JPH05506462A - Ｈｃｖペプチド抗原とｈｃｖの同定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＣＶ　ペプチド抗原（５，ＨＣＶ　（７）同定ｈ′ｄ、−の発明は、新規のＨ ＣＶべ、ｆチド抗原、’ｌｌＳ　’ｅＡ　’ペプチド抗原の製造方法、並びに当 該ペプチド抗原を用いるＨＣＶの同定方法に関する。

以前から知られている肝向性の病原体（例えば、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウ ィルス、肝炎ウィルス、サイトメガロウィルス。

及びエプスタイン−パールウィルス）の血清学上のマーカーの非存在下で発生す るウィルス性肝炎は、非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢ肝炎）と命名されている。ＮＡ ＮＢ肝炎は、さらに非経口的かつ特発的に伝染する非Ａ非Ｂ型肝炎と、腸を通じ て伝染する非Ａ非Ｂ型肝炎とに分類される。非経口的かつ特発的に伝染するＮＡ ＮＢ肝炎の原因物質である、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）が最近になって分離さ れた（Ｃｈｏｏ　Ｑ、−Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　（１９８ ９）　３５９−３６２　；　Ｋｕｏ、Ｇ、　ｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４ ４　（１９８９）　３６２−３６４）。

ＨＣＶは世界的に広まったＮＡＮＢ肝炎の重大な原因である。そして、ＨＣＶは 汚染された血液や血液製剤によって、輸血や親密な個人的接触によって、伝播さ れる。

ＨＣＶのウィルス蛋白のアミノ酸配列は、Ｅｌ”ＡＯ３１８２１６、！！Ｐ−Ａ Ｏ３６３０２５、ＩＥＰ−ＡＯ３８８２３２、及びＥＰ−ＡＯ３９６７４８によ り知られている。

そのＨＣＶのゲノムは、１０８６２ヌクレオチドの長さを有している。

翻訳により現れるその蛋白は、全長が約３０００アミノ酸である。当該蛋白は、 構造蛋白（エンベロープ蛋白とコア蛋白）と非構造蛋白（ＮＳＩ−ＮＳ５）とに 分類される。

免疫学的試験を用いて体液中のＨＣＶに対する抗体を検出（７、これによりＨＣ Ｖの定量を行−うことは得策である。それ故、抗ＨＣＶ抗体に結合する相手が、 かかる免疫学的試験においで必要とされる９、例えば、非構造Ｃｌ０Ｏ−３−Ｈ ＣＶ蛋白は免疫学的試験における結合相手入して使用しうろことが知られている （アボット研究所（米国）とオルソ　グイアグノステノクシステムズ社（米国） の免疫学的試験；　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４（＋９８９）３５９−３６４　；　 Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｏｅｔ　Ｃ，Ｌ、ｅｔ　ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ　３３７（１ ９９１）３１７　、　Ａｌｔｅｒ　Ｈ，Ｊ、Ｊ、Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔ、Ｈｅｐａ ｔｏｌ、（ｓｕｐｐｌ、）２９９０、７８）。

これらの試験の欠点は、抗原とし２て組換え蛋白が用いられていることである。

蛋白は、変性によって影響を受けやすく、その結果として溶解度と機能が減退す る故に診断試験においては取扱いが容易でない。蛋白上のエピトープの密度が低 いことの結果としで、測定シグナルの強度もまた、抗体の結合相手として短鎖の ペプチド抗原を用いる試験におけるよりも小さい。これに加えて、免疫学的試験 において抗原として蛋白若し２くは長鎖のペプチドを用いる場合、抗体の交差反 応と非特異的結合が増加することがある。その−ト、蛋白との反応は（、ばしば 拡散制御され、これは、免疫学的試験を所望する短時間で達成することの障害に なる５、さらに、診断を行うのに十分な量と質の蛋白を生産するのには時間とコ ストがかかる。ペプチドは、合成することにより容易に入手が可能であり、かつ 分子が規定されでいる。っよって、可能な限り短鎖て、かつ蛋白全体の一部分の みに相当するペプチド抗原を用いることは、抗ＯＣＶ抗体に関する免疫学的試験 において有利である。このような免疫学的手法は、Ｏｋａｍｏｔ。

