JPH03503047A - ポリマーおよびポリマー‐ペプチド複合体 - Google Patents
ポリマーおよびポリマー‐ペプチド複合体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ポリマーおよびポリマー−ペプチド複合体本発明はペプチド合成に使用する不溶
性ポリマー支持体、そのペプチド合成での使用およびポリマー−ペプチド複合体
(conjugate)に関する。
ペプチド合成、オリゴヌクレオチド合成、オリゴ糖合成、触媒反応用途、アフィ
ニティークロマトグラフィー、医薬用途および酵素固定化における不溶性支持体
マトリックスとしてポリマーを使用することが知られている。有機合成における
試薬支持体としての不溶性ポリマーの使用は生成物と試薬の分離を容易にし、他
の利点も有する。
不溶性ポリマー支持体の使用はペプチド合成(例えば、メリーフィールド合成−
メリーフィールド・アール・ビー(Merrifield R,B、)(196
2)、フェデレーション・プロシーディンゲス・フェデレーション・アメリカン
・ソサイエティー・オブ・エクスベリメンタル・バイオロジー(Fed、 Pr
oc、 Fed、 Amer、 Soc、 Exp、 Biol、)、21,4
12および(1963)、ジャーナル・オプ・アメリカン・ケミカル・ソサイエ
ティ−(J、 Amer、 Chis、 Soc、)、85.2149参照)お
よびヌクレオチド合成(例えば、レッシンガー・アール・エルおよびシーネット
・エム・ジz −(Letsinger R,L、& Hornet M、J、
)、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ−(J、 Ase
r。
Chet Soc、)、86.3045および(1964)、ジャーナル・オブ
・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー、86.5163参照)において特に
重要であつた。ペプチドの面相合成は多くの蕾者により記述されてきた(メイエ
ン中ツフェル・ジェイ(Meinehofer J、)、(1973)、rホル
モン性蛋白質およびペプチド」、ニドワード・シー・エイチ・シー(Ed、C,
H,Li、)、2.45〜267、ニューヨーク州アカデミツクプレス(Aca
demic Press)Hエリクソン・ビー・ダブリ5(Erickson
B、W、)ら、(1976)、「蛋白質」、ニドワード・エイチ・ニエーラス(
Ed、 H,)leurith)ら、2.255〜327、ニューヨーク州アカ
デミツクプレス:およびバラニー・ジー・アンド・メリーフィールド・アール・
ビー(Barany G、 & Merrifield R,B、)、(198
0)、「蛋白質」、ニドワード・イー・グロス(Ed、 E、 Gro@s)、
3〜284、ニエーヨーク州、アカデミツクプレス参照)ポリマー支持ペプチド
合成の典型的なメリーフィールド法は不溶性架橋ポリエチレン支持体を用いて開
発された。該支持体はジビニルベンゼンおよびスチレンを懸濁液中で共重合させ
ることにより調製され、不溶性ビードポリマーを形成する。ペプチドは、他の試
薬(溶液中)からの所望の生成物(支持体に付着した)の分離を容品にしかつ他
の利点も有する不溶性支持体上で合成される。ポリスチレン主鎖は大部分が化学
的不活性を維持するが、ペプチド鎖が成長するにつれてポリマーの膨張性が変化
する。
メリフィールド法の開発はシェパードにより提案され(シェパード・アール・シ
ー(Sheppard R,C,) (1971)、「ペプチド1971ふエド
ガー・エイチ・ネスバドウバ(Ed、 Il、 Ne5vadba)、lit〜
125、北オランダ、アムステルダム:アサートン・イー・クリープ(Athe
rton E、 C11ve)、デー・エル・ジz−(D、 L、 J、)、お
上びシェパード・アール・シー(1975)、ジャーナル・オブ・アメリカン・
ケミカル・ソサイエティ−97,6585)、前記文献では、極性ポリマーおよ
びポリジメチルアクリルアミドが非極性ポリスチレンにとって代わる。ポリジメ
チルアクリルアミドは、極性溶媒中で、ポリマー上で合成された側鎖保護ペプチ
ドと同様の溶媒和特性を有する。これはペプチド−ポリマーマトリックス中の凝
集現象を最小限にし、その結果、ペプチド特性および収率を改良する。
ポリマー支持体としてポリジメチルアクリルアミドを用いることはアサ−トンら
により記述された(アサ−トン・イー(Athertoi E、)ら(197
9)、バイオロジカル・ケミストリー(Biorg、 Chew、)、8.37
0)。ジメチルアクリルアミド、アクリロイルサルコシンメチルエステルおよび
エチレンビスアクリルアミドの共重合により得られた不溶性架橋ポリジメチルア
クリルアミド・ゲル上でのペプチド合成は守備よく達成される(アサ−トン・イ
ーら(1979)、バイオロジカル・ケミストリー、8.351)。他のポリア
ミド支持体についても記載された(スミス・シー・ダブリュ(Smith C,
1,)ら(1979)、インターナシ四ナル・ジャーナル・オプ・ペプチド・ア
ンド・プロティン・リサーチ(Int、 J、 Peptide、 Prote
in。
Res、)、13.109ニスクール・ジー・エル(Stahl G、 L、)
ら(1979)、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー、
101.5383:およびニブトン・アール(Epton R,)ら、ポリマー
、20.1444)。ポリジメチルアクリルアミド樹脂は懸濁重合により調製さ
れ、回分法によるペプチド合成中にビードゲルとして用いられてきた(アルシャ
ディー・アール(Arshady R,)ら(1979)、ジャーナル・才ブ・
ケミカル・ソサイエテイー、ケミカル・コミュニケーションズ(Chem、 C
oals、)、423)。ごく最近では、不活性珪藻土(Kiselguhr)
支持体マトリックスの存在下でのモノマーの共重合により、ポリマー支持体をカ
ラムに充填してペプチド合成の連続流法で使用できるようになった(アサ−トン
・イー、ブラウン・イー(Brawn E、)およびロゼビアー−zイ(Ros
evear A、)(1981)、ジャーナル・オプ・ケミカル・ソサイエテイ
ー、ケミカル・コミュニケーション、1151ニジエフアート・アール・シー(
1983)、ケミストリー・イン・プリテン(CheIIl、 Br1t)、■
9.402)。
ペプチドはポリエチレングリコールのような「可溶性」ポリマー支持体上で合成
されてポリマー−ペプチド複合体分子を形成する。溶媒を変えることによるポリ
マー−ペプチド複合体の調製は副産物からの複合体の分離を容易にした(ムラタ
ー(Mutter)ら(1978)、アンゲバンテ・ヘミ−・インターナチオナ
ル・エディチオン・イン・エングリッジs(Angew、 CheIi、 In
t、 Fdn、)、13.88)。
ペプチド合成の重要な用途はワクチンとして用いる合成免疫原の調製である。幾
つかのペプチド類がil vitroでウィルスまたはバクテリオファージに接
合できる抗血清を誘発できることが判明した(アーセノ・アール(Armon
R,)、(1980)、アメリカン・レビュー・オブ・ミクロバイオロジー(A
mer、 Rev、 Microbiol、、34.593)。さらに参考文献
として、「抗原としての合成ペプチド」、エドワーズ・アール・ポーター(Ed
s、R,Porter)およびジェー・フェラン(J、 Wheran)、シ
バシンポジウム、ウィリー(胃11ey)およびサンズ(Sons)、チッケス
ター(Chichestar)、英国、1986を引用する。例えば、該ペプチ
ドは興味のある特定の蛋白質上の特殊な抗原決定基に類似している。現在、口蹄
疫ウィルス、ポリオウィルス、インフルエンザウィルスおよびB型肝炎ウィルス
に対するワクチンは、すべて固相合成により生成された合成ペプチドの使用に基
づいた種々の基により研究されている。合成ワクチンは、はとんど副作用がなく
かつ不活化ウィルスに基づく現存するワクチンより安全であるという利点を有す
る。
しかしながら、一般に短ペプチド(short peptides)単独では免
疫反応を誘発できないが、それらは抗原性があり、特異抗体に結合できる。免疫
原または接種材料として用いるために、該ペプチドは、それ自体、免疫原性があ
る大きい担体分子に共有結合でリンケージされる。蛋白質は担体分子として広範
に用いられ、牛血清アルブミン、ニワトリオバルブミンおよびキーホールリンペ
ットヘモシアニンは実験動物中の合成抗原に対して抗体を作るのに用いられたき
た合でリンケージさせるのに必要な反応は数多くの副反応の結果として役に立た
ないものになり、それはリンケージを形成するのに用いる官能基に依存する。ま
た、リンケージ生成物の均質性はかろうじて決定できるにすぎず、品質コントロ
ールが困難となる。
したがって、通常、固相法によりワクチンとして用いるのに適した合成ポリペプ
チドを調製するためには、まず不溶性ポリマー支持体上でペプチドを調製し、該
支持体からの合成ペプチドを開裂し、ついで、該ペプチドを可溶性担体に共有結
させることが必要である。
その他に、ペプチド合成の典型的な液相法を用いる場合、ペプチドを可溶性担体
に共有結合させる必要がある。これらの工程はすべて最終生成物の全収率および
純度を減少させることを余儀なくする。
不溶性ポリマー支持体上でペプチドを調製し、ついで、該ポリマーを超音波で崩
