RO117329B1

RO117329B1 - Polipeptide care contin o secventa a virusului hepatitei c

Info

Publication number: RO117329B1
Application number: RO93-01778A
Authority: RO
Inventors: David Y Chien; William Rutter
Original assignee: Chiron Corp Emeryville
Priority date: 1991-06-24
Filing date: 1992-06-24
Publication date: 2002-01-30
Also published as: ES2188583T3; FI20021626L; EP0591431B1; FI110099B; HUT73098A; CA2110058C; JP2004115533A; JP3514680B2; JP4456595B2; KR0185426B1; JP3516681B2; WO1993000365A3; ATE229543T1; EP0591431A1; UA40572C2; JP2005053920A; DE69232871D1; JP2007131629A; JP2003277396A; JP4456596B2

Abstract

Prezenta inventie se refera la polipeptide cuprinzand o secventa trunchiata a virusului hepatitei C, care contine un octamer HCV in care este inclus un epitop al virusului hepatitei C. Aceste polipeptide sunt folosite ca reactivi imunogenici, in detectarea, prevenirea si tratamentul infectiilor cu HCV.

Description

Invenția se referă la polipeptide care conțin o secvență trunchiată a virusului hepatitei C, folosite ca reactivi imunologici în detectarea, prevenirea și tratamentul infecțiilor cu virusul hepatitei C.

Este cunoscut faptul că virusul hepatitei C (HCV) a fost inițial identificat și caracterizat ca o cauză a hepatitei non-A non-B (NANBH) de către Houghton și colaboratorii.

Aceasta a condus la descoperirea unui număr de polipeptide generale și specifice folosite ca reactivi imunologici. în Houghton și colab., EP 318216, Houghton și colab. EP 388232, Choo și colab., Science (1989) 244: 359-362; Kuo și colab., Science (1989) 244: 362-364; Houghton și colab. Hepatology (1991) 14: 381-388 se arată cunoașterea, cu o vastă fundamentare, a virusului hepatitei C, în general, ca și producerea și utilizarea polipeptidelor acestuia ca reactivi imunologici. Mai concret, descoperirile acestor publicații, în particular sunt încorporate aici prin referință. Alți autori au aplicat și extins lucrarea lui Houghton și colab.. Vezi adică, Highfield și colab., UK 2239245 (The Wellcome Fundation Ltd.); Wang, EP 442394 (United Biomedical Inc.); Leung și colab. EP 445423 [Abbot Laboratories); Habist și colab. EP 451891 (Akzo N.V.); Reyes și colab. PCT 91/15516 (Genelabs Inc.); Maki și colab. EP 468657 (Tonen Corp.); și Kamada și colab., EP 469348 (Shionogi Seiyaku K.K.).

Metodele sensibile și specifice pentru selecționarea și identificarea transportorilor virusului hepatitei C și sângele contaminat cu aceasta sau a produselor sângelui sunt un important pas înainte în medicină.

Hepatita posttransfuzională(PTH) apare la aproximativ 10% din pacienții transfuzați și HCV apare la până la 90% din aceste cazuri. Problema majoră în această boală este evoluția frecventă a leziunii cronice a ficatului (25 -50 %).

Pacientul trebuie să aibă grijă ca și la prevenirea transmisiei HCV prin sânge și produse din sânge sau prin contact personal să ceară diagnostic de precizie și instrumente de prognozare, cum ar fi polipeptidele HCV, pentru detectarea anticorpilor corespunzători HCV.

Aceste polipeptide sunt, de asemenea, folosite ca vaccinuri și agenți terapeutici de imunoterapie pentru prevenirea și/sau tratamentul bolii.

De când HCV este un agent relativ nou există o necesitate continuă de a defini reactivii imunologici suplimentari care să permită studierea în continuare a cursului clinic al bolii și epidemiologia HCV în rândul populației.

Problema, pe care o rezolvă invenția, este caracterizarea unei polipeptide cuprinzând o secvență trunchiată de virus al hepatitei C (HCV) având o lungime de 25 aminoacizi.

Polipeptidele cuprinzând o secvență trunchiată de virus al hepatitei C (HCV) având o lungime de 25 aminoacizi, conform invenției, rezolvă o serie de dezavantaje prin aceea că, ea cuprinde un octamer HCV conținând un epitop selectat din:

GRTWAQPC LINTNGSW NNTRPPLG WPQSEQV AAARVTAI SEVENKW

RO 117329 Bl în polipeptidele cuprinzând o secvență trunchiată HCV, conform invenției, secvența trunchiată HCV constă dintr-un octamer HCV conținând un epitop selectat din:

PKARRPEG

GRTWAQPC

LINTNGSW NNTRPPLG WPQSEQV AAARVTAI SEVENKW EAQALPVW

De asemenea, polipeptidele octamer HCV izolată conținând un epitop, conform invenției, rezolvă o serie de dezavantaje prin aceea că este selectată din grupul constând din:

PKARRPEG

GRTWAQPC

LINTNGSW

NNTRPPLG WPQSEQV AAARVTAI SEVENKW EAQALPVW

Invenția prezintă următoarele avantaje:

- permite producerea de polipeptide care reacționează imunologic cu anticorp HCV și/sau generează producerea de anticorpi anti-HCV in vitro.

- pot fi utilizați ca standarde sau reactivi în testele de diagnostic al hepatitei C virale.

Caracterizarea acestor epitopi permite producerea de polipeptide care reacționează imunologic cu anticorpi pentru HCV și/sau generează producerea de anticorpi anti-HCV in vivo.

Aceste produse polipeptidice sunt utilizate ca standarde sau reactivi în testele de diagnostic și/sau drept componenți ai vaccinurilor. Anticorpii, atât policlonali, cât și monoclonali, direcționați împotriva epitopilor HCV conținuți în secvențele acestor polipeptide sunt, de asemenea, reactivi utili, de exemplu, în testele de diagnostic ca agenți terapeutici pentru selecționarea agenților antivirali și pentru izolarea și purificarea particulelor sau polipeptidelor HCV.

în sens limitativ, prezenta invenție se referă la polipeptide ce conțin epitopii HCV caracterizați recent și descriși aici, metode de producere a acestor polipeptide (metode sintetice și recombinante), metode de utilizare a acestor polipeptide (adică, diagnostic, vaccin și terapeutic) și articole de producere, compoziții și formule adaptate la astfel de utilizări (adică polipeptide fixate la o imunoanaliză sau alt suport, oral sau compoziții farmaceutice injectabile).

în mod similar anticorpii (policlonali, monoclonali sau echivalenții cum ar fi, fragmente de legătură, proteine antigen de legare cu un singur lanț, etc.) corespunzători epitopilor HCV discutați aici sunt, de asemenea, incluși în scopul prezentei invenții ca și metodele de preparare a acestor anticorpi, metode de utilizare a acestor anticorpi

RO 117329 Bl (adică diagnostic vaccin și terapeutic) și articole de producere, compoziții și formulări adaptate acestor utilizări (adică anticorpi fixați la o imunoanaliză sau alt suport, compoziții farmaceutice orale sau injectabile).

Alte aspecte ale invenției sunt în legătură cu echipamentele pentru analizarea probelor pentru prezența unui antigen HCV, cuprinzând anticorpii de mai sus într-un cadru adecvat. Mai departe alte aspecte ale invenției sunt legate de echipamentele pentru analizarea probelor pentru prezența unor anticorpi direcționați împotriva antigenului HCV cuprinzând o polipeptidă ca cea descrisă mai sus într-un cadru adecvat.

în continuare, alte aspecte ale invenției sunt: o metodă pentru producerea unei polipeptide ce conține noi epitopi și HCV descoperiți și care, cuprinde incubarea celulelor gazdă transformată cu un vector de expresie, ce conține o secvență, care codifică o polipeptidă ce conține epitopul HCV în condiții care permit exprimarea acelei polipeptide; și o polipeptidă ce conține un astfel de epitop HCV produs prin această metodă.

