ES2256862T3 - Conjugados hapteno-peptido mejorados para detectar anticuerpos anti-vih-1 o anti-vih-2. - Google Patents
Conjugados hapteno-peptido mejorados para detectar anticuerpos anti-vih-1 o anti-vih-2.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN INMUNOANALISIS MEJORADO PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS ANTI - VIH - 1 O ANTI - VIH - 2 QUE PUEDEN ESTAR PRESENTES EN UNA MUESTRA DE ANALISIS. SE PRESENTA TAMBIEN UNA COMPOSICION QUE CONTIENE CONJUGADOS DE PEPTIDOS HAPTENADOS EN UN LUGAR ESPECIFICO Y LOS EQUIPOS DE ANALISIS.
Description
Conjugados hapteno-péptido
mejorados para detectar anticuerpos
anti-VIH-1 o
anti-VIH-2.
Esta invención se refiere en líneas generales a
conjugados hapteno-péptido y más particularmente, se
refiere a un inmunoensayo mejorado para detectar
VIH-1 y VIH-2 usando conjugados
hapteno-péptido.
Se usan haptenos en diversos inmunoensayos para
aumentar o amplificar la señal generada por un compuesto que genera
señales usado para detectar un analito en una muestra de ensayo,
aumentando de este modo la sensibilidad del ensayo. El término
"hapteno" se refiere a un antígeno parcial o miembro de unión
no proteico que es capaz de unirse a un anticuerpo, pero que no es
capaz de provocar formación de anticuerpos salvo que se acople a una
proteína vehículo. Los ejemplos de haptenos incluyen moléculas tales
como biotina o avidina, o biotina y avidina, y similares.
Los péptidos biotinilados, por ejemplo, se han
preparado biotinilando un antígeno o un péptido en solución con una
aportación molar seleccionada de reactivo de biotinilación y
retirando la biotina libre de la sonda en bruto por diálisis. Hay,
sin embargo, numerosos problemas asociados a este proceso de
biotinilación. Los péptidos biotinilados producidos por este proceso
típicamente son una mezcla de péptidos marcados con diversas y
diferentes cantidades de restos de biotina. Además, como la
biotinilación es aleatoria en el péptido, es probable que algunas
moléculas peptídicas en la solución no estén biotiniladas en ninguna
posición. Por tanto, los péptidos producidos por el proceso de
biotinilación en solución probablemente se realicen de manera
irregular en diferentes preparaciones. Además, cuando el péptido
biotinilado es un antígeno a usar en un inmunoensayo, el proceso de
biotinilación en solución habitualmente provoca la biotinilación de
restos de aminoácido en el epítopo antigénico, que después altera la
unión entre el antígeno y el anticuerpo. Además, como la biotina se
une aleatoriamente en la molécula peptídica, no hay control sobre
dónde sucede la biotinilación en el péptido, y la cantidad de
biotina presente en los péptidos en preparación de péptidos
biotinilados es desconocida e incontrolable.
El documento WO90/08957 describe un método para
la detección, para la exploración y propósitos de diagnóstico de
anticuerpos en un fluido corporal mediante una proteína de unión a
anticuerpo unida covalentemente a una matriz porosa retenida en una
columna transparente. De acuerdo con este documento, se pone en
contacto un fluido de ensayo que contiene anticuerpo con la matriz
con proteínas unidas mediante la cual la proteína inmoviliza
cualquier anticuerpo presente en el fluido de ensayo. El antígeno
biotinilado aleatoriamente de interés se pone en contacto con y se
une al anticuerpo inmovilizado; la avidina unida covalentemente a
una enzima se pone en contacto con y se une al complejo inmovilizado
biotinilado, que después se pone en contacto con una solución de
sustrato para tener un producto detectable. De manera similar,
Voller et al. describen un ensayo tipo sándwich de
biotina-avidina en el que la muestra se incuba, se
añade anticuerpo marcado con biotina y después se añade una enzima
marcada con avidina.
El documento US 4.957.737 describe péptidos
sintéticos que pueden usarse como reactivos en inmunoensayos para la
detección de anticuerpos del SIDA. En este documento, la secuencia
peptídica que se usa como sonda está radiomarcada en el resto de
cisteína terminal.
Campbell et al. describen el uso de
análogos del factor de liberación de hormona del crecimiento
biotinilados; en esta publicación, se indica que la bioactividad de
GFR es relativamente intolerante a modificaciones
N-terminales, y por tanto se postula que GRF
necesita biotinilación en un sitio lejos del núcleo bioactivo para
retener su actividad de liberación de hormona del crecimiento.
Por lo tanto, existe una necesidad de conjugados
hapteno-péptido mejorados en los que el hapteno,
preferiblemente biotina, esté unido a un sitio o sitios específicos
predeterminados en la molécula peptídica.
La presente invención proporciona inmunoensayos
mejorados para detectar anticuerpos frente a VIH-1
y VIH-2 que pueden estar presentes en una muestra de
ensayo. Los inmunoensayos para VIH-1 o
VIH-2 que están mejorados como se explica en este
documento, generalmente comprenden poner en contacto una muestra de
ensayo con un reactivo de captura para un analito anticuerpo, donde
dicho reactivo de captura comprende un miembro del par de unión
especifico para el analito anticuerpo de interés unido a una fase
sólida, para formar de este modo una primera mezcla. Esta primera
mezcla se incuba durante un tiempo y en condiciones suficientes para
formar complejos reactivo de captura/analito. Estos complejos
después se ponen en contacto con un conjugado
hapteno-péptido que comprende un hapteno unido a un
péptido específico para el miembro analito del complejo para formar
una segunda mezcla. Esta segunda mezcla se incuba para formar
complejos de reactivo de captura/analito/conjugado
hapteno-péptido. Después, preferiblemente se realiza
una etapa de lavado sobre los complejos de reactivo de
captura/analito/conjugado hapteno-péptido para
separar cualquier conjugado hapteno-péptido no
complejado de los complejos de reactivo de captura/analito/conjugado
hapteno-péptido. Después, se pone en contacto un
reactivo indicador que comprende un miembro de un par de unión
específico para el hapteno que está marcado con un compuesto que
genera señales capaz de generar una señal medible, con los complejos
de reactivo de captura/analito/conjugado
hapteno-péptido para formar una tercera mezcla. Esta
tercera mezcla se incuba durante un tiempo y en condiciones
suficientes para formar complejos reactivo de
captura/analito/conjugado hapteno-péptido/reactivo
indicador. La presencia, si la hay, del analito se determina
detectando la señal medible generada por el compuesto que genera
señales. La mejora del ensayo comprende poner en contacto los
complejos de reactivo de captura/analito con un conjugado
hapteno-péptido que comprende una secuencia de
restos amino acilo denominada en este documento como SECUENCIA ID.
Nº 1-5 que está marcada con al menos uno y
preferiblemente dos haptenos N-terminales en la
posición \alpha y/o \varepsilon.
También se proporciona una composición útil para
detectar anticuerpos anti-VIH-1 o
anti-VIH-2 que pueden estar
presentes en una muestra de ensayo. La composición comprende un
péptido con hapteno N-terminal sustancialmente puro
que se selecciona entre cualquiera de las secuencias denominadas en
este documento como SECUENCIA ID. Nº 1-5. Además, la
invención proporciona un kit de ensayo que comprende al menos un
reactivo conjugado hapteno-péptido. El reactivo
conjugado hapteno-péptido generalmente comprende un
péptido con hapteno N-terminal sustancialmente puro
que se selecciona entre cualquiera de las secuencias denominadas en
este documento como SECUENCIA ID. Nº 1-5 disuelto o
suspendido de otro modo en un tampón apropiado.