（こよってｔ己述され、ている（Ｊａｐａｎ　Ｊ、　ＥＸＴ）、　Ｍｅｔ、　６ ０（１９９０）２２３−２３４）。

しかしながら、当該刊行物に記述された、コア領域に由来する短鎖のペプチド抗 原（配列９）は、ＨＣＶに対して十分に感受性とはいえないことがわかってきた 。

これを受りて、本発明の目的は、抗ＨＣＶ抗体に特異的であり、かつ抗ＨＣＶ抗 体に関する免疫学的試験に好適なペプチド抗原を提供することにある。

かかる目的は、以下の配列のペプチド抗原１：５ａｒＧＪ、ｙＬｙｓＰｒｏＡｌ ａｘｌｅ工１ａＰｒｏＡｓｐＡｒｇＧコｕＶａｌＬｅ１１７′ＹｒＡｒｇＧ］− ｕＰｈ１％−ｓｐ ２：ＧＬｕＣｙｓＳ＊ｒＧｌｎＪ（ｊ、５ＬａｕＰｒｏり：ｙｒ工１ａＧ１ｕＧ ｌｎＧ１ｙ％ダｔａｔｌダｅｔＬｅｕＡｌａＧｌｕ＝Ｇ１ｎＰｈｅＬｙｓＧｌｎ ＬｙｓＡ１ａＬｅｕＧｌｙＬｅｕＬａｕＧＩｎＴｈｒＡ］、ａＳｄ’ａｒＡｒｑ Ｇｉｎ３：　入１．ａｖａ　ＩＧｌｎ’ｒｈｒＡｓｎ’ｒｒｐｃ１ｎＬｙＳＬａ ｔ、ＩＧｌｕＴｈｒＰＬｘｅＴｌ”ｐＡｌ、ａＬｙ５１（ｊ、ｓＭ■煤| ｒｐＡｓｎ ４：　ＡｓｎＰｒｏＬｙｓＰｒｏＧｌｎＬｙｓＬｙｓＡｓｎＬｙｓＡｒｇＡｓｎ ＴｈｒＡｓｎＡｒｇＡｒｇｓ：　Ａ５ｎＪ）ｒＯＬｙ５Ｐ１：’０Ｇ１ｎＡｒＣ ７ＬｙＳＴｈｒＬＹＳＡｒｑＡＳｎＴｈｒＡＳｎΔｒ９八ｒｇ６：ＰｒｏＧｌｎ ＡｓｐＶａｉＬｙｓＰｈａＰｒｏＧｌ、ｙＧｌｙＧｌｙＧｉｎ工１ｓＶａ１．Ｇ １ｙＧ１ｙＶａ１７：　Ｐｒ０ＡｒｑＧｌｙＳｅｒＡｒｑＰｒＯ５ａｒＴｒｐＧ ｌｙＰｒＯＴｈｒＡ、、５ｐＰｒＯＡｒｑＡｒｑ１３：　ＧｌｎＬａｕＰｈｅＴ ｈｒＰｈａＳｅｒＰｒｏＡｒｑＡｒｇＨｊ−ｓＴｒｐＴｈｒ’ｒｌｔｒＧｌｎＧ １ｙＣｙｓ−ＡＳｎＣＹ　３　Ｓ　ｅＴ：工１ｅＴｙｒＰｒｏｃ１．ｙＨｉ、Ｓ 工１．５ＴｈｒＧ　ＩＹ’ＲｉｓＡ、、ｒＣ７ＭｅｆＪ’−１ａＴｒｐＡ刀@ｐ 　・ Ｍ＊ｔＭｅｔＭｅｔ、Ａｓｎり？ｒｐＳａｒＰｒｏｌ〒ｈｒ’ｒｉｉ−ｒ、Ａコ ａＬａｕＶａ、ＬＭａｔＡｌａｌｏ：　ＧｌｎＬｙｓＬｙｓＡ、１ａＡ１．ａＡ ｒｇＡｓｒ＋ＴｈｒＡｓｎＡｒｇＡｒｇ１．１：　ＨｉｓＴｒｐＴｈ、ｒＴｂｒ ＧｌｎＧｌｙＳｓｒＡｓｎＳｅｒＳｅｒ工１ｓＴｙｒＰｒｏＧ１ｙＨｉｓ１２： 　５ｅｒＳ＠ｒ工ＬｅＴｙｒＰｒｏＧ］、ｙＨｃ、ｌ：コｅＴｈｒＧ１ｙＨｉｓ ＡｒｇＭｅセＡｌｓでｒ７Ｔｈｒ−１３：ＰｒｏＧｌｕＧｌｙＡｒｇＴｈｒ’Ｔ ｒｐＡ１ａＧｌｎＰｒｏＧｌｙＴｙｒＰｒｏＴｒｐＰｒｏ丁、５ｕＴｙｒ又は、 少なくとも・１個、好ま（２くは少なくとも７俯のアミノ酸より成るこれらのペ プチド抗原の部分配列に相当するペプチド抗原によって達成される。

好ましい部分配列は、配列表中に示されており、また文字／数字の組合せ（例え ば、６ａ、　２ｂ）によって記されている。

特に好ましい部分配列は次のものである：（配列２ａ） ＭａｔＭ＠ｔＬ＠ｕＡｌａＧｌｕＧｌｎＰｈａＬｙｓＧｌｎＬｙｓＡｌａＬａｕ ＧｌｙＬｅｕＬａｕＧｌｎＴｈｒＡｌａ（配列２ｂ） ＨｉｓＬｅｕＰｒｏＴｙｒ工１＊Ｇｌｕ（配列２ｄ） （配列２ｆ） （配列４ａ） Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　工１＠　Ｐｈａ（ 配列６ｂ） Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ（ 配列６ｅ） 最大鎖長が９アミノ酸である部分配列が特に好ましい。特に、配列６ｂ、　６ｄ 、　６ｅ、　２ｅ、　２ｆ、　２ｄ、　２ｇ、　４ａがこれに該当する。

配列１−３のペプチド抗原は、ＨＣＶ蛋白のＣ１００−３領域に含まれ、配列４ −８．１．０−１３のペプチド抗原は、ＨＣＶ蛋白のエンベロープ／コア領域に 含まれる。本発明に従う配列１−８．１０−１３のペプチドＴｒｐＡ１ａＧ１ｎ ＰｒｏＧｌｙＴｙｒＰτ０ＴｒＰＰｒｏ、　Ｏｌｃａｍｏｔｏ　前掲）のペプチ ド抗原９は配列表の配列番号１−３２中に明記されている。

