ES2123558T5 - Antigenos peptidicos del vhc y procedimiento para la determinacion del vhc. - Google Patents

Antigenos peptidicos del vhc y procedimiento para la determinacion del vhc.

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ES2123558T5 ES92913343T ES92913343T ES2123558T5 ES 2123558 T5 ES2123558 T5 ES 2123558T5 ES 92913343 T ES92913343 T ES 92913343T ES 92913343 T ES92913343 T ES 92913343T ES 2123558 T5 ES2123558 T5 ES 2123558T5
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Abstract

SE DESCRIBEN NUEVOS ANTIGENOS DEL PEPTIDO HCV, QUE REPRESENTAN SECUENCIAS PARCIALES DEL C-100-3 Y EL ENV/CORE, CON LA ZONA C. ESTOS ANTIGENOS DE PEPTIDO SON ADECUADOS PARA LA DETERMINACION DE ANTICUERPOS HCV, COMO INMUNOGENES PARA LA OBTENCION DE ANTICUERPOS CONTRA HCV, Y COMO VACUNAS PARA LA OBTENCION DE SUSTANCIAS INYECTABLES CONTRA EL HCV.

Description

Antígenos peptídicos del VHC y procedimiento para la determinación del VHC.
La invención se refiere a nuevos antígenos peptídicos del HCV, a un procedimiento para la producción de estos antígenos peptídicos así como a un procedimiento para la determinación de HCV con empleo de los antígenos peptídicos.
La presencia del virus de la hepatitis en ausencia de marcador serológico de los agentes hepatótropos conocidos hasta la fecha (por ejemplo virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis A, virus de la citomegalia y virus de Epstein-Barr) se designa como hepatitis no-A, no-B (hepatitis NANB). La hepatitis NANB se subdivide a su vez en hepatitis no-A, no-B de transmisión parenteral y esporádica y hepatitis no-A, no-B de transmisión enteral. De la hepatitis NANB de transmisión parenteral y esporádica se aisló recientemente el agente causante, el virus de la hepatitis C (VHC) (Choo Q.-L. et al., Science 244 (1989) 359-362 y Kuo, G. et al., Science 244 (1989) 362-364).
El VHC es un importante agente etiológico universal de la hepatitis NANB y se transmite a través de la sangre o productos sanguíneos contaminados, transfusiones de sangre o mediante contacto personal íntimo.
La secuencia aminoácida de la proteína del virus VHC es conocida por los documentos EP-A 0 318 216,
EP-A 0 363 025, EPA 388 232 y EP-A 0 396 748. El genoma del VHC tiene una longitud de 10.862 nucleótidos. Las proteínas originadas por la traducción poseen una longitud total de aproximadamente 3.000 aminoácidos. Las proteínas se pueden dividir en proteínas estructurales (proteínas de la cubierta y del núcleo) y proteínas no estructurales (NS-NS5).
La determinación del VHC se efectúa convenientemente identificando anticuerpos contra el VHC de los fluídos fisiológicos mediante ensayos inmunológicos. Por eso, para tales ensayos inmunológicos son necesarios partícipes de la unión para anticuerpos anti-VHC.
Así, en ensayos inmunológicos es conocido el empleo, por ejemplo, de la proteína no estructural C 100-3 del VHC como partícipe de la unión (ensayos de ABBOTT LABORATORIES, USA y ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC., USA; Science 244 (1989) 359-364; Van der Poel C.L. et al., Lancet 337 (1991) 317; Alter H.J., J. Gastroent. Hepatol. (suplemento) 1990, 78).
De estos ensayos, es desventajoso que se use como antígeno una proteína recombinante. Las proteínas, a causa de su propensión a la desnaturalización y, con ello, solubilidad y función disminuídas son difíciles de manipular en ensayos de diagnóstico. También la magnitud de la señal de medida, a causa de la baja densidad de epítopos sobre una proteína, es más pequeña que en un ensayo en el que se usa como partícipe de la unión del anticuerpo un antígeno peptídico de cadena corta. Además, con el uso de proteínas o péptidos de cadena larga como antígeno en un ensayo inmunológico, pueden presentarse multiplicadas las reactividades cruzadas y uniones inespecíficas de anticuerpos. Además, las reacciones con proteínas son a menudo de control difusional, lo que se opone a los cortos tiempos deseados para los ensayos inmunológicos. Además, la producción de proteínas utilizables en diagnóstico en cantidad y calidad suficiente exige mucho tiempo y grandes costes. Los péptidos son fácilmente asequibles mediante síntesis y son moléculas definidas.
Como consecuencia de ello, en un ensayo inmunológico sobre anticuerpos anti-VHC es ventajoso usar antígenos peptídicos de cadena lo más corta posible, que constituyan solamente cortes de la proteína total. Un procedimiento inmunológico de este tipo está descrito por Okamoto (Japan J. Exp. Met. 60 (1990) 223-234). Se ha demostrado, sin embargo, que el antígeno peptídico de cadena corta allí descrito (secuencia 9), el cual procede de la región core, no es suficientemente sensible para el VHC.
El documento EP-A-0 468 527 describe antígenos peptídicos del VHC de las regiones env y NS. El péptido posee una longitud de 22 a 121 aminoácidos.