壊して接種に適した物質を得ることが提案された(バーラオーイ・イー(Bah
raohi E、)ら、「18回欧州ペプチドシンポジウム議事録J(1984
)、165〜168)。
ゲル電気泳動の非連結基(unconnected field)において、生
成物回収率の問題は可溶化されるゲルのデザインにより解決された。ゲル電気泳
動は、付与された電場の影響下、ゲルを通して各成分に分離するサンプルの種々
の成分の異なった泳動速度に依存する。分離された成分は第1段階としてゲル上
で検出され、各成分に識別されるか、またはゲルが分離されて各成分のサンプル
を提供する。該成分はゲルに結合されないが、分離成分の該ゲルからの拡散が促
進されるという問題が生じる。ゲルは典型的には架橋された、不溶性のポリアク
リルアミド類であるが、選択的に化学開裂できる部位を有する架橋剤を用いてゲ
ルを可溶化でき、それにより、所望の成分を該ゲルからさらに容易に拡散させる
ことができる。用いられた特異的な部位および架橋剤として、過ヨウ素酸塩で開
裂されるN、N″−ジアリル酒石酸ジアミド、N、N、N″−トリアリルクエン
酸アミドおよびN、N’ −(1,2−ジヒドロキエチレン)ビスアクリルアミ
ド等の隣位ジオール類(タス・ジェ−(Tas J、)ら、(1979)、アナ
リティカル・バイオケミストリー(Alal、Biochem、)、100.2
64〜270:オーコーネル・ピー・ビー・エイチ(0’ Connell P
。
B、H,)ら、(1976)、アナリティカル・バイオケミストリー、76.6
3〜73.アンカー・エイチ・ニス(Anker H,S、)ら、(1970)
、フェツス・レターズ(Febs Lett、)、7(3)、293);アルカ
リ加水分解で開裂されるエチレンジアクリレート等のエステル類(ジーレス・ジ
ー・エル(Coules G、L、)ら、(1965)、アナリティカル・バイ
オケミストリー、13.336〜344:およびスルフヒドリル還元剤で開裂さ
れるN、N″−ビスアクリルシスタミン等のジスルフィド基(ハンセン・ジェー
・エヌ(Hansen J、jl、)、(1976)、アナリティカル・バイオ
ケミストリー、76.37〜44)が挙げられる。
直接、免疫化(i關unisation)のための担体分子として用いることが
できる固相ペプチド合成に適したポリマー支持体が必要である。
本発明はペプチド合成で使用できる新規な不溶性ポリマー支持体を提供し、形成
される不溶性ペプチド−ポリマー複合体を可溶化でき、得られた線状ポリマー−
ペプチドをさらに溶液中で化学または生物学実験に用いることを目的とする。
本発明の第1の実施態様によれば、架橋剤で架橋された可溶性ポリマーまたはコ
ポリマーから構成され、かつ、ペプチド鎖の付着のための部位を有する不溶性の
架橋ポリマーまたはコポリマーからなり、該架橋剤が選択的に化学開裂できるリ
ンケージを有してなるペプチド合成に使用する不溶性支持体が提供される。
支持体の好ましい形態は、重合して可溶性ポリマー鎖を形成できる少なくとも1
つの重合性モノマーと、ペプチド結合または共存結合形ペプチドーコポリマーリ
ンケージの重大な開裂を引き起こさない条件下で可溶性コポリマーフラグメント
を生じる選択的に化学開裂できるリンケージを有する架橋剤から構成される架橋
ポリマーからなり、核少なくとも1つの重合性モノマーが、ペプチド鎖を該コポ
リマーに共有結合で付着させる官能基を有するモノマーを有する。
さらに、本発明は、架橋剤で架橋された可溶性ポリマーまたはコポリマーから構
成されるポリマーに共有結合されたペプチドからからなり、該架橋剤が選択的に
化学開裂できるリンケージを有するポリマー−ペプチド複合体を提供するもので
ある。
かかる複合体のポリマ一部分は最初は不溶性形態であるため、例えば、ペプチド
合成、あるいは別々に合成されたまたは生物学的サンプルから単離されたペプチ
ドの付着のために有用な不溶性支持体を提供する。しかしながら、架橋剤の開裂
により、ポリマー−ペプチド複合体は部分的または完全に可溶性となる。この利
点は、例えば、公知の固相ペプチド合成技術を用いて不溶性架橋ポリマー支持体
上でペプチドを合成し、該ポリマー支持体は架橋剤を開裂することにより可溶化
できることである。すなわち、該可溶性のポリマー−ペプチド複合体は、例えば
、ワクチン等の接種に適した形態となる。
本発明のポリマー−ペプチド複合体は可溶性形態でも提供できる。
該可溶性形態は生理食塩水等の医薬上許容される賦形剤との組合せであり、ワク
チンとして使用できる。
ここで用いる「可溶性」なる用語は、少なくとも生理学的条件下で可溶性である
ことを意味し、「不溶性」なる用語は、少なくともペプチド合成の条件下で不溶
性であることを意味する。
可溶性ポリマーとは鎖間架橋の形成により不溶性となる任意のポリマーまたはコ
ポリマーである。かかる好ましいポリマーとしては、ポリスチレン、ポリジメチ
ルアクリルアミド、ポリメタクリレート等が挙げられる。可溶性ポリマーは、好
ましくは、ポリアミドあるいはポリアクリルアミドポリマーまたはコポリマー等
の極性ポリマーまたはコポリマーが挙げられる。特に好ましいものはジメチルア
クリルアミドポリマーまたはコポリマーである。
架橋剤は、各々が可溶性ポリマーに結合できる2つの反応性基からなり、該反応
性基は、可溶性ポリマー中の架橋剤が該可溶性ポリマーの分子間で分子間結合を
形成するように、選択的に化学開裂できる連結によって互いに結合される。
ここで用いる「選択的な化学開裂」なる用語は、実質的に可溶性ポリマーまたは
コポリマーに影響を及ぼさない条件下でリンケージが開裂し得ることを意味する
。また、該条件は、ペプチドおよび任意のボプチドーボリマー結合が不利に影響
されないような条件である。
好ましくは、該リンケージは酸不安定性リンケージである。通常、固相ペプチド
合成で使用する保護基は酸不安定性であるため、かかるリンケージは特に有利で
あり、ペプチド合成に用いる条件は酸不安定性リンケージに影響を及ぼさない中
性または塩基性の反応条件を有するように選択できる。したがって、不溶性ポリ
マー上でペプチドを合成すると、可溶化および脱保護の工程は単一工程で実施で
きる。
可溶性ポリマーが、1つ以上の不飽和モノマー(例えば、ポリアクリルアミド)
のビニル重合によって形成される場合、架橋剤は一般式:
%式%(
[式中、Rは選択的な化学開裂、好ましくは酸不安定性開裂できるリンケージを
意味するコで示される。最も好ましくは、該架橋剤は一般式:
口式中、R1およびR2は同一または異なって、各々水素、アルキル、アリール
、アラルキル、アルコキシおよびアロキシを意味し、ただしR1がアルコキシま
たはアロキシの時にR′はアルコキシまたはアロキシではないコで示される。好
ましくは、R1およびR1は両方とも−Hまたはメチルであり、架橋剤はN、N
’ −ビスアクリロイル−ジアミノエトキシメタン、または、さらに好ましくは
N、N’−ビスアクリロイル−2,2′−ジー(2′−アミノエトキシ)−プロ
パンである。
ペプチドは任意のポリペプチドであるが、好ましくは大きいポリペプチドまたは
蛋白質の一部分のような抗原または免疫優性ポリペプチドである。かかるポリペ
プチド類の例としては、口蹄疫ウィルス、ポリオウィルス、インフルエンザウィ
ルスおよびB型肝炎ウィルス等のウィルスと免疫的に交叉反応する合成ペプチド
類が挙げられる。
さらに、ペプチド鎖を付着させるペンダント官能基を有する不溶性ポリマー支持
体を付与し、ついで、適当に保護されたアミノ酸誘導体をそれと反応させ、該不
溶性ポリマー支持体に付着されたペプチド鎖を組み立ててなる工程を有する、本
発明の不溶性ポリマー支持体を用いたペプチド鎖の逐次合成方法が提供される。
好ましくは、かかる方法は、それに結合されたペプチド鎖を有する不溶性ポリマ
ー支持体を選択的な化学開裂に付すことにより、ペプチド鎖中の任意の共有結合
形ペプチドーポリマー結合またはペプチドリンケージの重大な開裂なしに架橋剤
の該リンケージの開裂を行って可溶化ペプチド−複合体を得る工程をさらに有す
る。
所望により、ペプチド−ポリマー結合は開裂してポリマーからペプチド鎖を遊離
できる。
さらに本発明の他の実施態様によれば、ペプチドが抗原と免疫的に交叉反応でき
る本発明の不溶性ポリマー−ペプチド複合体を合成し、架橋剤を開裂することに
より不溶性ポリマーを可溶性にしてなる、in vivoで抗原に抗血清を生じ
させるワクチンの製造方法が提供される。該ポリマー−ペプチド複合体はペプチ
ドを不溶性ポリマーに共有結合させることにより合成されるが、好ましくは、該
ペプチド自体は該不溶性ポリマー支持体上で合成される。
本発明の他の実施態様によれば、本発明の可溶性ポリマー−ペプチドを、緩衝液
および/または生理食塩水等の医薬上許容される賦形剤に投入してなるワクチン
の製造方法が提供される。さらに、ペプチドが抗原と免疫的に交叉反応できる本
発明の有効量の可溶性形態のポリマー−ペプチド複合体を哺乳動物に接種してな
る抗原に対する哺乳動物の免疫化方法が提供される。
また、
(a)その上に本発明の可溶性ペプチド−ポリマー複合体が吸収された不溶性支
持体からなり、ペプチドが興味ある抗体に対する特異抗原である抗体試験または
精製装置、
(b)興味ある抗体を含有する溶液が該装置と接触する抗体の精製方法、並びに
(c)抗体を含有する溶液および該装置を収容するためのインキュベーション浴
からなる抗体の精製用キットも本発明の範囲内に含まれる。
ここで用いる[抗体Jなる用語は、細胞受容蛋白質、免疫グロプリンおよび核酸
