Peptid-Konjugat-Komplexe zu bilden.
Dann wird vorzugsweise ein Waschschritt ausgeführt. Als nächstes wird ein Indikatorreagenz,
das ein Glied eines Bindungspaares umfasst, das spezifisch ist für das Hapten,
welches markiert ist mit einer signalerzeugenden Verbindung, die
in der Lage ist, ein messbares Signal zu erzeugen, mit den Einfangreagenz/Analyt/Hapten-Peptid-Konjugat-Komplexen
in Kontakt gebracht, um eine dritte Mischung zu bilden. Diese dritte
Mischung wird für
eine Zeit und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind,
um Einfangreagenz/Analyt/Hapten-Peptid-Konjugat/Indikatorreagenz-Komplexe zu bilden. Die
Gegenwart des Analyten, falls vorhanden, wird bestimmt durch Nachweisen
des Signals, das durch die signalerzeugende Verbindung erzeugt wird.
Es ist möglich,
die Menge von Analyt, die vorhanden ist, quantitativ zu bestimmen,
indem auch positive Kalibratoren, welche bekannte Konzentrationen
von Analyt enthalten, und negative Kalibratoren untersucht werden,
die Ergebnisse des gemessenen Signals, die mit diesen Kalibratoren erhalten
werden, über
den bekannten Konzentrationen aufgezeichnet werden, und die Ergebnisse
der Testproben aus den grafischen Darstellungen ausgelesen werden.
-
Die
Verbesserung, die hierin bereitgestellt wird, umfasst In-Kontakt-bringen
des Einfangreagenz/Analyt-Komplexes mit mindestens einem der Peptide,
die hierin als Sequenzidentifikationsnummer 1-5 bezeichnet werden,
welche an dem/den N-terminalen a- und/oder e-Position(en) hapteniert
worden sind. Vorzugsweise ist das Hapten Biotin. Außerdem wird
hierin eine Zusammensetzung bereitgestellt, die nützlich ist
zum Nachweisen von Anti-HIV-1- oder Anti-HIV-2-Antikörper. Die
Zusammensetzung umfasst im Allgemeinen eine im Wesentlichen reine
Lösung
von mindestens einem N-terminal haptenierten Peptid wie solche,
die hierin als Sequenzidentifikationsnummer 1-5 bezeichnet werden.
Wie hierin verwendet wird hierin unter einer "im Wesentlichen reinen Lösung" verstanden, dass
damit gemeint ist, dass die Konzentration von Peptiden in der Lösung, die
an nicht-N-terminalen Positionen hapteniert sind, den Antikörperanalyten
nicht in Mengen binden wird, die die Testergebnisse beeinträchtigen.
Diejenigen, die Fachleute sind, werden geeignete Puffer erkennen
zum Suspendieren oder Lösen
der Hapten-Peptid-Konjugate, die hierin bereitgestellt werden.
-
Eine
im Wesentlichen reine Lösung
von Hapten-Peptid-Konjugaten
kann als Teil eines Testkits mit einem oder mehreren Behältern wie
Glasfläschchen
oder Flaschen bereitgestellt werden. Jeder Behälter oder jedes Glasfläschchen
enthält
ein separates Reagenz wie ein Verdünnungsmittel, ein Indikatorreagenz,
das eine signalerzeugende Verbindung umfasst, Assayreagenzien, die
ein Hapten-Peptid-Konjugat umfassen, das hierin gelehrt wird, und
dergleichen. Das Hapten-Peptid-Konjugatreagenz
wäre eine
im Wesentlichen reine Form von Sequenzidentifikationsnummer 1-5,
markiert mit mindestens einem N-terminalen Hapten. Ein solches Testkit
würde außerdem Anweisungen
einschließen,
welche anzeigen, dass sein Inhalt verwendet werden kann, um die
Gegenwart des interessierenden Analyts zu bestimmen/bestätigen.
-
Die
Peptide, die wie hierin gelehrt hapteniert werden, sind abgeleitet
von der immundominanten Region (IDR) eines HIV-Antigens wie zum Beispiel HIV-1-gp41-IDR
und HIV-2-gp36-IDR. Diese HIV-Peptide schließen folgendes ein:
Sequenzidentifikationsnummer
1: Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr,
was ein 19-mer abgeleitet von
der immundominanten Region (IDR) von HIV-1 gp41 Subtyp B ist;
Sequenzidentifikationsnummer
2: Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Ala-Gln-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp, was
ein 25-mer abgeleitet von HIV-2 gp36 ist;
Sequenzidentifikationsnummer
3: Arg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr,
was ein 28-mer abgeleitet von HIV-1 gp41 ist; und
Sequenzidentifikationsnummer
4: Lys-Gln-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Ser-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
was ein 20-mer abgeleitet von dem IDR von HIV-1 gp41, Typ 0 ist;
Sequenzidentifikationsnummer
5: Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
was ein 19-mer mit
einer Disulfidbrücke
zwischen dem Cystein an Position 11 und dem Cystein an Position
17 ist. Das Peptid ist abgeleitet von dem IDR von HIV-1 gp41, Subtyp
B mit einem Ser-Lys-Austausch an Position 12 und Thr-Tyr-Austausch an
Position 18. Biotinylierte Formen dieser Peptide (Antigene) sind:
Sequenzidentifikationsnummer
6: Xaa-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr,
worin Xaa N-ε-(Biotinamidocaproyl)lysin
ist;
Sequenzidentifikationsnummer 7: Xaa-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr,
worin Xaa N-α-(Biotinamidocaproyl)lysin
ist;
Sequenzidentifikationsnummer 8: Xaa-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln- Ala-Gln-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp,
worin Xaa N-ε-(Biotinamidocaproyl)lysin
ist;
Sequenzidentifikationsnummer 9: Xaa-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Ala-Gln-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp,
worin Xaa N-α-(Biotinamidocaproyl)lysin
ist;
Sequenzidentifikationsnummer 10: Xaa-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr,
worin Xaa N-α-(Biotinamidocaproyl)
arginin ist; und
Sequenzidentifikationsnummer 11: Xaa-Gln-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Ser-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
worin Xaa N-α-(Biotinamidocaproyl)lysin
ist.
