JPH06247997A

JPH06247997A - Ｈｃｖペプチド抗原及びｈｃｖの測定方法

Info

Publication number: JPH06247997A
Application number: JP5196193A
Authority: JP
Inventors: Christoph Seidel; サイデルクリストフ; Ursula-Henrike Wienhues; ヴィーンヒュースウルスーラ−ヘンリケ; Hubert Bayer; ベイヤーヒューバート; Unknown; ユンクグーンター−ゲルハルト; Hans Georg Ihlenfeldt; ゲオルグイーレンフェルトハンス
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1994-09-06
Anticipated expiration: 2012-10-22
Also published as: DE4240980A1; AU655112B2; EP0967223A3; ES2143996T5; ES2143996T3; EP0582243A2; JP2666903B2; ATE189683T1; EP0582243A3; EP0582243B2; EP0582243B1; US5674676A; CA2103533A1; EP0967223A2; DE59309950D1; AU4439993A; KR940003967A

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】抗HCV 抗体に特異的であり、そして抗HCV 抗
体の免疫試験に適するペプチド抗原を提供する。【構成】配列番号１〜６（例えば、次式の）もしくは
28のアミノ酸配列または少なくとも４のアミノ酸の長さ
を有するその部分配列を含むHCV ペプチド抗原。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なHCV ペプチド抗
原、これらのペプチド抗原の生産方法、およびこれらの
ペプチド抗原の助けによるHCV の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】今まで知られていない肝親和性の薬剤の
血清学的マーカーの不在下の肝炎ウイルス（例えば、Ａ
型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイル
ス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン−バール
ウイルス）の存在は、非Ａ・非Ｂ型肝炎(NANB-肝炎）と
称される。NANB- 肝炎は、順に、非経口的かつ散在的に
伝染される非Ａ・非Ｂ型肝炎および腸内伝染される非Ａ
・非Ｂ型肝炎に分けられる。最近、非経口的かつ散在的
に伝染されるNANB- 肝炎の原因となるＣ型肝炎ウイルス
(HCV) が単離された(Choo Q.-L. ら,Science244(1989)3
59-362およびKuo,Gら,Science244(1989)362-364) 。

【０００３】HCV は世界中でNANB肝炎の重要な原因であ
る。このウイルスは汚染された血液もしくは血液製品、
輸血、または緊密な接触により伝染される。HCV ウイル
スタンパク質のアミノ酸配列が欧州特許出願第0318216
号、同第0363025 号、同第388232号、および同第039674
8 号明細書により知られている。HCV ゲノムは10862nt
の長さを有する。翻訳操作で合成されたタンパク質は約
3000のアミノ酸の全長を有する。これらのタンパク質は
構造タンパク質（エンベロープタンパク質およびコアー
タンパク質）と非構造タンパク質(NS1-NS5) に分けられ
る。

【０００４】HCV は、免疫試験で体液中のHCV の抗体を
検出することにより有利に測定される。それ故、このよ
うな免疫試験は抗HCV 抗体の結合パートナーを必要とす
る。それ故、免疫試験で結合パートナーとして、例え
ば、非構造C100-3-HCVタンパク質を使用することが知ら
れている(Abbott Laboratories,USAおよびOrtho Diagno
stic Systems Inc.,USA による試験；Science244(1989)
359-364;Van der PoelC.L.ら,Lancet337(1991)317;Alte
rH.J.,J.Gastroent.Hepatol.(suppl.)1990,78)。

【０００５】これらの試験の欠点は、使用される抗原が
組換えタンパク質であることである。タンパク質は、診
断試験における変性しやすさおよびそれらの低い溶解性
および機能のために取り扱い難い。タンパク質の低エピ
トープ密度のために、測定シグナルのサイズでさえも
が、短鎖ペプチド抗原が抗体の結合パートナーとして使
用される試験に較べて小さい。更に、タンパク質または
長鎖ペプチドが免疫試験で抗原として使用される場合、
抗体の交差反応性および非特異的結合の機会が増す。ま
た、タンパク質との反応は頻繁に拡散制御され、これは
免疫試験に所望される短いアッセイ時間に不利である。
更に、このような診断操作に使用される充分な品質およ
び量のタンパク質の調製は、時間およびコストがかか
る。それらが合成し得る際に、ペプチドは容易に接近
し、そして分子に形成される。

