JP2000510329A - Ｈｇｖ抗原の発現及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 膜結合形態及び可溶性形態のG型肝炎ウイルス抗原の組換え生産のための新規な方法ならびにHGVを診断的に検出するためのその使用を開示する。好ましくは真核宿主細胞を使用して該抗原を生産する。

Description

【発明の詳細な説明】 HGV抗原の発現及びその使用 本発明は、HGV抗原の新規な製造方法、及びHGVの診断的検出のためのその使用 に関する。 最近、以前から既に知られていたA型肝炎ウイルス(HAV)及びB型肝炎ウイルス( HBV)に加えて別のウイルスが特徴付けられ、これらは肝炎に関連するが、独立し たウイルス群である。これらのウイルス群は、通常、新しい群に対して連続した アルファベットの文字をいつも割り当てることにより命名される。また、新たに 発見された肝炎関連ウイルスのそれぞれは、これまでに知られたウイルスの群に 属さないことを示すことにより公知の群と区別される。すなわち、C型肝炎ウイ ルス(HCV)は非A/非B肝炎ウイルスとも称される(Chooら、1989，Science 244，35 9-362)。本発明は、HAV、HBV、HCV、HDV及びHEVウイルス群に分類できず、従っ てG型肝炎ウイルス(HGV)と称されるウイルスに関する。 HAV、HBV、HCV、HDV及びHEV群のいずれにも分類できない肝炎関連ウイルスがW O 94/18217に記載されている。しかしこのウイルスのヌクレオチド配列は、本発 明に記載される配列とは全く類似性を有していない。 HGVの核酸及びアミノ酸配列がWO 95/21922に記載されている。大腸菌における HGVポリペプチドの組換え発現が実施例13、19及び20に記載されている。この出 願に開示された配列に関しては明確な言及がなされている。 HGVの核酸及びアミノ酸配列はWO 95/32291にも記載されている。大腸菌、昆虫 細胞、及びワクシニアにおけるHGVの組換え発現が実施例16に記載されている。 この出願に開示された配列に関しては明確な言及がなされている。 本発明においてHGVと称する肝炎関連ウイルスの群はおそらくFlaviviridae科 に属するものである(Chambersら、1990，Annu．Ref．Microbiol．44，649-688) 。 ウイルス感染は通常、血清等の体液中のウイルス抗原または／及びこれらの抗 原に対する抗体の存在により検出される。ウイルスポリペプチドあるいはそのペ プチド断片をイムノアッセイにおいて抗原として使用して抗体を検出することが できる。そのような免疫学的試験を行うためには、ウイルスの適当な免疫原性ペ プチドあるいはポリペプチド成分を適当な量で提供することが必要である。 これまでHGVの定型的免疫学的診断のための方法は知られていない。さらに、 短鎖の合成ペプチド及びこれまでに知られた大腸菌からの組換え体ポリペプチド は特に良好な診断試薬ではないことが知られている。 従って本発明の目的は、HGV抗原の発現のための新規な方法、及びHGV感染の検 出のための新規な方法を提供することである。 この目的は、膜結合形態または／及び可溶性形態のHGVからの抗原の組換え生 産のための新規な方法により達成される。本発明の範囲内における適当なHGV抗 原はHGVゲノムからのポリペプチドであり(WO 95/21922及びWO 95/32291)、これ は少なくとも１個の抗原性または／及び免疫原性決定基を有する。推定エンベロ ープタンパク質E1及びE2をコードするHGV全ゲノムからのＤＮＡ配列領域が好ま しい。これらのエンベロープタンパク質は、機能性ウイルス粒子の外部にあり、 宿主生物との結合において重要な役割を果たすアミノ末端主部、及び膜に結合し た短いカルボキシ末端疎水性部からなる。 本発明の目標は、できる限り本物に近いHGV抗原の発現系であって、正確な翻 訳後プロセシングと、任意にグリコシル化と細胞質からの放出を生起するものを 提供することであった。この目的のため、発現は特に哺乳類細胞、例えばCHO細 胞中で実施される。これらの細胞においては、タンパク質生合成はサイトゾル中 のリボソームで起こる。HGV抗原は、例えば20〜30アミノ酸長の疎水性配列であ るアミノ末端シグナル配列と機能的に結合した状態で発現され、このシグナル配 列はいわゆるシグナル認識粒子によりサイトゾル中でタンパク質生合成の間に認 識され、リボソームは小胞体(ER)に向かわせられる。ここで、形成されたポリペ プチド鎖はそれらが移動停止配列により膜に捕捉されるまでER膜を通して輸送さ れる。このタンパク質はERの管腔中で任意にグリコシル化され、その後ゴルジ装 置においてさらに修飾される。