Sequenzidentifikationsnummer 12: Xaa-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
worin Xaa N-α-(Biotinamidocaproyl)lysin
ist.
Sequenzidentifikationsnummer 13: Xaa-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
worin Xaa N-ε-(Biotinamidocaproyl)lysin
ist.
Sequenzidentifikationsnummer 14: Xaa-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
worin Xaa N-ε-(Biotinamidocaproyl)-α-(biotinamidocaproyl)lysin
ist.
-
Peptidkonjugate,
die gemäß des verbesserten
Assays eingesetzt werden, können
synthetisiert werden unter Verwendung von Festphasenpeptidsynthese
(SPPS). Unter Verwendung dieses Verfahrens kann Biotin zum Beispiel
kontrollierbar und leicht an einem ausgewählten oder vordefinierten Ort
(Aminosäure)
innerhalb des Peptids eingelagert werden. SPPS kann Vorteil ziehen
aus chemischen Differenzen zwischen säurelabilen und basenlabilen
Schutzgruppen, um Haptene ortsspezifisch in Aminosäurereste
einzulagern. Der Biotinylierungsprozess, der hierin offenbart wird,
ist besonders nützlich
zum Markieren von Peptid- oder Porteinantigenen, welche spezifische
Bindungsdomänen
(Epitope) für
Antikörper
enthalten. Für
solche Peptide ist es wichtig, dass das Biotin an einer Stelle außerhalb
der Epitopregion eingelagert wird, so dass es die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung
nicht stören
wird.
-
Gemäß den Standard-SPPS-Verfahren
wird ein Peptid auf einem festen Träger wie einem Harz synthetisiert.
Geeignete Harze zum Unterstützen
der SPPS sind auf dem Gebiet gut bekannt und umfassen, sind aber
nicht beschränkt
auf, p-Alkoxylbenzylalkoholharz
und chlormethyliertes Polystyrolharz. Die Peptidsynthese beginnt
mit der Anlagerung einer gewünschten
Carboxyl-terminalen (C-terminalen) Aminosäure an das Harz. Das Peptid
wird synthetisiert durch die aufeinanderfolgende Zugabe von Aminosäureresten
zu dem C-terminalen Rest, der an das Harz angelagert ist. Hinzugesetzte
Aminosäuren
formen a-Peptid-Verknüpfungen
mit den Harz-unterstützten
Resten. Andere Mittel zum Hinzufügen
von zusätzlichen
Resten sind gut bekannt auf dem Gebiet und schließen das
Merrifield-tBoc-SPPS-Verfahren ein. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Peptid aufgebaut unter Verwendung von wiederholten Zyklen
von basenlabilen N-α-Fmoc-Aminosäureresten.
Somit haben der C-terminale Rest und alle hinzugefügten Reste,
aber ohne den N-terminalen Rest einzuschließen, eine basenlabile Schutzgruppe
an ihrer α-Aminogruppe.
-
Alle
reaktiven Gruppen von hinzugefügten
Resten werden durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt, um
unerwünschte
Konjugationen zwischen den hinzugefügten Resten und dem Rest, der
bereits in der Harz-gebundenen Kette vorhanden ist, zu verhindern.
Geeignete Schutzgruppen für
reaktive Gruppen von Aminosäuren,
einschließlich
basenlabile und säurelabile
Gruppen, sind auf dem Gebiet gut bekannt (siehe zum Beispiel Protective
Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, T. W. Greene und P. G.
M. Wuts, John Wiley & Sons,
Inc., 1991). Zum Beispiel können
der reaktive Schwefel (S) von Cystein, die b-Aminogruppe von Asparagin,
die g-Aminogruppe von Glutamin und der Imidazolstickstoff (N) von
Histidin geschützt
werden mit Triphenylmethyl, das auf dem Gebiet bekannt ist als Trityl
(Trt). Der reaktive Sauerstoff (O) von Serin oder Threonin, der
reaktive Sauerstoff von Tyrosin, die b-Carboxylgruppe von Aspartansäure und
die g-Carboxylgruppe von Glutaminsäure können geschützt werden mit t-Butylestern
(tBu).