【０００６】抗HCV 抗体に関する免疫試験では、それ
故、全体のタンパク質のセグメントのみに相当するでき
るだけ短い鎖を有するペプチド抗原を使用することが有
利である。このような免疫学的方法がOkamoto(Japan J.
Exp.Met.60(1990)223-234)により記載されている。しか
しながら、そこに記載された短鎖ペプチド抗原（配列
９）（その起点はコアー領域にある）は、HCV に対して
充分な感度を有しないことが判明した。

【０００７】更に別のHCV ペプチド抗原がドイツ特許出
願第P4209215.9号明細書に記載されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抗HC
V 抗体に特異的であり、そして抗HCV 抗体の免疫試験に
適するペプチド抗原を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記の目的は下記の配列
のペプチド抗原により達成される。

【００１０】

【化１】

【００１１】また、上記の目的は、少なくとも４、好ま
しくは少なくとも７のアミノ酸の長さを有するこれらの
ペプチド抗原の部分配列であるペプチド抗原により達成
される。配列Ｘ中のエピトープに関する研究は、或る問
題を生じた。溶液中の相当するペプチドは、HCV の抗体
と接触させ、続いてこうして形成された免疫複合体を検
出する必要があった。これは、ペプチドのビオチニル化
およびストレプトアビジン被覆固相上の複合体の固定化
により達成された。また、検出されたペプチドは、溶液
中の錯生成が使用されるようなイムノアッセイに特に適
する。エピトープは、WO93/01210の配列番号16に記載さ
れたペプチドの直後のＣ末端に配置する。Ｎ末端では、
それはコアー領域に配置する。

【００１２】適当な部分配列が配列表に示される。下記
の配列が特に好ましい部分配列である。配列7A1 から

【００１３】

【化２】

【００１４】配列NS5/1 から

【００１５】

【化３】

【００１６】配列Ｘから

【００１７】

【化４】

【００１８】特に好ましい部分配列は、９のアミノ酸の
最大長さを有する配列、特に物質NS4/3 およびNS5/1bで
ある。特に好ましいペプチド抗原はNS5/1 である。配列
Ｘから、配列番号26は全ての試験血清を認識し、一方、
配列番号25は反応性抗原（最大のシグナル）である。抗
HCV 抗体検出は当業者に知られている方法に従って行わ
れる。それ故、本発明の別の主題は、試料を配列番号１
〜11、20、および22〜28より成る群からの少なくとも一
種のペプチド抗原または少なくとも４、好ましくは少な
くとも７のアミノ酸の長さの上記のペプチド抗原の部分
配列であるペプチド抗原と共にインキュベートし、そし
て前記ペプチド抗原に結合された抗HCV 抗体の量を抗体
抗原複合体の形成を可能にする条件下で測定することを
特徴とするHCV 抗体の測定方法である。

【００１９】本発明のペプチド抗原は１〜1000ng/ mlの
濃度範囲、特に好ましくは20〜250ng/ ml の範囲の濃度
で使用されることが好ましい。本発明によれば、本発明
の少なくとも二種のペプチド抗原またはその部分配列の
組み合わせが使用されることが好ましい。配列番号１〜
11、20、および22〜28またはその部分配列の少なくとも
一種のペプチド抗原を配列番号12〜19から成る群または
その部分配列からの少なくとも一種のペプチド抗原と組
み合わせることが特に好ましい。

【００２０】配列番号12〜19の配列およびそれらの調製
がドイツ特許出願P4209215.9号明細書に記載されてお
り、その内容が本件特許出願の開示の主題である。抗原
は、例えば、幾つかの個々のペプチド抗原が使用される
ように、またはペプチド抗原が、有利にはアミノ酸ブリ
ッジ（これはHCV タンパク質中で自然に生じるアミノ酸
配列とは異なる）を介して、またはペプチドリンカーを
介して、互いに共有結合されるように組み合わされても
よい。

【００２１】特に好ましい抗原の組み合わせは、配列4a,6e,6b,2e,2g,NS4/3,NS5/1（組み合わせ１）配列4a,6e,6b,2e,2g,NS4/3（組み合わせ２）配列4a,2g,2e,6c,NS4/3,NS5/1 （組み合わせ３）配列4a,6e,6b,2e,2g,NS4/3a,NS4/3b,NS5/1b （組み合わ
せ４）配列4a,6e,6b,2e,2g,NS4/3,NS5/1,9c （組み合わせ５）配列4a,2g,NS4/3,2e,6c,NS5/1,9c（組み合わせ６）配列4a,6,2e,2g,7A1,NS5/1（組み合わせ７）を含む。