Imunoanalizele sunt, de asemenea, incluse în invenție. Acestea includ o imunoanaliză pentru detectarea unui anticorp HCV care cuprinde incubarea unei probe suspectate a conține un antigen HCV, cu un anticorp așa cum este descris mai sus, în condiții care permit formarea unui complex antigen-anticorp; și detectarea complexului antigen-anticorp conținând anticorpul. 0 imunoanaliză pentru detectarea anticorpilor anti-HCV cuprinzând incubarea unei probe suspectate a conține anticorpi antiHCV cu o polipeptidă ca cea descrisă mai sus, în condiții care să permită formarea complexului antigen-anticorp și detectarea complexului antigen-anticorp care conține polipeptidă.

De asemenea, sunt incluse în invenție vaccinurile pentru tratamentul infecției cu HCV cuprinzând o polipeptidă imunogenică ce conține un epitop HCV desris aici. în continuare, alt aspect al invenției este o metodă de producere a anticorpilor corespunzători HCV ce cuprinde administrarea la un individ a unei polipeptide imunogenice izolate, conținând un epitop HCV, descris aici, într-o cantitate suficientă pentru a produce un răspuns imun. Aspectele de mai sus ale invenției prezente sunt însoțite de descrierea formulei epitopului HCV:

aa_x-aa_y în care:

aa, reprezintă un aminoacid;

x și y sunt numere întregi,astfel, încât y - x > 6;

aa_x-aa_y indică o porțiune a secvenței aminoacidului din fig. 1.

xeste selectat din grupul ce constă din 23-24, 36, 66-79, 81-94, 96-98, 1O1-1O3, 186-189, 191, 206, 223, 232, 256, 286, 297-299, 321, 347, 357, 413, 414, 432, 465-472, 480484, 501, 502, 521, 540-549, 579, 594-599, 601-613, 641, 662-665, 685, 705, 706, 729, 782-789, 801, 851,893, 916, 928, 946, 952-954, 1026, 1072, 1109, 1112-1117, 1218, 1240, 1280-1285, 1322, 1322, 1338, 1371, 1384, 1410, 1411, 1454, 1492, 1493, 1532-1535, 1560, 1561, 1566-1568, 1571-1577, 1601-1607, 1615-1620, 1655, 1695, 1710 1712, 1728, 1729, 1758-1762, 1781, 1808, 1821, 1851, 1880, 19801913, 1925, 19401948, 1951, 1966-1969, 1999, 20001-2004, 2006-2011, 2024, 2048-2053, 2055-2057, 2071, 2088-2093, 2108, 2122-2148, 2165, 2187, 2226-2232, 2244-2249, 2277, 2281-2286, 2288, 2289, 2325, 2327, 2346,

RO 117329 Bl

2347, 2349, 2382, 2401, 2417-2422, 2578, 2602-2604, 2606, 2612, 26322638, 2660, 2676-2679, 2688, 2693, 2707, 2721, 2757-2762, 2779, 2794, 140

2795, 2797-2799, 2801, 2802, 2817, 2843, 2863-2867, 2878-2884, 28862895.

Obiecțiile de mai sus sunt, de asemenea, rezolvate utilizând epitopii HCV cu formula:

aa_x-aa_y 145 în care:

aa, reprezintă un aminoacid;

x și y sunt numere întrgi,astfel, încât y - x > 6;

aa_x-aa_y indică o porțiune a secvenței aminoacidului din fig. 1.

x este selectat din grupul ce cuprinde 35 (în care, y este mai mic de 45), 80 (unde, 150 yeste mai mic de 90), 95 (unde, yeste mai mic de 110), 99 (unde, yeste mai mic de 120], 100 (unde, yeste mai mic de 150), 190 (unde, yeste mai mic de 210), 500 (unde, yeste mai mic de 550), 600 (unde, yeste mai mic de 625), 1260 (unde, yeste mai mic de 1280), 1569 (unde, yeste mai mic de 1931), 1570 (unde, yeste mai mic de 1590), 1694 (unde, yeste mai mic de 1635), 1949 (unde, yeste mai 155 mic de 2124), 1950 (unde, yeste mai mic de 1985), 2000 (unde,yeste mai mic de 2050), 2005 (unde, yeste mai mic de 2025), 2054 (unde, yeste mai mic de 2223), 2250 (unde, yeste mai mic de 2330), 2287 (unde, yeste mai mic de 2385), 2290 (unde, yeste mai mic de 2310), 2345 (unde, yeste mai mic de 2375), 2348 (unde, yeste mai mic de 2464), 2445 (unde, yeste mai mic de 2475), 2473 (unde, yeste 160 mai mic de 2490), 2605 (unde, y este mai mic de 2620), 2780 (unde, y este mai mic de 2830], 2796 (unde, yeste mai mic de 2886), 2800 (unde, yeste mai mic de 2850), 2885 (unde, yeste mai mic de 2905), în fiecare din formulele de mai sus, x-y poate fi mai mic sau egal cu 10, 20,

30, 40 sau 50 în câteva exemplificări ale invenției. 165 ‘‘Virusul hepatitei C” se referă la speciile virale reorganizate artificial ale căror tulpini patogene cauzează NANBH, și tulpini atenuate sau particulele de interferență defective derivate din acestea. Genomul HCV este alcătuit din ARN. Se știe că virusurile conținând ARN au viteză mai mare de mutație spontană, adică, după câte se pare de ordinul 10'³ -10⁴ per nucleotidă încorporată (Fields & Knipe(1986)). De 170 aceea, când heterogenitatea și fluiditatea genotipului sunt moștenite în virusurile ARN, acestea sunt tulpini multiple/izolate, care pot fi virulente sau avirulente, în interiorul speciilor HCV. Propagarea, identificarea, detenție și izolarea diferitelor tulpini HCV sau izolate sunt bine documentate în literatură. Mai mult, prezentările de aici permit punerea diagnosticelor și prepararea vaccinelor pentru diferite tulpini/izolate ca și 175 compoziții și metode care au utilitate în procedeele de selecționare pentru agenții antivirali, pentru utilizarea farmacologică cum ar fi, agenții care inhibă replicarea HCV.

Este discutată aici informația despre câteva tulpini diferite/izolate ale HCV, în particular tulpina sau izolatul CDC/HCV 1 (numit, de asemenea, HCV 1). Informația dintr-o tulpină sau izolat cum ar fi, un genom parțial sau o secvență de aminoacid, 180 este suficientă pentru a permite celor calificați în această meserie folosirea standardelor pentru tulpini noi/izolate și a identifica dacă aceste tulpini noi/izolate sunt HCV. De exemplu, se descriu mai jos câteva tulpini diferite/izolate. Aceste tulpini care au fost obținute dintr-un număr de seturi și din diferite arii geografice, au fost izolate utilizând informația din secvența genomică a HCV 1.

185

RO 117329 Bl

Informația prezentată aici este o indicație că HCV poate fi în relație îndepărtată cu flavivirideele. Familia Flavivirus conține un număr mare de virusuri care sunt mici și care îmbracă forme patogene la om.

Morfologia și compoziția particulelor sunt cunoscute și sunt discutate în Brinton (1986). în general, referitor la morfologie, flavivirusurile conțin o nucleocapsidă centrală înconjurată de un strat dublu lipidic. Virionii sunt sferici și au un diametru de aproximativ 40-50 nm. Nucleele lor au diametre de 25-30 nm. De-a lungul suprafeței exterioare a învelișului virionului sunt proeminențe care au aproximativ 5-10 nm lungime cu umflături terminale, de aproximativ 2 nm în diametru. Exemplele tipice ale familiei includ virusul Yellow, Fever, virusul West Nile și virusul Dengue Fever. Ele posedă genomuri ARN răsucite pozitiv (aproximativ, 11000 nucleotide), care sunt ceva mai mari decât HCV și codifică un precursor poliproteinic, de aproximativ 3500 aminoacizi. Proteinele virale individuale sunt clivate din acest precursor polipeptidic.