-
Mittel
zum Auswählen
eines geeigneten Schutzmittels sind auf dem Gebiet bekannt und sind
abhängig von
dem Verfahren, das verwendet wird, um die Peptidkette aufzubauen,
und den Aminosäuren,
die das Peptid umfasst. Wo eine Peptidkette aufgebaut wird unter
Verwendung mehrfacher basenlabiler a-geschützter Aminosäurereste
sollten geeignete Schutzgruppen für andere Gruppen (Nicht-α-Aminogruppe)
stabil sein unter solchen basischen Bedingungen, die verwendet werden,
um Aminosäurereste
hinzuzufügen.
Das gilt besonders für
das Verfahren, das hierin offenbart wird, wo der Biotinylierungsprozess
einen Vorteil zieht aus den Differenzen in Stabilität und chemischer
Reaktivität
zwischen Schutzgruppen.
-
Zusätzliche
Aminosäurereste,
außer
der N-terminale Aminosäurerest,
werden zu dem Harz-gebundenen Peptid hinzugefügt in einer vorausgewählten Reihenfolge,
abhängig
von der gewünschten
Sequenz des Peptids, das zu biotinylieren ist, unter Verwendung
des obigen Verfahrens. Ein biotinylierbarer N-terminaler Aminosäurerest wird zu der Harz-gebundenen
Peptidkette hinzugefügt.
Wie hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "biotinylierbar", dass etwas biotinyliert werden kann.
Aminosäurereste,
die biotinyliert werden können,
sind auf dem Gebiet gut bekannt; ein bevorzugter Aminosäurerest
ist Lysin.
-
Die
N-terminale Aminosäure
wird typischerweise auf eine solche Art und Weise geschützt, dass
der gewünschte
Ort der Biotinylierung geschützt
wird mit einer basenlabilen Schutzgruppe, und alle anderen reaktiven
Gruppen an diesem Rest geschützt
werden mit einer säurelabilen
Schutzgruppe. Somit wird, wenn der N-terminale Rest zu der Harz-gebundenen
Peptidkette hinzugefügt
wird unter Verwendung des mehrfachen basenlabilen Kreislaufverfahrens,
die oben ausgeführt
wurde, die Biotinylierungsstelle ungeschützt, während alle anderen Gruppen
gegen Reagieren blockiert sind, wobei der Biotinylierungsschritt
zu folgen hat. Basenlabile Schutzgruppen können ein Carbamat wie 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
(Fmoc) einschließen,
und säurelabile
Schutzgruppen können
Trityl (Trt) und t-Butoxycarbonyl (tBOC) einschließen. Es
wird verstanden werden, dass nicht beabsichtigt ist, dass die eingesetzten
Schutzgruppen die vorliegende Erfindung beschränken.
-
Am
Ende der Peptidbildungsschritte, die hierin oben ausgeführt wurden,
gibt es ein Peptid einer vorherbestimmten Aminosäurerestsequenz und mit einem
biotinylierbaren N-terminalen
Rest, das an ein Harz gebunden ist, und alle reaktiven Gruppen der
einzelnen Aminosäurereste
in dieser Sequenz sind mit einer säurelabilen Schutzgruppe geschützt. Die
reaktive Gruppe des N-terminalen Aminosäurerestes, die zu biotinylieren
ist, ist ungeschützt.
Das Harz-gebundene geschützte
Peptid wird biotinyliert, indem das Peptid einer Biotinylierungslösung ausgesetzt
wird. Biotinylierungslösungen,
die zum Biotinylieren von Peptiden geeignet sind, sind auf dem Gebiet
bekannt; in einer bevorzugten Ausführungsform umfasst diese Lösung einen
N-Hydroxysuccinimidester von Biotin oder ein Biotinamidohexanoat.
Solche Ester können
erhalten werden von verschiedenen kommerziellen Quellen wie Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO. In einer bevorzugten Ausführungsform wird
ein N-Hydroxysuccinimidester
eines Biotinamidohexanoats der Formel Biotin-(NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO)n-ONHS verwendet,
worin n 0 bis 5 ist, und vorzugsweise ist n 1 bis 2. Die Biotinylierungsreaktion
wird in einem geeigneten Lösungsmittel,
wie auf dem Gebiet bekannt, ausgeführt. Ein bevorzugtes Lösungsmittel
ist N-Methylpyrrolidon (NMP).
-
Im
Anschluss an die Biotinylierung des Peptids wird das Peptid von
dem Harz gespalten unter Verwendung von Standardverfahren, die auf
dem Gebiet bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird Abspaltung erreicht durch Behandlung des Peptids mit einer
Spaltlösung,
die Trifluoressigsäure
(TFA) enthält.
Die Spaltlösung
kann weiter 1,2-Ethandiol (EDT), Anisol und Dimethylsulfid enthalten.
Das Peptid wird der Spaltlösung
etwa ein bis etwa fünf
Stunden lang ausgesetzt, abhängig
von der Anzahl der Argininreste in dem Peptid. Das abgespaltene
biotinylierte Peptid wird dann wiedergewonnen, vorzugsweise nach
Oxidation des Peptids und Reinigung des biotinylierten Peptids.
Oxidation des abgespaltenen Peptids wird erreicht typischerweise
durch Belüften
einer alkalisierten Lösung
des Peptids oder durch Aussetzen des Peptids gegenüber einem Oxidationsmittel
wie K3Fe (CN)6 (Kaliumhexacyanoferrat(III)).