【００２２】下記の配列がP4209215.9号明細書に記載さ
れている。

【００２３】

【００２４】これらの組み合わせにおいて、抗原は下記
の量で使用されることが好ましい。

【００２５】

【００２６】好ましい方法では、抗原は互いに共有結合
されずに個々に使用されるか、またはペプチドリンカー
の助けにより共有結合される。感染パラメーターHCV に
必要な高い感度のために、検出に使用されるアッセイの
好ましい型はヘテロジニアスイムノアッセイである。こ
れらのヘテロジニアスアッセイは、測定シグナルバック
グラウンドをかなり減少させ、かくして感度を増大する
洗浄工程を可能にする。

【００２７】測定は、例えば、ラジオイムノアッセイ、
エンザイムイムノアッセイにより、または蛍光抗体操作
で行い得る。このような操作において、ペプチド抗原は
通常固定化される。抗HCV 抗体につき試験される試料が
添加され、そして抗原に結合された抗体が標識された抗
ヒト免疫グロブリン抗体により測定される。本発明のペ
プチド抗原は、吸着、共有結合、またはビオチン／スト
レプトアビジン、抗体／抗原もしくは糖／ラクチンの如
き生物学的結合対（この場合、ペプチド抗原がこのパー
トナーに共有結合される）により固定化し得る。

【００２８】イムノアッセイを行うために、本発明のペ
プチド抗原はビーズ、プラスチックバイアルまたはマイ
クロタイタ・プレート（好ましくはポリスチレンまたは
ポリスチレンのコポリマー）に固定化されることが好ま
しい。当業者はこれらの操作を良く知っている。固定化
は、ペプチド抗原が表面に非特異的に吸着されるか、ま
たは官能化もしくは活性化された表面に共有結合される
ように行われることが好ましい。非特異的吸着は、ペプ
チド抗原をタンパク質で連結して複合体を形成し、次に
これを吸着に使用することにより改良し得る（例えば、
欧州特許出願第0269092 号明細書を参照のこと）。ま
た、結合は固定化抗体により行い得る。この目的のため
に、ペプチド抗原は、エピトープが抗体の結合、例え
ば、ペプチドタンパク質複合体の形成により阻止されな
いように修飾されるべきである。

【００２９】結合パートナーへのペプチド抗原の接合は
スペーサーにより行われることが好ましい。このスペー
サーは10〜50、好ましくは10〜30個の原子を含むと有利
であり、そしてそれはまた実質的に線状の分子であるこ
とが好ましい。これらの例は、アルシル鎖、ポリエーテ
ル鎖またはポリアミド鎖のスペーサーを含む。特に好ま
しい実施態様において、４〜９のアミノ酸の長さのペプ
チド抗原が10〜30の原子の長さの線状スペーサーにより
担体に結合される。アミノ酸からつくられるスペーサー
が使用される場合、前記のスペーサーはHCV 遺伝子中の
ペプチド抗原のすぐ近くの配列に相当しないアミノ酸か
らなることが有利である。

【００３０】好ましい実施態様において、本発明のペプ
チド抗原はビオチンに共有結合され、そして固定化がア
ビジン／ストレプトアビジン固相により行われる。ま
た、検出が標識抗体により行われるのではなく、配列番
号１〜20もしくは22〜28に含まれる配列の一つまたはそ
の部分配列を有する標識された付加的なペプチド抗原に
より行われる方法が好適である。

【００３１】本発明のペプチド抗原は、当業者に知られ
ているペプチドの合成方法に従って生産し得る。それ
故、本発明の別の主題は、Ｃ末端を形成するアミノ酸を
担体に結合させ、次にペプチド抗原をＣ末端から開始し
て次第に合成し、続いて担体から開裂させる本発明のペ
プチド抗原の生産方法である。詳しくは、アミノ酸のカ
ルボキシル基を、濾過し易い不溶性ポリマーに結合させ
る。次にペプチド鎖をＣ末端から開始して次第に形成さ
せる。この目的のために、Ｎ保護アミノ酸を合成樹脂の
反応性基と反応させる。Ｎ保護基が、担体粒子に共有結
合しているアミノ酸から除去され、そして得られるアミ
ノアシルポリマーを次のＮ保護アミノ酸と反応させる。
Ｎ保護基を、また担体樹脂に共有結合しているジペプチ
ドから除去し、そして得られるアミノアシルポリマーを
次のＮ保護アミノ酸と反応させる。全ての過剰の試薬お
よび副生物を簡単な濾過操作で除去する。所望のペプチ
ド配列がこのようにして一旦得られると、Ｃ末端アミノ
酸とポリマー担体のアンカー基の共有結合が開裂する。
簡単な濾過操作で、不溶性担体が溶液中にあるペプチド
から除去する。ペプチドは、あらゆるクロマトグラフィ
ー操作で精製し得る。