La Figura 1 es un resumen esquemático de un
proceso de biotinilación.
La Figura 2 muestra una representación de las
proporciones S/N frente a las respuestas a dosis de concentración
de péptidos de una muestra de Camerún a antígenos gp41 de
VIH-1 biotinilados.
La Figura 3 muestra una representación
semi-log de recuentos frente a respuestas de dosis
de concentración de péptidos de muestras de VIH a SECUENCIA ID. Nº
6.
Salvo que se indique otra cosa, los siguientes
términos tienen los siguientes significados:
La expresión "péptido sintético" como se usa
en este documento significa una forma polimérica de aminoácidos de
cualquier longitud que puede sintetizarse químicamente por métodos
bien conocidos para el especialista habitual. Estos péptidos
sintéticos son útiles en diversas aplicaciones.
Un péptido sintético o "antígeno" es
"inmunológicamente reactivo" con un anticuerpo cuando se une a
un anticuerpo debido al reconocimiento por el anticuerpo de un
epítopo específico contenido en el péptido. La reactividad
inmunológica puede determinarse por la unión del anticuerpo, más
particularmente por la cinética de la unión del anticuerpo, y/o por
competición en la unión usando como competidor o competidores un
péptido o péptidos conocidos que contienen un epítopo frente al
anticuerpo al que están dirigidos. Los métodos para determinar si un
péptido es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo son bien
conocidos en la técnica.
El termino "individuo" como se usa en este
documento se refiere a vertebrados, particularmente miembros de
especies de mamíferos e incluye, aunque sin limitación, animales
domésticos, animales de competición, primates y seres humanos; más
particularmente el término se refiere a primates/simios y seres
humanos.
La expresión "componente corporal que contiene
analito" o "muestra de ensayo" se refiere a un componente
del cuerpo de un individuo que es la fuente del analito anticuerpo
de interés. Estos componentes son bien conocidos en la técnica.
Estas muestras de ensayo incluyen muestra biológicas que pueden
ensayarse por los métodos de la presente invención descritos en este
documento e incluyen fluidos corporales humanos y animales tales
como sangre completa, suero, plasma, fluido cerebromedular, orina,
fluidos linfáticos, fluido ascítico y diversas secreciones externas
del tracto respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas,
saliva, leche, glóbulos blancos, mielomas y similares; fluidos
biológicos tales como sobrenadantes de cultivo celular; muestras
tisulares fijadas; y muestras celulares fijadas o cualquier otro
constituyente corporal.
Los conjugados hapteno-péptido
mejorados descritos en este documento pueden usarse para desarrollar
ensayos únicos y mejorados como se describe en este documento para
detectar o confirmar la presencia de anticuerpos
anti-VIH-1 o
anti-VIH-2. Los conjugados
hapteno-péptido también pueden usarse en combinación
con otros conjugados de hapteno que comprende un hapteno y, por
ejemplo, antígenos virales nativos y/o proteínas
recombinan-
tes.
tes.
"Analito", como se usa en este documento, es
la sustancia a detectar que puede estar presente en la muestra de
ensayo. El analito puede ser cualquier sustancia para la que existe
un miembro de unión específico de origen natural (tal como, un
anticuerpo), o para el que puede prepararse un miembro de unión
especifico. Por tanto, un analito es una sustancia que puede unirse
a uno o más miembros de unión específicos en un ensayo.
"Analito" también incluye cualquier sustancia antigénica,
hapteno, anticuerpo, y combinaciones de los mismos. Como miembro de
un par de unión específica, el analito puede detectarse por medio de
compañeros de unión específicos de origen natural (pares) tal como
el uso de proteína de factor intrínseco como miembro de un par de
unión específica para la determinación de vitamina B12, el uso de
proteína de unión a folato para determinar el ácido fólico, o el uso
de una lectina como miembro de un par de unión específica para la
determinación de un carbohidrato. El analito también puede incluir
una proteína, un péptido, aminoácido, un nucleótido diana, y
similares.
La presente invención proporciona ensayos que
utilizan miembros de unión específicos. Un "miembro de unión
específico", como se usa en este documento, es un miembro de un
par de unión específica. Es decir, dos moléculas diferentes donde
una de las moléculas se une específicamente a través de un medio
químico o físico a la segunda molécula. Por lo tanto, además los
pares de unión específicos de antígeno y anticuerpo de inmunoensayos
habituales, otros pares de unión específica pueden incluir biotina y
avidina, carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos
complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y
enzimas, inhibidores enzimáticos y enzimas, y similares. Además, los
pares de unión específica pueden incluir miembros que son análogos
de los miembros de unión específicos originales, por ejemplo, un
análogo de analito. El miembro del par de unión específica puede
incluir una proteína, un péptido, un aminoácido, un nucleótido
diana, y similares. Además, los pares de unión específica pueden
incluir miembros que son análogos de los miembros de unión
específicos originales, por ejemplo, un análogo de analito. Los
miembros de unión específicos inmunorreactivos incluyen antígenos,
fragmentos de antígeno, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo,
monoclonales y policlonales, y complejos de los mismos, incluyendo
los formados por moléculas de ADN recombinante. El termino
"hapteno", como se usa en este documento, se refiere a un
antígeno parcial o un miembro de unión no proteico que es capaz de
unirse a un anticuerpo, pero que no es capaz de provocar la
formación de anticuerpos salvo que se acople a una proteína
vehículo.
Un "reactivo de captura", como se usa en
este documento, se refiere a un miembro de unión específico no
marcado que es específico para el analito como en un ensayo tipo
sándwich, para el reactivo indicador o analito como en un ensayo
competitivo, o para un miembro de unión especifico auxiliar, que por
sí mismo es especifico para el analito, como en un ensayo indirecto.
El reactivo de captura puede estar unido directa o indirectamente a
un material en fase sólida antes de realizar el ensayo o durante la
realización del ensayo, posibilitando de este modo la separación de
complejos inmovilizados de la muestra de ensayo.
La "fase sólida" no es crítica y puede ser
cualquier variedad de materiales que puedan seleccionarse por un
especialista en la técnica sin experimentación innecesaria. La
expresión "fase sólida" se usa en un sentido amplio y se
refiere a cualquier material que sea insoluble, o pueda hacerse
insoluble por una reacción posterior. Por tanto, los materiales
porosos o no porosos, partículas de látex o poliestireno,
micropartículas magnéticas o no magnéticas, perlas, membranas, tubos
de plástico, paredes de pocillos de microtitulación y glóbulos rojos
de ovejas negras son todos ejemplos adecuados. El tamaño,
dimensiones, y forma de la fase sólida generalmente no son críticos
para practicar los métodos descritos en este documento.
Los métodos adecuados para inmovilizar antígenos
en fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrófobas,
covalentes y similares; pueden aplicarse una diversidad de
metodologías con relación a la aplicación de fases sólidas útiles.
El reactivo de captura puede unirse de manera pasiva o activa a la
fase sólida. El recubrimiento pasivo, como se usa en este documento,
significa una unión no covalente o acoplamiento no covalente entre
el reactivo de captura y la fase sólida. El recubrimiento activo
significa realizar un enlace covalente entre el reactivo de captura
y el soporte sólido. Generalmente, dicho enlace covalente se forma
por el extremo carboxi-terminal o
amino-terminal de un antígeno o mediante un grupo
carboxi o amino libre en la proteína que se une a un grupo funcional
apropiado en la superficie de la fase sólida. Dichas fases sólidas
que tienen dichos grupos funcionales se llaman derivatizados. El
recubrimiento activo también puede incluir el uso de compuestos
enlazadores para realizar la formación de un enlace covalente entre
el antígeno y el soporte sólido. El agente de enlace puede
incorporarse como parte de, o derivatizado sobre, la fase sólida
antes de añadir el reactivo de captura, habitualmente un antígeno.