これらは最終的に細胞膜への輸送のために分類さ れる。 第一の態様によれば、本発明は、膜結合形態のHGVの抗原の組換え製造のため の方法であって、 (a) シグナルペプチドと機能的に結合した機能的に活性な膜アンカードメインを 有する前記抗原をコードするＤＮＡ配列であって、前記シグナルペプチドが 前記抗原を細胞質から膜外に輸送するものであるＤＮＡ配列を宿主細胞に導 入し、 (b) 工程(a)からの宿主細胞を、導入されたＤＮＡ配列が発現し、それにより抗 原が膜結合形態で生産される条件下で培養し、 (c) その膜中に前記抗原を含む宿主細胞を単離する 工程を含む。 エンベロープタンパク質E1または／及びE2は、好ましくは膜結合抗原として生 産される。HGVのE1抗原のヌクレオチド配列は例えば、配列番号１に示した位置1 27及び位置681の間のヌクレオチド配列であり、これは配列番号２に示した位置3 9及び223の間のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。HGVのE2抗原 をコードするヌクレオチド配列は例えば、配列番号５に示した位置１27及び位置 1290の間のヌクレオチド配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号６に示 した位置39及び426の間のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。こ れらの具体的なヌクレオチド及びアミノ酸配列に加え、本発明はこれらの配列の 変異種も包含する。 従って本発明の主題は、 (a) 配列番号１の位置127及び681の間に示したヌクレオチド配列、 (b) 遺伝子コードの縮退の範囲内で(a)からの配列に対応する配列または／及び (c) ストリンジェントな条件下で(a)もしくは／及び(b)からの配列とハイブリダ イズするヌクレオチド配列 によりコードされる膜結合抗原E1を製造する方法である。 膜結合抗原E1は好ましくは (a) 配列番号２の位置39及び223の間に示されるアミノ酸配列または (b) (a)からの配列に少なくとも80%、特に少なくとも90%相同なアミノ酸配列を 含む。 本発明の別の主題は、 (a) 配列番号５の位置127及び1290の間に示されるヌクレオチド配列、 (b) 遺伝子コードの縮退の範囲内で(a)からの配列に対応する配列または／及び (c) ストリンジェントな条件下で(a)もしくは／及び(b)からの配列とハイブリダ イズするヌクレオチド配列 によりコードされる膜結合抗原E2の製造方法である。 膜結合抗原E2は好ましくは (a) 配列番号６の位置39及び426の間に示されるアミノ酸配列または (b) (a)からの配列に少なくとも80%、特に少なくとも90%相同なアミノ酸配列を 含む。 本発明においては、用語「ハイブリダイゼーション」はSambrookら、(1989)、 Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ne w York，1.101-1.104と同様に使用される。従って、ハイブリダイゼーションと は、１x SSC及び0.1%SDSで55℃、好ましくは62℃、特に好ましくは68℃で１時間 、特に0.2x SSC及び0.1%SDS中で55℃、好ましくは62℃、特に好ましくは68℃で １時間の洗浄後に、陽性ハイブリダイゼーションシグナルが依然として観察され る場合をいう。 本発明の別の主題は、特にCHO細胞のようなin vitroで培養された哺乳動物細 胞である組換え細胞であって、その表面上に膜結合形態でHGV抗原、特に抗原E1 もしくは／及びE2またはその免疫学的に関連する部分配列を提示する前記細胞で ある。 本発明の細胞は、例えばFACS分析またはELISAによるHGVの検出用の診断試薬と して使用できる。このためには、その表面上にHGV抗原を提示する細胞の、サン プル液体、例えばヒト血清との反応を測定する。反応が生起すると、抗HGV抗体 が試験サンプル中に存在すると推定できる。 本発明の第二の形態は、HGV抗原、好ましくは可溶性形態のE1またはE2抗原の 組換え製造のための方法に関する。この方法は、 (a) 機能的に不活性な膜アンカードメインを有する前記抗原をコードするＤＮＡ 配列を宿主細胞に導入し、 (b) 工程(a)からの宿主細胞を、導入されたＤＮＡ配列が発現され、それにより 抗原が可溶性形態で生産される条件下で培養し、 (c) 抗原を単離する 工程を含む。 前記方法は好ましくは、前記抗原をコードするＤＮＡ配列がシグナル配列に機 能的に結合し、それにより抗原が宿主細胞の細胞質から膜外に輸送されるような 形態で実施される。