Im Anschluss an die Oxidation wird die Peptidlösung angesäuert und gereinigt unter Verwendung
von Standardtechniken. Ein bevorzugtes Mittel der Reinigung ist
durch Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC). Ein schematisches Diagramm für den Biotinylierungsprozess
der vorliegenden Erfindung, um ein biotinyliertes HIV-Antigen herzustellen,
ist in 1 gezeigt. Eine ausführliche Beschreibung der Biotinylierung
zahlreicher Peptide unter Verwendung eines Biotinylierungsprozesses
der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend in den folgenden Beispielen
ausgeführt.
-
Die
folgenden Beispiele veranschaulichen Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung und sind nicht gedacht, die Ansprüche und Spezifikationen in
irgendeiner Weise zu beschränken.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1 Festphasensynthese
von Sequenzidentifikationsnummer 6
-
Die
Synthese des Peptids mit der Sequenzidentifikationsnummer 6 wurde
ausgeführt
auf einem automatisierten Festphasenpeptidsyntheseautomat unter
Verwendung von Fmoc-Chemie im Standardmaßstab mit 0,25 mmol p-Hydroxymethylphenoxymethyl(HMP)-Harz
und 1,00 mmol Fmoc-Aminosäuren. Der
Ablaufeditor war modifiziert insofern, als dass doppelte Kopplung
eingeführt
wurde nach jeweils zehn angelagerten Aminosäuren. Der hinzugefügte Lysinrest,
der sich zwischen den zwei Cysteinresten befindet, war N-α-Fmoc-N-ε-Boc-L-Lysin, während der
Lysinrest an dem N-terminalen Ende N-α-Boc-N-ε-Fmoc-L-Lysin
war. Das e-Amin des N-terminalen Lysins wurde derivatisiert mit
Biotinamidohexanoat-N-hydroxysuccinimidester, während das Peptid immer noch
auf dem Harz war. Keine Entschützung
wurde zu diesem Zeitpunkt durchgeführt, außer für das terminale Amin.
-
Ausdrücklicher
wurden etwa 160 mg (0,05 mmol) des vollständigen Peptids auf dem Harz
in etwa 5 ml eines N-Methylpyrrolidon(NMP)-Lösungsmittelsystems
gemischt. Etwa 45 mg (0,1 mmol) Biotinamidohexanoat-N-hydroxysuccinimidester
wurde hinzugegeben und die Lösung
wurde etwa 6 Stunden lang gemischt. Das Peptid auf dem Harz wurde
dann filtergewaschen mit etwa 2 ml Methylenchlorid und unter Vakuum
getrocknet. Das Peptid wurde mit etwa 10 ml einer Spaltlösung (10
ml) etwa 120 Minuten abgespalten und filtriert. Die Spaltlösung war
eine Mischung von 95% Trifluoressigsäure (TFA) und 5% einer 1:3:3-Mischung
von 1,2-Ethandithiol (EDT):Anisol:Dimethylsulfid. Das Peptid wurde
von dem Harz abfiltriert und mit kaltem Ether ausgefällt. Das
ausgefällte
Peptid wurde filtriert und mit Ether gewaschen. Das Rohpeptid wurde
in Dimethylformamid(DMF)-Wasser gelöst, der pH wurde auf etwa 9,0
mit Natriumcarbonat eingestellt und ein gleichmäßiger Strom von Luft wurde
durch die DMF-Lösung
hindurchgeleitet (d.h. das Peptid wurde oxidiert).
-
Im
Anschluss an die Oxidation wurde die Lösung mit TFA angesäuert und
das biotinylierte Peptid gereinigt unter Verwendung von Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC). Die Peaks wurden aufgetrennt auf einer C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule, 25,4
mm × 25
cm, 300 A, unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems mit einem
20%-zu-100%-Gradienten von Acetonitril-Wasser mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA).
Die Fließgeschwindigkeit
betrug 12 ml/min. Ultraviolett(UV)-Nachweis nutzte Wellenlängen von
230 nm und 260 nm. Das isolierte Material (11 mg) wurde analysiert
durch Massenspektroskopie (MS) und zeigte ein Molekülion bei
MS 2404 für
das korrekte Produkt. Das biotinylierte Peptid wurde auf freien
Thiolgehalt analysiert durch Ellman-Reagenz (erhältlich von Sigma Chemical Co.;
St. Louis MO). Nur 7% freies Thiol waren in dem gereinigten Peptid
vorhanden.
-
Beispiel 2 Festphasensynthese
von Sequenzidentifikationsnummer 7
-
Biotinyliertes
Peptid mit der Sequenzidentifikationsnummer 7 wurde hergestellt
wie oben in Beispiel 1 beschrieben, außer dass beide Lysinreste (das
Lysin, das sich zwischen den Cysteinresten befindet, und das N-terminale Lysin)
zu der Harz-gebundenen Kette als N-ε-tBoc-N-α-Fmoc-Lys hinzugefügt wurden. Die Biotin-Amidohexansäure wurde
an die α-Aminogruppe
des N-terminalen Lysins gekoppelt.
-
Beispiel
3 Festphasensynthese von Sequenzidentifikationsnummer 8 Biotinyliertes
Peptid mit der Sequenzidentifikationsnummer 8 wurde hergestellt
wie oben in Beispiel 1 beschrieben.