El uso de compuestos heterobifuncionales tales como
sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil
4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato)
o sulfo-SIAB
(sulfosuccinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato)
u homobifuncionales tales como sulfo-DST (tartrato
de disulfosuccinimidilo) o sulfo-EGS
(glicolbis[sulfosuccinimidil-succinato] de
etileno) permite que suceda una unión covalente más
específica/dirigida al sitio. La adición del compuesto enlazador
también puede incluir un brazo espaciador que permitiría que el
antígeno interaccionara más libremente con anticuerpos cuando está
unido a la fase sólida. La química del grupo enlazador es bien
conocida para el especialista en la técnica.
Un "reactivo indicador" adecuado comprende
un compuesto que genera señales (marcador) que es capaz de generar
una señal medible detectable por un medio externo, conjugado
(acoplado) a un miembro de unión específico. Los diversos
"compuestos que generan señales" (marcadores) contemplados
incluyen cromógenos, catalizadores tales como enzimas, compuestos
luminiscentes tales como fluoresceína y rodamina, compuestos
quimioluminiscentes tales como luminol, dioxetanos, compuestos de
acridinio y compuestos de fenantridinio, elementos radioactivos y
marcadores visuales directos. Los ejemplos de enzimas incluyen
fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano rusticano,
beta-galactosidasa, y similares. La selección de un
marcador particular no es crítica, pero será capaz de producir una
señal bien por sí mismo o bien junto con una o más sustancias
adicionales.
Un analito que puede estar presente en una
muestra de ensayo puede ser detectable en ensayos mediante el uso de
un conjugado hapteno-péptido descrito en este
documento. Además, como uno de los reactivos del ensayo, pueden
usarse diferentes péptidos sintéticos capaces de identificar y
unirse específicamente a diferentes epítopos de un analito tal como
un virus o bacteria en formatos de ensayo. Los péptidos con hapteno
de la presente invención pueden usarse para propósitos de unión,
enlace o amplificación de señal que son bien conocidos en la
técnica.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona una mejora en un ensayo diseñado para detectar la
presencia de un analito anticuerpo
anti-VIH-1 o
anti-VIH-2. Los ensayos que están
mejorados mediante lo contenido en este documento típicamente se
realizan del siguiente modo. Se pone en contacto una muestra de
ensayo con un reactivo de captura del analito, donde dicho reactivo
de captura comprende un miembro del par de unión específico para el
analito anticuerpo de interés unido a una fase sólida, para formar
de este modo una primera mezcla. Como el analito es un anticuerpo,
el reactivo de captura puede ser un antígeno recombinante, un
péptido sintético o una preparación de lisado que se une
específicamente al analito. La primera mezcla se incuba durante un
tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos de
reactivo de captura/analito. Estos complejos formados de este modo
después se ponen en contacto con un conjugado
hapteno-péptido para formar una segunda mezcla. Esta
segunda mezcla se incuba durante un tiempo y en condiciones
suficientes para formar complejos de reactivo de
captura/analito/conjugado hapteno-péptido. Después,
preferiblemente se realiza una etapa de lavado. Después, se pone en
contacto un reactivo indicador que comprende un miembro de un par de
unión específico para el hapteno que está marcado con un compuesto
que genera señales capaz de generar una señal medible con los
complejos de reactivo de captura/analito/conjugado
hapteno-péptido para formar una tercera mezcla. Esta
tercera mezcla se incuba durante un tiempo y en condiciones
suficientes para formar complejos de reactivo de
captura/analito/conjugado hapteno-péptido/reactivo
indicador. La presencia del analito, si lo hay, se determina
detectando la señal generada por el compuesto que genera señales. Es
posible cuantificar la cantidad de analito presente ensayando
también patrones positivos que contienen concentraciones conocidas
de analito y patrones negativos, representando los resultados de la
señal medida obtenida con estos patrones frente a las
concentraciones conocidas, y leyendo los resultados de las muestras
de ensayo extraídas de las representaciones.
La mejora proporcionada en este documento
comprende poner en contacto los complejos de reactivo de
captura/analito con al menos uno de los péptidos denominados en este
documento como SECUENCIA ID. Nº 1-5 que tienen
haptenos en la posición o posiciones \alpha y/o \varepsilon
N-terminales. Preferiblemente, el hapteno es
biotina. En este documento también se proporciona una composición
útil para detectar anticuerpos
anti-VIH-1 o
anti-VIH-2. La composición
generalmente comprende una solución sustancialmente pura de al menos
un péptido con hapteno N-terminal tal como los
denominados en este documento como SECUENCIA ID. Nº
1-5. Como se usa en este documento, una "solución
sustancialmente pura", se entenderá que significa que la
concentración de péptidos con hapteno en posiciones no
N-terminales en la solución no se unirá al analito
anticuerpo en cantidades que provoquen los resultados de ensayo. Los
especialistas en la técnica reconocerán tampones adecuados para
suspender o disolver los conjugados hapteno-péptido
proporcionados en este documento.
Una solución sustancialmente pura de conjugados
hapteno-péptido puede proporcionarse como parte de
un kit de ensayo con uno o más recipientes tales como viales o
frascos. Cada recipiente o vial contiene un reactivo diferente tal
como un diluyente, reactivo indicador que comprende un compuesto que
genera señales, reactivos de ensayo que comprenden un conjugado
hapteno-péptido como se explica en este documento, y
similares. El reactivo conjugado hapteno-péptido
será una forma sustancialmente pura de SECUENCIA ID. Nº
1-5 marcada con al menos un hapteno
N-terminal. Dicho kit de ensayo también incluirá
instrucciones que indican que los contenidos de los mismos pueden
usarse para detectar/confirmar la presencia del analito de
interés.
Los péptidos que tienen haptenos como se explica
en este documento se obtienen de la región inmunodominante (IDR) de
un antígeno de VIH tal como IDR de gp41 de VIH-1 e
IDR de gp36 de VIH-2. Estos péptidos de VIH
incluyen:
SECUENCIA ID. Nº 1:
Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr,
que es un oligómero de 19 unidades obtenido de la región
inmunodominante (IDR) de gp41 subtipo B de
VIH-1;
SECUENCIA ID. Nº 2:
Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Ala-Gln-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp,
que es un oligómero de 25 unidades obtenido de gp36 de
VIH-2;
SECUENCIA ID. Nº 3:
Arg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr,
que es un oligómero de 28 unidades obtenido de gp41 de
VIH-1;
SECUENCIA ID. Nº 4:
Lys-Gln-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Ser-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
que es un oligómero de 20 unidades obtenido de la IDR de gp41 de
VIH-1, Tipo 0.
SECUENCIA ID. Nº 5:
Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
que es un oligómero de 19 unidades que tiene un puente disulfuro
entre la cisteína de la posición 11 y la cisteína de la posición 17.
El péptido se obtiene de la IDR de gp41 de VIH-1,
subtipo B con un cambio de Ser a Lys en la posición 12 y un cambio
Thr a Tyr en la posición 18.