これにより、培養上清からさらに精製することなく抗原を容 易に単離することが可能となる。例えばCHO細胞のような真核生物宿主細胞が好 ましく使用される。 本発明の方法により得られる可溶性形態のHGV抗原の例は、欠失により機能的 に不活性化されたアンカー膜ドメインを有する抗原E1及びE2である。可溶性抗原 E1は好ましくは、 (a) 配列番号３の位置127及び552の間に示されるヌクレオチド配列、 (b) 遺伝子コードの縮退の範囲内で(a)からの配列に対応する配列または／及び (c) ストリンジェントな条件下で(a)もしくは／及び(b)からの配列とハイブリダ イズするヌクレオチド配列 によりコードされる。 可溶性抗原E1は特に好ましくは (a) 配列番号４の位置39及び180の間に示されるアミノ酸配列または (b) (a)からの配列に少なくとも80%、特に少なくとも90%相同なアミノ酸配列を 含む。 好ましい可溶性抗原E2は、 (a) 配列番号７の位置127及び1134の間に示されるヌクレオチド配列、 (b) 遺伝子コードの縮退の範囲内で(a)からの配列に対応する配列または／及び (c) ストリンジェントな条件下で(a)もしくは／及び(b)からの配列とハイブリダ イズするヌクレオチド配列 によりコードされる。 可溶性抗原E2は特に好ましくは (a) 配列番号８の位置39及び374の間に示されるアミノ酸配列または (b) (a)からの配列に少なくとも80%、特に少なくとも90%相同なアミノ酸配列を 含む。 本発明の別の主題は、機能的に不活性な膜アンカードメインを有するHGVの抗 原E1またはE2をコードする核酸である。該核酸は好ましくは上記に定義した配列 を含む。 本発明のさらに別の主題は、好ましくは診断試験に使用するための少なくとも １個のマーカー基または固相結合基を有する、前記核酸によりコードされるポリ ペプチドである。試験系で検出できる全ての公知のマーカー基、すなわち直接あ るいは間接的に検出可能なマーカー基をマーカー基として考慮する対象とするこ とができる。ここでいう直接検出可能なマーカー基は、直接検出可能なシグナル を生成する基、例えば放射性基、酵素基、あるいは発光性基である。酵素基及び 発光性基が特に好ましく、電気化学発光基が特に好ましい。一方、マーカー基は 間接的に検出可能な基とすることもでき、例えばビオチンやハプテン基であり、 これらはさらに信号を発生する基を有する適当な結合相手(ストレプトアビジン 、アビジンあるいは抗ハプテン抗体)との反応により検出できる。本発明のHGVポ リペプチドに融合した、適当な結合相手と特異的に反応する異種ペプチドあるい はポリペプチドドメインもマーカー基として使用できる。例としては、抗体との 反応によりマーカー基として働くことができるFLAGエピトープが挙げられる。 ペプチド、ポリペプチド、ハプテン、あるいはビオチン基も固相結合基として 使用して抗原を固相に固定することができる。必要な場合は、マーカーあるいは 固相結合基は、例えば二官能性スペーサー等の公知の方法により抗原に結合する ことができる。マーカーあるいは固相結合基をポリペプチドに結合するためのそ のような方法は免疫学の分野の技術者に知られており、ここでさらに説明する必 要はないであろう。 本発明のさらに別の主題は、可溶性HGV抗原をコードする核酸の少なくとも１ のコピーを含む組換えベクターである。このベクターは好ましくは、例えば酵母 ベクター等の真核生物ベクター、あるいは例えばプラスミドベクターもしくはウ イルスベクターのようなより高等な細胞に適したベクターである。このようなベ クターは当業者に知られている(例えばSambrookら、上出、16章参照)。 本発明のさらに別の主題は、本発明のＤＮＡ配列あるいは本発明のベクターに より形質転換された細胞である。この細胞は好ましくは真核生物細胞、特に哺乳 動物細胞である。外来核酸配列により真核生物細胞を形質転換あるいはトランス フェクトするための方法は分子生物学の分野の技術者によく知られており、ここ でさらに説明する必要はないであろう(例えばSambrookら、16章参照)。 可溶性HGVポリペプチドは、その抗原性によりHGVの検出用の診断試薬として使 用することができ、またHGV感染に対するワクチンの製造にも使用することがで きる。 可溶性及び膜結合したHGV抗原はそれそのものとして、あるいはその他のペプ チドまたは／及びポリペプチド成分との融合物、例えばFLAGエピトープのような 免疫学的に反応性を有するペプチド成分との融合物として製造することができる 。 HGVは、サンプル液体中のHGVに対する抗体の免疫学的測定により検出でき、こ の場合、サンプル液体を少なくとも１種の本発明の可溶性HGVポリペプチドとイ ンキュベートし、抗体のポリペプチドへの結合により該抗体を検出する。