【００３２】本発明のペプチド抗原は、例えば、Merrif
ield,JACS85(1964)2146 に従って生産し得る。必要によ
り、ビオチニル化がPNAS USA80(1983)4045に従って行い
得る。好ましいビオチニル化剤はビオチニルアミノカプ
ロン酸-N- ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
ビオチニル化ペプチド抗原の調製に好ましい方法は、ペ
プチド抗原の固相合成中のＮ末端におけるビオチン残基
の移入である。

【００３３】この方法は、ペプチド抗原がビオチニル化
されるべきではない幾つかのε−リシンアミノ基を含む
場合に使用されることが好ましい。これは、例えば、N-
α-Fmoc-N-ε- ビオチニル- アミノカプロイルリシン、
N-α-Fmoc-N-ε- ビオチニルリシンが使用される場合、
またはＮ末端アミノ酸がビオチニル化されるべきである
場合であり、ビオチニルアミノカプロン酸またはジメト
キシトリチルビオチンがジシクロヘキシルカルボジイミ
ドの如き活性化試薬とともに、または活性エステルとし
て使用される。

【００３４】別の好ましい実施態様において、ヒトIgG
のFc部分に対する検出抗体が固定化される。これは、モ
ノクローナル抗体を使用することにより行われることが
好ましい。次にペプチド抗原を溶解する。検出される抗
体（分析物）および試料液のその他の抗体の全てが壁抗
体により結合される。次に結合された抗体が分析物を結
合し、これにより順に適当な検出系、例えば、ペプチド
抗原酵素複合体を用いる競合アッセイにおいて検出し得
る。

【００３５】当業者に知られている免疫化方法を使用す
ることにより、本発明のペプチド抗原を用いて、免疫試
験でウイルスそれ自体を検出するための抗体を得ること
ができる。それ故、本発明の別の主題は、哺乳類を本発
明のペプチド（これは、必要により、担体に結合されて
いる）で免疫することを特徴とする抗体の生産方法であ
る。次に前記の抗体は既知の方法に従って血清または脾
臓から得られる。

【００３６】好ましい実施態様において、これらの免疫
された動物のＢリンパ球を形質転換剤の存在下で適当な
細胞系と融合する。所望の抗体を生産する細胞系をクロ
ーン化し、培養し、そしてモノクローナル抗体を細胞ま
たは培養上澄みから得る。これらの抗体を使用してHCV
ウイルスを直接測定することが可能である。それ故、本
発明の別の主題は、試料を抗原抗体複合体の形成を可能
にする条件下で本発明の抗体と共にインキュベートし、
そして形成された抗体抗原複合体の量を測定することを
特徴とするHCV ウイルスの測定方法である。

【００３７】本発明の別の主題は、本発明のペプチド抗
原を使用するワクチンの生産方法、およびHCV 感染症の
治療用のワクチンであり、前記のワクチンは免疫原とし
て薬理学上有効な投薬量で、そして医薬上許される配合
で配列番号１〜11、20、および22〜28で示された配列を
有する少なくとも一種のペプチド抗原（これらは必要に
より担体に結合されていてもよい）、またはその部分配
列を含む。

【００３８】これらのワクチンは既知の方法に従って調
製し得る。しかしながら、好ましい方法では、ペプチド
抗原をまず凍結乾燥し、続いて、必要により、添加剤の
添加のもとに懸濁する。本発明のワクチンまたはワクチ
ンの組み合わせを用いるワクチン投与は、既知の方法、
例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下および鼻
腔内法に従って当業者により行い得る。

【００３９】筋肉内投与または皮下投与に関して、ワク
チンは例えば生理食塩溶液中に懸濁し得る。鼻腔内投与
または眼内投与において、ワクチンはスプレーまたは水
溶液の形態で投与し得る。局所投与または経口投与にお
いて、免疫原を失活、例えば、口腔または胃中のタンパ
ク質分解酵素に対して一時的に保護することがしばしば
必要である。このような一時的な保護は、例えば、免疫
原の封入により行い得る。この封入は、保護剤で被覆す
ること（マイクロカプセル化）により、または多数の本
発明の免疫原を保護担体中に閉じ込めること（マクロカ
プセル化）により行い得る。