Las formas biotiniladas de estos péptidos
(antígenos) son:
SECUENCIA ID. Nº 6:
Xaa-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr,
donde Xaa es
N-e-(biotin-amidocaproil)lisina;
SECUENCIA ID. Nº 7:
Xaa-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-De-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr,
donde Xaa es
N-\alpha-(biotin-amidocaproil)lisina;
SECUENCIA ID. Nº 8:
Xaa-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Ala-Gln-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp,
donde Xaa es
N-\varepsilon-(biotin-amidocaproil)lisina;
\newpage
SECUENCIA ID. Nº 9:
Xaa-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Ala-Gln-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp,
donde Xaa es
N-\alpha-(biotin-amidocaproil)lisina;
SECUENCIA ID. Nº 10:
Xaa-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Lzu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-
Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr, donde Xaa es N-\alpha-(biotin-amidocaproil)arginina; y
Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr, donde Xaa es N-\alpha-(biotin-amidocaproil)arginina; y
SECUENCIA ID. Nº 11:
Xaa-Gln-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Ser-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
donde Xaa es
N-\alpha-(biotin-amidocaproil)lisina.
SECUENCIA ID. Nº 12:
Xaa-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-De-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
donde Xaa es N-\alpha-(biotin-amidocaproil)lisina.
donde Xaa es N-\alpha-(biotin-amidocaproil)lisina.
SECUENCIA ID. Nº 13:
Xaa-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
donde Xaa es N-\varepsilon-(biotin-amidocaproil)lisina.
donde Xaa es N-\varepsilon-(biotin-amidocaproil)lisina.
SECUENCIA ID. Nº 14:
Xaa-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr,
donde Xaa es N-e-(biotin-amidocaproil)-\alpha-(biotin-amidocaproil)lisina.
donde Xaa es N-e-(biotin-amidocaproil)-\alpha-(biotin-amidocaproil)lisina.
Los conjugados peptídicos empleados de acuerdo
con el ensayo mejorado pueden sintetizarse usando síntesis
peptídica en fase sólida (SPPS). Usando este proceso, puede
incorporarse biotina, por ejemplo, de manera controlable y fácil en
una posición seleccionada o predefinida (aminoácido) en el péptido.
SPPS puede tomar la ventaja de las diferencias químicas entre grupos
de protección inestables en ácidos e inestables en bases para
incorporar haptenos en sitios específicos en restos de aminoácidos.
El proceso de biotinilación descrito en este documento es
particularmente útil para marcar péptidos o antígenos proteicos, que
contienen dominios de unión específicos (epítopos) para anticuerpos.
Para dichos péptidos, es importante que la biotina se incorpore en
un sitio fuera de la región del epítopo de modo que no afecte a la
interacción antígeno-anticuerpo.
De acuerdo con procedimientos de SPPS
convencionales, se sintetiza un péptido en un soporte sólido tal
como una resina. Las resinas adecuadas para soportar SPPS son bien
conocidas en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, resina de
alcohol p-alcoxibencílico y resina de poliestireno
clorometilado. La síntesis peptídica comienza con el acoplamiento de
un aminoácido carboxi-terminal
(C-terminal) deseado a la resina. El péptido se
sintetiza por adición secuencial de restos de aminoácidos al resto
C-terminal acoplado a la resina. Los aminoácidos
añadidos forman enlaces \alpha-peptídicos con los
restos mantenidos en la resina. Son bien conocidos en la técnica
otros medios para añadir restos adicionales e incluyen el
procedimiento de SPPS con tBoc de Merrifield. En una realización
preferida, el péptido se produce usando ciclos repetidos de restos
N-\alpha-Fmoc-aminoácido
inestables en bases. Por tanto, el resto C-terminal
y todos
los restos añadidos, sin incluir el resto N-terminal, tienen un grupo protector inestable en bases en su grupo \alpha-amino.
los restos añadidos, sin incluir el resto N-terminal, tienen un grupo protector inestable en bases en su grupo \alpha-amino.
Todos los grupos reactivos de los restos añadidos
están protegidos con un grupo protector adecuado para evitar las
conjugaciones no deseables entre los restos añadidos y el resto ya
presente en la cadena unida a la resina. Los grupos protectores
adecuados para grupos reactivos de aminoácidos, incluyendo grupos
inestables en bases e inestables en ácidos, son bien conocidos en la
técnica (Véase, por ejemplo, Protective Groups in Organic
Synthesis, 2a Ed., T.W. Greene and P.G.M. Wuts, John Wiley &
Sons, Inc., 1991). Por ejemplo, el azufre (S) reactivo de la
cisteína, el grupo \beta-amino de la asparagina,
el grupo \gamma-amino de la glutamina, y el
nitrógeno (N) de imidazol de la histidina puede protegerse con
trifenilmetilo, conocido en la técnica como tritilo (Trt). El
oxigeno (O) reactivo de la serina o treonina, el O reactivo de la
tirosina, el grupo \beta-carboxilo del ácido
aspártico, y el grupo \gamma-carboxilo del ácido
glutámico pueden protegerse con ésteres de t-butilo
(tBu).
Se conocen en la técnica medios para seleccionar
un agente protector adecuado y dependen del método usado para
construir la cadena peptídica y los aminoácidos que comprenden el
péptido. Cuando se construye una cadena peptídica usando múltiples
restos de aminoácidos \alpha protegidos inestables en bases, los
grupos protectores adecuados para otros grupos
(no-\alpha-amino) deben ser
estables en esas condiciones básicas usadas para añadir los restos
de aminoácidos. Esto es particularmente cierto para el proceso
descrito en este documento donde el proceso de biotinilación
adquiere la ventaja de las diferencias de estabilidad y reactividad
química entre grupos protectores.
Los restos de aminoácidos adicionales, excepto el
resto de aminoácido N-terminal, se añaden al
péptido unido a la resina en un orden preseleccionado, dependiendo
de la secuencia deseada del péptido a biotinilar, usando el
procedimiento anterior. Un resto de aminoácido
N-terminal biotinilable se añade a la cadena
peptídica unida a la resina. Como se usa en este documento, el
termino "biotinilable" significa que es capaz de biotinilarse.
Los restos de aminoácidos capaces de biotinilarse son bien conocidos
en la técnica; un resto de aminoácido preferido es lisina.
El aminoácido N-terminal
típicamente se protege de modo que el sitio deseado de biotinilación
se protege con un grupo protector inestable en bases y todos los
demás grupos reactivos en ese resto están protegidos con un grupo
protector inestable en ácidos. Por tanto, cuando el resto
N-terminal se añade a la cadena peptídica unida a la
resina usando el procedimiento de múltiples ciclos inestables en
bases expuesto anteriormente, el sitio de biotinilación se
desprotege mientras que todos los demás grupos se bloquean de la
reacción con la etapa de biotinilación para que siga. Los grupos
protectores inestables en bases pueden incluir un carbamato tal como
9-fluorenilinetoxicarbonilo (Fmoc), y los grupos
protectores inestables en ácidos pueden incluir tritilo (Trt) y
t-butoxicarbonilo (tBoc). Se entenderá que los
grupos protectores empleados no pretenden limitar la presente
invención.
Al final de las etapas de construcción peptídica
expuestas anteriormente, el péptido de una secuencia de restos de
aminoácidos predeterminada y un resto N-terminal
biotinilable quedan unidos a una resina y todos los grupos reactivos
de los restos de los aminoácidos individuales en esa secuencia están
protegidos con un grupo protector inestable en ácidos. El grupo
reactivo del resto de aminoácido N-terminal que
tiene que biotinilarse se desprotege. El péptido protegido unido a
la resina se biotinila exponiendo ese péptido a una solución de
biotinilación. Las soluciones de biotinilación adecuadas para
biotinilar péptidos son bien conocidas en la técnica; en una
realización preferida, la solución comprende un
N-hidroxisuccinimida éster de biotina o un
biotinamidocaproato. Dichos ésteres pueden obtenerse de diversas
fuentes comerciales tales como Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. En
una realización preferida, se usa un
N-hidroxisuccinimida éster de un biotinamidocaproato
de fórmula
biotina-(NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CO)_{n}-ONHS,
donde n es de 0 a 5 y preferiblemente, n es de 1 a 2. La reacción de
biotinilación se realiza en un disolvente adecuado como se sabe en
la técnica. Un disolvente preferido es
N-metilpirrolidona (NMP).