この測 定の免疫学的方法は、例えば、単一反応相による均質イムノアッセイ、あるいは 複数の反応相による不均質イムノアッセイ等の公知の試験形式の任意のものを使 用して行うことができる。不均質試験形式を好ましく使用することができ、この 場合抗体の存在は固相の存在下に検出される。 この試験形式の一つの態様はいわゆる二重抗原架橋試験法である。この方法に おいては、サンプル液体を少なくとも二種のHGVポリペプチドP1及びP2とインキ ュベートし、ここでポリペプチドP1は固相に結合されているか、固相に結合でき る形態で存在し、ポリペプチドP2はマーカー基を有する。サンプル液体中の抗体 は、固定された免疫複合体、すなわち固相に結合されたものを使用して、固相ま たは／及び液相、好ましくは液相中の標識を測定することにより検出する。 この試験方法においては、好ましくはサンプル液体を標識抗原P2並びに固相抗 原P1と混合して、標識抗原、抗体及び固相結合抗原からなる標識固定化複合体を 得る。可溶性形態の本発明のポリペプチドを使用することにより、抗原の凝集に よるブランク及び好ましくないシグナル／ノイズ比の上昇を回避することができ る。 しかし、本発明の可溶性HGVポリペプチドはその他の試験形式にも使用でき、 例えば間接イムノアッセイに使用して、固定化された特異的抗原への結合と、好 ましくは標識を有する抗HVG第二抗体との結合による間接的な検出により特異的 な免疫グロブリンを検出することができる。 さらに本発明は、G型肝炎ウイルスに対する抗体の免疫学的測定用の試薬であ って、その他の検出成分とともに膜結合HGV抗原を有する組換え細胞または／及 び可溶性HGV抗原を含む試薬にも関する。 本発明のポリペプチドの別の利用分野はワクチンの製造である。このためには 、本発明のポリペプチドを好ましくは精製された形態で製造し、その後注射可能 な液体とするものであり、これは該ポリペプチドの溶液あるいは懸濁液のいずれ でもよい。ポリペプチドをリポソーム中に封入してもよい。ワクチンのその他の 成分は、例えば、水、塩溶液、グルコース、グリセロール等である。さらにワク チンは、乳化剤、バッファー、及び免疫反応を増加させる任意のアジュバント等 の補助物質を少量含む。ワクチンは通常、注射、好ましくは皮下あるいは筋肉内 注射により非経口的に投与される。 本発明を以下の実施例、配列表及び図面によりさらに説明する。 配列番号１は、トランスメンブランドメインを含むHGVのE1抗原を含む融合タ ンパク質(HGV-E1 TM)をコードするヌクレオチド配列を示す。 配列番号２は、前記融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。 配列番号３は、トランスメンブランドメインを含まないHGVのE1抗原を含む融 合タンパク質(HGV-E1S)をコードするヌクレオチド配列を示す。 配列番号４は、前記融合タンパク質HGV-E1Sのアミノ酸配列を示す。 配列番号５は、トランスメンブランドメインを含むHGVのE2抗原を含む融合タ ンパク質(HGV-E2TM)をコードするヌクレオチド配列を示す。 配列番号６は、前記融合タンパク質HGV-E2TMのアミノ酸配列を示す。 配列番号７は、トランスメンブランドメインを含まないHGVのE2抗原を含む融 合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。 配列番号８は、前記融合タンパク質HGV-E2Sのアミノ酸配列を示す。 図１は、ヒト血清によるE2抗原を発現する細胞系の染色を示す代表的なフロー サイトグラムを示す。実施例 実施例１ HGV抗原のクローニング及び発現 Sambrookら、(1989)、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York及びAusubelら、(1989)、Current Protocols Mol ecular Biology，John Wiley & Sons，New Yorkに記載されたように、標準的な 方法を使用してＤＮＡを操作し、ポリペプチドを発現させた。 ＤＮＡの操作は大腸菌K12株DH5α中において行った。組換えタンパク質は、CH O-DHFR細胞、DSM ACC 126において発現させた。 1.1 CMVプロモーター及びBGHポリ-アデニル化シグナルを含むベクターpcDNA3(I nvirtogen BV，NV Leek，Netherlands)の誘導体を真核細胞系における発現のた めのベクターとして使用した。このためにネオマイシン耐性遺伝子をジヒドロ葉 酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子で置換することによりベクターpcDNA3を修飾した。 