抗ＨＣＶ抗体試験は、当業者に知られている方法により行われる。

これにより、本発明は、配列１−１３、若しくは長さが少なくとも４個の、好ま しくは少なくとも７個のアミノ酸より成るこれらの部分配列の群からの少なくと も２つのペプチド抗原の組合せと一緒にサンプルをインキュベートし、そしてペ プチド抗原に結合した抗ＨＣＶ抗体の量を、抗体−抗原複合体の形成を可能にす る条件において定量することを特徴とする、ＨＣＶ抗体の定量方法に関する。

本発明によれば、ペプチド抗原又は本発明に従う当該ペプチド抗原の部分配列の 少なくとも２つの組合せが用いられる。配列１−３若しくはこれらの部分配列の ペプチド抗原が、配列４−１３若しくはこれらの部分配列の群からの少なくとも １つのペプチド抗原と組み合わされるのが好ましい。

配列９の好適な部分配列は、以下のものである：Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒ ｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｙかかる抗原の組合せは、例えばいくつかの個々のペプチド抗原を用い ることにより、あるいは、好適には自然界でＨＣＶ蛋白中に存在するアミノ酸配 列とは異なるアミノ酸橋か、若しくはペプチドリンカ−を用いて、ペプチド抗原 を互いに共有結合させることによって行われる。

次の抗原の組合せは特に好ましい： 配列２ｂ、　４．及び６ 配列２ｂ、　２ｃ、　４．及び６ 配列２ａ、　２ｂ、　２ｃ、　４．及び６配列２ａ、　２ｂ、　２ｃ、　４．６ ．９ａ、及び９ｂ配列２ａ、　２ｂ、　４．６．９ａ、及び３配列２ａ、　２ｂ 、　４．６．及び９ｃ配列２ｅ、　２ｇ、　４ａ、　ａｄ、　８ｃ配列２ｄ、　 ２ｆ、　４ａ、　６ｃ、　９ｃ配列１１．１２．８ａ これらの組合せにおいては、抗原は好ましくはおよそ等モル量で用いられる。

配列１１．１２．８ａの抗原の組合せは、ＨＣＶ感染が回復しつつある患者の血 清（回復期の血清）を検出するのに特に好適である。

抗原は、互いに共有結合させずに、若しくはペプチドリンカ−を用いて一緒に結 合させずに、別個に用いることが好ましい。

感染パラメーターＨＣＶには高感度が必要であるので、検出にはへテロジニアス イムノアッセイが好適に用いられる。ヘテロジニアス試験では、バックグラウン ド信号を相当に減じ、その結果として感度を向上せしめる洗浄工程が可能である 。

定量は、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、又は蛍光 抗体法によって行うことができる。このため、通常はペプチド抗原が固定される 。抗ＨＣＶ抗体を検査するためのサンプルが加えられ、抗原に結合した抗体が、 標識された抗ヒトイムノグロブリン抗体によって定量される。本発明におけるペ プチド抗原の固定化は、吸着により、共有結合により、又はビオチン／ストレプ トアビジンや抗体／抗原、若しくは糖／レク≠ンのような生物学的結合対によっ て行われる。この方法において、ペプチド抗原は、この結合相手に共有結合で結 合される。

本発明によるペプチド抗原は好ましくは当業者に知られている方法で固定化され る。例えば、ビーズ、プラスチック管、マイクロタイタープレート（好ましくは ポリスチレン若しくはポリスチレン共重合体）に固定化される。これは、好まし くは非特異的にペプチド抗原を表面に吸着させることによって、または官能化さ れた若しくは活性化された表面にペプチド抗原を共有結合させることによって行 われる。かかる非特異的な吸着は蛋白にペプチド抗原を結合、１５　、ｔ、ｉ、 で−結合体を形成（、そｌ″ｖ−、’−、、−、、の結合体を前記吸着のために 用いる１、、Ｉ−に４：っ−７“改に；され得ろ（例ズばＥＰ、−Ａ０２６９０ ９２４参照のこと）１１、：の結へ・はまた、固定化さ旧た抗体（５−よ−）ｒ も行われ得る。、−のブ、め（ご、ペプチド抗原は一１′−１，：１・−ブがペ プチド−蛋白結合体の形成等による抗体結合によってゴ丁ｊツクされないような 方法で修飾されるべきである。

ペプチド抗原と結合相手との結合は、好ましくはスペーサーによって行われる。

このスペーサーは好ましくは、１０−５０個の原子を有するのが妥当であり、１ ０−３０個の原子を有するのが好ましい。

そして、このスペーサーはまた本質的に直線状の分子であるのが好ましい。この 例としては、アルキル鎖、ポリエーテル鎖、若しくはポリアミド鎖によって形成 されているスペーサーが挙げられる。特に好ましい具体例は、４−９アミノ酸の 長さのペプチド抗原が１Ｏ−３０原子の直線状スペーサーを介してキャリアーに 結合されているものである。仮にアミノ酸で形成されたスペーサーを用いる場合 には、そのスペーサーがＨＣＶ遺伝遺伝子へプチド抗原の近傍にある配列に対応 しないアミノ酸で構成されているのが妥当である。