【００４０】使用される封入材料は、半浸透性であって
もよく、またはヒトもしくは動物の体に導入された場合
に半浸透性になってもよい。このような封入が適用され
る場合、生分解性の物質が担体として通常使用される。
また、本発明の主題は、一種または数種のペプチド抗原
による感染性HCV 血清の免疫測定方法であり、この方法
ではHCV のカルボキシル末端NS4 エピトープ（特にC100
-3の範囲外）からのペプチド抗原が使用される。配列番
号６を有するペプチドが、特に反応性であることが判明
した。感染性血清という用語は、HCV RNA が検出し得る
ような血清を表す。これは、例えば、ポリメラーゼ連鎖
反応で行い得る。これらのペプチド抗原は、特に、１以
下のアミノ酸により配列番号６とは区別されるアミノ酸
配列、そして配列番号６と較べて、３以下のアミノ酸だ
け短いか、もしくは25より多くのアミノ酸だけ長くな
く、または同じ長さを有するアミノ酸配列を含むものを
含む。

【００４１】下記の実施例および配列表は本発明を更に
詳しく説明する。下記の参照番号が配列表に使用され
る。

【００４２】

【００４３】実施例１ H-SRRFAQALPVWARPD-OH(NS5/1) の合成ペプチドをFmoc( フルオレニルメトキシカルボニル) 固
相合成により生産した。これらの反応をラボルテク(Lab
ortec)（スイス）SP640 ペプチド合成装置中で行った。
Fmocアミノ酸誘導体に関して、カップリング反応を、2.
4 当量のジシクロヘキシルカルボジイミドおよび2.2 当
量のN-ヒドロキシベンゾトリアゾールを使用して90分以
上で行った。使用した反応媒体はジメチルホルムアミド
であった。Fmoc基をDMF 中で10分および20分で20％のピ
ペリジンで開裂した。2.0 当量の下記のアミノ酸誘導体
を使用した。Pro 、Arg(PMC(ペンタメチルクロマン) 保
護基を有する) 、Ser(tert. ブチル保護基を有する) 、
Trp 、Asp(tert. ブチルエステル保護基を有する) 、Ph
e 、Ala 、Gln 、Leu 、Val 。これらのカップリング反
応を、試薬の半分を用いて繰り返した。成功したカップ
リングをカイザー試験(Anal.Biochemistry34(1970),59
5) でチェックし、そしてそれぞれのピペリジン開裂後
に樹脂被覆物を放出フルベン基のUV吸収により測定し
た。ペプチドを、ワング樹脂（ポリスチレン／１％ジビ
ニルベンゼン）5gに対し0.50ミリモル/gの仕込みで合成
した(JACS95(1973)1328)。合成後に、仕込みの程度はわ
ずかに0.39ミリモル/gであった。

【００４４】ペプチドを室温で30分間にわたってトリフ
ルオロ酢酸200 ml、ジクロロメタン200 ml、エタンジチ
オール10ml、m-クレゾール10ml、エチルメチルスルフィ
ド５mlおよび水５mlで遊離した。その開裂溶液をトルエ
ンで数回濃縮し、次にペプチドをジエチルエーテルで沈
殿させた。スカベンジャーおよびその他の小分子を除去
するために、原料をセファデックス(Sephadex)G10 カラ
ム中で精製した。31％の純度(RP-HPLC) を有する物質2.
4gを凍結乾燥後に得た。物質を95％より高い純度にする
ために、ペプチド250mg を分取RP-HPLC カラム(40mm x
250mm)（これはC18 材料（５μm 、300 Å）および水／
トリフルオロ酢酸、アセトニトリル／トリフルオロ酢酸
勾配で満たされている）で精製した。95.2％(HPLC)の白
色物質48mgを凍結乾燥後に得た。物質の同定をFAB-MSに
よりチェックした。

【００４５】実施例２実施例１からのペプチド抗原のビオチニル化のために、
高度に濃縮された１モル当量（溶解性はアミノ酸配列に
依存する）をアルゴン飽和したリン酸カリウム緩衝液
(0.1モル/l、pH8.0)に溶解し、そしてアルゴン飽和した
ジメチルホルムアミドに溶解した３当量のD-ビオチニル
- ε- アミノカプロン酸-N- ヒドロキシスクシンイミド
エステル(DMF5 μl 中の試薬１μモルの溶液）を添加し
た。