El documento EP-A-0 442 394 describe antígenos peptídicos cortos del VHC, de la región NS4. No se manifiestan los péptidos conforme a la invención conforme a la SEQ ID NO: 1-10 ni a la SEQ ID NO: 11 ni a secuencias parciales de ellos.
El documento EP-A-0 445 801 describe asimismo antígenos peptídicos cortos del VHC que no poseen una homología con ninguno de los antígenos peptídicos conforme a la invención conforme a la SEQ ID NO: 1-32.
El documento EP-A-0 464 287 describe la secuencia nucleotídica del VHC de los pB 333 a 9362, así como la secuencia aminoácida derivada de ella. No se manifiestan secuencias parciales preferidas cortas correspondientes a los protocolos de secuenciación SEQ ID NO: 1-11 de la presente solicitud.
El documento EP-A-0 484 787 describe antígenos peptídicos cortos de la región NS4 del VHC. No se manifiestan los antígenos peptídicos del VHC correspondientes a los protocolos de secuenciación SEQ ID NO: 1-11 y secuencias parciales de la SEQ ID NO: 11.
El documento EP-A-0 489 968 describe peptídos de la región NS4 del VHC. Ninguno de los péptidos corresponde a los péptidos conforme a la invención de las SEQ ID NO: 1-11 o secuencias parciales de la SEQ ID NO: 11.
El cometido de la presente invención es, por eso, preparar antígenos peptídicos que sean específicos de anticuerpos anti-VHC y que sean adecuados para ensayos inmunológicos sobre anticuerpos anti-VHC.
El cometido se soluciona mediante antígenos peptídicos del VHC con las secuencias aminoácidas correspondientes a los protocolos de secuenciación SEQ ID NO: 1-10. El cometido se soluciona, además, mediante el antígeno peptídico del VHC con la secuencia aminoácida correspondiente al protocolo de secuenciación SEQ ID NO: 11 o secuencias parciales de él, con una longitud de por lo menos 4 aminoácidos.
Son adecuados los antígenos peptídicos de secuencias:
1:
SerGlyLysProAlaIleIleProAspArgGluVaILeuTyrArgGluPheAsp
2:
GluCysSerGlnHisLeuProTyrIleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThr- AlaSerArgGln
3:
AlaValGlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsn
4:
AsnProLysProGlnLysLysAsnLysArgAsnThrAsnArgArg
5:
AsnProLysProGlnArgLysThrLysArgAsnThrAsnArgArg
6:
ProGlnAspValLysPheProGlyGlyGlyGlnIleValGlyGlyVal
7:
ProArgGlySerArgProSerTrpGlyProThrAspProArgArg
8:
GlnLeuPheThrPheSerProArgArgHisTrpThrThrGlnGlyCysAsnCysSerIleTyrProGlyHisIleThrGlyHisArgMet- AlaTrpAspMetMetMetAsnTrpSerProThrThrAlaLeuValMetAla
10:
GlnLysLysAlaAlaArgAsnThrAsnArgArg
11:
HisTrpThrThrGlnGlySerAsnSerSerIleTyrProGlyHis
12:
SerSerIleTyrProGlyHisIleThrGlyHisArgMetAlaTrpAspMetMet
13:
ProGluGlyArgThrTrpAlaGlnProGlyTyrProTrpProLeuTyr
o antígenos peptídicos que constituyen secuencias parciales de estos antígenos peptídicos, de al menos cuatro aminoácidos de longitud, preferiblemente de al menos siete.
Son secuencias parciales adecuadas las representadas en los protocolos de secuenciación y designadas con combinaciones letra/número (por ejemplo, 6 a, 2 b).
Son secuencias parciales preferidas especialmente:
De la secuencia 2:
GluCysSerGlnHisLeuProTyrIleGluGlnGlyMetMetLeu
(secuencia 2a)
MetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAla
(secuencia 2b)
MetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGln
(secuencia 2c)
HisLeuProTyrIleGlu (secuencia 2d)
Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln (secuencia 2e)
Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln (secuencia 2f)
Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr (secuencia 2g)
De la secuencia 4:
Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg (secuencia 4a)
De la secuencia 6:
Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile (secuencia 6a)
Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Phe (secuencia 6b)
Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val (secuencia 6d)
Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly (secuencia 6e)
Son preferidas especialmente secuencias parciales cuya longitud es de un máximo de 9 aminoácidos. Estas son especialmente las secuencias 6b, 6d, 6e, 2e, 2f, 2d, 2g, 4a.
Los antígenos peptídicos con las secuencias 1-3 (correspondientes a las SEQ ID NO: 1-11), están contenidas en la región C 100-3 de la proteína del VHC y los antígenos peptídicos con las secuencias 4-8, 10-13 en la región env/core de la proteína del VHC. Los antígenos peptídicos conforme a la invención con las secuencias 1-8, 10-13 y el antígeno peptídico de la secuencia 9 (ArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSerGluArgSerGlnProArgGlyArgArgGlnProIleProLysAlaArgArgProGluGlyArgThrTrpAlaGlnProGlyTyrProTrpPro, Okamoto loc. cit) están descritos mediante los protocolos de secuenciación SEQ ID NO: 1-32.