-
Beispiel 4 Festphasensynthese
von Sequenzidentifikationsnummer 9
-
Biotinyliertes
Peptid mit der Sequenzidentifikationsnummer 9 wurde hergestellt
wie oben in Beispiel 1 beschrieben.
-
Beispiel 5 Festphasensynthese
von Sequenzidentifikationsnummer 10
-
Biotinyliertes
Peptid mit der Sequenzidentifikationsnummer 10 wurde hergestellt
gemäß Beispiel
1, außer
dass beide Lysinreste eingelagert wurden als N-α-tBoc-N-ε-Fmoc-Lys.
Der N-termianle Arg-Rest wurde als N-ε-Fmoc-N-α-(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl)-L-arginin
hinzugefügt.
Das Biotin wurde an die a-Aminogruppe des N-terminalen Arg gekoppelt.
Sequenzidentifikationsnummer 10 wurde gereinigt durch HPLC, mit
einem Molekulargewicht von 3405 durch Massenspektrum.
-
Beispiel 6 Festphasensynthese
von Sequenzidentifikationsnummer 11
-
Biotinyliertes
Peptid mit der Sequenzidentifikationsnummer 11 wurde hergestellt
gemäß Beispiel
1, außer
dass beide Lysinreste eingelagert wurden als N-ε-tBoc-N-α-Fmoc-Lys.
Die Biotin-amidohexansäure
wurde an die a-Aminogruppe
des N-terminalen Lysins gekoppelt.
-
Beispiel 7. Chemilumineszenz-Immunoassay
für HIV-1-Antikörper
-
Biotinyliertes
Petid mit der Sequenzidentifikationsnummer 6 wurde hergestellt wie
in Beispiel 1 beschrieben. Eine Lösung des biotinyliertem Peptids
mit der Sequenzidentifikationsnummer 1 wurde hergestellt durch Lösen von
etwa 1 mg Sequenzidentifikationsnummer 1 (nach Kundenangaben synthetisiert
von Cambridge Research Biochemicals, Cheshire, England) in etwa
1 ml einer Natriumbicarbonatlösung
(20 mM, pH 8,0). Die Peptidlösung
wurde gemischt mit einem N-Hydroxylsuccinimidester von Biotin-amidocaproyl-amidohexansäure (1,23
mg, 4,5 Moläquivalente
zu dem 19-mer) durch magnetisches Rühren bei Raumtemperatur über Nacht.
-
Wenn
auch das biotinylierte Peptid weiter verarbeitet werden kann, um überschüssiges Biotin
zu entfernen, durch Dialyse in Hülse
mit einem Cutoff bei einem niedrigen Molekulargewicht von 1.000,
entschieden wir, dass das biotinylierte Peptid ohne Entfernung von
freiem Biotin verwendet werden kann in einem Immunoassaysystem mit
einem Waschschritt und bei Verwendung eines monoklonalen Anti-Biotin-Antikörpers, welcher
eine viel höhere
Bindungsaffinität
gegenüber
Makromolekül-verknüpftem Biotin
als gegenüber
freiem Biotin aufweist.
-
Der
Assay wurde auf einem eigenständigen
halbautomatisierten Instrument (O.S. Khalil et al., Clin. Chem 37,
Seite 1540-1547, 1991) (Abbott PRISMTM Instrument,
erhältlich
von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL 60064) ausgeführt. Das
Instrumentensystem wurde modifiziert zu einer Hochdurchsatzversion
von 40-Sekunden-Zyklen pro Schritt anstatt 72-Sekunden-Zyklen, wie
in der genannten Referenz beschrieben.
-
Ein
HIV-Antikörperassay
wurde durchgeführt
wie folgt. Zuerst wurden 50 μl
einer Mischung von Mikropartikeln, die mit rDNA-Antigenen für HIV-1
und HIV-2 beschichtet waren, mit 100 μl einer Testprobe in der Inkubationsvertiefung
18 Minuten lang inkubiert, um eine Mischung zu bilden. Jeder Typ
von Mikropartikel in der Mischung wurde separat mit den rDNA-Antigenen beschichtet
durch passive Adsorption an Polystyrol-Latex-Mikropartikeln, die erhältlich sind
von Seradyn; Indianapolis IN. Nach Beschichtung wurden die gemischten Partikel
wärmebeansprucht
bei 55°C-60°C. Als Nächstes wurde
die gesamte Probe/Mikropartikel-Mischung mit 600 μl Transferpuffer
(pH 7,2, 10 mM Phosphat, 0,9% NaCl, 0,12 fettfreie Trockenmilch
und 0,1% NaN3) von der Inkubationsvertiefung
zu der Nachweisvertiefung überführt. Dann
wurde biotinyliertes Peptid mit der Sequenzidentifikationsnummer
6 oder biotinyliertes Peptid mit der Sequenzidentifikationsnummer
1 (hergestellt wie oben in Beispiel 1 bzw. 7 beschrieben) gelöst bei einer
Konzentration von etwa 3,3 μ/ml
in pH 8,3, 0,1 M Borat, 6% Kalbsserum, 1% E. coli-Lysat, 2% Cholsäure, 0,05
CKS (CTP:CMP-3-Desoxy-manno-octulosonatcytidyltransferase
oder CMP-KDO-Synthetase)
und 0,1% NaN3). Etwa 50 μl der biotinylierten Peptidlösung wurden
in die Nachweisvertiefung pipettiert. Im Anschluss daran wurde dieses
Reaktionsgemisch etwa 10,6 Minuten lang inkubiert. Jede Probenvertiefung
wurde dann vier Mal gewaschen mit etwa 100 μl eines Probenwaschpuffers (pH
9,0, 0,1 M Borat, 0,25 M NaCl, 0,025 Lithiumlaurylsulfat und 0,1%
NaN3). Dann wurden etwa 50 μl eines Indikatorreagenz-Konjugats
(N-Methylacridinium-Konjugat
von monoklonalem Anti-Biotin (120 ng/ml in Phosphat-gepufferter
Salzlösung
[PBS] von pH 6,3, 4% Rinderserumalbumin [BSA], 1% Triton X-100®, 0,2%
fettfreie Trockenmilch und 0,1% NaN3) zu
der Reaktionsvertiefung hinzugegeben. Als nächstes wurden die Reaktionsgemische
etwa 10,6 Minuten lang inkubiert. Im Anschluss an diese Inkubation
wurde jede Vertiefung gewaschen mit einem Konjugatpuffer von pH
5,7, der 25 mM (2[N-Morpholino]ethansulfonsäure) (MES), 0,9% NaCl und 0,1%
Proclin® enthielt.