これはpcDNA3を制限酵素Avr-II/Bst1107Iで切断し、約４kb長のベクター断片を 単離し、約700bp長のAvr-II/Bst1107I DHFR断片を挿入することにより行った(Se tzerら、(1982)，J．Biol．Chem．257，5143-5147;Crouseら、(1982)，J．Biol ．Chem．257，7887-7897)。 HGVエンベロープタンパク質E1及びE2をコードするＤＮＡ配列を、得られたベ クターpcDNA3-DHFRに、シグナルペプチド配列及びいわゆるFLAGエピトープをコ ードするＤＮＡ配列と機能的に結合させてクローン化し、両方の成分とともに融 合タンパク質として発現させた。エリスロポエチンシグナル配列(Jacobsら、（1 985）Nature 313，806-810)を93bp長EcoRI/EheI断片（配列番号１の位置１〜93) としてシグナル配列として使用した。 FLAGエピトープは８アミノ酸長のペプチドであり(Hoppら、(1988)，Bio/Techn ology 6，1204-1210)、これに対するモノクローナル抗体は市販品として入手可 能で、所望の発現産物を精製し同定するために任意に使用することができる。FL AGエピトープをコードするＤＮＡ配列を製造するため、２種のオリゴヌクレオチ ドを一緒にハイブリダイズさせ、キナーゼによる処理の後にリンカーとして使用 した(配列番号１の位置94-125に対応する)。 E1及びE2発現ベクターを製造するため、プラスミドpcDNA3-DHFRをEcoRI及びNo tIで消化し、約5.9kb長のベクター断片を単離し、前記シグナル配列断片及びFLA Gリンカーと三者間の結合を行った。 使用したHGV-ｃＤＮＡは、Genelabs Technologies Inc.，Redwood City，CA， USAから得たものである(WO 95/32291)。ほぼ完全なHGVゲノムは約9.3kb長のXbaI /EcoRI断片として存在し、これはベクターpGEM-3Zの対応する制限部位にクロー ン化されている(Promega Corp.，Madison，WI，USA)。 エンベロープタンパク質E1及びE2はトランスメンブランアンカー配列とともに 、あるいはそれなしに発現させた。それぞれの構築物のヌクレオチド及びアミノ 酸配列は以下の通りである。 配列番号1/2−トランスメンブラン配列を含む抗原E1（位置13-93、シグナルペ プチド；位置94-126、FLAG配列＋NotIリンカー；位置127-681、E1配列；位置688 -693、XbaIリンカー）。 配列番号3/4−トランスメンブラン配列を含まないE1抗原（位置13-93、シグナ ル配列；位置94-126、FLAG配列＋リンカー；位置127-552、E1配列；位置559-564 、リンカー配列）。 配列番号5/6−トランスメンブラン配列を含むE2抗原（位置13-93、EPO配列； 位置94-126、FLAG配列＋リンカー；位置127-1290、E2配列；位置1297-1302、リ ンカー配列）。 配列番号7/8−トランスメンブランアンカー配列を含まないE2抗原（位置13-93 、シグナル配列；位置94-126、FLAG配列＋リンカー；位置127-1134、E2配列；位 置1141-1146、リンカー配列）。 上記の構築物をクローン化するために、適当なオリゴヌクレオチドを使用して ＰＣＲによりエンベロープタンパク質をコードするＤＮＡ配列を増幅し、NotI/X baI断片として、シグナルペプチド及びFLAGエピトープとをコードするＤＮＡ配 列と読み枠を合わせてベクターにクローン化した。 1.2 発現 HGVエンベロープタンパク質を発現させるため、トランスフェクション試薬DOT AP(Boehringer Mannheim GmbH，カタログ番号1202375)を使用して1.1に記載した 発現構築物をCHO-DHFR細胞に導入した。10%の透析ウシ胎児血清(GibcoBRL、カタ ログ番号10110-070)を混合したヌクレオチド非含有MEMα培地(GibcoBRL、カタロ グ番号22561-021)中でトランスフェクトされた細胞を選択した。 メトトレキセート(Sigma-Aldrich GmbH、カタログ番号M8407)を増殖培地に添 加して、安定な細胞系中でのDHFR選択により発現構築物をさらに増幅した。10日 間の選択の後、各クローンを採取し、抗-FLAG M1抗体(Eastman Kodak Comp.、カ タログ番号IB13001)を使用してFLAGエピトープの発現について分析した。 