El desarrollo de la identificación de un anticuerpo anti-VHC se efectúa según métodos corrientes para el especialista. Por eso, otro objeto de la invención es un procedimiento para la determinación de anticuerpos del VHC, el cual se caracteriza porque la muestra, con una combinación de al menos dos antígenos peptídicos del grupo de secuencias con los SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 15, 16, 22, 23, 25, 29-32 o antígenos peptídicos que constituyen secuencias parciales de estos antígenos peptídicos de al menos cuatro aminoácidos de longitud, preferiblemente de al menos 7, eligiéndose respectivamente por lo menos un antígeno peptídico del grupo de secuencias con los SEQ ID NO: 1, 2, 11, se incuba, y bajo condiciones que hacen posible la formación de un complejo anticuerpo-antígeno se determina la cantidad de anticuerpo anti-VHC que se une al antígeno peptídico.
Conforme a la invención, se usa una combinación de al menos dos de los antígenos peptídicos conforme a la invención o secuencias parciales de ellos. Es preferido especialmente combinar los antígenos peptídicos de las secuencias 1-3 (SEQ ID NO: 1-11) de ellos con al menos un antígeno peptídico del grupo de las secuencias 4-13 (SEQ ID NO: 12-32) o secuencias parciales de ellos.
Son secuencias parciales adecuadas de la secuencia 9:
ArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSerGlnArgSerGlnProArgGly
(secuencia 9a)
SerGlnProArgGlyArgArgGlnProIleProLysAlaArgArgProGluGlyArgThr
(secuencia 9b)
Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr
(secuencia 9c)
La combinación de los antígenos se puede efectuar, por ejemplo, usando varios antígenos peptídicos individuales o uniendo entre sí covalentemente antígenos peptídicos, convenientemente a través de un puente de aminoácidos, que se diferencia de las secuencias de aminoácidos que se presentan de forma natural en las proteínas del VHC o de un péptido ligador.
Son preferidas especialmente las combinaciones de antígenos:
Secuencia 2b, 4 y 6
Secuencia 2b, 2c, 4 y 6
Secuencia 2a, 2b, 2c, 4 y 6
Secuencia 2a, 2b, 2c, 4, 6, 9a y 9b
Secuencia 2a, 2b, 4, 6, 9a y 3
Secuencia 2a, 2b, 4, 6 y 9a
Secuencia 2e, 2g, 4a, 6d, 6e
Secuencia 2d, 2f, 4a, 6c, 9c
En las combinaciones, los antígenos se usan preferiblemente en cantidades aproximadamente equimolares.
La combinación de los antígenos con las secuencias 11, 12, 8a es especialmente adecuada para el reconocimiento de sueros de pacientes los cuales están convalecientes de una infección por el VHC (sueros de reconvalecencia).
Preferiblemente, los antígenos se usan individualmente, sin unión covalente entre sí, o unidos covalentemente ente sí con empleo de un péptido ligador.
Debido a la alta sensibilidad que es necesaria en los parámetros de infección por el VHC, para la identificación se usan inmunoensayos heterogéneos. Estos ensayos heterogéneos permiten etapas de lavado que reducen considerablemente el ruido de fondo de la señal de medida, mediante lo cual aumenta la sensibilidad.
La determinación se puede efectuar, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o mediante inmunofluorescencia. Para esto, habitualmente se inmoviliza el antígeno peptídico. Se añade la muestra en la que se deben investigar los anticuerpos anti-VHC, y se determinan los anticuerpos unidos al antígeno mediante un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana marcado. La inmovilización del antígeno peptídico conforme a la invención puede ser por adsorción, covalente o mediante un apareamiento biológico como biotina/estreptavidina, anticuerpo/antígeno, o azúcar/lectina. Para esto, el antígeno peptídico se une covalentemente a estos partícipes.
Los antígenos peptídicos conforme a la invención se pueden inmovilizar para inmunoensayos preferiblemente por métodos habituales para el especialista, por ejemplo en bolos, tubitos de plástico o placas de microtitulación (preferiblemente de poliestireno o de copolímeros de poliestireno). Esto se efectúa preferiblemente adsorbiendo de forma inespecífica el antígeno peptídico en la superficie o uniéndololo covalentemente a superficies funcionalizadas o activadas. La adsorción inespecífica se puede mejorar al encadenar el antígeno peptídico con una proteína en un conjugado y emplear este conjugado para la adsorción (véase, por ejemplo, el documento EP-A 0 269 092). La unión se puede efectuar también sobre un anticuerpo inmovilizado. Para ello, el antígeno peptídico se debería modificar de tan manera que el epítopo no resultara bloqueado por la unión del anticuerpo, por ejemplo mediante la formación de un conjugado péptido proteína.
La conjugación del antígeno peptídico con el partícipe de unión se efectúa preferiblemente a través de un espaciador. Este espaciador contiene convenientemente de 10 a 50 átomos, preferiblemente de 10 a 30 y es preferida asimismo una molécula esencialmente lineal. Son ejemplos de esto espaciadores de cadenas alquilo, poliéter o poliamida. En una forma de realización especialmente preferida se une un antígeno peptídico de una longitud de 4 a 9 aminoácidos al soporte a través de un espaciador lineal de 10 a 30 átomos. En el caso en que se deba emplear un espaciador de aminoácidos, éste se compone convenientemente de aminoácidos que no correspondan a la secuencia del entorno inmediato al antígeno peptídico en el gen del VHC.
En una forma de realización especialmente preferida, el antígeno peptídico conforme a la invención se une covalentemente a biotina, efectuándose la inmovilización a través de una avidina/estreptavidina-fase sólida.