Después de la biotinilación del péptido, el
péptido se escinde de la resina usando procedimientos convencionales
conocidos en la técnica. En una realización preferida, la escisión
se consigue tratando el péptido con una solución de escisión que
contiene ácido trifluoroacético (TFA). La solución de escisión puede
comprender adicionalmente 1,2-etanoditiol (EDT),
anisol y sulfuro de dimetilo. El péptido se expone a la solución de
escisión durante aproximadamente una a aproximadamente cinco horas
dependiendo de la cantidad de restos de arginina en el péptido. El
péptido biotinilado, escindido, después de recupera, preferiblemente
después de oxidar el péptido y purificar el péptido biotinilado. La
oxidación del péptido escindido se consigue típicamente aireando una
solución alcalinizada del péptido o exponiendo el péptido a un
agente de oxidación tal como K_{3}Fe(CN)_{6}
(ferricianuro potásico). Después de la oxidación, se acidifica la
solución del péptido y se purifica usando técnicas convencionales.
Un medio preferido de purificación es mediante cromatografía líquida
de alta presión (HPLC). Se muestra un diagrama esquemático del
proceso de biotinilación de la presente invención para producir un
antígeno de VIH biotinilado en la Figura 1. A continuación en este
documento, se expone una descripción detallada de la biotinilación
de numerosos péptidos usando un proceso de biotinilación de la
presente invención en los siguientes ejemplos.
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones de
la presente invención y no pretenden limitar las reivindicaciones y
memoria descriptiva de ningún modo.
La síntesis del péptido SECUENCIA ID. Nº 6 se
realizó en un sintetizador de péptidos en fase sólida automático
usando química de Fmoc a escala convencional con 0,25 mmol de resina
de p-hidroximetilfenoximetilo (HMP) y 1,00 mmol de
aminoácidos Fmoc. El editor del procesamiento se modificó para que
se introdujera un acoplamiento doble después de cada diez
aminoácidos unidos. El resto de lisina añadido localizado entre los
dos restos de cisteína fue
N-\alpha-Fmoc-N-\varepsilon-Boc-L-Lisina,
mientras que el resto de lisina en el extremo
N-terminal fue
N-\alpha-Boc-N-\varepsilon-Fmoc-L-Lisina.
La \varepsilon-amina de la lisina
N-terminal se derivatizó con
N-hidroxisuccinimida éster de biotinamidocaproato
mientras el péptido aun permanecía en la resina. No se realizó
desprotección excepto para la amina terminal en ese
momento.
momento.
Específicamente, se mezclaron aproximadamente 160
mg (0,05 mmol) del péptido completado en la resina en
aproximadamente 5 ml de un sistema disolvente de
N-metilpirrolidona (NMP). Se mezclaron
aproximadamente 45 mg (0,1 mmol) de
N-hidroxisuccinimida éster de biotinamidocaproato y
la solución se mezcló durante aproximadamente 6 horas. El péptido de
la resina después se lavó para filtrarlo con aproximadamente 2 ml de
cloruro de metileno y se seco al vacío. El péptido se escindió con
aproximadamente 10 ml de una solución de escisión (10 ml) durante
aproximadamente 120 minutos y se filtró. La solución de escisión era
una mezcla de ácido trifluoroacético al 95% (TPA) y un 5% de una
mezcla 1:3:3 de 1,2-etanoditiol (EDT):Anisol:sulfuro
de dimetilo. El péptido se filtró de la resina y se precipitó con
éter frío. El péptido precipitado se filtró y se lavó con éter. El
péptido en bruto se disolvió en dimetilformamida
(DMF)-agua, se ajustó el pH a aproximadamente 9,0
con carbonato sódico y se pasó una corriente de aire continua a
través de la solución de DMF (es decir, se oxidó el péptido).
Después de la oxidación, se acidificó la solución
con TFA y el péptido biotinilado se purificó usando cromatografía
líquida a alta presión (HPLC). Los picos se separaron en una columna
C18 de HPLC en fase inversa, de 25,4 mm x 25 cm, 300A, usando un
gradiente del 20% al 100% de acetonitrilo-agua con
un sistema de disolvente de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%. El
caudal fue de 12 ml/minuto. La detección en ultravioleta (UV)
utilizó longitudes de onda de 230 nm y 260 nm. El material aislado
(11 mg) se analizó por espectrometría de masas (MS) y mostró un ión
molecular a MS 2404 para el producto correcto. El péptido
biotinilado se analizó para el contenido de tiol libre mediante el
reactivo de Ellmans (disponible de Sigma Chemical Co.; St. Louis
MO). Solo estaba presente un 7% de tiol libre en el péptido
purificado.
El péptido biotinilado SECUENCIA ID. Nº 7 se
preparó como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1 con la
excepción de que ambos restos de lisina (la lisina localizada entre
los restos de cisteína y la lisina N-terminal) se
añadieron a la cadena unida a la resina como
N-\varepsilon-tBOC-N-\alpha-Fmoc-Lys.
Se acopló biotina-ácido amidocaproico al grupo
\alpha-amino de la lisina
N-terminal.
El péptido biotinilado SECUENCIA ID. Nº 8 se
preparó como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1.
El péptido biotinilado SECUENCIA ID. Nº 9 se
preparó como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1.
El péptido biotinilado SECUENCIA ID. Nº 10 se
preparó de acuerdo con el Ejemplo 1 excepto en que ambos restos de
Lys se incorporaron como
N-\alpha-tBOC-N-\varepsilon-Fmoc-Lys.
El resto de Arg N-terminal se añadió como
N-\varepsilon-Fmoc-N-\alpha-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil)-L-arginina.
La biotina se acopló al grupo a-amino de la Arg
N-terminal. Se purificó SECUENCIA ID. Nº 10 de HPLC
con un peso molecular en el espectro de masas de 3405.
El péptido biotinilado SECUENCIA ID. Nº 11 se
preparó de acuerdo con el Ejemplo 1 excepto en que ambos restos de
Lys se incorporaron como
N-\varepsilon-tBOC-N-\alpha-Fmoc-Lys.
La biotina-ácido amidocaproico se acopló al grupo
\alpha-amino de la lisina
N-terminal.
El péptido biotinilado SECUENCIA ID. Nº 6 se
preparó como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se produjo una solución
biotinilada del péptido SECUENCIA ID. Nº 1 disolviendo
aproximadamente 1 mg de SECUENCIA ID. Nº 1 (sintetizado por
Cambridge Research Biochemicals, Cheshire, Inglaterra a petición del
cliente) en aproximadamente 1 ml de una solución de bicarbonato
sódico (20 mM, pH 8,0). Se mezcló la solución peptídica con un
N-hidroxisuccinimida éster del ácido
biotin-amidocaproil-amidocaproico
(1,23 mg, 4,5 equivalentes molares para el oligómero de 19
unidades) por agitación magnética a temperatura ambiente durante una
noche.