あるいは、細胞膜上にトランスメンブランアンカーを有するE1及びE2配列を発 現するクローン(HGV-E1TM及びHGV-E2TM)を、M1抗体及び抗マウスIg-フルオレセ イン-(Fab')₂断片(Boehringer Mannheim GmbH、カタログ番号1214 616)で染色し た後、フローサイトメトリー(実施例２参照)により分析した。FLAGエピトープを 発現するクローンをサブクローン化し、ヒト血清の分析に使用した(FACS-分析、 実施例２参照)。 発現構築物HGV-E1S及びHGV-E2Sを発現するクローンは膜に結合した抗原を提示 せず、トランスメンブランアンカーを含まない抗原を直接培養上清に分泌する。 これらの抗原は古典的な免疫学的試験に使用することができる。これは精製を必 要とせず、これらは無血清培地上清から、M1抗体で被覆したELISAプレートに直 接結合させることができる。実施例２ 膜結合抗原HGV-E2TMを使用したFACS分析 この方法においては、膜をベースとした組換えFLAG-E2TM融合タンパク質を発 現するCHO細胞を、ヒト血清中のHGV-特異抗体の捕捉物質として使用した。組換 えにより発現されたFLAG-E2TM融合タンパク質は、前記抗体の捕捉物としてその ままの形態で利用できる。この方法では、コンフォーメーションに従ったエピト ープが保持され、この方法はHGV-特異抗体の存在についてヒト血清を分析するの に理想的なものである。 FLAG-E2TMを発現する細胞をこのためにPBS中の0.04%EDTAの中で培養容器から 解離し、PBS中で洗浄した。200,000細胞のアリコートをl00μｌ PBS、１mMCaCl₂ 、0.2%ウシ血清アルブミン及び0.02%NaN₃中に再懸濁し、1〜5μｌのヒト血清と ともに氷上で30分間インキュベートし、同じバッファーで２回洗浄し、フローサ イトメトリーのためにHGVに結合した抗体を検出可能にするために、抗-ヒトIg- フルオレセイン-(Fab')₂断片(Boehringer Mannheim GmbH、カタログ番号1295750 )とともに30分間さらにインキュベートした。さらに２回洗浄した後、フローサ イトメーターで細胞を分析した。 血清抗体のCHO細胞に対する非特異的結合あるいはFLAGエピトープのみへの結 合を排除するため、陰性対照として関連のないFLAG融合タンパク質(例えば同様 にアミノ末端FLAG配列とともに得られるヒトウロキナーゼ受容体)でトランスフ ェクトされたCHO細胞を別途染色することができる。 図1-1は、２種のCHOクローン、すなわち、アミノ末端FLAG配列を有するウロキ ナーゼ受容体を発現するクローン(3UR8、図1-1a)あるいはアミノ末端FLAG配列を 有するE2TMを発現するクローン(2E2TM12、図1-1b)の染色を示す。両方のクロー ンがFLAG特異抗体M1により染色された(塗りつぶされた曲線)。塗りつぶされてい ない曲線はアイソタイプ対照を示す。3UR8あるいは2E2TM12の場合には、FLAGの 広い発現範囲、すなわちクローンの細胞の約2/3が組換え融合タンパク質を発現 することが判る。 図1-2は、HGV特異抗体を含むヒト血清による染色を示す。2E2TM12細胞の2/3が この血清により染色され(図1-2b)、M1抗体による染色と同様であった(図1-1b)。 これに対して3UR8細胞の染色は見られなかったが(図1-2a)、これらはFLAGエピト ープを発現した。従って2E2TM12細胞の染色は血清抗体のCHO細胞あるいはFLAGエ ピトープに対する結合によるものではなく、組換え融合タンパク質のE2TM成分に 対する特異的結合のみによるものである。従って、この方法はヒト血清中のE2TM 特異抗体を検出するのに適している。 そして図1-3は、HGV特異抗体を含まないヒト血清による染色を示す。2E2TM1２ 細胞(図1-3a)及び3UR8細胞(図1-3b)のいずれもがこの血清により染色されなかっ た。これはHGVエンベロープタンパク質の膜結合発現がヒト血清中のHGV抗 体の検出の特異的な診断手段であることを示している。実施例3 抗原HGV-E2TMを使用したELISA分析 この方法においては、FLAG-E2TM融合タンパク質をCHOクローンから単離し、古 典的なELISA形式におけるHGV特異抗体の捕捉物質として使用した。このために、 前記抗原をFLAGエピトープを介してビオチン化M1抗体に結合し、この抗体をさら にストレプトアビジン被覆ELISAプレートに結合させた。この形態においても組 換えにより発現されたFLAG-E2TM融合タンパク質は天然の形態で提示され、コン フォーメーションに従ったエピトープを保持していた。 