を含む任意の生物分子を意味し、特異的なリガンドまたは抗原に結合できるか、
またはそれらと複合できる。
前述のごとく、好ましい不溶性支持体は、重合して可溶性ポリマー鎖を形成でき
る少なくとも1つの重合性モノマーと、ペプチド結合または共有結合形ペプチド
ーコポリマーリンケージの重大な開裂を引き起こさない条件下で可溶性コポリマ
ーフラグメントを生じる選択的に化学開裂できる結合を有する架橋剤から構成さ
れた架橋コポリマーからなり、譲歩なくとも1つの重合性モノマーが、ペプチド
鎖を該コポリマーに共有結合で付着させる官能基を有するモノマーを含む。かか
る支持体の典型的な例は、ジメチルアクリルアミドを含有するモノマーからなる
コポリマーである。官能基を有する該モノマーはアルキレンエステル基(例えば
、式−(CH*)n−CO、OR(式中、nは典型的には8以下の整数、Rはア
ルキル基を意味する))で示されるような保護されたヒドロキシル基を有する化
合物であり、C末端リンケージによるペプチドの共有結合での付着を可能とする
遊離ヒドロキシル基を生じさせるような暖和で、好ましくは塩基性の反応条件下
で開裂を受けることができる。かかるモノマーの例としては、アクリロイルサル
コシンメチルエステルおよび6−アセドキシヘキシルアクリルアミドが挙げられ
る。好ましくは、保護されたヒドロキシル基は、モノマーの重合性基、例えばア
ルリルラジカルから少なくとも約4原子、好ましくは約6原子の所にある鎖の端
部で担持されるため、該保護ヒドロキシル基はポリマー主鎖から分離される。該
原子の鎖は炭素、酸素および/または窒素原子を含んでもよい。
モノマーと架橋剤の比率は、選択的な化学開裂の後に可溶性ポリマーまたはコポ
リマー鎖が得られるように選択されなければならない。特に好ましい例では、ペ
プチド合成に使用される不溶性支持体は、ジメチルアクリルアミド、N、N’
−ビスアクリロイル−2,2−ジー(2′ −アミノエトキシ)プロパンお上び
6−アセドキシヘキシルアクリアミドを17.6:1.2:1のモル比率で重合
させることにより製造できる。この重合は、例えば、開始剤として過酸化ベンゾ
イル(0,3モル比率)を用いて脱酸素したジメチルホルムアミド溶液中で行う
ことができる。
本発明の不溶性支持体の処理を容易にするため、珪藻土、好ましくは多孔性珪藻
土のような不活性支持体上でin 5itu重合により不溶性ポリマーまたはコ
ポリマーを形成するのが好ましい。このようにして、カラム反応器内で連続流ペ
プチド合成に適した物理的に支持されたポリマーまたはコポリマーが製造できる
(エイ・ドライランド(A、 Dryland)およびアール・シー・シェパー
ド(R,C,5heppard)、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティ
ー、パーキンI (J、Chem。
Soc、 Perkin I)、1986.125)。
以下、ペプチド−ポリマー複合体:
(i)H−Arg−Pro−Lys−Pro−Gin−にIn−Phe−Phe
−G ly −L eu −N Ie−ポリマーおよび(ii)H−His−
Lys−Thr−Asp−Ser−Phe−Vat−Gly −Leu−Met
−Gly−ポリマー
「式中、「ポリマー」は、その構造が以下の記載から明らかである不溶性ポリマ
ーまたは水溶性ポリマー鎖の合成の各段階のポリマーを意味する]で示される合
成について概説して本発明の不溶性ポリマーの使用例を示す。ペプチド配列(i
)および(ii)は、各々、「基質P」および「基質KにエーロキニンA)Jと
して知られる神経ペプチド類に関する。これらの神経ペプチドは実質的に免疫原
性であり、通常、低濃度の遊離ペプチドが血漿中で循環する。これらの配列は、
F utmoc−ポリアミド連続流技術(エイ・ドライランドお上びアール・シ
ー・シェパード、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー、パーキン1,
1986.125)を用い、本発明の不溶性ポリマー支持体、例えば、ジメチル
アクリルアミド、6−アセドキシヘキシルアクリルアミドおよびN、N’ −ビ
スアクリロイル−2,2−ジー(2′−アミノエトキシ)−プロパン(以下、「
ポリマーA」または「ケタールポリマー」ト呼ぶ)の珪藻上上で支持されたコポ
リマー上で組み立てることができる。用いる他の不溶性コポリマー支持体は、ジ
メチルアクリルアミド、N、N’ −ビスアクリロイル−ジアミノエトキシメタ
ンおよびアクリロイルサルコシンメチルエステル(以下、「ポリマーB」または
「ホルマールポリマー」と呼ぶ)を共重合することにより調製された。遊離アミ
ノ末端部に対して向けられた抗体の主形成は次の免疫化スケジュールにおいて予
期されるため、合成を容易にするためにポリマー−結合型C末端配列が修飾され
る。さらに新規なN末端抗体の形成は、タキキニン(tachykinins)
と同一のC末端配列を区別するのに有利である。
ジアミノエタンを用いて不溶性ポリマーA支持体中の6−アセドキシヘキシルア
クリルアミドモノマーの残基から保護アセチル基を除去した後、ジメチルアミノ
ピリジンの存在下、F woe−アミノ酸無水物を用いて第1のアミノ酸残基を
樹脂にエステル化し、脱保護ヒドロキシル基と反応させる。ペプチド−ポリマー
複合体(i)の場合、無水!−ヒドロキシベンゾトリアゾール触媒の存在下、式
:(エイ・ドライランドおよびアール・シー・シェパード、テトラヘドロン・レ
ターズ、1988.44.859)で示されるF raoc−アミノ酸ペンタフ
ルオロフェニルエステルとして次の残基を添加し、ペプチド−ポリマー複合体(
11)の場合、式:(イー・アサ−トン、キヤメロン・エム・メルダルおよびア
ール・シー・シェパード、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー、ケミ
カル・コミユニティ−11986,1763)で示される対応する3−(3,4
−ジヒドロ−4−オキソ−ベンゾトリアゾール)エステルである。Fmoc−0
−t−ブチル−セリンおよびスレオニンの非結晶性エステルの代わりに無水物が
用いられる。適当なアミノ酸側鎖保護用にt−ブチルエステル、エステル類また
はt−ブトキシカルボニル誘導体が用いられる。アルギニンは4−メトキシ−2
,3゜6−ドリメチルベンゼンスルホニル(Mtr)誘導体として保護された。
塩基不安定性フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸誘導体の使用により、通
常の固相合成の酸性反応条件が完全に回避される。水か存在しなければ、反応混
合物中に存在する(ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはペンタフルオロフェノ
ールのような)弱い酸性覆によるポリマーの溶解の証拠は得られなかった。不溶
性ペプチド−ポリマー複合体(ii)を可溶化し、「側鎖」脱保護し、95%の
水性トリフルオロ酢酸で90分間処理することにより不溶性珪藻土支持体から分
離した。フェノールの存在下、アルギニン含有ベブチドー不溶性ポリマー複合体
(i)の脱保護を一夜行った(MLr−基の開裂)。
この処理後、両方のペプチド−ポリマーA複合体試料(i)および(ii)は自
由に水に可溶し、分子量が50.000を超えると仮定すると、基質に関連ポリ
マーはゲル透過クロマトグラフィー上の空隙容積中で溶離する(セファデックス
(Sephad−ex)G 75 )。ポリマーへ対抗品に比べて対応ペプチド
ポリマーB複合体を可溶化することは幾分か困難であった。
これらの実験では、カルボキシ末端エステルリンケージでの可溶性ペプチド−ポ
リマーの適合度、線状ポリマーからのゲル濾過並びにhplc特性決定およびア
ミノ分析により合成の適合度を確認した(実測値=(1)については、Arg、
1.01 ;Pro、2.04;Lys、1.02;Glu、2.10:Phe
、1.94;Gly、1.04:Leu、1,00;Nle。
1.02;(ii)については、His、0.93:Lys、0.98:Thr
、0.99:ASp、1.01;Ser、0.86;Phe、0.97;Val
、1.00;Leu。
J、00;Met、0.94;Gly、2.01)。
前述のすべてのペプチド−ポリマー複合体はウサギに免疫原性がある。ホルマー
ルおよびケタール基質P−ポリマー(例えば、可溶化基質−Pホルマールポリマ
ー複合体および可溶化基質P−ケタールポリマー複合体)は両方とも、1:50
0以上でかつ免疫化スケジュール中の類似点での通常の基質P−牛血清アルブミ
ン複合体により誘発されたものより優れた有用な抗体価を生じる。基質Pに対す
る抗体は、″5■−ボールトンーハンター試薬によりアミノ末端で標識されたペ
プチドを用いて検出できる。基質Kに対する抗体は後述のプロッティング(bl
otting)法を用いて検出できる。
本発明の重要な用途は、その上で本発明の可溶性ペプチド−ポリマー複合体が吸
収される不溶性支持体からなる、取り扱いに有利な新規生成物を提供することで
ある。かかる生成物は多数の抗体を含む抗血清から、ペプチド抗原に対して特異
抗体を単離するのに用いることができる。以下、かかる生成物の使用例について
述べる。
ニトロセルロース膜上に吸収されたペプチド−ポリマー複合体をペプチド抗血清
でインキネベートした。ヒツジ抗つサギIgG抗血清およびウサギパーオキシダ
ーゼ−抗パーオキシダーゼ複合体並びにクロモーゲンとしてのジアミノベンジジ