Proben wurden dann etwa 5 Minuten lang inkubiert, während sie
zu der Station für
die chemische Auslösung
und Photonennachweis verschoben wurden. Das Reaktionsgemisch in
der Reaktionsvertiefung wurde mit etwa 50 μl Harnstoffperoxid (0,2% in
0,15 N NaOH) ausgelöst und
Photonenzählungen
wurden mit einem Photomultiplier integriert. Die Ergebnisse dieser
Studie sind in Tabelle 1 gezeigt.
-
Wie
die Daten von Tabelle 1 zeigen führte
die Verwendung von Sequenzidentifikationsnummer 6 zu einer signifikanten Erhöhung des
Signal-Rausch(S/R)-Verhältnisses
im Vergleich zu Ergebnissen unter Verwendung der Lösung von
biotinyliertem Peptid mit der Sequenzidentifikationsnummer 1. Tabelle
1
-
Beispiel B. Dosiswirkungen
-
A. Subtyp-O-HIV-1-Testprobenreaktionen
auf biotinylierte HIV-1-gp41-IDR-Peptide
in einem reinen g41-Peptidsondenassay.
-
Ein
Chemilumineszensimmunoassay wurde unter Befolgung der Verfahren
von Beispiel 7 durchgeführt,
außer
dass Schritt 3 des Assays eine Serie von Verdünnungen verwendete: (i) Sequenzidentifikationsnummer
6 (ε-N-terminale
biotinylierte HIV-1-Typ-B-Sequenz)
in Konzentrationen von 0, 4, 10, 20, 40, 100, 200 und 500 ng/ml,
(ii) Sequenzidentifikationsnummer 7 (a-N-terminale biotinylierte HIV-1-Typ-B-Sequenz)
in Konzentrationen von 4, 20, 100 und 500 ng/ml, und (iii) Sequenzidentifikationsnummer
11 (α-N-terminale
biotinylierte HIV-1-Typ-O-Sequenz) in Konzentrationen von 4, 20,
100 und 500 ng/ml. Kontrollen und Proben, die in dem Lauf verwendet
wurden, waren negativer Kalibrator, eine gp41-IDR-Probenplatte (monoklonales
IAM 41-4D4; A. Buchacher, et al., AIDS Res Hum Retroviruses, 10:359-369,
[1999] und HIV-1-Subtyp-O-Probenplatte (Cameroon-M). Die Ergebnisse
dieses Experimentes sind in 2 dargestellt.
Wie in 2 zu sehen ist zeigen die Daten die Sensitivität eines
Immunoassays, der ein biotinyliertes Peptid der vorliegenden Erfindung
verwendet.
-
B. Dosiswirkungen von
Anti-HIV-1-Proben auf Sequenzidentifikationsnummer 6 in einem kombinierten HIV-1/2-Vollassay.
-
Das
Assayprotokoll wie in Beispiel 7 beschrieben wurde befolgt, außer dass
die Sonde in Schritt 3 eine Reihe von acht unterschiedlichen Sonden
verwendete, die aus einer Basensonde hergestellt wurden, die aus (a)
3-biotinyliertem Arg von HIV-1 gp41, HIV-1 p24 und HIV-2 (2,8, 0,6
bzw. 0,2 μg/ml)
und (b) biotinyliertem 19-mer von HIV-2-IDR (0,05 μg/ml) bestand;
dann wurde ein Schuss biotinyliertes HIV-1-gp41-IDR-19-mer zu Konzentrationen
von 0, 4, 10, 20, 40, 100, 200 und 500 ng/ml zugegeben. Kontrollen
und Testproben, die in dem Lauf verwendet wurden, waren negativer
Kalibrator, positiver Kalibrator, gp41-IDR-Probenplatte (MAb 4D4, siehe oben)
und HIV-1-Subtyp-O-Probenplatte
(Cameroon-M). Eine Dosiswirkungskurve von Testproben auf Sequenzidentifikationsnummer
6 ist in 3 gezeigt, in halblogarithmischer
Auftragung über
dem Peptideinsatz. Die Daten von 3 zeigen
die Sensitivität
eines Immunoassays, der ein biotiniyliertes Peptid der vorliegenden
Erfindung verwendet.