Aunque el péptido biotinilado puede procesarse
adicionalmente para retirar el exceso de biotina por diálisis en
tubos con un limite de peso molecular bajo de 1.000, se determinó
que el péptido biotinilado podía usarse sin retirada de la biotina
libre en un sistema de inmunoensayo con una etapa de lavado y cuando
se usa un anticuerpo anti-biotina monoclonal, que
tiene una afinidad de unión muy superior por la biotina unida a la
macromolécula que por biotina libre.
El ensayo se procesó en un instrumento
semiautomático único (O.S. Khalil et al., Clin, Chem 37,
págs. 1540-1547, 1991) (instrumento Abbott
PRISM^{TM}, disponible de Abbott Laboratories, Abbott Park, IL
60064). El sistema instrumental se modificó para una versión de alto
rendimiento de ciclos de 40 segundos por etapa en lugar de ciclos de
72 segundos como se describe en la referencia citada.
Se realizó un ensayo de anticuerpo contra VIH del
siguiente modo. Primero, se incubaron 50 \mul de una mezcla de
micropartículas recubiertas con ADNr de antígenos de
VIH-1 y VIH-2 con 100 \mul de
muestra de ensayo en el pocillo de incubación para formar una mezcla
durante 18 minutos. Cada tipo de micropartícula en la mezcla se
recubrió por separado con el ADNr de los antígenos por absorción
pasiva sobre partículas de látex de poliestireno disponibles de
Seradyn; Indianapolis IN. Después del recubrimiento, las partículas
mezcladas se sometieron a un proceso térmico a
55ºC-60ºC. Después, la mezcla muestra
completa/micropartículas se transfirió con 600 \mul de tampón de
transferencia (pH 7,2, fosfato 10 mM, NaCl al 0,9%, leche en polvo
desnatada al 0,12% y NaN_{3} al 0,1%) desde el pocillo de
incubación al pocillo de detección. Después, el péptido biotinilado
SECUENCIA ID. Nº 6 o péptido biotinilado SECUENCIA ID. Nº 1
(preparado como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1 y 7,
respectivamente) se disolvió a una concentración de aproximadamente
3,3 \mu/ml, en borato 0,1 M, pH 8,3, suero de ternera al 6%,
lisado de E. coli al 1%, ácido cólico al 2%, CKS
(CTP:CMP-3-desoxi-mano-octulosonato
citidilil transferasa o CMP-KDO sintetasa) al 0,05%,
y NaN_{3} al 0,1%. Se pipetearon aproximadamente 50 \mul de la
solución de péptido biotinilado en el pocillo de detección. Después
de esto, se incubó la mezcla de reacción durante aproximadamente
10,6 minutos. Cada pocillo de muestra después se lavó cuatro veces
con aproximadamente 100 \mul de un tampón de lavado de sonda (pH
9,0, borato 0,1 M, NaCl 0,25 M, laurilsulfato de litio al 0,025%, y
NaN_{3} al 0,1%). Después, se añadieron 50 ml de un conjugado de
reactivo indicador (conjugado de N-metil acridinio
de anti-biotina monoclonal (120 ng/ml en solución
salina tamponada con fosfato [PBS] pH 6,3, albúmina de suero bovina
[BSA] al 4%, Triton X-100® al 1%, leche en polvo
desnatada al 0,2%, y NaN_{3} al 0,1%) a cada pocillo de reacción.
Después, las mezclas de reacción de incubaron durante
aproximadamente 10,6 minutos. Después de esta incubación, se lavó
cada pocillo con un tampón conjugado de pH 5,7 que contiene (ácido
2[N-morfolino]etanosulfónico) (MES) 25
mM, NaCl al 0,9%, y Proclin® al 0,1%). Las muestras después se
incubaron durante aproximadamente 5 minutos mientras se movía al
puesto de desencadenamiento químico y detección de fotones. La
mezcla de reacción en el pocillo de reacción se desencadenó con
aproximadamente 50 \mul de peróxido de urea (al 0,2% en NaOH 0,15
N), y se integraron los recuentos de fotones con un
fotomultiplicador. Los resultados de este estudio se muestras en la
Tabla 1.
Como los datos de la Tabla 1 demuestran, el uso
de SECUENCIA ID. Nº 6 provocó un aumento significativo en la
proporción señal a ruido (S/N) cuando se comparan los resultados
usando el péptido biotinilado en solución SECUENCIA ID. Nº 1.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se realizó un ensayo de quimioluminiscencia
siguiendo los procedimientos del Ejemplo 7, excepto en que en la
etapa 3 del ensayo se usó una serie de diluciones: (i) SECUENCIA ID.
Nº 6 (secuencia de tipo B de VIH-1 biotinilada en
\varepsilon-N-terminal) en
concentraciones de 0, 4, 10, 20, 40, 100, 200 y 500 ng/ml, (ii)
SECUENCIA ID. Nº 7 (secuencia de tipo B de VIH-1
biotinilada en \alpha-N-terminal)
en concentraciones de 4, 20, 100, y 500 ng/ml, y (iii) SECUENCIA ID.
Nº 11 (secuencia de tipo O de VIH-1 biotinilada en
\alpha-N-terminal) en
concentraciones de 4, 20, 100 y 500 ng/ml. Los controles y muestras
usados en el procesamiento fueron un patrón negativo, un panel de
IDR de gp41 (IAM 41-4D4 monoclonal; A. Buchacher,
et al., AIDS Res Hum Retroviruses,
10:359-369, [1994]) y un panel de subtipo O de
VIH-1 (Camerún-M). Los resultados de
este experimento se presentan en la Figura 2. Como se puede ver en
la Figura 2, los datos muestran la sensibilidad de un inmunoensayo
usando un péptido biotinilado de la presente
invención.
invención.
Se siguió el protocolo de ensayo que se ha
descrito en el Ejemplo 7 excepto en que la sonda de la etapa 3 fue
una serie de ocho sondas diferentes producidas a partir de una sonda
básica compuesta de (a) 3 Arg biotiniladas de gp41 de
VIH-1, p24 de VIH-1, y
VIH-2 (2,8, 0,6, y 0,2 \mug/ml, respectivamente)
y (b) un oligómero de 19 unidades biotinilado de IDR de
VIH-2 (0,05 \mug/ml); después, con copias del
oligómero de 19 unidades de IDR de gp41 de VIH-1
biotinilado a concentraciones de 0, 4, 10, 20, 40, 100, 200, y 500
ng/ml. Los controles y las muestras de ensayo usados en el
procesamiento fueron un patrón negativo, un patrón positivo, un
panel de IDR de gp41 (Mab 4D4, supra), y un panel de subtipo
O de VIH-1 (Camerún-M). Se muestra
una curva de respuesta a dosis de las muestras de ensayo a SECUENCIA
ID. Nº 6 en la Figura 3, en una representación
semi-log de los recuentos frente a la aportación de
péptido. Los datos de la Figura 3 muestran la sensibilidad de un
inmunoensayo usando un péptido biotinilado de la presente
invención.
El péptido completamente protegido de SECUENCIA
ID. Nº 5 se ensambló en una resina de hidroximetilfenilo (HMP)
mediante una síntesis en fase sólida por etapas esencialmente como
se ha descrito en el Ejemplo 1. Se usaron los siguientes aminoácidos
protegidos en la síntesis:
Fmoc-(tBu)-Asp-OH
Fmoc-(Trt)-Cys-OH
Fmoc-(Trt)-Gln-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Leu-OH
Fmoc-(tBoc)-Lys-OH
Fmoc-(tBu)-Thr-OH
Fmoc-Trp-OH
Todos los aminoácidos se acoplaron doblemente a
un exceso molar de 4 veces en los sitios reactivos.