Au fost deduse structura genomică și secvența de nucleotide a genomului ARN al HCV. Genomul apare a fi un ARN răsucit o singură dată ce cuprinde aproximativ 10000 nucleotide. Genomul este răsucit pozitiv și posedă un cadru deschis de citire (ORF), continuu, translațional care codificăo polipeptidă de aproximativ 3000 aminoacizi. în ORF, proteinele structurale par a fi codificate în aproximativ primul sfert al regiunii N-terminale, cu majoritatea poliproteinei responsabile pentru proteinele nestructurale. Când s-a comparat cu toate secvențele virale cunoscute, au fost observate analogii co-lineare mici dar semnificative cu proteinele ne-structurale ale familiei Flavivirusului și cu postvirusurile (care sunt acum considerate a fi parte din familia Flavivirusului).

Bazat pe presupusă codificare a aminoacizilor din secvența de nucleotide a HCV și alte evidențe, domeniile de proteină posibilă ale poliproteinei codificate de HCV ca și cele din imediata apropiere sunt următoarele:

Domeniu presupus Imediata apropiere (nr. aminoacizi)

C (proteine nucleocapsidei)................................. 1-191

Ε_η (proteina care învelește virionul).......................... 192-383

E_e / NSI (anvelopa).................................... 384-800

NS 2 (funcție necunoscută) ............................. 800-1050

NS 3 (proteaza) .................................... 1050-1650

NS 4 (funcție necunoscută) ............................ 1651-2100

NS 5 (poliproteaza).............................. 2100-3011 (final)

Aceste domenii sunt, totuși experimentale. De exemplu, limita E1-NS 2 este probabil regiunea 750-810 și limita NS 3 -NS 4 este, aproximativ 1640-1650. Există, de asemenea, dovezi că versiunea a 191 a C este un precursor, care este mai departe prelucrat (adică) la aproximativ 170 aa în lungime.), și că proteinele NS 2, NS 4 și NS 5 sunt fiecare prelucrate în două proteine mature.

Diferite tulpini, izolate sau subtipuri de HCV se așteaptă să conțină variații la aminoacizii și acizii nucleici comparativ cu HCV 1. Multe izolate se așteaptă să prezinte mai mulți omologi (adică mai mult, de aproximativ 40%) în secvența de aminoacizi totali, comparativ cu HCV 1.

t

RO 117329 Bl

Totuși, se poate, de asemenea, constata că există alte izolate HCV mai puțin omoloage. Acestea pot fi definite ca HCV în conformitate cu diferite criterii cum ar fi, de exemplu, un ORF de aproximativ 9OOO nucleotide până, la aproximativ 12000 nucleotide, care codifică o polipeptidă similară în mărime cu aceea a HCV 1, o polipeptidă codificată de hidrofobicitatea similară și/sau caracter antigenic cu aceea a HCV 1 și prezența secvențelor colineare de peptide care sunt asemănătoare cu HCV 1. Suplimentat, genomul va fi un ARN răsucit pozitiv.

HCV codifică cel puțin un epitop care este identificabil imunologic cu un epitop în poliproteina HCV 1. Epitopul este unic la HCV când se compară cu Flavivirusurile cunoscute anterior. Unicitatea epitopului poate fi determinată prin reactivitatea imunologică cu anticorpi la speciile cunoscute Flavivirus.

Metode pentru determinarea reactivității imunologice sunt cunoscute în domeniu, de exemplu, prin radioimunoanaliză, prin analiză ELISA, prin hemaglutinare și aici sunt date câteva exemple de tehnici pentru analize.

în mod alternativ, o comparație a secvenței epitopului HCV cu speciile cunoscute anterior ale membrilor familiei Flavivirusului poate fi folosită pentru a evalua unicitatea.

Suplimentar celor de mai sus, următorii parameri de omologie a acizilor nucleici și omologie a aminoacizilor sunt aplicabile, fie individual, fie în combinație, în identificarea unor tulpini/izolat ca HCV. Când tulpinile HCV și izolatele sunt în legătură evolutivă, se așteaptă ca întreaga omologie a genomurilor, la nivelul nucleotidelor să fie de aproximativ 10% sau mai mare, probabil va fi aproximativ 40% sau mai mare, probabil aproximativ 60% sau mai mare, și mai probabil aproximativ 80% sau mai mare; și în plus vor exista secvențe alăturate corespunzătoare de aproximativ cel puțin 13 nucleotide.

Trebuie notat că există regiuni variabile și hipervariabile în interiorul genomului HCV, de aceea omologia în aceste regiuni se așteaptă să fie semnificativ mai mică decât aceea din întregul genom. Corespondența dintre secvența genomică a tulpinii HCV propuse și, de exemplu, secvența cADN a CDC/HCV 1 poate fi determinată prin tehnici cunoscute în domeniu. De exemplu, ele por fi determinate printr-o comparație directă a informației secvenței de polinucleotide din HCV presupus și secvența(ele) cADN a HCV descris aici. De exemplu, de asemenea, ele pot fi determinate prin hibridizarea polinucleotidelor în condiții care formează duplexuri stabile între regiunile omoloage (de exemplu, acelea care vor fi folosite înainte de digestia S1), urmată de digestia cu nuclează(aze) specifice unui singur lanț urmată de determinarea mărimii fragmentelor digerate.

Din cauza relației de evoluție a tulpinilor sau izolatelor de HCV presupuse sau izolatele sunt identificabile prin omologia lor la nivelul polipeptidei. în general, tulpinile HCV sau izolatele se așteaptă să fie de cel puțin 10% omologie mai mult, de aproximativ 40% omologie, probabil mai mult de 70% omologie și chiar mai probabil mai mult de aproximativ 80% omologie și câteva pot chiar să aibe mai mult de aproximativ 90% omologie, la nivelul polipeptidei.

Tehnicile pentru determinarea omologiei secvenței de aminoacizi sunt cunoscute în domeniu. De exemplu, secvența de aminoacizi poate fi determinată direct și comparată cu secvențele arătate aici. în mod alternativ, secvența de nucleotide a materialului genomic HCV presupus poate fi determinată (de obicei printr-un intermediar cADN), secvența de aminoacizi codificată de acesta și regiunile corespunzătoare pot fi comparate.

235

240

245

250

255

260

265

270

275

RO 117329 Bl

Așa cum s-a utilizat aici printr-o polinucleotidă derivată din” o secvență desemnată se înțelege o secvență de polinucleotidă care este cuprinsă într-o secvență, de aproximativ cel puțin 6 nucleotide, preferabil, cel puțin aproximativ 8 nucleotide, mai preferabil, de cel puțin 10-12 nucleotide, și chiar, mai preferabil, de cel puțin 15-20 nucleotide, corespunzătoare unei regiuni a secvenței desemnate de nucleotide.

Corespunzător” înseamnă omolog sau complementar secvenței desemnate. De preferință, secvența regiunii din care este derivată polinucleotidă este omoloagă sau complementară unei secvențe care este unică unui genom HCV. Dacă este sau nu o secvență unică unui genom se poate determina prin tehnici cunoscute celor specializați în domeniu. De exemplu, secvența poate fi comparată cu secvențele din Băncile de Date (ca la data anterioară), adică Banca de Gene, pentru a determina dacă este prezentă în gazda neinfectată sau alte organisme. Secvența poate fi, de asemenea, comparată cu secvențele cunoscute (ca mai înainte) ale altor agenți virali, incluzând acelea care sunt cunoscute că induc hepatita, adică HCV, HBV și HDV și membrii Flaviviridelor.