Son asimismo adecuados procedimientos de determinación en los cuales la detección se efectúa no sobre un anticuerpo marcado, sino sobre otro antígeno peptídico marcado, de las secuencias 1 a 13 o secuencias parciales de las mismas.
La preparación de los antígenos peptídicos conforme a la invención es posible por métodos para la síntesis peptídica corrientes para especialista. Por eso, otro objeto de la invención es un procedimiento para la preparación del antígeno peptídico conforme a la invención, el cual consiste en unir el aminoácido que constituye el extremo C-terminal a un soporte, incorporar por etapas el antígeno peptídico a partir del extremo C-terminal y a continuación disociarlo del soporte.
En particular, se encadena para esto un aminoácido, por ejemplo a través de su grupo carboxilo, a un polímero insoluble fácilmente filtrable y después, se sintetiza por pasos la cadena peptídica a partir del extremo C-terminal. Con este fin, un aminoácido con el N protegido se hace reaccionar con un grupo reactivo de la resina sintética. Del aminoácido anclado covalentemente a la partícula portadora se separa el grupo protector del N en \alpha y el aminoacilpolímero resultante se transforma con el siguiente aminoácido con el N protegido. Del dipéptido unido covalentemente a la resina portadora, se separa el grupo protector del N en \alpha y el aminoacilpolímero resultante se transforma con el siguiente aminoácido con el N protegido. Todos los reactivos en exceso y productos intermedios se separan mediante simple filtración. Una vez obtenida de esta forma la secuencia peptídica deseada, se disocia la unión covalente entre el aminoácido C-terminal y el grupo de anclaje del soporte polímero. El soporte insoluble se separa del péptido, que ahora se encuentra en solución, mediante simple filtración. El péptido se purifica por métodos cromatográficos.
\newpage
Los antígenos peptídicos conforme a la invención se pueden preparar, por ejemplo, según Merrifield, JACS 85 (1964) 2146. Una biotinilización, dado el caso necesaria, se puede efectuar, por ejemplo, según PNAS USA 80 (1983) 4045. Un agente de biotinilización preferido para esto es el biotinilaminocaproíl-N-hidroxisuccinimidil éster.
Un procedimiento preferido para la preparación de antígenos peptídicos biotinilizados es la introducción del resto de biotina en el extremo N-terminal durante una síntesis en fase sólida del antígeno peptídico.
Este procedimiento se emplea preferiblemente, pues, cuando el antígeno peptídico contiene varios grupos \epsilon-amino de lisina que no se deben biotinilizar. Este es especialmente el caso cuando se emplean N-\beta-Fmoc-N-\epsilon-biotinil-aminocaproíl-lisina, N-\alpha-Fmoc-N-\epsilon-biotinil-lisina o en la biotinilización de los aminoácidos N-terminales biotina, ácido biotinilamino-caproico o dimetoxitritilbiotina con un reactivo de activación como, por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida o como éster activado.
En otra forma de realización preferida, se inmoviliza un anticuerpo identificador que está dirigido, por ejemplo, contra la parte Fc de la IgG humana. Para esto, se emplea preferiblemente un anticuerpo monoclonal. El antígeno peptídico se encuentra entonces en solución. El anticuerpo a identificar (analito) y también todos los demás anticuerpos del líquido muestra se unen a los anticuerpos de las paredes. El anticuerpo unido puede entonces ligar el analito, que se puede identificar con un sistema de identificación adecuado, por ejemplo, competitivamente con un conjugado antígeno peptídico-enzima.
Con los antígenos peptídicos conforme a la invención es posible también, mediante procedimientos habituales para el especialista, preparar anticuerpos inmunizantes, con los que se puede identificar el propio virus en un ensayo inmunológico.
Por eso, otro objeto de la invención es un procedimiento para la preparación de anticuerpos, el cual se caracteriza porque se inmuniza un mamífero con un péptido conforme a la invención, el cual está unido dado el caso a un soporte, y se obtienen los anticuerpos por procedimientos conocidos, por ejemplo, del suero o del bazo.
En una forma de realización preferida, se fusionan linfocitos B de los animales inmunizados con una línea celular adecuada en presencia de agentes transformantes, se clona la línea celular que produce los anticuerpos deseados y se cultiva, y de las células o del sobrenadante del cultivo se obtienen los anticuerpos monoclonales.
Con estos anticuerpos es posible determinar directamente virus VHC. Por eso, otro objeto de la invención es un procedimiento para la determinación de virus VHC, el cual se caracteriza porque se incuba la muestra con un anticuerpo conforme a la invención bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo y se determina la cantidad de complejo anticuerpo-antígeno formado.
Otro objeto de la invención es un procedimiento para la producción de vacunas con empleo de los antígenos peptídicos conforme a la invención así como una vacuna para el tratamiento de infecciones por el VHC que contiene como inmunógeno un antígeno peptídico, dado el caso unido a un soporte, de las secuencias 1-8, 10-13 o secuencias parciales de ellas o al menos dos antígenos peptídicos de las secuencias 1-13 o secuencias parciales de ellas en una dosis farmacológicamente efectiva y en una formulación farmacéuticamente aceptable.
La preparación de estas vacunas se puede llevar a cabo por los métodos conocidos. Preferiblemente, sin embargo, los antígenos peptídicos se liofilizan primero y a continuación se suspenden, dado el caso con empleo de sustancias coadyuvantes.