適切な具体例において、本発明によるペプチド抗原はビオチンに共有゛結合され 、この場合はアビジン／ストレプトアビジン固相によって固定化が行われる。

定量方法はまた、標識抗体を介するのではなくて、標識された付加的なペプチド 抗原配列１−１３又はその部分配列を介し、て検出するのが好適である。

本発明において、ペプチド抗原は、当業者に知られているペブ千ド自成法４・用 いて製造ずろこ２・が可能て、」）ろ１１、これを受ζ−ｊマー、本発明はまｌ Ｌ−、ペプチド抗原の製造方法に関、、ｉ　７．、　Ｃの方法は５、キャリアー にＣ末端を形成するアミノ酸を結＆３〜せ、Ｃ末端から始めで段階的にベブプ゛ ド抗原を組立て、続いｒ−４＋−３・・り了−・へからペプチド抗原を解離させ る工程を含む。

この方法は詳細には、アミノ酸を例えばモのカルボキシル基を介して不溶性ポリ マー（容易にろ過できるもの）に結合させ、その後ペプチド鎖をＣ末端から始め て段階的に組立てる。この目的のためにＮ−保護アミノ酸を人造樹脂の活性基と 反応させる。Ｎα−保護基を、キャリアー粒子に共有結合で固定されたアミノ酸 から除去し、そして生成するアミノアシルポリマーを、次のＮ−保護アミノ酸と 反応させる。Ｎα−保護基をキャリアーに共有結合されたジペプチドから除去し 、生成するアミノアシルポリマーを次のＮ−保護アミノ酸と反応させる。すべて の過剰な試薬と副産物は、簡便なろ過によって除去される。この方法で所望する ペプチド配列が調製されたら、Ｃ末端アミノ酸と高分子キャリアーのアンカー基 との間の共有結合を開裂させる。かかる不溶性のキャリアーは、簡便なろ過によ って溶液中に存在するペプチドから分離される。

このペプチドは、クロマトグラフィー法により精製される。

本発明による、ペプチド抗原は、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　ＪＡＣ３８５ （１９６４）２１４６に従って調製することができる。もしもビオチン化が必要 であれば、これは例えばＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８０（１９８３）４０４５に従って 行うことができる。これについての好ましいビオチン化試薬は、ビオチニル−ア ミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。

ビオチン化されたペプチド抗原の好ましい製造方法は、ペプチド抗原の固相合成 中に、ペプチド抗原のＮ末端にビオチン残基を導入する方法である。この方法は 、ペプチド抗原がビオチン化するｆ定のない数個のε−リシンアミノ基を含む場 合に好ましく用いられる。これは、例えば、Ｎ＝α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−ビオチ ニルーアミノ力プロリルリ２・ン、Ｎ−α−ＦＩＩＩＩＯＣ−Ｎ−ε−ビオチニ ルリンンか用いられる場合か、Ｎ末端アミノ酸のビオチン化のために、ビオチン 、ビオチニル−アミノカプロン酸、又はジメトキントリチルビオチンが、例えば ジシクロヘキシカルカルボジイミドのような活性化試薬と共に用いられるか、又 は活性型エステルとして用いられる場きである。

さらに好ましい具体例では、例えばヒｉｉｇＧのＦｅ部に向けられた検出抗体が 固定される。モノクローナル抗体がこの検出抗体と（７て用いられる１、ペプチ ド抗原は、そのときは溶液中に存在する。

サンプル液中の検出すべき抗体（被分析物）と他の全ての抗体は固定化さ第１た 抗体によって結合される。結合された抗体は、その後被分析物と結合することが でき、被分析物は好適な検出系、例、尖ばベブ升ド抗原−酵素結名体による競合 的な検出系により検出され得る。

また、本発明によるベブヂ゛ｌ：抗原を用いて、当業者に知られている免疫化法 によって抗体を得ることが可能−こあり、これによりウィルス自体を免疫学的試 験で検出することができる。

か＜１，７：、本発明はまた抗体の製造方法に関する。、二の方法は、哺乳動物 を、所望によりＡ゛−ヤリ下−に結合されている本発明ペプチドで免疫化し１、 そ（７て抗体を公知の方法１−従い、例凡ば血清や膵臓から得ることにより特徴 付けられる。。

好適な具体例としては、免疫された動物のＢリンパ球をトランスフす一ミング剤 の存在下で好適な細胞系と融合し、所望の抗体を生産する細胞系をクローン化し 、培養して、モノクローナル抗体を細胞又は培養上清から単離する。

この抗体を用いれば、ＨＣ■ウィルスを直接定量することが可能である。従って 、本発明はまたＨＣＶウィルスの定量方法に関する。

この方法は、サンプルを抗原−抗体複合体の形成が許容される条件下で本発明抗 体とインキュベートし、その結果形成された抗体−抗原複合体を定量することに より特徴付けられる６、加えて本発明は、本発明ペプチド抗原を用いるワクチン の製造法に関する５、そ（、て、ＨＣＶ惑染を治療するための当該ワクチンは、 所望によりキャリアーに結合させて、配列１−８．１０−１３のペプチド抗原を 、若しくは、：れらの部分配列を、又は配列１−１３か、その部分配列の少ｔく とも２つのペプチド抗原を、薬理学士効果的な用量でかつ製薬学Ｊ−許容され得 る処方で、免疫原として含んでいる。

これらのワクチンの製造は、公知の方法（５゛よ一つで行う、−とができる。と はいえ、そのペプチド抗原は、初めに凍結乾燥を行い、その後所望に、Ｉ、り補 助物質を加〆、、″ｉ：・＠濁させる１−Ｊ−が好まｊ、い。