Corespondența sau necorespondența secvenței derivate din alte secvențe poate, de asemenea, fi determinată prin hibridizare în condiții strict adecvate. Tehnicile de hibridizare pentru determinarea complementarității secvențelor de acid nucleic sunt cunoscute în domeniu, de exemplu, Manitas și colaboratorii (1982). Mai mult, lipsa perechii duplexului de polinucleotide formate prin hibridizare poate fi determinată prin tehnicile cunoscute, incluzând, de exemplu, digestia cu o nuclează cum ar fi S1, care digeră specific suprafața unui singur lanț din duplexul de nucleotide. Regiunile din care secvențele ADN tipice pot fi “derivate” includ dar nu limitează, de exemplu, regiunile care codifică epitopii specifici ca și regiunile netranscrise și/sau netranslatate.

Polinucleotidă derivată nu este neapărat derivată fizic din secvența de nucleotide arătată, dar poate fi generată într-o manieră care include de exemplu, sinteza chimică sau replicare a ADN sau reverstranscripția sau transcrierea. în plus, combinațiile regiunilor corespunzătoare acelea din secvența desemnată pot fi modificate în modurile arătate în acest domeniu, ar fi corespunzător cu intenția de utilizare.

în mod similar, o secvență de polinucleotide sau aminoacizi “derivată din” o secvență desemnată de aminoacizi sau acizi nucleici se referă la o polipeptidă care are o secvență de aminoacizi identică cu aceea a unei polipeptide codificate în secvență; sau o porțiune din aceasta în care porțiunea constă din 3-5 aminoacizi, și, mai preferabil, de cel puțin 8-10 aminoacizi și chiar, mai preferabil, de cel puțin 11-15 aminoacizi sau care este identificabilă imunogenic cu o polipeptidă în secvență. Această terminologie, de asemenea, include o polipeptidă dintr-o secvență desemnată de acizi nucleici.

Un recombinant sau o polipeptidă derivată poate include unul sau mai mulți analogi sau aminoacizi nenaturali în secvența lui.

Metode de inserare a analogilor de aminoacizi într-o secvență

Se cunosc în acest domeniu metode de inserare a analogilor aminoacizilor întro secvență. Se pot include, de asemenea, unul sau mai mulți markeri, care sunt, de asemenea, cunoscuți celor specializați în domeniu.

Termenul “ polinucleotidă recombinantă” așa cum este utilizat aici semnifică o polinucleotidă genomică, cADN, semisintetică sau de origine sintetică, care prin originea ei sau manipulare: (1) nu este asociată cu o nucleotidă sau o porțiune a unei nucleotide cu care este asociată în natură, (2) este legată la o polinucleotidă, alta decât aceea la care este legată în natură, sau (3) nu apare în natură.

RO 117329 Bl

Termenul “polinucleotidă” așa cum este utilizat aici se referă la o formă polimerică de nucleotide de orice lungime, fie ribonucleotide, fie dezoxiribonucleotide. Acest termen se referă numai la structura primară a moleculei. Astfel, acest termen include dublul sau simplul strat ADN și ARN.

De asemenea, el include tipuri cunoscute de modificări, de exemplu, markeri care sunt cunoscuți în acest domeniu, metilarea capetelor”, substituirea uneia sau mai multor nucleotide care apar natural cu un analog, modificări internuleotidice cum ar fi, de exemplu, acelea cu legături neîncărcate (adică, metil fosfonați, fosfotrieteri, fosforoamidați, carbonați etc.) și cu legături încărcate (adică trifosfați și ditriofosfați etc.), acelea conținând umidități variabile, cum ar fi, de exemplu, proteinele (incluzând, de exemplu, nucleaze, toxine, anticorpi, peptide semnal, poli-L-lisina, etc.), acelea cu intercalări (adică acridină, psoralen, etc), acelea conținând agenți de chelare (adică, metale, radioactive, bor metale oxidante, etc.), acelea conținând alcalanți, acelea cu legături nemodificate ale polinucleotidei.

peptidă “purificată” se referă la polipeptidă care este într-o stare care este substanțial liberă de alte polipeptide, adică, într-o compoziție care conține un minim de aproximativ 50% în greutate (polipeptidă dorită] polipeptidă totală în compoziție, preferabil un minimum, de aproximativ 90% al polipeptidei dorite, fără legătură cu materialele neproteice din compoziție. Tehnicile pentru purificarea polipeptidelor virale sunt cunoscute în domeniu. Anticorpii purificați sunt definiți similar.

“Celulele gazdă recombinante”, “celulele gazdă”, “celulele”, “liniile celulare”, culturile celulare” și alți asemenea termeni denotă microorganisme sau linii celulare eucariote superioare cultivate ca entități unicelulare și se referă la celulele care pot fi sau au fost folosite ca recipiente pentru vectorul recombinant sau alt ADN de transfer, și care includ descendenți ai celulei care au fost transformate.

Este de înțeles că descendenții unei singure celule parentale nu este necesar să fie complet identici ca morfologie, genom sau ca ADN total complementar ca părinții originali, datorită mutației naturale, accidentale sau deliberate.

Un “replicon” este orice element genetic, adică, o plasmidă, un cromozom, un virus, o cosmidă, etc, care evoluează ca o unitate autonomă a replicării polinuceotidei în interiorul unei celule, adică, este capabilă de replicare sub propriul ei control.

Un “ vector” este un replicon în care alt segment polinucleotidic este atașat, astfel, încât să determine replicarea și/sau expresia segmentului atașat.

“Secvența control” se referă la secvențele de polinucleotide care este necesar să efectueze exprimarea secvențelor de codificare la care ele sunt legate.

Natura acestor secvențe control depinde de organismul gazdă, la procariote, în general, aceste secvențe control includ promotorul, locul de legare ribozomal și terminatori. în general, la eucariote, aceste secvențe de control includ promotorii, terminatorii și în anumite cazuri amplificatori.

Termenul de “secvență control” își propune să includă cel puțin toți componenții a căror prezență este necesară pentru exprimare, și, de asemenea, include componenții adiționali a căror prezență este avantajoasă, de exemplu, secvențele conducătoare.

“Legătură operabilă” se referă la o juxtapunere în care componenții astfel descriși sunt într-o relație ce le permite să funcționeze într-o manieră proprie.

330

335

340

345

350

355

360

365

370

RO 117329 Bl □ secvență de control “legată operabil” la o secvență de codificare este legată într-o astfel de manieră ca exprimarea secvenței de codificare să se realizeze în condiții comparabile cu secvențele de control.

Un “cadru deschis de citire” (ORF) este o secvență a regiunii de polinucleotide care codifică o polinucleotidă; această regiune poate reprezenta o porțiune a unei secvențe de codificare totală.

O “secvență de codificare” este o secvență de polinucleotide care este transcrisă într-un mARN și/sau translatată într-o polipeptidă când este plasată sub controlul secvențelor de reglare adecvate. Limitele secvenței de codificare sunt determinate printr-un codon de translație de începere la capătul 5’ terminal și un codon de translație de oprire la capătul 3' terminal.

Secvența de codificare poate include, dar nu este limitată la mARN, cADN și secvențele de polinucleotide recombinate.

“Identificare imunologică cu/ca” se referă la prezența epitopilor sau polipeptidelor care sunt, de asemenea, prezente în polipeptidele desemnate, proteine HCV uzuale.

Identificarea imunologică poate fi determinată prin legarea anticorpilor și/sau competiția în legare; aceste tehnici sunt cunoscute tuturor celor specializați în domeniu.

Așa cum este utilizat aici, termenul “epitop” se referă la un determinant antigenic al unei polipeptide. Un epitop poate cuprinde 3 sau mai mulți aminoacizi care definesc locul de legare al unui anticorp. în general, un epitop este alcătuit din cel puțin 5 aminoacizi și câteodată conține cel puțin 8 aminoacizi. Metodele de cartare ale epitopilor sunt cunoscute în domeniu.

□ polipeptidă este “reactivă imunologic” cu un anticorp dacă ea se leagă la un anticorp datorită recunoașterii anticorpului de un epitop specific conținut în polipeptidă.