a）ELISAプレートの調製：ストレプトアビジン被覆ELISAマイクロタイタープ レート(Microcode，Streptavidin MTP F8)を25μｌ FLAG特異的ビオチン化M １抗体(PBS中2.5μｇ/ml、0.2%ウシ血清アルブミン)と60分間インキュベー トし、その後0.9%NaCl、0.05%Tween 20で３回洗浄した。その後これをPB S、0.2%ウシ血清アルブミン、0.05%Tween20で30分間ブロックし、上記の ように洗浄した。 b）細胞溶解：FLAG-E2TMを発現する細胞をPBS中の0.04%EDTAの中で培養容器 から解離し、PBS中で洗浄した。次に細胞をPBS、0.5%Nonidet P40、プロ テアーゼミックス(Boehringer Mannheim GmbH、カタログ番号1206 893)中で 溶解した。このために10⁷細胞/ml可溶化溶液を２時間氷上でインキュベー トした。不溶物質を遠心分離により除去した。 c）抗原の結合及びアッセイ：調製したELISAプレート(a参照)を細胞溶解物(PB S、0.1%Nonidet P40中に希釈)と室温で１時間インキュベートした。PBSで ３回洗浄した後、最後にヒト血清を適当な希釈度(1:30〜1:50)で加え、室温 で90分インキュベートした。最初にPBS、0.1％Nonidet P40で、その後0. 9%NaCl、0.05%Tween 20で数回洗浄した後、これを抗ヒトIg-POD、(Fab')₂ 断片(Boehringer Mannheim GmbH、カタログ番号1089 196)と１時間インキュ として使用し、30〜60分後の色の変化をELISAリーダーにおいて405nmで 測定した。結果 最初に組換えE2TMを発現しないCHO溶解物をゼロサンプルとしてこのアッセイ において使用した。これらに関しては、血液ドナーの群において平均で100〜140 mAの範囲の吸光度値が観察された。その結果、少なくとも250mAの吸光度及び少 なくとも2.0のシグナル比E2/CHOを有するサンプルを陽性と判定した。これは、 非常に特異的であると判定できるFACS分析(実施例2)からの結果と非常によく一 致した。 血液ドナーパネル中、80サンプルのうちの７サンプル(9%)がE2抗原に対する抗 体の存在について陽性であった。 122の薬物中毒患者（いわゆる静脈注射による薬物濫用者）を含むリスク群パ ネル中、40サンプル(33%)がE2 ELISAにおいて陽性であった。 さらに一連の経過観察血清（輸血後C型肝炎、輸血後非A非B型肝炎、輸血後B型 肝炎並びに散発性急性B型肝炎の１名の患者からそれぞれの症例において採取） においてHGV-E2陰性からHGV-E2陽性へのセロコンバージョンが観察された。 均質ELISA法によりやはり同様な結果が得られた。これについては、E2TMを含 む溶解物をビオチン化M1抗体及び血清(1:50の希釈度)とともにストレプトアビジ ン被覆マイクロタイタープレート(Microcode，Streptavidin MTP F8)中で室温で ２時間インキュベートし、その後最初にPBS、0.1%Nonidet P40で、その後0.9%Na Cl、0.05%Tween 20で洗浄した後、抗ヒトIg-POD、(Fab')₂断片(Boehringer Mann heim GmbH、カタログ番号1089 196)と１時間インキュベートした。0. 〜60分後の色の変化をELISAリーダーにおいて405nmで測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 膜結合形態のHGV抗原の組換え生産方法であって、 (a) シグナルペプチドと機能的に結合させた機能的に活性な膜アンカードメ インを有する前記抗原をコードするＤＮＡ配列であって、前記シグナル ペプチドが前記抗原を細胞質から膜外に輸送するものである前記ＤＮＡ 配列を宿主細胞に導入し、 (b) 工程(a)からの宿主細胞を、導入されたＤＮＡ配列が発現され、それに より抗原が膜結合形態で生産される条件下で培養し、 (c) その膜中に前記抗原を含む宿主細胞を単離する 工程を含む前記方法。 2. 真核宿主細胞を使用する請求項１に記載の方法。 3. CHO宿主細胞を使用する請求項２に記載の方法。 4. (a) 配列番号１の位置127及び681の間に示したヌクレオチド配列、 (b) 遺伝子コードの縮退の範囲内で(a)からの配列に対応する配列または／及 び (c) ストリンジェントな条件下で(a)もしくは／及び(b)からの配列とハイブ リダイズするヌクレオチド配列 によりコードされる膜結合抗原E1が生産される請求項１〜３のいずれか１ 項に記載の方法。 