ンを用いて抗体結合部位を検出した(z 7L/ −:xイ・ステルンベルガー
(L、A、 3ternxberger)、イミエノサイトケミストリー(Ia
auocytochemistry)、第3版、二s−ヨーク州、プレンティス
・ホール(Prentice Ba1l)、1986)。
この方法により、基質Pおよび基質にポリマーで各々免疫化されたウサギから、
血清中の基質Pおよび基質Kに対する抗体を検出した。
ニトロセルロースに結合された1n9以下のペプチド−ポリマーが検出可能であ
り、このような条件下では該ポリマー自体は全く反応しない。蛋白質に結合され
た適当な合成ペプチドを用いて通常に作成された抗ペプチドーポリマー複合体に
より、ペプチド−ポリマー複合体のプロットを検出した。
可溶化でき、さらに溶液中で手技(manipulate)される不溶性ゲル支
持体を固相合成で用いる一般的原理は重要であると考えられる。
前述と同様の用途では、効果的に合成されたペプチドの分離は通常必要とせず、
それにより、免疫原を生じさせる非常に急速で単純な方法が提供される。該方法
はペプチドワクチンの経済的な大規模生産のためには特に重要であり、それによ
り、免疫化学における重要な手段が提供されることは当業者が認めるところであ
ろう。
以下、実施例および添付図面により本発明をさらに詳しく説明する。
第1図は、本発明のポリマー−ペプチド複合体を用いて作成した抗血清のIgG
フラクシッンと基質p(xllsで標識された)の結合を示す。
第2図は抗血清と基質Pフラクションの交叉反応性を示す。
第3図は抗血清による遊離標識された基質Pの3つの異なった抗原への結合を示
す。
第4図および第5図は放射性同位元素標識免疫測定流体における遊離ペプチドに
対するポリマー結合ペプチドの競合能力を示す。
アール・アーシェデ4−(R,Ar5hedy)、イー・アサ−トン(E。
Atherton)、ディー・エル・ジエイ・クリープ(D、L、J、 C11
ve)およびアール・シー・シェパード(R,C,5heppard)、ジャー
ナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー、パーキン1.19B1,529の方法
の修飾により、ポリマーをビードゲル樹脂として調製した。通常の架橋剤、N、
N’ −ビスアクリロイル−1,2−ジアミノエタンの代わりにN、N’ −ビ
スアクリロイル−ジアミノエトキシメタンを該ポリマーに組み込んだ。
N、N’ −ビスアクリロイル−ジアミノエトキシメタンの調製:アール・エフ
・ウェブ(R,F、 Webb)、エイ・ジエイ・デエーク(A。
J、 Duke)およびエル・ニスーzイ・スミス(L、S、A、 Sm1th
)、ジャーナル・オプ・ケミカル・ソサイエテイー、1962.4307〜43
19に記載されたように調製したジアミノエトキシエタン(109,74,6ミ
リモル)を入れたフラスコに無水クロロホルム(51cm’)を添加し、ついで
、無水酢酸ナトリウム(13,609,163ミリモル)を添加した。混合物を
電磁撹拌機で撹拌し、氷水浴中で0℃に冷却した。希釈した塩化アクリロイル(
13,59y、150ミリモル)を1時間かけて滴下した。添加を完了すると、
該混合物に約0.19のヒドロキノンを添加し、これを35分間還流し、ついで
、冷却した。水(200cmつを添加し、有機相を除去して保持した。塩化ナト
リウムを水性相に添加し、該水性相をクロロホルムで完全に抽出した。合したク
ロロホルム抽出物を乾燥しくNatSO4)、蒸発させた。生成物を熱い酢酸エ
チルから再結晶化し、真空中で乾燥して白色の結晶性固体を得た。収量14.5
59(収率80%)、融点104〜105℃、酢酸エチル−アセトン(1: 1
v/v)中のtic(シリカ)、[0,39、nmr、δ(CDCLs、60
MHz)3.6(8H,多重線、CHlCtHO)、4.6(2)1,1重線、
0CR1O)、5.5(2H。
多重線、CH*=CHC0)、6.1(4H,多重線、 CHを冨CHCO)。
6.7(2H,1重線、=CHC0NH)、実測値:C54,63,N7゜39
、N11.32゜元素分析:C,、H,、N、O,として、計算値:C54,5
3,N7.49.Nl 1.56%。
懸濁重合:
酢酪酸セルロース(イーストマン(Eastman)、17%ブチリル、AST
M粘度15X6.25g)を清浄希釈したジクロロエタン(150cmつ中に完
全に溶解し、撹拌機お上び窒素流入口を備えかつ熱制御された水槽内で50±℃
に保持された円筒状の段付重合容器に没入した。ジメチルアクリルアミド(7g
、70.6ミリモル)、アクリロイルサルコシンメチルエステル(1,59,9
,37ミリモル)およびN、N’ −ビスアクリロイルジアミノエトキシメタン
(1,269,5,20ミリモル)からなるモノマー混合物を添加する前に、溶
液を450±20 rp+iで撹拌し、N、で15分間フラッジし、冷却した(
5℃)ジメチルホルムアミド−水(1:2X75cm’)で希釈し、過硫酸アン
モニウム(1,1259)と十分に混合した。緩やかな窒素流下で約tsh重合
を続けた後、混合物を冷却し、アセトン−水(1:1v/v)で希釈し、均質懸
濁液が得られるまで撹拌し、ついで濾過した。回収したポリマーをさらにジメチ
ルホルムアミドで洗浄し、任意の微粒子をデカンテーションにより除去した。最
後に、ポリマーをジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥した(P、011)
。収量7.79のビード樹脂(実測値:サー(Sar)、0 、78 mequ
iv、 9−’)。
前述の懸濁重合技術を用い、ポリマーを容易にすぐれたビード形態で得た。重合
混合物中のアクリロイルサルコシンメチルエステル量の変化により、変動官能価
を有する樹脂が調製できる。0.78mequiv、 g−+の樹脂に加えて、
さらに少ないサルコシン含量(0,23+equiv、 g−’)を有する樹脂
も調製した。一定量のN、N’ −ビスアクリロイルジアミノエトキシメタンを
2度配合して最終樹脂の膨潤度を制限した。一般に、コポリマーの架橋結合密度
が大きい程、一定の溶媒系中であまり膨潤しない。したがって、樹脂の官能価が
変化するだけでなく、適当な膨潤性も制御できる。
ペプチド合成では、ビードポリマーを用いる必要はない。また、新しいポリマー
も、製造された珪藻土支持体の空隙内で、共重合の方法により調製される。新規
な架橋剤、N、N’ −ビスアクリロイル−1、!−ジアミノエタンを配合する
ポリマーの一般的な方法は、イー・アサ−トン、イー・ブラウン、アール・シー
・シェパードおよびエイ・ローゼビアー、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイ
エティー、ケミカル・コミユニケージジン、1981,1151により記述され
た。
DES−アミド−[11−Nle]−基質P−ポリマーの固相合成りOC,^r
g、 Pro、 Lys (BOC)Pro、G In、G In、 Phe、
Phe、G ly、Leu 、 N1e−樹■
ジメチルアクリルアミド−N 、 N ’ −ビスアクリロイルジアミノエト
キシメタン−アクリロイルサルコシンメチルエステル・コポリマー(0,59)
を再希釈されたエチレンジアミン(20cm’)と共に室温で一夜振盪した。得
られた樹脂をDMF(10x 1分)、DMF’中lO%ジイソプロピルエチル
アミン(3x1分)、DMF(10X 1分)で完全に洗浄した。イー・アサ−
トンおよびアール・シー・シェパード、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエ
ティー、ケミカル・コミュニケーション、1985.165に記載されたように
調製し 。
たフルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)−Nle−ペンタフルオロフェ
ニルエステルを用いてアミノ樹脂をアシル化しく1.0ミリモル、60分)、F
MOC基を20%ピペリジン−DMPで開裂した。ノルロイシンの取り込みは0
、6 mequiv、 9−’であった。
樹脂をDMF中で膨潤させ、半分の体積を除去した。残った半分を反応セル中で
保持し、修飾されたベックマン(Becka+an)990ペプチド合成装置(
イー・アサ−トン、シー・ジエイ・ローガンお上びアール・シー・シェパード、
ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー、パーキン・トランスケーション
ズ!、198L538参照)を用いる基質Pの合成に使用した。結合反応のため
、FMOC−アミノ酸を、そのペンタフルオロフェニルエステル(L eus
G lysPheおよヒPro)またはp−ニトロフェニルエステル(Ginお
よびLys(B OC))として活性化した。触媒ヒドロキシベンシトリアール
の存在下で該p−ニトロフェニルエステルを結合させ、その等偏量を反応混合物
に添加した。各活性化されたDMF(約4.5cm”)中のFMOC−アミノ酸
(0,5ミリモル)を添加し、ついで、脱保護ペプチド−樹脂を添加した。ニン
ヒドリンおよび2,4.6−)リニトロベンゼンスルホン酸試験により定性的に
判定されたカップリング反応を約60分以内で完了させた。
合成を完了させるため、BOC,Arg(HCQ)−OH(2,4ミリモル)を
DMF(5cm’)中ジシクロヘキシルカルボジイミド(1,2ミリモル)で5
分間予備活性させ、全反応混合物を樹脂に添加した。有利には、−夜アシル化を