Reactivitatea imunologică poate fi determinată prin legarea anticorpului, mai particular prin cinetica de legare a anticorpului, și/sau prin competiția în legare, utilizând drept competitor (I) o polipeptidă(e) cunoscută ce conține un epitop împotriva căruia este direcționat anticorpul. Se cunosc în domeniu tehnicile de determinare dacă o polipeptidă este reactivă imunologic cu un anticorp.

Așa cum se utilizează aici, termenul “anticorp” se referă la o polipeptidă sau un grup de polipeptide care conține, cel puțin un loc de combinare a anticorpului. Un loc de combinare a anticorpului sau “domeniul de legare” este format din domenii variabile de pliere a unei (unor) molecule anticorp pentru a forma spații de legare tri-dimensionale cu forma suprafeței interne și complementaritatea distribuției sarcinii, a trăsăturilor unui epitop al unui antigen permite o reacție imunologică cu antigenul. Un loc de combinare al anticorpului poate fi format dintr-un lanț greu/ușor (V_H și respectiv V_L), care formează ochiuri hipervariabile care contribuie la legarea antigenului.

Termenul “anticorp” include, de exemplu, anticorpi articulați, anticorpi hibrizi, anticorpi himerici, anticorpi alterați, anticorpi univalenți, proteine Fab și anticorpi cu un singur domeniu.

Așa cum este utilizat aici, termenul “anticorp cu un singur domeniu” (dAb) este un anticorp care este alcătuit dintr-un domeniu V_H, care reacționează imunologic cu un antigen desemnat. Un dAb nu conține V_L, dar poate conține alte domenii de legare

RO 117329 Bl a antigenului, cunoscute că există în anticorpi, de exemplu, domeniile kappa și lambda. Se cunosc în domeniu metodele de preparare a anticorpilor dAb, de exemplu, Ward și colaboratorii (1989).

Anticorpii pot, de asemenea, fi alcătuiți din domeniu V_H și V,, ca și alte domenii de legare a anticorpului.

Se cunosc în această meserie, exemplele din aceste tipuri de anticorpi și metode de preparare a acestora (vezi, US 4816467] și include următoarele:

De exemplu, “anticorpii articulați” se referă la anticorpii care sunt tetrameri sau aglomerări ale acestora, conținând lanțuri ușoare și grele care sunt de obicei asociate în configurație Y și care pot sau nu pot avea legături covalente între lanțuri. în anticorpii articulați, secvențele de aminoacizi a tuturor lanțurilor unui anticorp particular sunt omoloage cu lanțurile găsite într-un anticorp produs de limfocite care produc un anticorp in situ, sau in vitro (de exemplu, în hidridoame). în mod tipic, anticorpii policlonali purificați și anticorpii monoclonali. Exemple ale metodelor de preparare a acestor anticorpi, sunt descrise ca metode infra.

“Anticorpii hibrizi” sunt anticorpii în care o pereche de lanțuri grele sau ușoare este omoloagă acelora dintr-un prim anticorp, în timp ce altă pereche de lanțuri grele sau ușoare este omoloagă acelora dintr-un al doilea anticorp diferit. Astfel, fiecare din aceste două perechi va lega epitopii diferiți, în particular, la antigenii diferiți. Aceasta are ca rezultat proprietatea de “bivalență”, adică, capacitatea de a lega doi antigeni diferiți. Acești hibrizi pot fi, de asemenea, formați folosind lanțuri himere, așa cum se arată mai jos.

Anticorpii himerici”, sunt anticorpii în a căror lanțuri ușoare sau grele sunt fuzionate proteine.

în mod tipic, domeniul constant al lanțurilor este dintr-o specie particulară și/sau clasă, și domeniile variabile sunt dintr-o specie și/sau clasă diferită. De asemenea, este inclus oricare anticorp în care fie unul fie ambele lanțuri ușoare sau grele sunt compuse din combinații de secvențe care simulează secvențele din anticorpii din surse diferite, dacă aceste surse sunt din clase diferite, din specii de origini diferite și dacă au sau nu punctul de fuziune la limita variabil/constant. Astfel, este posibil să se producă anticorpi în care nici în regiune constantă nici în regiune variabilă să nu se mimeze secvențe anticorp cunoscute. Este atunci posibil, de exemplu, să se construiască anticorpii a căror regiune variabilă are o afinitate specifică mai mare pentru un antigen particular sau a căror regiune poate realiza fixarea mărită a componentului sau să producă îmbunătățiri la proprietățile pe care le posedă în particular o regiune constantă.

Alt exemplu îl reprezintă “anticorpii alterați”, care se referă la anticorpii în care secvența de aminoacizi care apare în mod natural într-un anticorp articulat a fost variată. Prin utilizarea tehnicilor de ADN recombinant, anticorpii pot fi reconstituiți, pentru a se obține caracteristicele dorite. Posibilele variații sunt multiple, și se situează în domeniul de la schimbarea unuia sau mai multor aminoacizi până la completa reorganizare a unei regiuni, de exemplu, regiunea constantă.

în general, schimbările din regiunea constantă, au ca scop realizarea trăsăturilor dorite ale procesului celular, adică, schimbări în fixarea complementară, intersecția cu membranele și alte funcții de execuție.

420

425

430

435

440

445

450

455

460 î

RO 117329 Bl

Schimbările în regiunea variabilă pot fi realizate prin modificarea caracteristicilor de legare ale antigenului. Anticorpul poate, de asemenea, fi prelucrat prin inginerie genetică în scopul de a transporta specific o moleculă sau o substanță la o celulă specifică sau un loc al țesutului. Modificările dorite pot fi făcute prin tehnici cunoscute în biologia moleculară, adică tehnici recombinante, mutageneză direcționată etc.

Mai departe, alt exemplu îl reprezintă anticorpii univalenți”, care sunt agregate alcătuite dintr-un dimer lanț greu/ lanț ușor legat la regiunea Fc (adică constantă, a unui al doilea lanț greu. Acest tip de anticorp scapă modulației antigenice [vezi, Glenic și colaboratorii, (1982)].

în această definiție a anticorpilor sunt incluse fragmentele “Fab” ale anticorpilor. Regiunea “Fab” se referă la acele porțiuni ale lanțului grea și ușoară, care este aproximativ echivalentă sau analoagă cu secvența care cuprinde porțiunea ramificată a lanțului, grea și ușoară, și care s-a arătat că manifestă legare imunologică la un antigen specific, dar căreia îl lipsește porțiunea efectelor Fc. “Fab” include agregate dintr-un lanț greu și un lanț ușor (cunoscut în mod obișnuit ca Fab’) ca și tetramerii conținând lanțuri 2H și 2L (cunoscute ca Fab 2), care sunt capabile să reacționeze selectiv cu un anumit antigen sau o familie de antigeni. Anticorpii “Fab” pot divizați în subseturi analoage celor descrise mai sus, adică, “Fab articulat”, “Fab hibrid”, “Fab himetic” și “Fab modificat”.

Metodele de producere a fragmentelor de anticorpi “Fab” sunt cunoscute în acestă meserie și includ, de exemplu, proteoliza și sinteza prin tehnicile recombinate.

De asemenea, sunt incluse în termenul “anticorpi” proteinele cu un singur lanț, de legare a antigenelor (SCA) ca cele descrise în articolele al cărui coautor este Schlom I., în iunie 1992, publicată în Center Research (ca și articolul citat aici).

Așa cum se folosește aici, termenul polipeptidă imunogenică este o polipeptidă care necesită un răspuns celular și/sau răspuns umoral imun, dacă este singură sau legată de un transportor în prezența sau absența unui adjuvant.