【００４６】その反応混合物を分析RP-HPLC による永久
制御のもとにアルゴン雰囲気下で室温で２時間攪拌し
た。５％未満の抽出物が存在する場合、その反応混合物
を分取RP-HPLC カラムに直接かけ、そして生成物を0.1
％のトリフルオロ酢酸／水〜0.1 ％のトリフルオロ酢酸
／アセトニトリル勾配（傾斜：90分で０％から100 ％)
により精製した。生成物を生成物画分の濃縮および凍結
乾燥により得た。収率は40％〜90％の範囲であった。分
析操作において、純度をHPLC、HPCEおよびTLC によりチ
ェックした。同定をLSI-MS（モルピーク）および特定の
色素試薬（ビオチンに対してp-ジメチルアミノシンナム
アルデヒド）を使用するTLC によりチェックし、そして
内容物を微量分析（窒素）で測定した。

【００４７】実施例３ HCV 抗体を検出反応につき二工程サンドイッチイムノア
ッセイで測定した。下記の組成の試薬：試薬１：ペプチド抗原の組み合わせ１〜６、ビオチニル
化ペプチド抗原またはペプチド抗原単独 40ミリモル/lのリン酸緩衝液pH7.0 0.9 重量％のNaCl 10容量％のウシ血清試薬２：ヒト免疫グロブリン（ヒツジ）へのポリクロー
ナル抗体の複合体20mU/ml およびペルオキシダーゼ 40ミリモル/lのリン酸緩衝液pH7.0 0.05重量％のツイーン(Tween, 登録商標)20 0.2 ％のウシ血清アルブミン 0.2 ％のウシIgG １mlの試薬１および試料10μl をストレプトアビジン被
覆ポリスチレンバイアル（欧州特許出願第0344578 号明
細書の実施例１に従って製造）中で室温で１時間インキ
ュベートした。続いて、その混合物を水道水で３回洗浄
し、そして室温で１時間にわたって１mlの試薬２でイン
キュベートした。続いて、その混合物を水道水で３回洗
浄した。ABTS( 登録商標)(3.2 ミリモル/lの過ホウ酸ナ
トリウムを含む100 ミリモル/lのリン酸クエン酸緩衝液
pH4.4 中の1.9 ミリモル/lの2,2'- アジノ- ジ- ［3-エ
チル- ベンゾチアゾリンスルホネート(6) ］- ジアンモ
ニウム塩)1mlを検出反応のために添加した。60分後に、
吸光度を420nm で光度計により測定できる。結果を表
１、表２および表３に示す。

【００４８】表中に使用した記号の説明：-/+:陰性／陽
性（ELISA における陽性シグナルに対するカット・オフ
は、420nmにおける平均吸光度＋10の陰性対照血清の集
合の３標準偏差と定義される。試料を1:250 の試料希釈
で測定した）下記の抗原濃度を使用した。 a)試験中、個々の抗原として

【００４９】

【００５０】b)組み合わせ中

【００５１】

【００５２】

【表１】

【００５３】

【表２】

【００５４】

【表３】

【００５５】実施例４臨床試料を使用する研究において、PCR を使用すること
により９種の感染性血清を見出し、更にイムノアッセイ
で分析した。試料のうちの２種を通常の抗原混合物(c32
2-3 、c33c、c100-3) で検出した。ペプチド7A1 を使用
して、更に別の血清を検出することが可能であった。

【００５６】

【００５７】実施例５ペプチド7A1 を使用して、2000のドナー標本から５種の
感染性血清を検出することが可能であった。これらのう
ちのわずかに２種が通常の抗原混合物(c22-3、c33c、c1
00-3) で同定された。

【００５８】

【表４】

【００５９】実施例６コアー領域中のエピトープ以下にコアー領域中の新規な優性HCV 抗原を記載する。
この抗原は古典的方法で見出し得なかったが、実施例２
に相当するビオチニル化ペプチドの助けにより、そして
HCV 陽性であると示された血清の抗体との免疫複合体を
形成する個々のビオチニル化ペプチドの能力を試験する
ことにより見出すことができた。これらのペプチドは、
可溶性ペプチド抗原が使用される方法に特に有益であ
る。しかしながら、それらは、ペプチド抗原が固相に直
接結合されるような方法ではそれ程有益ではない。