行う。
残基4(Phe)、6(Gin)、9(Lys)および11(Arg)の添加お
よび脱保護の後でアミノ酸分析用のサンプルを除去した。
工程 4 6 9 11Nle O,970,
97G、97 0.97Leu 1.00 0.99 1.0
0 1.00Gly 1.00 1.00 1.00 1
.00Phe 1.02 2.06 2.05 2.06Gi
n 1.01 2.06 2.03Pro
O,971,92Lys
O,910,92Arg
0.91最終のペプチド−樹脂をDMF’およびジエチルエーテルで
完全に洗浄し、真空中で乾燥して0.33 ミリモル9°1のペプチド負荷を有
する樹脂0.3239を得た(ペプチド104.6マイクロモル)。
来皇鳳l
可溶化実験
ゲル樹脂
90%の水性トリフルオロ酢酸(TFAX7cj+9をビードゲルポリマー(サ
ー(Sar)、0.78 mequiv、9一つ(50xg)に添加し、該ポリ
マーは膨潤したが溶解しなかった。混合物を室温で24時間、勢いよく振盪する
と、該ポリマーが溶解して透明な均質溶液を得た。
これを蒸発・乾燥してガラスを得た。水(7cmつを添加し、さらに振盪した(
6h)後、粘性溶液を得た。該溶液のpHを塩基でpH7,0に調整した。充填
されたセファデックス(Seph−adex)G 25カラム(83X 2.5
cm)l:+7フル(0,5cm”)を適用し、水中Z’ 溶離L、一定の空隙
容積(分子量>5,000)で溶離されることが判明した。
実施例1で記載したように調製した高負荷H−Nle−樹&(0,6ミリモル9
一つのサンプルを純粋のTFA(10cmつと共に室温で24時間振盪した。溶
液を濾過して少量の不溶性物質を除去し、濾液を蒸発・乾燥した。残渣は水(2
,0C111つに容易に溶解して7.7マイクロモルN1e(回収率90%)を
含む溶液を得た。充填されたセファデックスG50カラム(87X2.5CI)
に、この溶液サンプルを適用し、水中で溶離し、一定の空隙容積(分子量>30
.000)で溶離されることが判明した。
実施例3
Des−アミド−[N1el−基質P−ポリマーlO%v/vレゾルシノール(
20cmつを含む95%の水性TPA溶液を、実施例1で記載したように調製し
た保護基質P−(Nle)−樹脂(20s+y)に添加した。樹脂は膨潤し、つ
いで、混合物を室温で48時間、勢いよく振盪した。粘性溶液を蒸発させて白色
固体を得、それをジエチルエーテル(2X3cs+つで洗浄した。粘着残渣に水
(30cmつを添加し、混合物を室温で一夜振盪した。水性の泡状の溶液を濾過
して少量の不溶性ゲルを除去し、濾液を収集し、凍結乾燥して白色粉末を得、該
粉末は大部分がジエチルエーテル(2cmつに溶解した。残留したゼラチン状の
固体は水(3CI”)1こ容易に溶解し、充填されたセファデックスG50カラ
ム(87x2.5cm)に溶液 (pH7,0)を適用し、水中で溶離した。溶
離剤を210nmで連続的にモニターし、フラクション・コレクターで収集した
。107〜250ci”(Vo= 152cmつで溶離すルフラクシクンを合し
、真空中で濃縮した。残留溶液を凍結乾燥して白色固体を得、該固体は水(3c
x’)に容易に再溶解して僅かに粘性である溶液PG 3152を得た。アミノ
酸分析により、ペプチド−ポリマー溶液PG3152は0.88ミクロモルのペ
プチド(1,15u)、Arg(0,89)、Lys(0,90)、Pro(1
,85)、Gin(2,03)、Phe(2,09)、Gly(1,00)、L
eu(0、9,8)、N1e(0,96)を含んでいた。
該溶液を次の免疫学研究で直接用いた。
最初の水性濾過工程中に単離された不溶性ゲルを保持し、凍結乾燥して白色固体
(1319)を得、該固体をアミノ酸分析で分析し、=3.3アミクロモル(4
,489)のペプチド、Arg(0,89)、Lys(0,93)、Pro(1
,94)、Gln(2,04)、Phe(2,07)、Gly(1,00)、L
eu(0,98)、N1e(0,97)を含んでいることが判明した。該固体を
2 cm”の水中でゲル化し、これを免疫学研究に直接用いた。
亙嵐匹工
免疫学的研究
実施例!で記載したように調製したペプチド−ポリマー溶液PG3152(3C
I”の水に溶解した1、1519のペプチド)で、ダッチベルテッド(Dutc
h belted)ウサギを免疫化した。該動物に、0 、5 cx”のフロイ
ント完全アジュバントCDIFCO)で乳化された1 、 0 cm’のPG3
152(0,5cz’)の注射を行った。後くに静脈注射を行った。最初の免疫
化から4週間後に、再度注射を行い、ペプチド−ポリマー溶液をフロイント不完
全アジュバントで乳化した。2回の免疫化後のウサギの耳の静脈から採血し、血
清フラクション(2,5CI3)の1118−ボールトン−ハンター基質Pトレ
ーサーを結合する能力を試験した(5.OOOcpm)。トレーサー結合は3回
の免疫化の後で検出でき、最良のウサギでは1 :400の力価プラトーに達し
た。この低い力価の結果、免疫グロブリンフラクション(IgG)が硫酸アンモ
ニウム分画およびDEAEセルロースコロマドグラフィーにより調製された。こ
れにより、抗体が通常のIgGフラクシゴンを作り、明白なトレーサー結合およ
び抗体希釈曲線(第1図)が得られることを確実にする。抗血清と基質P類似体
の特徴(第2図)は、該抗血清が基質Pおよび基質P−(1−8)を認識するが
、より小さいアミノ末端フラグメント基質P−(1−4)並びにカルボキシル末
端類似体基質P−(5−11)および基質P−(6−11)の几めの悪い親和性
を示すのみであることを示す。予期されることであるが、これは、抗血清が基質
Pのアミノ末端に対して向いていることを意味する。関係するペプチド、全く異
なったアミノ末端を有する基質KにューロキニンA)は1000倍モル過剰でさ
えも抗血清と交叉反応しなかった。
寒凰五旦
6−ヒトロキシヘキシルアクリルアミドの調製27.59のNatCOs ・1
0HtOおよび50zf2のアセトンの水L50xQ中溶液に6−アミノヘキサ
ノール(4,50y、38.4ミリモル)を溶解した。この溶液を水浴中で冷却
した。3.43;、Qの塩化アクリロイル(42,2ミリモル)のアセトン30
zQ中溶液を40分かけて滴下した。水浴中で1時間、室温で30分、反応を行
つf:。
溶液がNatCOs中で飽和するまで溶媒を真空中で除去した。ついで、溶液を
5X25峠の酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を合し、Na、SOa上で乾燥
させた。濾過・蒸発後、粗原料の収量は5.819であった。残渣を沸騰エーテ
ルで数回抽出した。蒸発後、収量は4.849C28,3ミリモル、収率73%
)であった。融点58〜59℃。TLCRf O,22(CHCf2z:MeO
H,9:l)、元素分析:CsH,、No、とじて、計算値:C,63,13%
、H,10,00%:N。
8.18%。実測値:C,63,19%:H,9,17%、N、8.04%。
6−アセドキシヘキシルアクリルアミドの調製6−ヒトロキシヘキシルアクリル
アミド(4,009,23,4ミリモル)、無水酢酸(4,4LxQ、 46.
8ミリモル)およびジメチルアミノピリジン(23,3JI9.2.gミリモル
)を15iQのピリジン中に溶解し、室温で4時間反応させた。溶媒を除去した
後、残渣を100xQの酢酸エチル中に溶解し、MCIおよびブラインで洗浄し
た。
N a * S 04上で乾燥させ、有機溶液を濾過し、溶媒を真空中で除去し
て黄色のシロップを得た。ベンゼン、ついでヘキサンを添加し、蒸発させること
により、再結晶を誘発させた。粗原料の収量4,849、融点38〜45℃。こ
の粗生成物3.59を、木炭で脱色したEtOAc20xe中に溶解し、ヘキサ
ン200112中に滴下した。撹拌と同時に物質が再結晶した。4℃で一夜放置
した後、生成物を収集した。収量2.509C71%が再結晶)、融点43〜4
3.5℃。TLCRf O,47(CHCe、:MeOH9:1)。NMR:δ
(CDCム)6.67(br、s、lH,NH)、5.5〜6.4(M、3H,
CH*=CH−)。
4.03(tr、J=6Hz、2H,CHtO)、3.30(br、q、3H。
CHIN)、 2 、02 (s、 3 H,COCHs)、 1.4 (a、
8 Ho(CHS)4)。
元素分析:C□HtmNO*として、計算値:C,61,95%:H,8,98
%:N、6.56%。実測値:C,62,09%:H,9,09%:N、6゜5
1%。
2.2−ジー(2−フタルイミドエトキシ)プロパンの調製50.09のヒドロ
キシエチルフタルイミド(0,26モル)のベンゼン20011Q中溶液をガラ
ス螺旋の10インチカラムを通してゆっくりと蒸留し、微量のHloを除去した
。冷却後、16酎の2.2−ジメトキシプロパン(0,13モル)および15m
gのパラ−トルエンスルホン酸をベンゼン溶液に添加した。混合物を還流し、ベ
ンゼン−メタノール共沸混合物を55℃で蒸留した。ヘッド温度の不意の上昇は
TLCが反応を完了したことを示すため、511Q以上の2.2−ジメトキシプ
ロパンを添加した。全体で40112の蒸留物を収集するまで蒸留を続けた。ベ
ンゼン中アンモニアで反応を中和し、濾過した。ベンゼンを真空中で蒸発させ、
残渣を真空中で乾燥させて53.99の粗生成物を得た。この物質を3001+
2の酢酸エチルから再結晶化して22.19の白色結晶を得た。0.054モル
、収率41%、融点139〜141”CoNMRδ(CD012s)7.50(