本発明によれば１、かかるワノ′チン、又はかかる「７クチンの組合せによるｆ 防接種は、当業者；、知ら４１でいるｔｉ法、例えば、皮肉、筋肉内、腹腔内１ ．静脈内、皮下、又は鼻腔内に行うことができる。

筋肉内又は皮下投すする場合は、ワケチ゛・・を例えば生理食塩水中に＠濁する ことができる。ｌｋｖ内や眼内に適用するためには、ワクチンを、例えばスプレ ーか水溶液の形態で用いることができる。局所、例えば経口投与をするためには 、免疫原を不活化から、例えば口腔内や胃内の蛋白分解酵素から一時的に保護す ることが往々にして必要である。この一時的な保護は、例えば免疫原をカプセル 化することにより達成され得る。このカプセル化は、例えば保護剤でコーティン グすることにより（マイクロカプセル化）、又は大量の本発明免疫原を保護キャ リアー内に包埋すること（マクロカプセル化）により行い得る。

カプセル化用の材料は、半透性か、ヒトや動物の体内に導入されたときに半透性 になるものであり得る。一般的には、生物学的に分解される物質がカプセル化の キャリアーとして用いられる。

本発明は、以下の実施例と配列表によりさらに説明される。

次に配列表を表示する： （来貢以下余白） 配列　配列番号 エコ　３２ 実施例　１ 当該ペプチドは、Ｆｍｏｃ　（フルオレニルオキシカルボニル）固相合成によっ て調製した。かかる反応は、ラボチック（Ｌａｂｏｒｔｅｃ；スイス）の５Ｐ６ ４０ペプチド合成機によって行われた。Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体に関して、カッ プリング反応は、２．４当量のジシクロへキシルカルボジイミドと２．２当量の Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールにより９０分間行った。ジメチルホルムアミ ドを反応媒体として用いた。当該Ｆｍｏｃ基は、ＤＭＦ中の２０％のピペリジン を用いて１０及び２０分間で開裂させた。２．０当量の以下のアミノ酸誘導体を 使用した：Ｐｒｏ、　Ａｒｇ（ＰＭＣ（ペンタメチルクロマン）保護基を有する ）、Ｇａｙ、　５ｅｔ（ｔ−ブチル保護基を有する）　、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ（ｔ− ブチル保護基を有する）　、Ａｓｐ（ｔ−ブチルエステル保護基を有する）。カ ップリング反応は半分の試薬を用いて繰り返した。当該カップリングの結果は、 カイザー試験（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４（１９７０）５９５ ）によって確認し、樹脂の負荷はそれぞれのピペリジン開裂の後で放出されたフ ルベン基による紫外線吸光度によって確認した。ペプチドは０、５０ｍＭｏ　ｌ ／ｇを負荷しうるワング樹脂（ポリスチレン７１％ジビニルペンゾール）　５ｇ 上で合成した（ＪＡＣ３，９５（１９７３）１３２８）。当該合成後、負荷の程 度はまだ０．３９ｍＭｏｌ／ｇであった。

２００ｍ１のトリフルオロ酢酸、２０００１１のジクロロメタン、１０ｍ１のエ タンジチオール、１０ｍ１のｍ−クレゾール、５ａ＋１のエチルメチルスルフィ ド、及び５ｍｌの水中にて室温で３０分間処理してペプチドを放出させた。この 開裂溶液は、ドルオールと一緒に数回蒸発させ、その後当該ペプチドをジエチル エーテルで沈澱させた。

スカベンジャー及び他の小分子を除去するために、その組物質をセファデックス ＧＩＯカラム上で精製した。凍結乾燥の後、３．２ｇの物質が４２％（ＲＰ−Ｈ ＰＬＣ）の純度で得られた。当該物質の最終純度を９５％より上とするために、 ４００ｍｇのペプチドを、Ｃ１８物質（５マイクロメーター、３００オングスト ローム）が充填された、調製ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（４００ｍｍ　Ｘ　２５０ｍ ｍ）で、水／トリフルオロ酢酸、アセトニトリル／トリフルオロ酢酸勾配によっ て精製した。凍結乾燥後、１１８ｍｇの９６．５％（ＨＰＬＣ）の白色物質を得 た。当該物質の同一性は、ＦＡＢ−ＭＳによって確認された。

実施例２ 実施例１で得たペプチド抗原をビオチン化するために、アルゴン飽和リン酸カリ ウム緩衝液（０，１ｍｏｌ／、　ｐＨ８，０）中に１モル当量を可能な限り濃縮 して（溶解度はアミノ酸配列に左右される）溶解した。そして、これにアルゴン 飽和ジメチルホルムアミド（５μｌのＤＭＦ中における１μｍａｔの試薬の溶液 ）中に溶解した３当量のＤ−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキ シスクシンイミドエステルを添加する。

反応混合物は、継続的に分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで監視しつつ、アルゴン雰囲気下 で２時間室温において攪拌した。５％未満の遊離体が存在したときには、反応物 を直接、調製ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに供した。

そして、当該生成物を、０．１％トリフルオロ酢酸／水から０．１％トリフルオ ロ酢酸／アセトニトリル勾配によって精製した（勾配：９０分で０％から１００ ％）。その生成物は、生成物画分を蒸発させ、かつ凍結乾燥することにより得ら れた。収率は、４０％と９０％の間であった。純度は、ＨＰＬＣ，ＨＰＣＥおよ びＴＬＣによって分析し、同一性はＦＡＢ−ＭＳ　（モルピーク）と特異的染色 試薬（ビオチンではｐ−ジメチル−アミノシンナミックアルデヒド）を用いたＴ ＬＣによって確認し、そして量は微量分析（窒素）によって検定した。