Termenul “polipeptidă” se referă la un polimer de aminoacizi și nu se referă la lungimea specifică a produsului; astfel peptidele, oligopeptidele și proteinele sunt incluse în definiția de peptidă. Acest termen, de asemenea, nu se referă sau exclude modificările post-exprimare ale polipeptidei, de exemplu, glicozilare, acetilare, fosforilare și altele asemănătoare. Sunt incluse în această definiție de exemplu, polipeptidele conținând unul sau mai mulți analogi ai unui aminoacid incluzând, de exemplu, aminoacizii nenaturali, etc.,) polipeptidele cu legături substituite ca și alte modificări cunoscute în meserie, ambele aparținând natural și nenatural.

“Transformarea”, așa cum se utilizează aici, se referă la inserarea unei polinucleotide exogene într-o celulă gazdă, indiferent de metoda utilizată pentru inserție, de exemplu, metoda directă, transducția, cartare sau electroporarea.

Polinucleotida exogenă poate fi menținută ca un vector neintegrat, de exemplu, o plasmidă, sau alternativ, poate fi integrată într-un genom gazdă.

“Tratamentul așa cum se utilizează aici se referă la profilaxie și/sau terapie.

Un “individ” așa cum se utilizează aici, se referă la vertebrate, în particular membrii ai speciilor de mamifere, și includ dar nu este limitat la animale (adică, câini, pisici, cornute, porcine, oi, capre, iepuri, șoareci, șobolani, cobai, etc. și primate incluzând maimuțe, cimpanzei, babuini și oameni).

RO 117329 Bl

Așa cum se utilizează aici “șirul în sens” a unui aminoacid conține secvența care are secvență omoloagă cu aceea a mRNA “șirul în anti-sens” conține o secvență care este complementară cu aceea a șirului în sens”.

Așa cum se utilizează aici, un ”genom înșiruit pozitiv” al unui virus este unul în care genomul, ARN sau ADN, este într-un singur șir și care codifică una sau mai multe polipeptide virale. Exemple de virusuri ARN înșiruite pozitiv includ Togaviridae, Cronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae și Caliciviridae. Se include, de asemenea, Flaviviridae, care a fost clasificată înainte ca Togaviridae (vezi, Fields Knipe (1986)).

Așa cum se utilizează aici, “un anticorp ce conține un component al corpului” se referă la un component al unui corp al unui individ, care este o sursă de anticorpi de interes. Anticorpul conținând componenții corpului sunt cunoscuți în domeniu și includ, dar nu sunt limitați la, de exemplu, plasmă, ser, lichid spinal, lichid limfatic, secțiunile externe ale căilor respiratorii, tractusurile intestinal și genitourinar, lacrimile, saliva, laptele, globulele albe ale sângelui și mieloamele.

Așa cum se utilizează aici, o “probă biologică” se referă la o probă a țesutului sau a fluidului izolat dintr-un individ, dar nu se limitează la, de exemplu, plasmă, ser, lichidul spinal, lichid limfatic, secrețiile externe ale pielii, căilor respiratorii, tractusurile intestinal și genitourinar, lacrimile, saliva, lapte, celule ale sângelui, tumori, organe și, de asemenea, probe de constituenți ai culturilor celulare in vitro (incluzând dar nu limitat la mediu condiționat rezultat din creșterea celulelor în mediu de cultură celulară, de presupus celulele infectate viral, celule recombinant și componenți celulari.

Practica prezentei invenții va folosi, dacă nu este contraindicat, tehnicile convenționale de biologie moleculară, microbiologie, ADN recombinant și imunologie care sunt utilizate în domeniu.

Aceste tehnici sunt pe deplin explicate în literatură (vezi, Maniatis Filsch & Lambrook, “Molecular Cloning”, A Laboratory Manual” (1982); ADN Cloning, voi. I ADN II” (D, N. Glover ed. 1985); oligonucleotide synthesis” (M.J. Gait, ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization” (B.D.Hames & S.J.Higgins, ed. 1984));

“Transcription ADN Translation” (B.D.Hammes & S.J.Higgins, ed. 1984);

“Animal Cell Culture” (R.I.Freshney ed. 1986); “Immobilized Cells ADN Enzymes” (IRL Press, 1986); B.Prebal, “A Practicai to Molecular Cloning” (1984); seriile “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.);

“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(J.H.Miller ADN M.P.Calos ed. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth Enzvmol. voi. 154 ADN 155 (Wu ADN Grossman, ADN Wu, ed., respectively), Mayer ADN Walker, ed.(1987), “Immunochemical Methods In Cell ADN Molecular Biology” (Academic Press, London); Scopes, (1987) “Protein Purification: Principles ADN Practice”, Second Edition (Springer-Verlang, NY) și “HADNbook of Experimental Immunology”, voi. I-IV (D.M.Weir ADN C.C.BIackwell ed. 1986).

Toate brevetele, cererile de brevet și publicațiile menționate aici, atât supra, cât și infra sunt încorporate aici prin referințe.

în continuare, se prezintă fig. 1-10, care reprezintă:

- fig. 1, poliproteina HCV, prototip izolat HCV 1.

- fig. 2, o secvență de compoziție cADN pentru HCV 1.

- fig. 3, secvența consens de nucleotide a izolatului uman 23, secvențele care se deosebesc sunt arătate sub linia secvenței. Aminoacizii codificați în secvența consens sunt, de asemenea, arătați. .

510

515

520

525

530

535

540

545

550

555

RO 117329 Bl

- fig. 4, secvența consens de nucleotide a izolatului uman 27, secvențele care diferă sunt arătate sub linia secvenței. De asemenea, sunt arătați aminoacizii codificați în secvența consens.

- fig. 5, secvențele nucleotidice aliniate pentru izolatele umanee 23, 27 și HCV 1. Secvențele omoloage sunt indicate prin simboluri (*) secvențele neomoloage sunt cu litere mici;

- fig.6, secvențele aliniate de amînoacizi ale izolatelor umane 23, 27 și HCV 1. Secvențele omoloage sunt indicate prin simboluri (#), secvențele sunt cu litere mici.

- fig. 7, o comparație a secvenței de nucleotide aliniate a izolatelor THORNE, EC 1 HCT±±18 și HCV.

- fig. 8, o comparație a secvențelor de nucleotide a EC 10 și o compoziție a secvenței HCV 1; Secvența EC 10 este deasupra liniei punctate și secvența HCV 1 este sub linia punctată.

- fig. 9,o comparație a secvențelor aminoacizilor 117-308 (referitor la HCV 1) codificată în regiunile “EnvL”ale secvențelor consens ale izolatelor umane HCT++18. JH 23, JH27, Tborne, EC i și ale HCV 1.

- fig. 10, arată o comparație a secvențelor de amînoacizi 330-360 (referitor la HCV 1) codificate în regiunile “EnvL” ale secvențelor consens ale izolatelor umane HCT++18. JH 23, JH27, Tborne, EC și și ale HCV 1.

Polipeptidele HCV trunchiate

Materialul utilizat și procesele prezentei invenții sunt posibile prin identificarea următoare a noilor epitopi HCV. Cunoașterea acestor epitopi (sau regiuni antigenice] permite construirea de polipeptide conținând secvențe HCV trunchiate care pot fi folosite ca reactivi imunologici.

Secvențele de amînoacizi HCV trunchiate ce codifică cel puțin un epitop sunt utilizate ca reactivi imunologici. De exemplu, polipeptide cuprinzând astfel de secvențe trunchiate pot fi utilizate ca reactivi într-o imunoanaliză. De asemenea, aceste polipeptide sunt subunități antigenice prezumtive în compoziții pentru producerea antiserului sau vaccinelor. în timp ce aceste secvențe trunchiate pot fi produse prin diferite tratamente cunoscute ale proteinei virale native, în general, se preferă să se producă sintetic sau polipeptide recombinante cuprinzând o secvență HCV. Polipeptidele ce conțin aceste secvențe HCV trunchiate pot fi alcătuite în întregime din secvențe HCV (unul sau mai mulți epitopi contagioși sau nu), fie din secvențe HCV și secvențe heteroloage între fuziune proteică. Secvențele heteroloage utilizate includ secvențe care manifestă secreția din gazdă recombinant, intensifică activitatea imunologică a epitopilor HCV sau facilitează cuplarea polipeptidei la un suport de imunoanaliză sau un transportor de vaccin (EP 116201; US 4722840; EP 259149; US 4629783)

Mărimea polipeptidelor cuprinzând secvențe HCV trunchiate poate fi valabilă, mărimea minimă fiind o secvență de mărime suficientă pentru a manifesta un epitop HCV, în timp ce mărimea maximă e critică. Pentru conveniență, mărimea maximă obișnuită nu este substanțial mai mare ca aceea necesară pentru manifestarea epitopilor HCV doriți și a funcțiilor secvenței heteroloage, dacă există vreuna.