【００６０】最長の配列は抗原Ｘ（配列番号28）であ
る。最短でかつ最も反応性の配列はD2（配列番号26）で
ある。最も反応性の抗原（実施例３のイムノアッセイで
最大のシグナル）はD1（配列番号25）である。また、残
留反応性がD3（配列番号27）に見られる。これらの配列
を26のHCV 陽性血清で試験し、全てが明瞭な反応（24の
血清が500mA より大きく、一種が300mA より大きく、そ
して一種が150mA より大きい）を示した。しかしなが
ら、それらは陰性血清(70mA)との反応を示さなかった。
また、抗原B3（配列番号21）、B4（配列番号22）、B5
（配列番号23）、およびB6（配列番号24）を試験し、抗
原濃度に対するシグナルの高さの依存性を測定した。抗
原B4〜B6の使用につき得られる典型的な濃度は、実施例
３に相当する試験で150 〜200 μm/mlの範囲である。B3
は反応性ではない。

【００６１】上記の新規なペプチドの試験の結果を表５
および表６に示す。それぞれの試験につき、抗原50ngを
インキュベーション緩衝液100 μl 中で使用した。血清
を1:60に希釈した。反応性は以下のことを意味する。 +: 70〜140mA ++: 40〜500mA +++:>500mA

【００６２】

【表５】

【００６３】

【表６】

【００６４】

【配列表】

配列番号１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１８のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１：

【００６５】

【化５】

【００６６】配列番号２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号２：

【００６７】

【化６】

【００６８】配列番号３の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１５のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号３：

【００６９】

【化７】

【００７０】配列番号４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号４：

【００７１】

【化８】

【００７２】配列番号５の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１６のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号５：

【００７３】

【化９】

【００７４】配列番号６の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１８のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号６：

【００７５】

【化１０】

【００７６】配列番号７の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号７：

【００７７】

【化１１】

【００７８】配列番号８の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号８：

【００７９】

【化１２】

【００８０】配列番号９の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号９：

【００８１】

【化１３】

【００８２】配列番号１０の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１０：

【００８３】

【化１４】

【００８４】配列番号１１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１１：

【００８５】

【化１５】

【００８６】配列番号１２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１２：

【００８７】

【化１６】

【００８８】配列番号１３の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１３：

【００８９】

【化１７】

【００９０】配列番号１４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１４：

【００９１】

【化１８】

【００９２】配列番号１５の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１５：

【００９３】

【化１９】

【００９４】配列番号１６の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１６：

【００９５】

【化２０】

【００９６】配列番号１７の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１７：

【００９７】

【化２１】

【００９８】配列番号１８の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１５のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１８：

【００９９】

【化２２】

【０１００】配列番号１９の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１６のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号１９：

【０１０１】

【化２３】

【０１０２】配列番号２０の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１５のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号２０：

【０１０３】

【化２４】

【０１０４】配列番号２１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１１のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号２１：

【０１０５】

【化２５】

【０１０６】配列番号２２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１２のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号２２：

【０１０７】

【化２６】

【０１０８】配列番号２３の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１２のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号２３：

【０１０９】

【化２７】

【０１１０】配列番号２４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１２のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号２４：

【０１１１】

【化２８】

【０１１２】配列番号２５の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：８のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号２５：

【０１１３】

【化２９】

【０１１４】配列番号２６の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号２６：

【０１１５】

【化３０】

【０１１６】配列番号２７の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号２７：

【０１１７】

【化３１】

【０１１８】配列番号２８の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１７のアミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号２８：