実施例３ ＨＣＶ抗体は、２段階サンドイッチイムノアッセイ法によって定量する。以下の 組成の試薬を当該試験に使用する：試薬ｌ： ０、　ｔｏ　ｕ　ｇ／ｍｌ　（ペプチド抗原１．３．４．５．６）又は０．２５ 　ｕ　ｇ／ｍｌ（ペプチド抗原２．４．７）のビオチン化ペプチド抗原、又はこ れらのペプチド抗原の１＝１混合物。

４０ｍｍｏｌ／ｌ　リン酸緩衝液ｐＨ７，００，９重量％ＮａＣ１ １０容量％　ウシ血清 試薬２： ２０ｍＵ／ｍｌ　ヒト免疫グロブリンに対するポリクローナル抗体（ヒツジ）と ペルオキシダーゼとの複合体 ４０ｍｍｏｌ／ｌ　リン酸緩衝液ｐＨ７，００，０５重量％ＴｗｅｅｎＲ２０ ０，２％　ウシ血清アルブミン ０．２％　ウシＩｇＧ １ｍ１の試薬ｌと１０μＩのサンプルを、ストレプトアビジンを被覆したポリス チレン管（ＥＰ−Ａ　０３４４５７８の実施例１に従って調製した）の中で室温 で１時間インキュベートする。引き続き、当該ポリスチレン管を、水道水で３回 洗浄し、そして１ｍｌの試薬２と室温で１時間インキュベートする。次いで、当 該ポリスチレン管を３回水道水で洗浄する。１ｍｌのＡＢＴＳ’　（３，２ｍｍ ｏｌ／ｌの過ホウ酸ナトリウムを含む１００ｍｍｏｌ／１のリン酸−クエン酸塩 緩衝液ｐｉ（４，４中に２゜２−アジノージ［３−エチル−ベンゾチアゾリンス ルフェート（６）］ジアンモニウム塩を１，９　ｍｍｏｌ／１含有）を検出反応 のために加える。４２０ｎｍにおける吸光度を６０分後に光度計で測定する。結 果を表Ｉに示す。

表１： 表■の注釈ニ ー／＋：陰性／陽性（ＥＬＩＳＡにおける陽性信号のカットオフは、１０の陰性 対照血清のグループについての４２０ｎｍにおける平均吸光度、プラス３標準偏 差として定義付けられる。サンプルは、■＝２５０の希釈で測定した　）。

血清１は、０ＲＴＨＯＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳＹＳＴＥＭＳ　［ＮＣ，ノオ／Ｉ ／７−ＨＣＶ抗体ＥＲＩＳＡテスト系による試験においては陰性であったが、臨 床所見に基づけば陽性であった。

血清２−５は、０ｒｔｈｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの試験により陽性である ことが、血清６と７は、ＡＢＢＯＴＴ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ　ＩＮｃ、の アボットＨＣＶ　ＥＩＡ（カタログ番号３Ａ５３−２４）により陽性であること が明らかにされた。

ペプチド抗原１−６は、Ｎ末端に導入された付加的リジンのε−アミノ基におい て、固相上のジメトキシトリチル−ビオチンによりビオチン化された。

ペプチド抗原混合物１＋４と３＋６は、分子混合比率１：１て用いられた。

実施例４ ストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープレート上で、２段階サンドイ ッチイムノアッセイ法によって、ペプチドまたはペプチド混合物を用いて血清を 調べた。

その定量は、概ね実施例３に類似する方法で行った。そのために以下の試薬を使 用した 試薬ｌ： １００μｌのインキュベーション緩衝液（４０ｍｍｏｌ／ｌ　リン酸緩衝液ｐＨ ７，０，０，９重量％ＮａＣ１，１０容量％　ウシ血清）中の、５０ｎｇのペプ チド（若しくは表の注釈において記述した量）。

試薬２； ヒト免疫グロブリンに対するポリクローナル抗体（ヒツジ）とペルオキシダーゼ （ペルオキシダーゼ活性２０ｍＵ／ｍｌ）との複合体、４０ｍｍｏｌ／ｌリン酸 緩衝液ｐＨ７，０，０，０５重量％ＴｗｅｅｎＲ２０，０゜２％　ウシ血清アル ブミン、０．２％　ウシＩｇＧ洗浄液・ ４０ｍｍｏｌ／Ｉ　リン酸緩衝液ｐ）１７．　Ｏｌｏ、９重Ｉ％塩化ナトリウム 、０．０５重量％ＴｗｅｅｎＲ２０ 発色試薬・ １０ｍｇ　ＡＢＴＳ　”　、　８０μｌのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４，４， １００１１１１１１０１／ｌ）１０ｍｌ中の、０．４％Ｈ２Ｏ２血清（５０μｌ のインキュベーション緩衝液で１：１０に希釈）と１００μｍの試薬ｌを、スト レプトアビジンを被覆したマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。１ 時間室温でインキュベートし、引き続いて毎回２００μｍの洗浄液で５回洗浄す る。１５０μｌの試薬２を加え、室温で１時間インキュベートして、毎回２００ μＩの洗浄液で３回洗浄する。１５０μｌの発色試薬を加え、室温で１時間イン キュベートし、４２０ｎｍにおける吸光度を光度計で測定する。