în mod tipic, secvența trunchiată HCV de amînoacizi se va situa în domeniul de aproximativ 5 (sau 8) până la 100 amînoacizi în lungime. Mai tipic, totuși, secvența de HCV va fi de maxim 50 (sau 40) amînoacizi în lungime și câteodată un maximum, de 20, 25 sau 30 amînoacizi. Se dorește de obicei să se selecteze secvențele HCV de cel puțin 8, 10, 12 sau 15 amînoacizi.

τ

RO 117329 Bl

605

Exemplele de secvențe HCV trunchiate de aminoacizi (octameri) care sunt utilizate așa cum se descrie aici sunt arătate mai jos, în exemple. Este de înțeles că aceste peptide nu precizează harta unui epitop.

Porțiunile neimunogenice ale secvenței pot fi definite prin utilizarea tehnicilor convenționale și șterse din secvențele descrise. Mai departe, secvențele suplimentare de aminoacizi trunchiate care cuprind un epitop sau sunt imunologice pot fi identificate așa cum se descrie aici.

Produsele peptidici conținând secvențe trunchiate HCV de aminoacizi discutate mai jos pot fi preparați ca peptide singulare sau încorporate într-o polipeptidă mai mare și își pot găsi utilizarea așa cum se descrie aici. în aplicațiile preferate, secvențele trunchiate din domeniile E1 și/sau domeniile E2 au aplicații în vaccinuri și produse terapeutici. în timp ce, în general, oricare din domenii poate avea ceva utilitate în diagnostic, sunt preferați în particular C, NS 3, NS și NS 5, cu combinații ale epitopilor C cu epitopii dintr-unul sau mai multe domenii NS 3, NS 4 sau NS 5 fiind preferate în particular.

Prepararea polipeptidelor

Disponibilitatea secvențelor ADN ce codifică secvențele HCV de aminoacizi permit construirea vectorilor de expresie ce codifică regiuni antigenice active ale polipetidei (vezi, fig. 2).

Aceste regiuni antigenice active pot fi derivate din antigeni acoperiți sau antigeni anvelopă sau din antigeni de interior (miez, sămânță], sau din antigeni nestructurali, incluzând, de exemplu, polinucleotide care leagă proteinele polinucleotide-polimeraze, și alte proteine virale cerute de replicarea și/sau asamblarea particulei virale. Fragmentele care codifică polipeptidele dorite sunt derivate, de exemplu, din clone cADN viral, utiliând digestia de restricție convențională sau prin metode sintetice și sunt legate în vectori care pot, de exemplu, conține porțiuni ale secvențelor de fuziune, cum ar fi «-galactozidaza sau superoxid dismutaza (SOD), de preferință, SOD. Metodele și vectorii care sunt utilizați pentru producerea de polipeptide care conțin secvențe de fuziune de SOD sunt descrise în publicația EP 0196056, publicată în 1 octombrie 1986. - Vectorii care codifică polipeptidele de fuziune ale polipeptidelor SOD, și HCV adică NANBg.^, NANB_b și C 100-3, care sunt codificate într-o compoziție cADN al HCV sunt descrise în secțiunile IV. B.1, IV., B2 și respectiv IV B 4.

Orice porțiune dorită a cADN care conține un cadru deschis citirii (sau o versiune sintetică a acestuia) poate fi utilizată pentru exprimarea unei polipeptide recombinante, cum ar fi o proteină matură sau de fuziune.

în mod alternativ, o polipeptidă care conține epitopii HCV poate fi realizată prin sinteza chimică utilizând tehnicile stADNard bazate pe secvența de aminoacizi din figuri și exemple.

ADN care codifică polipeptidă dorită, dacă este în formă fuzionată sau nu, și dacă sau nu conține o secvență semnal ce permite secreția, poate fi legat în vectorii de exprimare adecvați pentru orice gazdă convenabilă.

Atât sistemele gazdă eucariote, cât și procariote sunt în prezent folosite în formarea polipeptidelor recombinante și liniile de celule gazdă sunt date în EP 316216.

Polipeptidă este apoi izolată din celulele lizate sau din mediul de cultură și purificate pentru extinderea necesităților de utilizare.

610

615

620

625

630

635

640

645

RO 117329 Bl

Purificarea poate fi prin tehnicile cunoscute în domeniu, de exemplu, extracția diferențiată, fracționarea sării, cromatografie pe rășini schimbătoare de ioni, cromatografie de afinitate, centrifugare și altele.

Vezi, de exemplu, Metode în Enzimologie, pentru o varietate de metode de purificare a proteinelor. Astfel de polipeptide pot fi utilizate pentru diagnostic, sau acelea care dau naștere la anticorpi de neutralizare pot fi formulate în vaccinuri. Anticorpii care apar împotriva acestor polipeptide pot fi, de asemenea, folosiți pentru diagnostic sau pentru imunoterapie pasivă. în plus, așa cum s-a discutat mai jos, anticorpii de la aceste polipeptide sunt utilizabili, de exemplu, în izolarea și identificarea particulelor HCV.

Polipeptidele HCV pot fi, de asemenea, izolate din virionii HCV și trunchiate (dacă nu sunt deja).

Virionii pot fi crescuți în celule infectate cu HCV în culturi de țesuturi, sau într-o gazdă infectată.

Prepararea polipetidelor antigenice și conjugarea cu transportor □ regiune antigenică a unei polipetide este în general, relativ mică, tipic de 810 aminoacizi sau mai puțin, în lungime. Fragmente de câțiva aminoacizi ca, de exemplu, pot caracteriza o regiune antigenică. Aceste segmente pot corespunde regiunilor antigen HCV. Conform cu acestea, utilizarea cADN al HCV ca o bază, al cărui ADN codifică segmente scurte ale polipeptidelor HCV pot fi exprimate recombinant, fie ca fuzionare de proteină, fie ca polipeptide izolate.

în plus, se pot obține convențional prin sinteză chimică secvențe scurte de aminoacizi.

în cazurile în care polipeptidă sintetizată este corect configurată astfel că reprezintă epitopul corect, dar are proprietăți imunologice prea mici, polipeptidă poate fi legată la un transportor adecvat.

Se cunosc în acest domeniu un număr de tehnici pentru obținerea acestei legături, inclusiv formarea legăturilor disulfidice utilizând N-succinimidil-3-(2-piridiltio) propionat (SPDP) și succinimidil-4-(N-maleimido-metil)ciclohexan-1 -carboxilat (SMCC) obținut de Pierce Company, Rockford, lllinois, (dacă peptidei îl lipsește o grupare sulfhidril aceasta poate fi suplinită prin adăugarea unui reziduu de cisteină).

Acești reactivi creează o legătură disulfidică între ele însele și reziduurile peptidice de cisteină ale unei proteine și o legătură amidică între epsilon amino a lizinei, sau altă grupare amino liberă, în altă legătură. Se cunosc o varietate de agenți de formare a acestor legături disulfidică/amidă, de exemplu, Immun Rev. (1982), 62: 185. Alți agenți de cuplare bifuncționali formează o legătură tioeter mai degrabă decât o legătură disulfidică.