5. (a) 配列番号２の位置39及び223の間に示したアミノ酸配列または (b) (a)からの配列に少なくとも80%相同なアミノ酸配列 を含む膜結合抗原E1が生産される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 6. (a) 配列番号５の位置127及び1290の間に示したヌクレオチド配列、 (b) 遺伝子コードの縮退の範囲内で(a)からの配列に対応する配列または／及 び (c) ストリンジェントな条件下で(a)もしくは／及び(b)からの配列とハイブ リダイズするヌクレオチド配列 によりコードされる膜結合抗原E2が生産される請求項１〜３のいずれか１ 項に記載の方法。 7. (a) 配列番号６の位置39及び426の間に示したアミノ酸配列または (b) (a)からの配列に少なくとも80％相同なアミノ酸配列 を含む膜結合抗原E2が生産される請求項１〜３及び６のいずれか１項に記載 の方法。 8. その表面に膜結合形態のHGV抗原E1または／及びE2を提示する組換え細胞。 9. in vitroで培養された哺乳動物細胞である請求項８に記載の細胞。 10．CHO細胞である請求項９に記載の細胞。 11．HGVを検出するための診断試薬としての請求項8〜10のいずれか１項に記載 の細胞の使用。 12．FACS分析あるいはELISAにより検出が行われる請求項11に記載の使用。 13．可溶性形態のHGV抗原の組換え生産方法であって、 (a) 機能的に不活性な膜アンカードメインを有する前記抗原をコードするＤ ＮＡ配列を宿主細胞に導入し、 (b) 工程(a)からの宿主細胞を、導入されたＤＮＡ配列が発現され、それに より抗原が可溶性形態で生産される条件下で培養し、 (c) 抗原を単離する 工程を含む前記方法。 14．前記抗原をコードするＤＮＡ配列が、宿主細胞の細胞質から抗原を膜外に輸 送するシグナル配列に機能的に結合されている請求項13に記載の方法。 15．真核宿主細胞を使用する請求項13または14に記載の方法。 16．CHO細胞を使用する請求項15に記載の方法。 17．(a) 配列番号３の位置127及び552の間に示したヌクレオチド配列、 (b) 遺伝子コードの縮退の範囲内で(a)からの配列に対応する配列または／ 及び (c) ストリンジェントな条件下で(a)もしくは／及び(b)からの配列とハイブ リダイズするヌクレオチド配列 によりコードされる可溶性抗原E1が生産される請求項13〜16のいずれか１ 項に記載の方法。 18．(a) 配列番号４の位置39及び180の間に示したアミノ酸配列または (b) (a)からの配列に少なくとも80％相同なアミノ酸配列 を含む可溶性抗原E1が生産される請求項13〜17のいずれか１項に記載の方 法。 19．(a) 配列番号７の位置127及び1134の間に示したヌクレオチド配列、 (b) 遺伝子コードの縮退の範囲内で(a)からの配列に対応する配列または／ 及び (c) ストリンジェントな条件下で(a)もしくは／及び(b)からの配列とハイブ リダイズするヌクレオチド配列 によりコードされる可溶性抗原E2が生産される請求項13〜16のいずれか１ 項に記載の方法。 20．(a) 配列番号８の位置39及び374の間に示したアミノ酸配列または (b) (a)からの配列に少なくとも80％相同なアミノ酸配列 を含む可溶性抗原E2が生産される請求項13〜16及び19のいずれか１項に 記載の方法。 21．機能的に不活性な膜アンカードメインを有するHGVの抗原E1またはE2をコ ードする核酸。 22．(a) 配列番号３の位置127〜552、または配列番号７の位置127〜1134に示 したヌクレオチド配列、 (b) 遺伝子コードの縮退の範囲内で(a)からの配列に対応するヌクレオチド 配列または／及び (c) ストリンジェントな条件下で(a)もしくは／及び(b)からの配列とハイブ リダイズするヌクレオチド配列 を含む請求項21に記載の核酸。 23．請求項21または22に記載の核酸によりコードされるポリペプチド。 24．少なくとも１個の固相結合基またはマーカー基を有する請求項23に記載の ポリペプチド。 25．請求項21または22に記載の核酸を１コピー以上含む組換えベクター。 26．請求項21または22に記載の核酸または請求項25に記載のベクターにより 形質転換された組換え細胞。 27．HGV検出用の診断試薬としての請求項13〜20のいずれか１項に記載の方法 により生産されたポリペプチドまたは請求項23もしくは24に記載のポリペ プチドの使用。 28．不均質イムノアッセイにおける請求項27に記載の使用。 29．二重抗原架橋試験における請求項28に記載の使用。 30．その他の検出成分に加えて、 (a) 請求項8〜10のいずれか１項に記載の組換え細胞または／及び (b) 請求項13〜20のいずれか１項に記載の方法により生産されたポリペプ チドまたは請求項23もしくは24に記載のポリペプチド を含むHGV検出用の試薬キット。