表ＩＬ　ＩＩＩ　、　！Ｖ、　Ｖ　、ＶＩ、及びＶｌｌ　ｉ：結果を示す。

これらの表における表示は以下の如くである：表ＩＩ： ０ｒｔｈｏ：オルソ試験における測定信号の相対的大きさく実施例３を参照のこ と）。

空白部：測定値がブランク値の２倍より小さいか、ブランク値と同一である（　 ＨＣＶ抗体には反応しない（ナンセンス配列）ビオチン化ペプチドで定量）。

黒丸：ウェルあたり５０ｎｇのペプチドを用いて、測定値がブランク値の３倍ま たはそれ以上である。

白丸：ウェルあたり５０ｎｇのペプチドを用いて、測定値がブランク値の２倍で ある。

黒画角：ウエルあたり２５０ｎｇのペプチドを用いて、測定値がブランク値の３ 倍またはそれ以上である。

白画角：ウエルあたり２５０ｎｇのペプチドを用いて、測定値がブランク値の２ 倍またはそれ以上である。

本：陰性対照 表ＩＩ＋　＋ 空白部二表１１と同様である。

黒丸：ウェルあたり５０ｎｇのペプチドで、測定値がブランク値の４倍またはそ れ以上である。

白丸：ウェルあたり５０ｎｇのペプチドで、測定値がブランク値の３倍またはそ れ以上である。

ｎ、　ｔ、　：計測しなかった。

２ａ、　２ｂ、　３．４．６　：単一のペプチド抗原の代わりに、表示したペプ チドの各々１０ｎｇの混合物を試薬１中において用いた。

本：陰性対照 表１■： 記号の意味は、表Ｉ＋の記載に対応する。

ペプチド混合物は、個々のペプチドを５０ｎｇ含有する。

実施例５ 表ｖ、ＶＩ、及びＶｌ＋ 実施例３に類似するイムノアッセイの結果を示す。以下のペプチド濃度を試薬ｌ において使用した： いくつかの抗原を組み合わせて用いたとき、使用量は個々の抗原の数に応じて減 らした。

配列　２ａ５０μｇ／ｍｌ 配列　２ｂ　５０　ｕ　ｇ／ｍｌ 配列　２ｄ　１００　ｕ　ｇ／ｍｌ 配列　２ｆ　１００　ｕ　ｇ／ｍｌ 配列　２ｈ　１００　ｕ　ｇ／ｍｌ 配列　４　４００　ｕ　ｇ／ｍｌ 配列　４ａ　３５０　ｕ　ｇ／ｍｌ 配列　４ｂ　２５０μｇ／ｍｌ 配列　４ｃ　３００　ａ　ｇ／ｍｌ 配列　６　３５０　ｕ　ｇ／ｍｌ 配列　６ａ　３５０１１　ｇ／ｍｌ 配列　６ｂ　３５０　ｕ　ｇ／ｍｌ 配列　６ｃ　２５０　ｕ　ｇ／ｍｌ 配列　６ｄ　３００　ａ　ｇ／ｍｌ 配列　８ａ　９００μｇ／ｍｌ 配列　９ａ　３５０　ｕ　ｇ／ｍｌ 配列　９ｃ　３５０　ｕ　ｇ／ｍｌ 配列ｌｔ　３００μｇ／ｍｌ 配列１２　５５０．［Ｚ　ｇ／ｍｌ ＋／−：陽性／陰性（実施例３におけると同様のイムノアッセイにおける陽性信 号のカットオフは、６つの陰性対照血清のグループについての４２０ｒ＋ｍにお ける平均吸光度プラス２標準偏差として定義付けられる。サンプルは、１：１０ ０の希釈で測定した　）。