La vacunación con la vacuna o combinaciones de vacunas conforme a la invención se puede efectuar por métodos corrientes para el especialista, por ejemplo por vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea e intranasal.
Para la administración intramuscular o subcutánea, la vacuna se puede suspender, por ejemplo en solución fisiológica de sodio cloruro. Para la administración intranasal o intraocular, la vacuna se puede aplicar, por ejemplo, en forma de un nebulizador o de una solución acuosa. Para la toma local, por ejemplo oral, es necesario con frecuencia proteger temporalmente el inmunógeno contra la inactivación, por ejemplo contra enzimas proteolíticas en la cavidad bucal o en el estómago. Una protección transitoria de este tipo se puede efectuar, por ejemplo, mediante encapsulación del inmunógeno. Esta encapsulación se puede efectuar, por ejemplo, mediante recubrimiento con un agente protector (microencapsulación) o con la inclusión de una pluralidad de inmunógenos conforme a la invención en un soporte protector (macroencapsulación).
El material de encapsulación puede ser semipermeable o hacerse semipermeable en la incorporación al organismo humano o animal. Habitualmente se emplea como soporte para la encapsulación una sustancia degradable biológicamente.
Los siguientes ejemplos y protocolos de secuenciación explican la invención más detalladamente.
En los protocolos de secuenciación significan:
Secuencia SEO ID NO
1 1
2 2
2 a 3
2 b 4
2 c 5
2 d 6
2 e 7
2 f 8
2 g 9
2 h 10
3 11
4 12
4 a 13
4 b 14
5 15
6 16
6 a 17
6 b 18
6 c 19
6 d 20
6 e 21
7 22
8 23
8 a 24
9 25
9 a 26
9 b 27
9 c 28
10 29
11 30
12 31
13 32
Ejemplo 1 Síntesis de H-ProArgGlySerArgProSerTrpGlyProThrAspProArgArg-OH
El péptido se obtuvo mediante síntesis de Fmoc(fluoreniloxi-carbonil)-fase sólida. Las reacciones se llevaron a cabo en un sintetizador de péptidos SP 640 de Labortec (Suiza). Las reacciones de acoplamiento se llevaron a cabo con 2,4 equivalentes de diciclohexilcarbodiimida y 2,2 equivalentes de N-hidroxibenzotriazol, referidos a los de Fmoc-(derivado de aminoácido), durante 90 minutos. Como medio de reacción se empleó dimetilformamida. El grupo Fmoc se disoció mediante 20% de piperidina en DMF en 10 y 20 minutos. Se emplearon 2,0 equivalentes de los siguientes derivados de aminoácidos: Pro, Arg (con grupo protector PMC (pentametilcromano)), Gly, Ser (con grupo protector t-butilo), Trp, Thr (con grupo protector t-butilo), Asp (con grupo protector t-butil éster). Las reacciones de acoplamiento se repitieron con la mitad de los reactivos. El resultado del acoplamiento se ensayó mediante la prueba Kaiser (Anal. Biochemistry 34(1970)595), la carga de la resina se determinó mediante absorción UV de los grupos fulveno liberados depués de cada disociación con piperidina. El péptido se sintetizó en 5 g de resina Wang (poliestireno/1% de divinilbenceno) con una carga de 0,50 mMol/g (JACS 95(1973)1328). Después de la síntesis, el grado de carga todavía era de 0,39 mMol/g.
La liberación del péptido se llevó a cabo con 200 ml de ácido trifluoracético, 200 ml de diclorometano, 10 ml de etanoditiol, 10 ml de m-cresol, 5 ml de sulfuro de etilmetilo y 5 ml de agua, en 30 minutos a temperatura ambiente. La solución de disociación se concentró varias veces con tolueno, después se precipitó el péptido con dietiléter.
Para la separación del absorbente y otras pequeñas moléculas, el material bruto se purificó sobre una columna de Sephadex G10. Después de liofilizar se obtuvieron 3,2 g de material de una pureza del 42% (RP-HPLC). Para llevar el material a la pureza final de >95% se purificaron 400 mg de péptido sobre una columna de RP-HPLC preparativa (40 mm x 250 mm), rellena con material C18 (5 micrómetros, 300 Angströms) y un gradiente agua/ácido trifluoracético, acetonitrilo/ácido trifluoracético. Después de la liofilización se obtuvieron 118 mg de material blanco del 96,5% (HPLC). La identidad del material se ensayó mediante FAB-EM.
Ejemplo 2
Para la biotinilización del antígeno peptídico del ejemplo 1 se disolvió un equivalente molar lo más concentrado posible (la solubilidad depende de la secuencia de aminoácidos) en tampón de potasio fosfato saturado con argón (0,1 mol/l, pH 8,0) y se mezcló con 3 equivalentes del D-biotinil- \epsilon -aminocaproíl-N-hidroxisuccinimidil éster disuelto en dimetilformamida saturada con argón (solución de 1 \mumol de reactivo en 5 \mul de DMF).