-
Beispiel 9. Festphasensynthese
von Sequenzidentifikationsnummer 12
-
Ein
voll geschütztes
Peptid mit der Sequenzidentifikationsnummer 5 wurde auf einem Hydroxymethylphenyl(HMP)-Harz
zusammengebaut durch schrittweise Festphasensynthese im Wesentlichen
wie in Beispiel 1 beschrieben. Die folgenden geschützten Aminosäuren wurden
in der Synthese verwendet:
Fmoc-(tBu)-Asp-OH
Fmoc-(Trt)-Cys-OH
Fmoc-(Trt)-Gln-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Leu-OH
Fmoc-(tBoc)-Lys-OH
Fmoc-(tBu)-Thr-OH
Fmoc-Trp-OH
-
Alle
Aminosäuren
waren doppelt gekoppelt bei einem 4-fachen Molüberschuss gegenüber Reaktionsstellen.
-
Biotinylierung
der Alphaaminoposition des N-terminalen Lysins schritt voran durch
zuerst Entfernen der terminalen Fmoc-Schutzgruppe mit 20% Piperidin in NMP.
Biotin wurde dann an den Alphaaminoterminus gekoppelt durch Zugabe
von 1 Moläquivalent
Biotinamidocaproyl-N-hydroxysuccinimidester zu dem voll geschützten Peptid,
während
es immer noch auf dem Harz war. Der Peptid-Harz-Komplex wurde mit
NMP gewaschen und die Kopplung wiederholt. Kopplung wurde durchgeführt während Verwirbeln
der Reagenzien auf dem automatisierten Peptidsyntheseautomat in
10 ml NMP für
24 Stunden.
-
Das
Peptid wurde dann von dem Harz abgespalten wie in Beispiel 1 und
die restlichen Schutzgruppen wurden durch Verrühren des geschützten Peptids
mit 92,5 Trifluoressigsäure,
5% Ethandithiol, 2,5% Wasser 6 Stunden lang bei Raumtemperatur entfernt.
Das Peptid wurde dann von dem Harz filtriert und mit kaltem Ether
ausgefällt.
Das ausgefällte
Peptid wurde filtriert und mit Ether gewaschen.
-
Das
Rohpeptid wurde auf Reinheit analysiert unter Verwendung von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
auf einer C18-Säule,
4,6 mm × 25
cm, unter Verwendung einer Fließgeschwindigkeit von
einem ml/min bei Einsatz von 0,1% wässeriger TFA als "Lösungsmittel A" und 0,1% TFA in
Acetonitril als "Lösungsmittel
B". Der Lösungsmittelgradient,
der für
diese Peptidanalyse eingesetzt wurde, startete mit 20% Lösungsmittel
B. Ein linearer Gradient von 1%/min bis 70% Lösungsmittel B wurde verwendet,
um das Peptid zu eluieren, gefolgt von 10 Minuten 100 Lösungsmittel
B, um die Säule
zu waschen. Die Gegenwart von Peptid in dem Effluent wurde gleichzeitig
bei 230 nm und bei 260 nm überwacht.
-
Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
im präparativen
Maßstab
wurde auf eine ähnliche
Art und Weise durchgeführt
unter Verwendung einer C18-Säule,
41,4 mm × 25
cm, unter Verwendung des oben beschriebenen Lösungsmittelsystems. Die Peptidfraktionen
wurden gesammelt, wie sie eluiert wurden, und bis zur Trockenheit
lyophilisiert, bevor Massenspektrumsdaten gesammelt wurden.
-
Die
intramolekulare Disulfidbindung zwischen dem Lysin, das sich an
Position 12 befindet, und dem Tyrosin, das sich an Position 18 befindet,
wurde gebildet durch Verrühren
des gereinigten Peptids in 20% Dimethylsulfoxid, 80% 100 mM Tris®-Puffer pH 6,0 bei
einer Konzentration von 1 mg/ml oder weniger. Analytische Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
wurde verwendet, um das Ausmaß der
Reaktion zu überwachen.
Als die Oxidation vollständig
war (nach ungefähr
24 Stunden) wurde das Peptid gereinigt durch präparative Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
im präparativen
Maßstab
wie oben beschrieben. Massenspektrumsdaten des fertigen Produkts
bestätigten
das korrekte Produkt mit einem Molekulargewicht von 2504, 9.
-
Beispiel 10 Festphasensynthese
von Sequenzidentifikationsnummer 13
-
Die
Synthese von Sequenzidentifikationsnummer 13 ging im Wesentlichen
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 9 beschrieben vor
sich. Jedoch ersetzte das N-α-(Fmoc)-N-ε-(Biotinamidocaproyl)-Lys N-α-(Fmoc)-N-ε-(tBoc)-Lys
an der N-terminalen
Position der Sequenz. Das biotinylierte Lysinderivat wurde doppelt
gekoppelt bei 1 Moläquivalent
an Reaktionsstellen. Zusätzlich
war der Alphaaminoterminus in diesem Peptid nicht biotinyliert.
-
Die
restlichen Schritte: Spaltung, Reinigung des Rohprodukts durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie,
Oxidation und erneute Reinigung durch HPLC waren die gleichen.