表Ｉ（ （−）　陰性血清 表ＩＩ＋ 表１ｖ 〈−陰性血清 表Ｖ 表ＶＩ 表Ｖｌｌ 配列番号１ 配列の型　ペプチド 配列の長さ＝１８アミノ酸 Ｓａｒ　Ｇ１．ｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａ１．ａ　工Ｌｅ　Ｉｌａ　ＰｒＯＡｓｐ 　Ａｒｑ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ配列番号２ 配列の型：ペプチド 配列の長さ：３３アミノ酸 配列番号３ 配列の型：ペプチド 配列の長さ：１５アミノ酸 配列番号４ 配列の型：ペプチド 配列の長さ：１８アミノ酸 Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ 配列番号５ 配列の型：ペプチド 配列の長さ：２１アミノ酸 配列番号６ 配列の型：ペプチド 配列の長さ＝６アミノ酸 配列番号７ 配列の型：ペプチド 配列の長さ：９アミノ酸 配列番号８ 配列の型：ペプチド 配列の長さニアアミノ酸 配列番号９ 配列の型：ペプチド 配列の長さ＝９アミノ酸 配列番号ＩＯ 配列の型：ペプチド 配列の長さ＝ＩＯアミノ酸 配列番号１１ 配列の型：ペプチド 配列の長さ＝１９アミノ酸 配列番号１２ 配列の型：ペプチド 配列の長さ：１５アミノ酸 配列番号１３ 配列の型：ペプチド 配列の長さ：９アミノ酸 Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ配 列番号１４ 配列の型：ペプチド 配列の長さ：１０アミノ酸 配列番号１９ 配列の型：ペプチド Ａｌａ　ＴＡｌ、ｉ　Ｖａｌ　Ｍａｔ　Ａｌａ配列番号ニジ４ 配列の型　ペプチド 配列の長、さ　１）１７°−、ノ酸 〕へ ａｉｄ、　列番（号）”ン：　５ 配列の型　ペプチド 配列の長さ　・１５ア・ミ２ノ酸 配列番号２６ 配列の型　ペプチド 配列の＆さ　２１アミノ酸 配列番号２７ 配列の型：ペプチド 配列の長さ・２０アミノ酸 配列番号２８ 配列の型：ペプチド 配列の長さ、１５アーノ酸 配列番号２９ 配列の型、ペプチド 配列の長さ：１１アミノ酸 配列番号３０ 配列の型：ペプチド 配列の長さ＝１５アミノ酸 配列番号３１ 配列の型・ペプチド 配列（ロー）長さ、１８アミノ酸 配列番号３２ 配列の型　ペプチド 配列の長さ＝１６アミノ酸 要約 Ｃ−１００−３およびＣ領域を伴うエンベロー・ブ／コアの部分配列に相当する 新規のＩ（ＣＶペプチド抗原が開示される。これらのペプチド抗原は、ＨＣＶ抗 体の定量に、ＨＣＶに対する抗体を生産するための免疫原として、またはＨＣＶ に対するワクチンを製造するためのワクチンとして好適である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．配列番号：１，２，１１，１２，１５，１６，２２，２３，２９−３２で表 されるアミノ酸配列、又は鎖長が少なくとも４アミノ酸であるその部分配列を有 するＨＣＶペプチド抗原。
2. ２．最大鎖長が９アミノ酸である部分配列を有する、請求の範囲第１項記載のＨ ＣＶペプチド抗原。
3. ３．配列番号：４，１２及び１６ 配列番号：４，５，１２及び１６ 配列番号：３，４，５，１２及び１６ 配列番号：３，４，５，１２，１６，２６及び２７配列番号：３，４，１１，１ ２，１６及び２６配列番号：３，４，１２，１６及び２６配列番号：７，９，１ ３，２０及び２１配列番号：６，８，１３，１９及び２８、または配列番号：２ ５，３０及び３１ から成るＨＣＶペプチド抗原の組合せ。
4. ４．Ｃ末端を形成するアミノ酸をキャリアーに結合させ、当該Ｃ末端から開始し てペプチド抗原を段階的に合成し、続いて当該ペプチド抗原をキャリアーから開 裂させることから成る、請求の範囲第１または２項に記載されたペプチド抗原の 製造方法。
5. ５．配列番号：１，２，１１，１２，１５，１６，２２，２３，２５，２９−３ ２の群からのペプチド抗原、又は鎖長が少なくとも４アミノ酸である上記ペプチ ド抗原の部分配列に相当するペプチド抗原のうち、少なくとも２つのペプチド抗 原の組合せと共にサンプルをインキュベートし、当該ペプチド抗原に結合したＨ ＣＶ抗体の量を抗体−抗原複合体の形成が可能な条件下で定量することから成る 、ＨＣＶ抗体の定量方法。
6. ６．前記組合せが、配列番号：１，２，１１，１２，１５，１６，２２，２３， ２５，２９−３２の部分配列に相当する、鎖長が４−９アミノ酸であるペプチド 抗原を少なくとも１つ含む、請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．配列番号：１−３２の群からの少なくとも２つのＨＣＶ抗原の組合せを用い る、請求の範囲第５項記載の方法。
8. ８．配列番号：４，１２及び１６ 配列番号：４，５，１２及び１６ 配列番号：３，４，５，１２及び１６ 配列番号：３，４，５，１２，１６，２６及び２７配列番号：３，４，１１，１ ２，１６及び２６配列番号：３，４，１２，１６及び２６配列番号：７，９，１ ３，２０及び２１配列番号：６，８，１３，１９及び２８、又は配列番号：２４ ，３０及び３１ を組合せとして用いる、請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．所望によりキャリアーと結合される、配列番号：１，２，１１，１２，１５ ，１６，２２，２３，２９−３２またはその部分配列のペプチド抗原で哺乳動物 を免疫してポリクローナル抗体を得るか、又は当該動物の抗体産生細胞を不死化 して細胞系をつくり、当該細胞系からモノクローナル抗体を単離することから成 る、ＨＣＶ抗原に対する抗体の生産方法。
10. １０．所望によりキャリアーと結合される、配列番号：１，２，１１，１２，１ ５，１６，２２，２３，２９−３２のペプチド抗原、又は配列番号：１−３２の ペプチド抗原、若しくは鎖長が少なくとも４アミノ酸である当該ペプチド抗原の 部分配列に相当するペプチド抗原のうち、少なくとも２つのペプチド抗原を、薬 理学上有効な量で、かつ製薬学上許容され得る処方で免疫原として含有してなる 、ＨＣＶ感染を治療するためのワクチン。
11. １１．配列番号：１，２，１１，１２，１５，１６，２２，２３，２９−３２の ペプチド抗原、又は配列番号：１−３２のペプチド抗原、若しくは鎖長が少なく とも４アミノ酸である当該ペプチド抗原の部分配列に相当するペプチド抗原のう ち、少なくとも２つのペプチド抗原を免疫原として用いるワクチンの製造方法。