Se agitó la mezcla de reacción durante 2 horas a temperatura ambiente en atmósfera de argón, bajo control permanente por medio de RP-HPLC analítica. Si estaba presente <5% del aducto, se añadió directamente la mezcla de reacción a una columna de RP-HPLC preparativa y el material producto se purificó por medio de un gradiente 0,1% de ácido trifluoracético/agua a 0,1% de ácido trifluoracético/acetonitrilo (subida: del 0% al 100% en 90 minutos). El material producto se obtuvo mediante concentración y liofilización de las fracciones de producto. Los rendimientos se situaron entre el 40% y el 90%. Como analítica sirvieron: para la pureza HPLC, HPCE y TLC, para la identidad FAB-EM (pico molar) y TLC con reactivos de tinción específicos (p-dimetilaminocinamaldehído sobre biotina) y determinación de contenido sobre microanálisis (nitrógeno).
Ejemplo 3
Se determinan anticuerpos del VHC en un inmunoensayo sándwich en 2 etapas. Para la identificación se emplean los reactivos con la siguiente composición:
Reactivo 1
0,10 \mug/ml (de antígeno peptídico 1,3,4,5,6) o 0,25 \mug/ml (de antígeno peptídico 2,4,7), antígeno peptídico biotinilizado o una mezcla 1:1 de táles antígenos peptídicos
40 mmol/l de tampón fosfato, pH 7.0
0,9% en peso de NaCl
10% en volumen de suero bovino
Reactivo 2
20 mU/ml de un conjugado de anticuerpos policlonales contra inmunoglobulina humana (oveja) y peroxidasa
40 mmol/l de tampón fosfato, pH 7.0
0,05% en peso de Tween® 20
0,2% de albúmina de suero bovino
0,2% de IgG bovina
En un tubito de poliestireno recubierto con estreptavidina (obtenido según el ejemplo 1 del documento EP-A 0 344 578) se incuban 1 ml de reactivo 1 y 10 \mul de muestra, durante una hora a temperatura ambiente. A continuación se lava tres veces con agua corriente y se incuba con 1 ml de reactivo 2, durante una hora a temperatura ambiente. A continuación se lava tres veces con agua corriente. Para la reacción de identificación se añaden 1 ml de ABTS® (2,2'-azino-di-(3-etil-benzotiazolinsulfonato(6))-sal diámonica, 1,9 mmol/l, en tampón fosfato-citrato de 100 mmol/l, pH 4,4, con 3,2 mmol/l de sodio perborato). Después de 60 minutos se mide fotométricamente la extinción a 420 nm. Los resultados los muestra la tabla 1:
TABLA 1
1
Aclaraciones a la tabla 1:
-/+:
Negativo/positivo (el corte para una señal positiva en el ELISA se define como la extinción media a 420 nm más tres desviaciones estándar de un colectivo de 10 sueros de control negativos. Las muestras se midieron a una dilución de ensayo de 1:250).
El suero 1 era negativo, por el sistema de ensayo ELISA, en el ensayo de anticuerpos del VHC Ortho de ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC., pero positivo debido al cuadro clínico.
Los sueros 2-5, según el ensayo de Ortho Laboratories, los sueros 6 y 7 con el ABBOTT HCV EIA, nº catálogo 3 A53-24 de ABBOTT LABORATORIES INC, fueron identificados como positivos.
Los antígenos peptídicos 1-6 fueron biotinilizados en fase sólida con dimetoxitritil-biotina en el grupo \epsilon-amino de una lisina N-terminal introducida adicionalmente.
Las mezclas de antígenos peptídicos 1+4 y 3+6 se emplearon en una relación molar de mezcla de 1:1.
Ejemplo 4
Se ensayaron otros sueros con péptidos y mezclas de péptidos en un inmunoensayo sándwich de dos etapas sobre placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina.
El desarrollo de la determinación se efectuó con considerable analogía al ejemplo 3. Para esto se emplearon los siguientes reactivos:
Reactivo 1
50 ng de péptido (o las cantidades mencionadas en las aclaraciones a la tabla) en 100 \mul de tampón de incubación (40 mmol/l de tampón fosfato, pH 7,0, 0,9% en peso de NaCl, 10% en volumen de suero bovino.
Reactivo 2
Conjugado de anticuerpos policlonales contra inmunoglobulina humana (oveja) y peroxidasa (actividad de la peroxidasa 20 mU/ml), 40 mmol/l de tampón fosfato, pH 7.0, 0,05% en peso de Tween® 20, 0,2% de albúmina de suero bovino, 0,2% de IgG bovina.
Solución de lavado
40 mmol/l de tampón fosfato, pH 7.0, 0,9% en peso de sodio cloruro, 0,05% en peso de Tween® 20.
Reactivo de tinción
10 mg de ABTS®, 80 \mul de H_{2}0_{2} del 0,4% en 10 ml de tampón citrato-fosfato (pH 4,4, 100 mmol/l).
En cada pocillo de una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina, se ponen suero (diluído 1:10 en 50 \mul de tampón de incubación) y 100 \mul de reactivo 1. Se incuba durante una hora a temperatura ambiente y a continuación se lava cinco veces con 200 pl de solución de lavado cada vez. Se añaden 150 \mul de reactivo 2, se incuba durante una hora a temperatura ambiente y se lava tres veces con 200 pl de solución de lavado cada vez. Se añaden 150 pl de reactivo de tinción, se incuba durante una hora a temperatura ambiente y se mide fotométricamente la extinción a 420 nm.
Las tablas II, III, IV, V, VI y VII muestran los resultados.
En las tablas significan:
TABLA II
Ortho:
Magnitud relativa de la señal de medida en el ensayo de Ortho (véase ejemplo 3).