【０１１９】

【化３２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 8310−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者ウルスーラ−ヘンリケヴィーンヒュースドイツ連邦共和国Ｄ−80797 ミュンヘンシュライスシャイマーシュトラーセ 205 (72)発明者ヒューバートベイヤードイツ連邦共和国Ｄ−82362 ヴァイルハイムアムエールシュラーク２ (72)発明者グーンター−ゲルハルトユンクドイツ連邦共和国Ｄ−72076 チュービンゲンオブデアグラーフェンハルデ５ (72)発明者ハンスゲオルグイーレンフェルトドイツ連邦共和国Ｄ−72070 チュービンゲンヴァイラーハルデ 22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１〜６もしくは28のアミノ酸配
列または少なくとも４のアミノ酸の長さを有するその部
分配列を含むHCV ペプチド抗原。
【請求項２】９のアミノ酸の最大長さを有する部分配
列を含む請求項１に記載のHCV ペプチド抗原。
【請求項３】配列番号７、８、10、11、22、23、24、
25、26の部分配列を含む請求項２に記載のHCV ペプチド
抗原。
【請求項４】配列番号３または９の部分配列を含む請
求項１に記載のHCVペプチド抗原。
【請求項５】配列番号12、14、13、15、16、９、３また
は配列番号12、14、13、15、16、９または配列番号12、
16、15、17、９、３または配列番号12、14、13、15、1
6、７、８、11または配列番号12、14、13、15、16、
９、３、18または配列番号12、16、９、15、17、３、18
または配列番号12、19、15、16、６、３からなるHCV ペ
プチド抗原の組み合わせ。
【請求項６】Ｃ末端の形成アミノ酸を担体に結合さ
せ、ペプチド抗原をＣ末端から開始して次第に形成さ
せ、続いて担体から開裂することを特徴とする請求項１
〜４に記載のペプチド抗原の生産方法。
【請求項７】配列番号１〜６および28より成る群また
は長さが少なくとも４のアミノ酸のこれらのペプチド抗
原の部分配列であるペプチド抗原からの少なくとも二種
のペプチド抗原の組み合わせと共に試料をインキュベー
トし、そしてペプチド抗原に結合されたHCV 抗体の量を
抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で測定するこ
とを特徴とするHCV 抗体の測定方法。
【請求項８】組み合わせが、配列番号７、８、10、1
1、22、23、24、25または26の部分配列である長さ４〜
９のアミノ酸の少なくとも一種のペプチド抗原を含むこ
とを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】組み合わせが配列番号12〜19の群からの
少なくとも一種のHCV 抗原を含むことを特徴とする請求
項７に記載の方法。
【請求項１０】組み合わせが配列番号３および９の群
からの少なくとも一種のペプチド抗原を含むことを特徴
とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】配列番号12、14、13、15、16、９、３ま
たは配列番号12、14、13、15、16、９または配列番号1
2、16、15、17、９、３または配列番号12、14、13、1
5、16、７、８、11または配列番号12、14、13、15、1
6、９、３、18または配列番号12、16、９、15、17、
３、18または配列番号12、19、15、16、６、３が組み合
わせとして使用されることを特徴とする請求項９に記載
の方法。
【請求項１２】哺乳類を配列番号１〜６または28のペ
プチド抗原（これらは必要により担体に結合されていて
もよい）、またはその部分配列で免疫化して、ポリクロ
ーナル抗体を得るか、または抗体を生産するこれらの動
物の細胞を細胞系に不死化して、その細胞系からモノク
ローナル抗体を得ることを特徴とするHCV 抗原に対する
抗体の生産方法。
【請求項１３】配列番号７〜11または22〜26が、部分
配列であるペプチド抗原として使用されることを特徴と
する請求項12に記載の方法。
【請求項１４】試料を抗原抗体複合体の形成を可能に
する条件下で請求項12または13に記載の抗体と共にイン
キュベートし、形成された抗体抗原複合体の量を測定す
ることを特徴とするHCV ウイルスの測定方法。
【請求項１５】配列番号１〜６または26の少なくとも
一種のペプチド抗原（これらは必要により担体に結合さ
れていてもよい）を含み、または少なくとも４のアミノ
酸の長さのこれらのペプチド抗原の部分配列であるペプ
チド抗原が使用されているHCV 感染症の治療用ワクチン
であって、前記のワクチンが薬理学上有効な投薬量で医
薬上許される配合で免疫原として使用されることを特徴
とするHCV 感染症の治療用ワクチン。
【請求項１６】部分配列：配列番号12、14、13、15、
16、９、３または配列番号12、14、13、15、16、９また
は配列番号12、16、15、17、９、３または配列番号12、
14、13、15、16、７、８、11または配列番号12、14、1
3、15、16、９、３、18または配列番号12、16、９、1
5、17、３、18または配列番号12、19、15、16、６、３
がペプチド抗原として使用されることを特徴とする請求
項15に記載のワクチン。
【請求項１７】配列番号１〜６もしくは28のペプチド
抗原または少なくとも４のアミノ酸の長さのこれらのペ
プチド抗原の部分配列であるペプチド抗原が免疫原とし
て使用されるワクチンの生産方法。
【請求項１８】使用されるペプチド抗原がHCV のカル
ボキシル末端NS4 エピトープからのペプチドであること
を特徴とする一種または数種のペプチド抗原による感染
性HCV 血清の免疫測定方法。
【請求項１９】アミノ酸配列が非ＨＣＶ特異的成分、
好ましくはビオチン基および／または非ＨＣＶ特異的ア
ミノ酸配列に接続されることを特徴とする請求項１に記
載のＨＣＶペプチド抗原。