La biotinilación de la posición alfa amino de la
lisina N-terminal sucedió retirando primero el grupo
protector Fmoc terminal con piperidina al 20% en NMP. Después se
acopló la biotina al extremo alfa amino por la adición de 1
equivalente molar de éster de
biotinamidocaproil-N-hidroxisuccinimida
al péptido completamente protegido mientras permanecía en la resina.
El complejo péptido-resina se lavó con NMP y se
repitió el acoplamiento. El acoplamiento se realizó con agitación
con vórtice de los reactivos en el sintetizador de péptidos
automático en 10 ml de NMP durante 24 horas.
El péptido después se escindió de la resina como
en el Ejemplo 1 y los grupos protectores restantes se retiraron por
agitación del péptido protegido con ácido trifluoroacético al 92,5%,
etanoditiol al 5%, agua al 2,5% durante 6 horas a temperatura
ambiente. Después se filtró el péptido de la resina y se precipitó
con éter frío. El péptido precipitado se filtró y se lavó con
éter.
El péptido en bruto se analizó para su pureza
usando cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa en
una columna C18 de 4,6 mm x 25 cm usando un caudal de 1 ml/min
empleando TFA acuoso al 0,1% como "disolvente A" y TFA al 0,1%
en acetonitrilo como "disolvente B". El gradiente del
disolvente empleado para este análisis peptídico comenzó con
disolvente B al 20%. Se usó un gradiente lineal del 1%/min hasta
disolvente B al 70% para eluir el péptido seguido de 10 minutos de
disolvente B al 100% para lavar la columna. La presencia del péptido
en el efluente se controló simultáneamente a 230 nm y 260 nm.
Se realizó cromatografía líquida de alta
resolución en fase inversa a escala preparativa de un modo similar
usando una columna C18 de 41,4 mm x 25 cm, usando el sistema
disolvente descrito anteriormente. Las fracciones peptídicas se
recogieron según eluían y se liofilizaron hasta sequedad antes de
recoger los datos de espectro de masas.
El enlace disulfuro intramolecular entre la
lisina localizada en la posición 12 y la tirosina localizada en la
posición 18 se formó agitando el péptido purificado en
dimetilsulfóxido al 20%, tampón tris® 100 mM al 80% pH 6,0 a una
concentración de 1 mg/ml o menos. Se usó cromatografía líquida de
alta resolución en fase inversa analítica para controlar el grado de
la reacción. Cuando se completó la oxidación (aproximadamente 24
horas) se purificó el péptido por cromatografía líquida de alta
resolución en fase inversa de escala preparativa como se ha descrito
anteriormente. Los datos del espectro de masas del producto acabado
confirmaron el producto correcto con un peso molecular de
2504,9.
La síntesis de SECUENCIA ID. Nº 13 procedió
esencialmente del mismo modo que el descrito en el Ejemplo 9. Sin
embargo,
N-\alpha-(FMOC)-N-\varepsilon-(biotin-amidocaproil)-Lys
reemplazó
N-\alpha-(FMOC)-N-\varepsilon-(tBoc)-Lys
en la posición N-terminal de la secuencia. El
derivado de lisina biotinilada se acopló doblemente a 1 equivalente
molar de sitios reactivos. Adicionalmente, el extremo a
amino-terminal no se biotiniló en este péptido.
Las etapas restantes; escisión, purificación del
producto en bruto por cromatografía líquida de alta resolución en
fase inversa, oxidación, y re-purificación por HPLC,
fueron iguales.
La síntesis de SECUENCIA ID. Nº 14 procedió
esencialmente del mismo modo que el descrito en el Ejemplo 9. Sin
embargo,
N-\alpha-(FMOC)-N-\varepsilon-(FMOC)-Lys
reemplazó
N-\alpha-(FMOC)-N-\varepsilon-(tBoc)-Lys
en la posición N-terminal de la secuencia.
Adicionalmente, la biotinilación de las posiciones alfa y épsilon de
la lisina N-terminal sucedió simultáneamente con la
adición de 2 equivalentes molares de
biotinamidocaproil-N-hidroxisuccinimida
al péptido como se ha descrito anteriormente. El acoplamiento se
repitió con otros 2 equivalentes molares de reactivo biotina.
Las etapas restantes; escisión, purificación del
producto en bruto por cromatografía líquida de alta resolución en
fase inversa, oxidación, y re-purificación por HPLC,
fueron las mismas.
Los péptidos biotinilados en sitio específico
sintetizados en los Ejemplos 9-11 se compararon con
péptidos representativos de los obtenidos por biotinilación en fase
de solución. Se sintetizaron SECUENCIA ID. Nº 15, SECUENCIA ID. Nº
16 y SECUENCIA ID. Nº 17 usando química de FMOC convencional usando
restos de lisina biotinilados para marcar el péptido en las
posiciones 12, 14 ó 12 y 14.
Se usó un inmunoensayo enzimático de
micropartículas para VIH-1 y VIH-2,
para comparar los péptidos biotinilados en sitios específicos con
los representativos de péptidos biotinilados en solución. Los
ensayos se procesaron en un analizador AxSYM® que es un sistema
automático disponible en el mercado de Abbott Laboratories (Abbott
Park, IL). El analizador AxSYM® combinó muestras de suero humano con
micropartículas recubiertas con proteínas recombinantes de
VIH-1 y VIH-2 (reactivo de captura).
Por tanto, los anticuerpos
anti-VIH-1 y
anti-VIH-2 presentes en la muestra
de ensayo se unieron a la fase sólida. Los complejos de reactivo de
captura/anticuerpo después se hicieron contactar y se incubaron con
el conjugado de péptido biotinilado en solución o el conjugado de
péptido biotinilado en un sitio específico para formar complejos de
reactivo de captura/anticuerpo/conjugado de péptido. Para detectar
cualquier complejo, después se incubó anticuerpo de conejo
anti-biotina conjugado con fosfatasa alcalina, con
los complejos de captura/anticuerpo/conjugado de péptido. Después de
un lavado, se añadió
4-metilumbeliferil-fosfato. La
velocidad de aparición de un sustrato desfosforilado fluorescente
se correlacionó con la detección de anticuerpos contra VIH. El
reactivo de captura, el conjugado fosfatasa alcalina, y el sustrato
4-metilumbeliferil-fosfato están
disponibles en el mercado de Abbott Laboratories. Se muestran los
datos de los diversos ensayos en la Tabla 2 a continuación. Como se
muestra por la Tabla 2, los conjugados de péptido biotinilado en
sitios específicos (SECUENCIA ID. Nº 12, SECUENCIA ID. Nº 13 y
SECUENCIA ID. Nº 14) dieron resultados superiores en comparación con
conjugados peptídicos representativos de los obtenidos a través de
biotinilación en solución de un péptido similar que tiene un resto
de aminoácido distinto en la posición 18 (SECUENCIA ID. Nº 15,
SECUENCIA ID. Nº 16 y SECUENCIA ID. Nº 17).
| Muestra | Sec. ID. | Sec. ID. | Sec. ID. | Sec. ID. | Sec. ID. | Sec. ID. |
| Nº | Nº 12 | Nº 13 | Nº 14 | Nº 15 | Nº 16 | Nº 17 |
| 1 | 42,21 | 42,11 | 88,57 | 21,53 | 22,45 | 18,12 |
| 2 | 35,76 | 38,10 | 71,10 | 14,83 | 12,40 | 11,73 |
| 3 | 12,20 | 16,36 | 21,88 | 13,63 | 12,37 | 14,55 |
| 4 | 148,29 | 177,72 | 94,63 | 15,51 | 11,47 | 10,98 |
Como demuestran los datos anteriores, los
péptidos de VIH biotinilados descritos y preparados como se ha
descrito anteriormente dieron resultados superiores en la detección
de anticuerpos anti-VIH en comparación con el uso de
un péptido biotinilado preparado usando el procedimiento de
biotinilación en solución.