Campo en blanco:
Valor de medida más pequeño que el doble del ensayo en blanco o idéntico al ensayo en blanco (determinado con péptido biotinilizado no reactivo con anticuerpos del VHC (secuencia sin sentido)).
Círculo relleno:
Valor de medida triple del ensayo en blanco o mayor, a 50 ng de péptido por pocillo.
Círculo vacío:
Valor de medida doble del ensayo en blánco, a 50 ng de péptido por pocillo.
Cuadrado relleno:
Valor de medida triple del ensayo en blanco o mayor, a 250 ng de péptido por pocillo.
Cuadrado vacío:
Valor de medida doble del ensayo en blanco o mayor, a 250 ng de péptido por pocillo.
*:
Controles negativos.
TABLA III
Campo en blanco:
Como en la tabla II.
Círculo relleno:
Valor de medida cuádruple del ensayo en blanco o mayor, a 50 ng de péptido por pocillo.
Círculo vacío:
Valor de medida triple del ensayo en blanco o mayor, a 50 ng de péptido por pocillo.
n.t.:
Medida no efectuada.
2a, 2b, 3, 4, 6:
En lugar de un antígeno peptídico en solitario, en el reactivo 1 se empleó una mezcla de 10 ng de cada uno de los péptidos mencionados.
*:
Controles negativos.
Tabla IV
La significación de los símbolos corresponde a las indicaciones para la tabla II.
Las mezclas de péptidos contenían respectivamente 50 ng de los péptidos individuales.
Ejemplo 5
Tablas V, VI y VII
Resultados de inmunoensayos análogos al ejemplo 3, en los que en el reactivo 1 se emplearon las siguientes concentraciones de péptido:
Con el empleo de varios antígenos en combinación, las cantidades empleadas se reducen de acuerdo con el número de antígenos distintos.
\newpage
Secuencia 2a 50 \mug/ml
Secuencia 2b 50 \mug/ml
Secuencia 2d 100 \mug/ml
Secuencia 2f 100 \mug/ml
Secuencia 2h 100 \mug/ml
Secuencia 4 400 \mug/ml
Secuencia 4a 350 \mug/ml
Secuencia 4b 250 \mug/ml
Secuencia 4c 300 \mug/ml
Secuencia 6 350 \mug/ml
Secuencia 6a 350 \mug/ml
Secuencia 6b 350 \mug/ml
Secuencia 6c 250 \mug/ml
Secuencia 6d 300 \mug/ml
Secuencia 8a 900 \mug/ml
Secuencia 9a 350 \mug/ml
Secuencia 9c 350 \mug/ml
Secuencia 11 300 \mug/ml
Secuencia 12 550 \mug/ml
-/+:
Pos./Neg. (el corte para una señal positiva en el inmunoensayo, como en el ejemplo 3, se define como la extinción media a 420 nm más 2 desviaciones estándar de un colectivo de 6 sueros de control negativos. Las muestras están diluídas 1:100 con tampón de incubación).
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA II
2
TABLA III
3
TABLA IV
4
TABLA V
5
TABLA VI
6
TABLA VII
7
SEQ ID NO: 1
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18 aminoácidos
\sa{Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg}
\sac{Glu Phe Asp}
SEQ ID NO: 2
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33 aminoácidos
\sa{Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met Leu}
\sac{Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala}
\sac{Ser Arg Gln}
SEQ ID NO: 3
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 15 aminoácidos
\sa{Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met Leu}
SEQ ID NO: 4
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18 aminoácidos
\sa{Met Met Leu Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu}
\sac{Gln Thr Ala}
SEQ ID NO: 5
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 21 aminoácidos
\sa{Met Met Leu Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu}
\sac{Gln Thr Ala Ser Arg Gln}
SEQ ID NO: 6
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 6 aminoácidos
\sa{His Leu Pro Tyr Ile Glu}
SEQ ID NO: 7
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 9 aminoácidos
\sa{Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln}
SEQ ID NO: 8
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 7 aminoácidos
\sa{Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln}
SEQ ID NO: 9
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 9 aminoácidos
\sa{Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr}
SEQ ID NO: 10
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 10 aminoácidos
\sa{Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala}
SEQ ID NO: 11
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 19 aminoácidos
\sa{Ala Val Gln Thr Asn Trp Gln Lys Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys}
\sac{His Met Trp Asn}
SEQ ID NO: 12
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 15 aminoácidos
\sa{Asn Pro Lys Pro Gln Lys Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg}
SEQ ID NO: 13
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 9 aminoácidos
\sa{Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg}
SEQ ID NO: 14
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 10 aminoácidos
\sa{Gln Lys Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg}
SEQ ID NO: 15
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 15 aminoácidos
\sa{Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg}
SEQ ID NO: 16
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 16 aminoácidos
\sa{Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly}
\sac{Val}
SEQ ID NO: 17
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 12 aminoácidos
\sa{Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile}
SEQ ID NO: 18
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 9 aminoácidos
\sa{Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Phe}
SEQ ID NO: 19
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 12 aminoácidos
\sa{Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val}
SEQ ID NO: 20
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 9 aminoácidos
\sa{Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val}
SEQ ID NO: 21
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 9 aminoácidos
\sa{Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly}
SEQ ID NO: 22
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 15 aminoácidos
\sa{Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg}
SEQ ID NO: 23
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 47 aminoácidos
\sa{Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Gly}
\sac{Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met}
\sac{Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val}
\sac{Met Ala}
SEQ ID NO: 24
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18 aminoácidos
\sa{Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu}
\sac{Val Met Ala}
SEQ ID NO: 25
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 45 aminoácidos
\sa{Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu}
\sac{Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg}
\sac{Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro}
SEQ ID NO: 26
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 21 aminoácidos
\sa{Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu}
\sac{Arg Ser Gln Pro Arg Gly}
SEQ ID NO: 27
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20 aminoácidos
\sa{Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg}
\sac{Pro Glu Gly Arg Thr}
SEQ ID NO: 28
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 15 aminoácidos
\sa{Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr}
SEQ ID NO: 29
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 11 aminoácidos
\sa{Gln Lys Lys Ala Ala Arg Asn Thr Asn Arg Arg}
SEQ ID NO: 30
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 15 aminoácidos
\sa{His Trp Thr Thr Gln Gly Ser Asn Ser Ser Ile Tyr Pro Gly His}
SEQ ID NO: 31
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18 aminoácidos
\sa{Ser Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp}
\sac{Asp Met Met}
SEQ ID NO: 32
TIPO DE SECUENCIA: Péptido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 16 aminoácidos
\sa{Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu}
\sac{Tyr}

Claims (12)