m、8H,芳香族CH)、3.33(s、8H,NCHICHtO)、1.23
(s、6H,一対の(CHS)*)。TLCRf O,4B(CHCQ*:Me
OH98:2)。
2.2−ジー(2−アミノエトキシ)プロパンの調製2.2−ジー(2−フタル
イミドエトキシ)プロパン(46,29,0,11モル)、水酸化ナトリウム(
43゜71F、1.10モル)および100J112のHloを合し、20時間
還流した。冷却後、この溶液を液体−液体抽出器中、p−ジオキサンで20時間
抽出した。回転蒸発によりp−ジオキサンを除去して黄色油を得た。数曲を減圧
下で蒸留し、!2゜59の無轍透明の油を得た。0.077モル、収率71%。
沸点107〜110℃10.18xxH9゜NMRδ(CD CI!*) 3
、41 (tr。
4H,J=6Hz、CHtO)、2.78(tr、4H,J=6Hz、NCHt
)。
1.33(s、6H,一対の(CHs)t)、1.20(s、4H,NH,)。
N、N’ −ビスアクリロイル−2,2−ジー(2−アミノエトキシ)プロパン
の調製
450mQの0.67M炭酸カルシウムおよび130x(!のアセトンからなる
溶液に2.2−ジー(2−アミノエトキシ)プロパン(II。
0g、67.8モル)を溶解し、水浴中で冷却した。150mQのアセトン中に
溶解した塩化アクリロイル(18,1xQ、223ミリモル)を滴下し、溶液を
一夜撹拌した。溶液が塩中で飽和するまで、アセトンおよび水を真空中で乾燥さ
せた。ついで、溶液を6X50112のクロロホルムで抽出した。クロロホルム
抽出物を合し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で除去してシ
ロップを得た。
ベンゼンを添加して結晶を得た。蒸発後、14.6yの粗生成物を得た。この物
質を、酢酸エチルおよびヘキサンから結晶化して13゜19の白色結晶を得た。
48.6 ミリモル、収率72%。融点94〜95℃。NMRδ(CD012s
)7.0(br、s、2H,NH)、5.7〜6 、5 (a、4 H,= C
H,)、 5 、50 (tr、 2 H,−CHt=)、3.47 (+a。
8H,NC)(ICH!O)、1.30(8,6H,一対の(cHs)*)。元
素分析:C+sH□N、O,として、計算値:C,57,76%、H,8,20
%;N、10.36%。実測値:C,057,79%、H,8,18%、N、1
0゜29%。
珪藻土支持コポリ(ジメチルアクリルアミド−6−アセドキシアクリルアミドー
N、N’ −ビスアクリロイル−2,2−ジー(2−アミノエトキシ)プロパン
の調製
ジメチルアクリルアミド(3,359,33,8ミリモル)、6−アセドキシヘ
キシルアクリルアミド(0,4099,1,92ミリモル)およびN、N’ −
ビスアクリロイル−2,2−ジー(2−アミノエトキシ)プロパン(0,627
9,2,32ミリモル)を8m12のDMF’中に溶解し、N、ガスを溶液中に
15分間吹き込んだ。同時に、DMF511Q中過酸化ベンゾイル(2,19ミ
リモル)溶液0.530v中にN。
ガスを15分間吹き込んだ。N、脱酸素化の後、モノマー溶液と2.5順の開始
剤溶液を混合し、均圧化チューブを備えた滴下漏斗に投入した。該滴下漏斗を、
109の珪藻土を入れたtoo、wf丸底フラスコ上に取り付けた。水流吸引器
により、系を5分間減圧した。
ついで、該溶液を1回で珪藻土中に投入した。ポンプを作動させながら、装置を
持ち上げて静かに振盪し、珪藻土中の溶液を均一に分散させた。3分間振盪した
後、装置を真空と遮断し、N、を入れた。
装置のフラスコを60℃の湯浴中で20分間保持した。室温で17時間保持した
後、生成物を焼結物(sinter)上で収集し、DMFおよび0.05Mの水
性トリスで洗浄した。ついで、ハンドプレスを用いて700μlスクリーンを通
させ、0.05M)リスで洗浄した。
ビードを収集し、0.05M)リスを用いてデカンテーションにより微粉を除去
した。ついで、樹脂をDMFおよびEttOで洗浄し、真空下、5ide上で乾
燥した。収11:11.849゜ポリマー含量22.2%。
実施例6
Des−アミド−[11−ノルロイシン−基質−P−ポリマーの合え
ジメチルアクリルアミド、6−アセドキシヘキシルアクリルアミドおよびN、N
’ −ビスアクリロイル−2,2−(2−アミノエトキシ)プロパンからなる珪
藻土支持ポリマー(1,109)を適当なジアミノエタンと共に一夜振盪した。
DMFで洗浄した後、ベンチトップ(benchitop)モデルの連続流合成
装置(ドライランド・エイ・ディー、シェパード・アール・シー、ジャーナル・
オブ・ケミカル・ソサイエティー、パーキン・トランスアクションズI、198
6.125〜137参照)上の反応カラム中に樹脂を投入し、流出液がニンヒド
リンに対して陰性になるまで、さらにDMFで洗浄した。
9−フルオレニルメトキシカルボニルノルロイシンの対称無水物(Fmoc−N
le−OH)0.38ミリモルで樹脂をアシル化した。該無水物は、0.282
9のFmoc−Nle−OH(0,8ミリモル)を10xQのジクロロメタン中
に溶解し、0.07849のジシクロカルボジイミド(0,38ミリモル)を添
加することにより調製した。20分後、ジシクロへキシルユリアを濾過し、溶媒
を真空中で蒸発させた。残金を1xQのDMF中に取り、樹脂を塗布してベッド
中に浸漬した。
0 、5 xQのDMF中ジメジメチルアミノピリジンMAP、0.0229.
0.1ミリモル)を添加した。試薬を系中で再循環させ、60分間アシル化を行
った。樹脂を流し出した後、一定量の(Fmoc−Leu)t。
およびDMAPを用いる同一の方法で再アシル化した。0,4ミリモルの無水酢
酸および0.1ミリモルのDMAPで樹脂をキャッピング(cap)L、た。つ
いで、20%ピペリジでのFIIlOc脱保護および0.4ミリモルの適当なN
α−FIlloc−アミノ酸D hbtエステル(アサ−トン・イー、メルダル
・エムおよびシェパード・アール・シー、ジャーナル・才ブ・ケミカル・ソサイ
エティー、コミユニケージジン・コミユニティ−11986,1763)の溶液
1 、5 zQでのアシル化からなる連続サイクルでペプチドを加工した。カイ
ゼル(Kaiser)ニンヒドリン試験((カイゼル・イー(Kaiser E
、);コレスコツト・アール・シー(Colescott R,C,):ボッシ
ンガー・シー・ディ(BossingerC,O,);クック・ピー・アイ(C
ook P、1.)、アナリティカル・バイオケミストリー(Analt、 B
ioches、)、34.595(1970))およびトリニトロベンゼンスル
ホン酸試験(ハンコック・ダブリス・ニス(Hancock Y、S、)、バッ
テルスビー・ジェイ・イー(BattersbyJ、E、)、アナリティカル・
バイオケミストリー、71261(1976))が陰性である時にカップリング
が完了していると判断した。溶解素の側鎖アミノ基をBOc基で保護した。Fm
ocArg(Mtr)OHの対称無水物としてアルギニンを添加した。合成の完
了後、N端末アルギニンからFmoc基を除去し、樹脂をDMFおよびエーテル
で洗浄した。脱保護および可溶化が必要となるまで、高真空中、KOH上で24
時間乾燥した後、珪藻土支持基質P−ポリマー複合体を一20℃で保存した。収
量1.069゜アミノ酸分析:Arg (0,87)、Pr。
(1,80)、Lys(0、89)、Gin(1,99)、Phe(2,02)
、cty(1,02)、Leu(1,00)、N1e(1,17)。負荷:珪藻
土樹脂1g当たり0.056ミリモルのロイシン。樹脂の有機含量:29.9%
。
実施例7
基 −P−ポリマー 合体の可溶化−脱保護実施例6で記載のように調製した珪
藻土支持保護基質−P−ポリマー複合体0.209を、トリフルオロ酢酸:フェ
ノール 95:5(v/v)十微量の水で17時間処理した。濾過後、トリフル
オロ酢酸を回転蒸発により除去した。水を添加し、真空中で蒸発させた。残金を
20xQのH,0中に溶解し、ジエチルエーテルで分配することにより有機副生
成物を除去した。水を蒸発させた後、残金を0.1M酢酸中に溶解し、最終容積
が5.3峠となるように、そのO、l z(1をアミノ酸分析用に採取した。残
部をセファデックスG−25カラム:寸法2.6X8B、5cx;溶媒0.1M
酢酸;流速1 、 Ox(1/分:lO畦フラクシロンに通した。高分子量ピー
クを収集し、凍結乾燥した。
高真空中、PetaおよびKOH上で24時間乾燥した後、重量は25.9であ
った。これを2.21のH2O中に溶解した。この溶液のアミノ酸分析により、
ロイシン含量が基質−P−ポリマー合成当たり!65ミクロモル、13112当
たり1.94ミクロモルであることが示された。免疫学的試験が必要となるまで
、この溶液を一20℃で保存した。
実施例8
基質−に−グリシン−ポリマーの合成
ジメチルアクリルアミド、6−アセドキシヘキシルアクリルアミドおよびN、N
’ −ビスアクリロイル−2,2−(2−アミノエトキシ)プロパンからなる珪
藻土支持コポリマー1.59を適当なジアミノエタンで一夜処理した。それをD
MFおよびエーテルで洗浄し、懸濁液をベンチトップ連続流ペプチド合成装置内
の反応カラムに投入した。ついで、基質−P−ポリマー合成に記載された最初の
アシル化に類似した方法でF會OC−グリシンの対称無水物 o、38ミリモル
で樹脂をアシル化した。無水酢酸でキャッピングした後、DMF中20%ピペリ
ジン7の10分間のF moc脱保護並びにDMFl、5xQ中の0.4ミリモ