Aunque la invención se ha descrito con detalle y
con referencia a realizaciones específicas, será evidente para un
especialista en la técnica que pueden hacerse diversos cambios y
modificaciones a dichas realizaciones sin alejarse del alcance de la
invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: David J. Daghfal
\hskip3.9cmTracey L. Colpitts
\hskip3.9cmBarbara T. Merchant
\hskip3.9cmChi D. Chang
\hskip3.9cmIsaac S. Y. Sze
\hskip3.9cmKeeve D. Jaffe
\hskip3.9cmDominique Bridon
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CONJUGADOS HAPTENO-PÉPTIDO MEJORADOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: ABBOTT LABORATORIES D377/AP6D
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 100 ABBOTT PARK ROAD
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ABBOTT PARK
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: IL
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 60064-3500
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Macintosh
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Sistema:7.0.1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Microsoft Word 5.1a
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: POREMBSKI, PRISCILLA E.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.207
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/RESGUARDO: 5766.US.01
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELEFÓNO: 708-937-6365
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 708-938-2623
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Ser Gly Lys Leu Ile}
\sac{Cys Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Tyr Leu Lys Asp Gln Ala Gln Leu Asn Ser
Trp Gly Cys Ala Phe}
\sac{Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro
Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp
Gln Gln Leu Leu Gly}
\sac{Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Gln Asp Gln Gln Leu Leu Ser Ile Trp Gly
Cys Lys Gly Lys Leu}
\sac{Ile Cys Tyr Thr}
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Lys Gly Lys Leu Ile}
\sac{Cys Tyr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Épsilon-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Ser Gly Lys Leu Ile}
\sac{Cys Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Alfa-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Ser Gly Lys Leu Ile}
\sac{Cys Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Épsilon-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Tyr Leu Lys Asp Gln Ala Gln Leu Asn Ser
Trp Gly Cys Ala Phe}
\sac{Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro
Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Alfa-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Tyr Leu Lys Asp Gln Ala Gln Leu Asn Ser
Trp Gly Cys Ala Phe}
\sac{Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro
Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Alfa-Biotin-Amidocaproil-Arginina"
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:
10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp
Gln Gln Leu Leu Gly}
\sac{Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Alfa-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Asp Gln Gln Leu Leu Ser Ile Trp Gly
Cys Lys Gly Lys Leu}
\sac{Ile Cys Tyr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Alfa-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Lys Gly Lys Leu Ile}
\sac{Cys Tyr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Épsilon-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Lys Gly Lys Leu Ile}
\sac{Cys Tyr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Alfa-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Lys Gly Lys Leu Ile}
\sac{Cys Tyr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Épsilon-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Xaa Gly Lys Leu Ile}
\sac{Cys Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 14
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Épsilon-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Lys Gly Xaa Leu Ile}
\sac{Cys Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Épsilon-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Modificado en sitios
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 14
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador-Xaa
\hskip6.5cm/nota = "Xaa = N Épsilon-Biotin-Amidocaproil-Lisina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Xaa Gly Xaa Leu Ile}
\sac{Cys Thr Thr}
Claims (6)
1. Un inmunoensayo diseñado para detectar la
presencia de anticuerpos anti-VIH-1
o anti-VIH-2 en una muestra de
ensayo, comprendiendo dicho ensayo las etapas de:
(i) poner en contacto dicha muestra de ensayo con
un reactivo de captura para formar complejos de reactivo de
captura/anticuerpo anti-VIH-1 o
anti-VIH-2;
(ii) poner en contacto dichos complejos de
reactivo de captura/anticuerpo
anti-VIH-1 o
anti-VIH-2 con al menos un conjugado
hapteno-péptido para formar complejos de reactivo de
captura/anticuerpo anti-VIH-1 o
anti-VIH-2/conjugado
hapteno-péptido;
(iii) poner en contacto dichos complejos de
reactivo de captura/anticuerpo
anti-VIH-1 o
anti-VIH-2/conjugado
hapteno-péptido con un reactivo indicador para
formar complejos de reactivo de captura/anticuerpo
anti-VIH-1 o
anti-VIH-2/conjugado
hapteno-péptido/reactivo indicador; y
(iv) detectar una señal generada por dicho
reactivo indicador como un indicio de la presencia de dicho
anticuerpo anti-VIH-1 o
anti-VIH-2 en dicha muestra de
ensayo;
caracterizado en que dicho péptido en
dicho conjugado hapteno-péptido se selecciona entre
el grupo compuesto por las siguientes secuencias:
Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr
(SEC. ID. Nº: 1);
Lys-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Ala-Gln-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp
(SEC. ID. Nº: 2);
Arg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-
Cys-Thr-Thr (SEC. ID. Nº: 3);
Cys-Thr-Thr (SEC. ID. Nº: 3);
Lys-Gln-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Ser-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr
(SEC. ID. Nº: 4); y
Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr
(SEC. ID. Nº: 5);
y dicho hapteno es al menos un hapteno localizado
en la posición \alpha y/o la posición \varepsilon
N-terminal.
2. El inmunoensayo de la reivindicación 1, en el
que dicho hapteno comprende biotina.
3. Una composición útil para detectar anticuerpos
anti-VIH-1 o
anti-VIH-2, en la que dicha
composición comprende una secuencia peptídica con hapteno
sustancialmente pura caracterizada en que dicho péptido se
seleccione entre el grupo compuesto por los siguientes péptidos:
Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr
(SEC. ID. Nº: 1);
Lys-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Ala-Gln-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp
(SEC. ID. Nº: 2);
Arg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-
Cys-Thr-Thr (SEC. ID. Nº: 3);
Cys-Thr-Thr (SEC. ID. Nº: 3);
Lys-Gln-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Ser-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr
(SEC. ID. Nº: 4); y
Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr
(SEC. ID. Nº: 5);
y dicho hapteno es al menos un hapteno localizado
en la posición \alpha y/o la posición \varepsilon
N-terminal.
4. La composición de la reivindicación 3, en la
que dicho hapteno comprende biotina.
5. Un kit de ensayo útil para determinar la
presencia de un analito anticuerpo
anti-VIH-1 o
anti-VIH-2 en una muestra de ensayo,
comprendiendo dicho kit un recipiente que contiene una secuencia
peptídica con hapteno sustancialmente pura caracterizada en
que dicho péptido se selecciona entre el grupo compuesto por los
siguientes péptidos:
Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Thr-Thr
(SEC. ID. Nº: 1);
Lys-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Ala-Gln-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp
(SEC. ID. Nº: 2);
Arg-Ile-Leu-Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-
Cys-Thr-Thr (SEC. ID. Nº: 3);
Cys-Thr-Thr (SEC. ID. Nº: 3);
Lys-Gln-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Ser-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr
(SEC. ID. Nº: 4); y
Lys-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys-Tyr-Thr
(SEC. ID. Nº: 5);
y dicho hapteno es al menos un hapteno localizado
en la posición \alpha y/o la posición \varepsilon
N-terminal.
6. El kit de la reivindicación 5, en el que dicho
hapteno comprende biotina.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US486657 | 1990-03-01 | ||
| US48665795A | 1995-06-07 | 1995-06-07 |
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-
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