1. Antígenos peptídicos del VHC con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1-10.
2. Antígenos peptídicos del VHC con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11 o secuencias parciales de ella con al menos 4 aminoácidos de longitud.
3. Combinación de antígenos peptídicos del VHC de
SEQ ID NO: 4, 12, 16
SEQ ID NO: 4, 5, 12 y 16
SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12 y 16
SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12, 16, 26 y 27
SEQ ID NO: 3, 4, 11, 12, 16 y 26
SEQ ID NO: 3, 4, 12, 16 y 26
SEQ ID NO: 7, 9, 13, 20, 21
SEQ ID NO: 6, 8, 13, 19, 28
4. Procedimiento para la preparación de antígenos peptídicos según las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el aminoácido que forma el extremo C-terminal se une a un soporte, se sintetiza el antígeno peptídico por etapas a partir del extremo C-terminal y a continuación se disocia del soporte.
5. Procedimiento para la determinación de anticuerpos del VHC, caracterizado porque se incuba la muestra con una combinación de al menos dos antígenos peptídicos del grupo de las SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 15, 16, 22, 23,25, 29-32 6 antígenos peptídicos que constituyen secuencias parciales de diversas de esta SEQ ID NO con al menos 4 aminoácidos de longitud, eligiéndose respectivamente al menos un antígeno peptídico del grupo de las SEQ ID NO: 1, 2, 11 y, bajo condiciones que hacen posible la formación de un complejo anticuerpo-antígeno, se determina la cantidad de anticuerpos del VHC unidos al antígeno peptídico.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque se emplea una combinación de al menos dos antígenos del VHC del grupo de las SEQ ID NO: 1-32, eligiéndose al menos un antígeno peptídico del grupo de las SEQ ID NO: 1-11.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque se emplean como combinaciones:
SEQ ID NO: 4, 12, 16
SEQ ID NO: 4, 5, 12 y 16
SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12 y 16
SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12, 16, 26 y 27
SEQ ID NO: 3, 4, 11, 12, 16 y 26
SEQ ID NO: 3, 4, 12, 16 y 26
SEQ ID NO: 7, 9, 13, 20, 21
SEQ ID NO: 6, 8, 13, 19, 28
8. Procedimiento para la producción de anticuerpos contra antígenos del VHC, caracterizado porque se inmuniza a un mamífero con un antígeno peptídico, dado el caso unido a un soporte, conforme a las reivindicaciones 1-2, se obtienen anticuerpos policlonales o se inmortalizan células de estos animales, que producen anticuerpos, en líneas celulares y de estas líneas celulares se obtienen anticuerpos monoclonales.
9. Procedimiento para determinación de virus VHC, caracterizado porque se incuba la muestra con un anticuerpo según la reivindicación 8 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo, y se determina la cantidad de complejo anticuerpo-antígeno formado.
\newpage
10. Vacuna para el tratamiento de infecciones por el VHC que contienen un antígeno peptídico, dado el caso unido a un soporte, conforme a una de las reivindicaciones 1 a 2, o al menos dos antígenos peptídicos de las SEQ ID NO: 1-32 como inmunógeno, eligiéndose al menos un antígeno peptídico de las SEQ ID NO: 1-11, en una dosis farmacológicamente efectiva y en una formulación farmacéuticamente aceptable.
11. Vacuna según la reivindicación 11, caracterizada porque como antígenos peptídicos se emplean las secuencias parciales:
SEQ ID NO: 4, 12, 16
SEQ ID NO: 4, 5, 12 y 16
SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12 y 16
SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12, 16, 26 y 27
SEQ ID NO: 3, 4, 11, 12, 16 y 26
SEQ ID NO: 3, 4, 12, 16 y 26
SEQ ID NO: 7, 9, 13, 20, 21
SEQ ID NO: 6, 8, 13, 19, 28
12. Procedimiento para la producción de vacunas con empleo de los antígenos peptídicos conforme a una de las reivindicaciones 1 a 2 6 de al menos dos de los antígenos peptídicos de SEQ ID NO: 1-32 como inmunógenos, eligiéndose al menos un antígeno peptídico de las SEQ ID NO: 1-11.
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