-
Beispiel 11. Festphasensynthese
von Sequenzidentifikationsnummer 14
-
Die
Synthese von Sequenzidentifikationsnummer 14 ging im Wesentlichen
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 9 beschrieben vor
sich. Jedoch ersetzte das N-α-(Fmoc)-N-ε-(Fmoc)-Lys N-α-(Fmoc)-N-ε-(tBoc)-Lys
an der N-terminalen Position der Sequenz. Zusätzlich ereigneten sich Biotinylierung
an den Alpha- und
Epsilonpositionen des N-terminalen Lysins gleichzeitig durch die
Zugabe von 2 Moläquivalenten
Biotinamidocaproyl-N-hydroxysuccinimid
zu dem Peptid wie oben ausgeführt.
Diese Kopplung wurde mit weiteren 2 Moläquivalenten Biotinreagenz wiederholt.
-
Die
restlichen Schritte: Spaltung, Reinigung des Rohprodukts durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie,
Oxidation und erneute Reinigung durch HPLC waren die gleichen.
-
Beispiel 12 MEIA für HIV-1-
und HIV-2-Antikörper
unter Verwendung von ortsspezifischen und guasilösungsbiotinylierten Peptidkonjugaten
-
Die
ortsspezifisch biotinylierten Peptide, die in Beispiel 9-11 synthetisiert
wurden, wurden verglichen mit Peptiden, die repräsentativ sind für solche,
die durch Lösungsphasenbiotinylierung
erhalten wurden. Sequenzidentifikationsnummer 15, Sequenzidentifikationsnummer
16 und Sequenzidentifikationsnummer 17 wurden synthetisiert unter
Verwendung von Standard-Fmoc-Chemie unter Verwendung von biotinylierten
Lysinresten zum Markieren des Peptids an Positionen 12, 14 oder
12 und 14.
-
Ein
Mikropartikelenzymimmunoassay für
HIV-1 und HIV-2 wurde verwendet, um die ortsspezifisch biotinylierten
Peptide mit solchen zu vergleichen, die repräsentativ sind für lösungsbiotinylierte
Peptide. Diese Assays wurden auf einem AxSYM
®-Analysator
durchgeführt,
welcher ein automatisiertes System ist, das kommerziell erhältlich ist
von Abbott Laboratories (Abbott Park, IL). Der AxSYM
®-Analysator
kombiniert Humanserumproben mit Mirkopartikeln, die beschichtet
sind mit HIV-1- und HIV-2-rekombinanten Proteinen (Einfangreagenz).
Folglich banden Anti-HIV-1- und Anti-HIV-2-Antikörper, die in der Testprobe
vorhanden waren, an die feste Phase. Die Einfangreagenz/Antikörper-Komplexe
wurden dann in Kontakt gebracht mit dem lösungsbiotinyliertem Peptidkonjugat
oder dem ortsspezifisch biotinyliertem Peptidkonjugat und damit
inkubiert, um Einfangreagenz/Antikörper/Peptidkonjugat-Komplexe
zu bilden. Um irgendwelche Komplexe nachzuweisen wurde dann Kaninchen-Anti-Biotin-Antikörper, das
an alkalische Phosphatase konjugiert war, mit den Einfangreagenz/Antikörper/Peptidkonjugat-Komplexen
inkubiert. Nach einer Wäsche
wurde 4-Methylumbelliferylphosphat hinzugegeben. Die Geschwindigkeit
des Erscheinens eines fluoreszenten dephosphorylierten Substrats korrelierte
mit dem Nachweis von HIV-Antikörpern.
Das Einfangreagenz/alkalische Phosphatase-Konjugat und 4-Methylumbelliferylphosphat-Substrat
war kommerziell erhältlich
von Abbott Laboratories. Daten für
die verschiedenen Assays sind in Tabelle 2 unten gezeigt. Wie durch
Tabelle 2 gezeigt ergaben die ortsspezifisch biotinylierten Peptidkonjugate
(Sequenzidentifikationsnummer 12, Sequenzidentifikationsnummer 13
und Sequenzidentifikationsnummer 14) herausragende Ergebnisse im
Vergleich zu Peptidkonjugaten, die repräsentativ sind für solche,
die erhalten werden durch Lösungsbiotinylierung
eines ähnlichen
Peptids mit einer Aminosäurerestunterscheidung
bei Position 18 (Sequenzidentifikationsnummer 15, Sequenzidentifikationsnummer
16 und Sequenzidentifikationsnummer 17). Tabelle
2 Geschwindigkeiten
-
Wie
die Daten oben zeigen ergaben biotinylierte HIV-Peptide, die wie hierin oben offenbart
und hergestellt wurden, hervorragende Ergebnisse beim Nachweisen
von Anti-HIV-Antikörpern im
Vergleich zu der Verwendung eines biotinylierten Peptids, das unter
Verwendung des Lösungsbiotinylierungsverfahrens
hergestellt wurde.
-
Während die
Erfindung ausführlich
und mit Bezug auf spezielle Ausführungsformen
beschrieben worden ist, wird es für den Fachmann offensichtlich
sein, dass verschiedene Änderungen
und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von dem Schutzumfang
der Erfindung abzuweichen. SEQUENZLISTE