ルの適当なNα−FaIoc−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルの溶液
1.5祿および0.1ミリモルの無水HOBtでのアシル化からなる連続サイク
ルでペプチドを加工した。無水エタノール中に溶解し、真空中で2回乾燥し、つ
いで、無水ベンゼン中で懸濁させ、真空中で2回蒸発させることに上りHOBt
を無水状態にした。対称無水物としてPmoc −5er(OtBu)−OHお
よびF+++oc−Thr(OtBu) −OHを添加した。ヒスチジンおよび
リシンの側鎖をBoc基で保護し、トレオニンおよびセリンをt−ブチルエステ
ルとして保護し、グルタミン酸をt−ブチルエステルとして保護した。通常、カ
ップリングは20分以内に完了し、ニンヒドリントリニトロベンゼンスルホン酸
試験により判定した。例外はカップリング時間にに一夜を要するヒスチジンであ
る。N末端ヒスチジンからP soc基を除去した後、樹脂をDMF’およびエ
ーテルで洗浄し、高真空中、KOH上で24時間乾燥した。可溶化および脱保護
が必要となるまで珪藻土支持基質P−ポリマー複合体を一20℃で保存した。収
量i、oot。
アミノ酸分析:His(0,79)、Lys(0,81)、Thr(0,96)
、Asp(1,01)、5er(0,96)、Phe(0,90)、Val(0
,90)、Gly(2,02)、Leu(1,00)、Met(0、89)。負
荷:珪藻土樹脂!2当たり0.055ミリモルのロイシン。樹脂の有機含量72
8.1%。
実施例9
基 −に−ポリマー複合体の可溶化および脱保護実施例8に記載のように調製し
た珪藻土支持基質−に−ポリマー複合体0.1009を51の95%TFAで9
0分間処理した。濾過することにより該珪藻土を除去し、511QのTFAで洗
浄した。合した濾液および洗液からTFAを蒸発させて無色透明のガムを得た。
これを5zQの0.1M酢酸中に溶解し、エーテルで洗浄した。o、1zQをア
ミノ酸分析用に採取した。残りの水性溶液をセファンデックスG−25カラム:
寸法2.5x88.5cR;溶媒0.1M酢酸;流速1、O*Q/分:10分フ
ラクションに通した。高分子量ピークを収集し、凍結乾燥した。高真空中、KO
HおよびP a Os上で24時間乾燥した後、重量は23.3gであった。最
終生成物のアミノ酸分析により、基質−に−ポリマー複合体1g当たり204ミ
クロモルのレシチンが示された。2xQのHto+sμCの酢酸中に生成物を溶
解し、免疫学的試験が必要となるまで一20℃で凍結した。
基 −に−ポリマー複合体の可溶化−説保護珪藻土支持基質一に一ポリマー複合
体0.1169を、TFA:H!O(95:5)10x(lで90分間処理した
。該珪藻土を濾過し、LOxQのTFAで洗浄した。合した濾液およびTFA洗
液から真空中でTFAを蒸発させ、得られた油を5.0村の0 、1 M酢酸中
に溶解した。この水性相溶液を3x2,5xi2のエーテルで抽出した。その容
積は4.6雇となり、アミノ酸分析用に0.2511+を除去した。
残りの溶液をセファンデックスG−25カラム:寸法35.5X2.5CI:溶
媒0,1M酢酸;流速1 、 OzQ/分:5分フラクシジンに通した。生成物
を含有するフラクシタンをプールし、凍結乾燥し、高真空中、KOH上で24時
間乾燥した。収量:13.lI9゜これを5酎のH2O中に溶解し、アミノ酸分
析用に0.25iI2を採取しf為アミノ酸分析により、ペプチド−ポリマー複
合体1g当たり260ミクロモル、1112当たり0.ロアミクロモルのレシチ
ンが示され几。
免疫学的試験が必要となるまで溶液を一20℃で凍結した。
X隻週上度
二にロセルロース膜上にブロッティングされたペプチド−ポリマー複合体による
抗体の結合
20μQ中0.1〜10μ9等量のペプチドを含有するペプチド−ポリマー複合
体のサンプルをニトロセルロース膜上にブロッティングした。プロットを乾燥し
た後、該膜を37℃で1時間、3%BSA(PBS/BSA)を含有する食塩加
リン酸緩衝液中に浸漬した。
該膜をPBS/BSA中で洗浄し、37℃で1時間、ウサギ抗ペプチド抗血清の
PBS/BSA中1:100希釈液511a中に浸漬した。
PBS中で洗浄後、ヒツジ抗つサイー1gG血清のPBS中1=50希釈液中で
膜を1/2時間浸漬した。該膜をPBS中で洗浄し、ウサギ抗ベルオキシダーセ
ーベルオキシダーゼ複合体中、37℃で1/2時間浸漬した。PBSを洗浄した
後、PBS中0.1%ジアミノベンジジン中で膜を被覆し、約1μQの30%H
t O*を添加することによりプロットを視覚化した。
実施例11
実施例9の基質−に−ポリマー溶液、実施例7の基質−P−ポリマー溶液の両方
について、プツチベルテッドウサギ中での抗ペプチド抗体を形成する能力を試験
した。第3図は、形成された抗血清による3つの異なる抗原:(1)珪藻土支持
樹脂上で合成された基質−P−ポリマー(ウサギ2L22)、(2)未支持ビー
ド樹脂上で合成された基質−P−ポリマー複合体(1ウサギ)および(3)基質
−P−BSA複合体(2ウサギ)に対する遊離標識基質−Pの結合を示す。
フロイント完全アジュバン〜ト中で乳化された基質−P−ポリマー200nlF
でウサギを免疫化し、同量のフロイント不完全アジュバントで2週問および6週
間増大し、8週間で採血した。基質−P−ポリマーはプツチベルテッドウサギ中
で免疫原性があり、通常の基質−P−BSA複合体に匹敵する抗体価を誘発する
(第3図および第1表)。同系統のウサギでは、基質−に−ポリマーに対する抗
体反応が生じ、ニトロセルロース・プロンティグ試験を用いて検出した。
第1表
4級1に敗
抗原 抗体a、b血清希釈溶液に対するIts 1−基質−P
の結合%
1:50 1:100 1:500 1:2000基質−P−ポリ? −57,
3c 50.6 2g、5 16.9JSMI−343B。
ウサギ21
基質−P−ポリマー 33.2 26.5 11.1 5.3J
SMI−343B。
ウサギ22
基質−P−ポリマー 29.2 24.6 13.5 10.5
第1表(続き)
抗原 抗体a、b血清希釈溶液に対するIts 1−基質−P
の結合%
1:50 1:100 1:500 1:2G00基質−P −78,276,
265,456,1a:希釈された血清を、IIJ−ボールトン−ハンター試薬
で標識された基質−Pでインキュベートした。木炭を添加して混合物を遠心分離
した。B−上清中のst数(抗体結合)、F=ペレット中の計数(遊離基質−P
)。
b:結合%冨B/(B+F)。
C:結合%は2つの値の平均である。
実施例12
ペプチド−KLH複合体およびペプチド−ポリマー複合体に対した作成された抗
体に対するペプチド−ポリマーの結合能カニトロセルロース上にペプチドポリマ
ー複合体(実施例11で用いたペプチド−ポリマー複合体の1つのような)をプ
ロッティングし、それを抗血清と接触させることにより、抗ペプチド抗体のアフ
ィニティ精製を行うことができる。かかるペプチド−ポリマー複合体はニトロセ
ルロース膜に非常に強く付着する。ペプチド−KLH複合体に対して作成された
抗血清を用いた。基質−Pの場合、ペプチドのカルボキシ末端が・KLHに結合
されるため、抗体はN−末端の方に向く。基質−に−KLH複合体に対しては、
抗体はC−末端の方に向く。しかしながら、基質−P−ポリマー、基質−に−ポ
リマーは両方とも、各KLH対照物に対して作成された抗体と結合できる。基質
−P約1’n9相当の基質−P−ポリマーに対する抗体結合を検出した。0 、
1 n9の基質−Kを含有する基質−に−ポリマーに対する抗体結合を検出した
。同じプロッティング法を用い、ペプチド−ポリマー複合体で免疫化されたウサ
ギ中の抗ペプチド抗体の存在を検出した。0 、1 n9を含有する基質−に上
で検出できる基質−に−ポリマー産生抗体で3匹のウサギを免疫化した。1n9
の基質−Pを含有する基質−P−ポリマー上で検出できる基質−P−ポリマー産
生抗体でラビット21を免疫化した。ペプチド−ポリマー複合体のニトロセルロ
ースプロットにより、抗ペプチド抗体の検出方法が容易に得られ、それにより、
これらの抗体をアフィニティー精製する新規な方法が得られる。
実施例13
放射性同位元素標識免疫測定における遊離ペプチドに対するポリマー結合ペプチ
ドの競合能力
実施例12のプロッティング検定で用いたのと同じ抗血清を放射性同位元素標識
免疫測定(RI A)で用いた。第4図から明らかなように、基質−PxRIA
の標準曲線の読み取り可能な部分で2つの濃度の基質−P−ポリマーが反応した
。92.6p9および1.0in9の基質−Pに対応するペプチド−ポリマーの
量により、39および400p9の未標識、未結合の基質−Pが行った競合と同
程度であった。したがって、N−末端遊離基質−P−KLHに対して形成された
抗体は、約40%のポリマー結合基質−Pと効果的に結合できる。
基質−に−ポリマーはRIA中の遊離基質−にとうまく競合しなかった(第5図
)。このことは、抗体がペプチドのカルボキシ末端の方に向かず、複合体中のポ
リマーに結合することを考慮すると驚くべきことではない。特定の抗原に反応す
る抗体は多クローン性であり、基質−に−ポリマーがある程度の競合を示すこと
により、ペプチドの内部に結合できる少なくとも1つの抗体があることを示唆す
る。
実施例14
ポリマー−ペプチド複合体を用いた抗ペプチド抗体の単離ポリマー−ペプチド複
合体の調製
LKB Byolynxペプチド合成システムを用い、エンドブラズミン(en
doplasmtn)の残基2−6(リンカ−のような+グリシン)に相当する
ペプチド配列H−Asp、Asp、G lu、Val、Asp、GlyOHを調
製した。用いたポリマーは実施例6に記載したものである。ポリマー−ペプチド
の収量は44fyであり、結合したペプチドの重量は8.3gであり、ポリマー
−ペプチド複合体1g画たり0.1899のペプチドに相当する。アミノ酸分析
により、Gly(1)Val(0,91)Asp(2,88)お上びGlu(0
,96)を得た。該複合体を5112の水中に溶解し、ストリップ(5CJII
つのニトロセルロース紙(シュリーヘル(Schleicher)およびシュー
エル(Schuell))を用いて4℃で2時間インキエベートした。該ストリ
ッップをゼラチン溶液(水中1%、30分間)で遮断し、エンソプラズミンのア
ミノ末端(17残基)配列に対して形成されたウサギ抗血清と48時間混合した
。ついで、該ストリップを2xQの0.2Mグリシン−HCl2、pH2,1で
5分間溶出し、溶出液をIM)リス塩基でpHs、sに中和した。強い特異的反
応を示すエンドプラズミンで免疫化することにより、精製された抗体を試験し、
それにより、ニトロセルロースに結合されたポリマー−ペプチド複合体は、対応
するペプチド配列と反応する抗体を効果的に閉じ込めることができることが判明
した。ポリマー−ペプチド複合体中でエンドプラズミンアミノ酸配列を欠く蛋白
質とは反応しなかった。
0 0 0 0 0 0 ロ 0 ロ
ロ■ (ON+ ロ り マ の へ −Figure 3種
々のザブスタンス−P抗原に対して作成された結合%
結合%
国臥調宜翌方
−−MIA暴−−”” PCTloB 8B101090m−鵠lAm−’−”
N’−PCTloB 8B101090
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.架橋剤で架橋された可溶性ポリマーまたはコポリマーから構成され、かつ、 ペプチド鎖の付着のための部位を有する不溶性架橋ポリマーまたはコポリマーか らなり、該架橋剤が選択的に化学開裂できるリンケージを有することを特徴とす るペプチド合成に使用する不溶性ポリマー支持体。 2.重合して可溶性ポリマー鎖を形成できる少なくとも1つの重合性モノマーと 、ペプチド結合または共有結合形ペプチド−コポリマーリンケージの重大な開裂 を引き起こさない条件下で可溶性コポリマーフラグメントを生じる選択的に化学 開裂できるリンケージを有する架橋剤から構成される架橋コポリマーからなり、 該少なくとも1つの重合性モノマーが、ペプチド鎖を該コポリマーに共有結合で 付着させる官能基を有するモノマーを含む請求項1記載の不溶性ポリマー支持体 。 3.官能基を有するモノマーが、開製してC−末端リンケージによるペプチドの 共有結合での付着を可能にする遊離ヒドロキシル基を形成できる保護ヒドロキシ ル基を有する化合物である請求項2記載の不溶性ポリマー支持体。 4.官能基を有するモノマーが6−アセトキシヘキシルアクリルアミドからなる 請求項3記載の不溶性ポリマー支持体。 5.ジメチルアクリルアミドを含むモノマーのコポリマーからなる請求項1〜4 いずれか1項記載の不溶性ポリマー支持体。 6.架橋剤が一般式: CH2=CH−R−CH=CH2 [式中、Rは選択的に化学開裂できるリンケージを意味する〕で示される化合物 からなる請求項1〜5いずれか1項記載の不溶性ポリマー支持体。 7.Rが酸性条件下で選択的に化学開裂できるリンケージである請求項6記載の 不溶性ポリマー支持体。 8.架橋剤が一般式: ▲数式、化学式、表等があります▼ [式中、R1およびR2は同一または異なって、各々水素、アルキル、アリール 、アラルキル、アルカリル、アルコキシおよびアロキシから選択されるものを意 味し、ただし、R1がアルコキシまたはアロキシの時にR2はアルコキシまたは アロキシでない]で示される化合物である請求項1〜7いずれか1項記載の不溶 性ポリマー。 9.R1、R2が両方ともHであり、架橋剤がN.N′−ビスアクリロイル−ジ −2−アミノエトキシメタンである請求項8記載の不溶性ポリマー支持体。 10.R1、R2が両方ともメチルであり、架橋剤がN.N′−ビスアクリロイ ル−2,2−ジ−(2′−アミノエトキシ)−プロパンである請求項8記載の不 溶性ポリマー支持体。 11.コポリマーが不活性担体上でin situ形成される請求項1〜10い ずれか1項記載の不活性ポリマー支持体。 12.不活性支持体が珪藻土からなる請求項11記載の不溶性ポリマー支持体。 13.それに共有結合でリンケージされた少なくとも1つのペプチド鎖を有する 請求項1〜12いずれか1項記載のペプチド−ポリマー複合体。 14.架橋剤の残基中に存在する開裂可能なリンケージの選択的な化学開裂によ り、請求項13記載のペプチド−ポリマー複合体から得られるニとを特徴とする 可溶性ペプチド−ポリマ−複合体。 l5.N.N′−ジメチルアクリルアミド、6−アセトキシヘキシルアミド、お よびアセトキシ基の無ペンダントヒドロキシル基への開裂により修飾された架橋 剤としてのN.N′−ビスアタリロイル−2,2−ジ−(2′−アミノエトキシ )−プロパンからなり、少なくとも1つのペンダントヒドロキシル基でのC−末 端リンケージによってそれに共有結合で付着されたペプチド鎖を有することを特 徴とするペプチド−ポリマー複合体。 16.該架橋剤の残基の酸性条件下での選択的な化学開裂により、請求項15記 載の複合体から得られることを特徴とする可溶性ペプチド−ポリマー複合体。 17.架橋剤で架橋された可溶性ポリマーまたはコポリマーから構成される不溶 性の架橋ポリマーまたにコポリマーに共有結合されたペプチドからなり、該架橋 剤が選択的に化学開裂できるリンケージを有することを特徴とするポリマー−ペ プチド複合体。 18.請求項17記載のポリマー−ペプチド複合体の架橋剤の残基中に存在する リンケージの選択的な化学開裂により得られることを特徴とする可溶性ポリマー −ペプチド複合体。 19.ペンダント官能基を有する不溶性ポリマー支持体を付与してペプチド鎖を 付着を可能とし、ついで、適当に保護されたアミノ酸誘導体をそれと反応させて 不溶性ポリマー支持体に付着されたペプチド鎖を組み立てる工程を含み、請求項 1〜12いずれか1項記載の不溶性ポリマー支持体を用いることを特徴とするペ プチド鎖の逐次合成方法。 20.不溶性ポリマー支持体がN,N′−ジメチルアクリルアミド、6−アセト キシペキシルアクリルアミド、および架橋剤としてのN,N′−ビスアクリロイ ル−2,2−(ジ−2′−アミノエトキシ)−プロパンからなるコポリマーであ る請求項19記載の方法。 21.それに結合されたペプチド鎖を有する不溶性ポリマー支持体を選択的な化 学開裂に付すことにより、ペプチド鎖中の任意の共有結合形ペプチド−ポリマー 緒合またはペプチドリンケージの重大な開裂なしに架橋剤のリンケージの開裂を 行って可溶化ペプチド−複合体を得る工程をさらに含む請求項19または20記 載の方法。 22.中性または塩基性反応条件下で、適当に保護されたアミノ酸残基を不溶性 ポリマー支持体と反応させる工程を実施し、酸性条件下で選択的な化学開裂を行 う請求項21記載の方法。 23.さらに、ペプチド−ポリマー結合を開裂させてポリマーからペプチド鎖を 遊離する工程を含む請求項21または22記載の方法。 24.その上に請求項14または16記載の可溶性ペプチド−ポリマー複合体が 吸収された不溶性支持体からなり、ペプチドが、興味のある抗体がそれに対して 結合するペプチドであることを特徴とする抗体結合装置または試薬。 25.不溶性支持体がニトロセルロース支持体である請求項24記載の装置また は試薬。 26.請求項24または25記載の少なくとも1つの装置または試薬を含むこと を特徴とする選択された化学物質を同定するための診断用キット。 27.請求項24または25記載の少なくとも1つの装置または試薬を含むこと を特徴とする溶液中の選択された化学物質を検定するための検定用キット。 28.興味ある抗体を含む溶液を請求項24または25記載の装置または試薬と 接触させることを特徴とする抗体精製方法。 29.興味ある抗体を含む溶液および請求項24または25記載の装置または試 薬を収容するためのインキユベーション浴からなることを特徴とする抗体精製用 キット。 30.請求項16または18記載の可溶性ペプチド−ポリマー複合体あるいは該 ペプチド−ポリマー複合体の混合物からなることを特徴とするワクチン。 31.請求項16または18記載の可溶性ペプチド−ポリマー複合体あるいは該 ペプチド−ポリマー複合体の混合物からなることを特徴とする哺乳動物中の抗体 誘発用製剤。 32.有効量の、請求項16または18記載の可溶性ペプチド−ポリマー複合体 あるいは該ペプチド−ポリマー複合体の混合物を哺乳動物に接種すること特徴と する抗原に対する哺乳動物の免疫化方法。 33.一般式: ▲数式、化学式、表等があります▼ [式中、R1およびR2は同一または異なって、各々水素、アルキル、アリール 、アラルキル、アルカリル、アルコキシおよびアロキシを意味し、ただし、R1 がアルコキシまたはアロキシの時にR2はアルコキシまたはアロキシでない] で示される化合物。 34.N,N′−ビスアクリロイル−ジアミノエトキシメタン。 35.N.N′−ビスアクリロイル−2.2−ジ−(2′−アミノエトキシ)− プロパン。 36.6−アセトキシヘキシルアクリルアミド。
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