Mulți din acești agenți de formare a legăturii tioeter sunt accesibili din punct de vedere comercial și includ esterii reactivi ai acidului 6-maleimidocaproic, acid 2bromacetic, acid 2-iodoacetic, acid 4-(N-maleimido-metil)ciclohexan-1-carboxilic și alții asemănători.

Grupele carboxil pot fi activate prin combinarea lor cu succinimidă sau acid 1hidroxil-2-nitro-4-sulfonic, sare de sodiu. Metodele suplimentare de cuplare a antigenilor implică sistemul rotavirus/peptidă legată”, descris în EP 259149, a căror descoperire este încorporată aici prin referință. Lista anterioară nu se vrea a fi închisă, și modificările compușilor numiți pot fi clar utilizate.

RO 117329 Bl

695

Se poate utiliza orice transportor care nu induce el însuși producerea de anticorpi periculoși pentru gazdă. Transportorii adecvați sunt în mod tipic mari, macromoleculele ce se metabolizează încet cum ar fi proteinele, polizaharidele cum ar fi, latex, sepharoză funcționalizată, agaroză, celuloză, granule de celuloză și altele asemănătoare; aminoacizi polimerici, cum ar fi acid poliglutamic, polilizină și alți asemenea copolimeri ai aminoacizilor; particule virale inactive, vezi, de exemplu, Secțiunea II D.

Substanțele proteice utilizabile sunt în special albuminele serice, hemocianina din sângele de melc, moleculele de imunoglobuline, tiroglobulina, ovalbumina, anatoxina tetanică și alte proteine bine cunoscute de specialiștii în acest domeniu.

în plus, proteinele virale de completarea lungimii conțin polipeptide.

Prepararea particulelor hibride imunogene conținând epitopi HCV

Imunogenitatea epitopilor HCV poate de asemenea fi amplificată prin prepararea lor în sisteme de mamifere sau de drojdii fuzionate cu sau asamblate cu proteine ce formează particule cum ar fi, de exemplu, antigenul de suprafață al hepatitei B, adică, brevetul US 4722840.

Construcțiile în care epitopul HCV este legat direct la secvența care codifică proteina care formează particula formează hibrizi care sunt imunogenici în raport cu epitopul HCV. în plus, toți vectorii preparați includ epitopii specifici lui HCV, având diferite grade de imunogenitate, cum ar fi, de exemplu, peptidă pro-S.

Astfel, particulele constituite din proteine ce formează particula care include HCV sunt imunogenice în raport cu HCV și HBV.

Antigenul de suprafață al hepatitei (HBS Ag) s-a dovedit că este format și asamblat în particule în S. cerevisiae (O. Valenzuela și colaboratorii (1982)) ca și în, de exemplu, celule de mamifere (P. Valenzuela și colaboratorii (1982)). Formarea acestor particule s-a arătat că mărește imunogenitatea subunității monomer. Construcțiile pot, de asemenea, include epitopul imunodominant al HBVAg ce conține 55 aminoacizi ai regiunii de presuprafață(pre-S), Neurath și colab. (1984). Sunt discutate în EP 174444, publicat în 19 martie 1986, construcții ale particulei pre-SHBVAg care se exprimă în drojdie; hibrizii, inclusiv secvențele heteroloage virale pentru exprimarea drojdiei sunt discutați în EP 175261, publicată 26 martie 1966. Aceste construcții pot fi, de asemenea, fi exprimate în celulele mamiferelor cum ar fi, celulele ovariene ale hamsterului de China (CHO) utilizând un vector SV 40-dihidrofolat reductaza (Michelle și colab. (1984).

în plus, porțiunile secvenței ce codifică proteina care formează particule pot fi înlocuite cu codonii care codifică un epitop HCV. în această înlocuire, regiunile care nu sunt necesare să medieze agregarea unităților pentru a forma particule imunogenice în drojdie sau mamifere pot fi îndepărtate, eliminând astfel situsurile suplimentare antigenice HBV din compoziția cu epitopul HCV.

Prepararea vaccinurilor

Vaccinurile pot fi preparate din una sau mai multe polipeptide imunogenice derivate din HCV. Aceste polipeptide pot fi exprimate în diferite celule gazdă (adică, bacterii drojdii, insecte sau celule de mamifere), sau în mod alternativ pot fi izolate din preparate virale sau pot fi sintetizate.

Vaccinurile singulare sau multiple împotriva HCV pot cuprinde unul sau mai mulți epitopi din una sau mai multe proteine structurale, și/sau unul sau mai mulți epitopi din una sau mai multe proteine nestructurate. Aceste vaccinuri pot fi alcătuite

700

705

710

715

720

725

730

735

RO 117329 Bl din, de exemplu, polipeptide HCV recombinante și/sau polipeptide izolate din virioni.

în particular, vaccinurile sunt proiectate să conțină unul sau mai multe din următoarele proteine HCV, sau subunități antigen derivate din acestea; E1, E 2, C, NS 3,

NS 4 și NS 5. în particular, sunt preferate vaccinurile ce conțin E1 și/sau E2 sau subunități ale lor.

Suplimentar celor de mai sus, este, de asemenea, posibil să se prepare vaccinurile din microorganisme atenuate care să exprime una sau mai multe polipeptide HCV recombinate. Microrganismele atenuate adecvate sunt cunoscute în acest domeniu și includ de exemplu, virusuri (adică, virusul vaccinea (Prown și colab. (1986)) ca și bacterii.

Prepararea vaccinurilor care conțin o polipeptidă imunogenică ca ingredientfte) active este cunoscută în domeniu. în mod tipic aceste vaccinuri sunt preparate ca injectabile, fie ca soluții lichide, fie ca suspensii; de asemenea, pot fi preparate forme solide adecvate pentru prepararea soluției sau suspensiei, lichidului anterior injecției. Prepararea poate, de asemenea, fi emulsionată, sau proteina încapsulată în lipozomi. Ingredientele imunogenice active sunt adesea amestecate cu excipientele care sunt acceptabile din punct de vedere farmaceutic și comparabile cu ingredientul activ. Excipientele adecvate sunt, de exemplu, apă, sare, dextroza, glicerol, etanol, sau altele asemănătoare și combinații ale acestora. în plus, dacă se dorește, vaccinul poate conține cantități minore de substanțe auxiliare cum ar fi, agenți de umectare sau emulsifiere, agenți de tamponare a pH-ului și/sau adjuvanți care măresc eficacitatea vaccinului. Exemplele de adjuvanți care pot fi eficienți includ, dar nu sunt limitați la: hidroxid de aluminiu, N-acetil-muramil-L-treonil-D-izoglutamină (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-izoglutamină (CGP 11637, se referă la nor-MDP), N-acetil-muramilL-alanil-D-izogluglutaminil-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxietilamină(CGP 19835 A, se referă la MTP-PE), și RIBI, care conține trei componente extrase din bacterii, monofosforil lipida A, trehaloză dimicolat și scheletul peretelui celular (MPL+TDM+CWS) într-o emulsie 2% squalen/Tween^R8O. Eficiența unui adjuvant poate fi determinată prin măsurarea cantității de anticorpi direcționați împotriva unei peptide imunogenice conținând o secvență antigenică HCV rezultată din administrarea acestei polipeptide în vaccinurile care, de asemenea, conțin diferiți adjuvanți.

Aceste vaccinuri sunt convențional administrate parenteral, prin injectare, de exemplu, fie subcutanat, fie intramuscular. Formulările suplimentare care sunt adecvate pentru alte moduri de administrare includ supozitoare și, în câteva cazuri formulări orale. Pentru supozitoare, lianți și transportorii tradiționali pot include, de exemplu, polialchilen glicoli sau trigliceride; astfel de supozitoare pot fi formate din amestecuri ce conțin ingredientul activ în domeniul 0,5 și 10%, preferabil 1-2%. Formulările orale includ astfel de excipiente folosite în mod normal, ca, de exemplu, grade farmaceutice de manitol, lactoză, amidon, stearat de magneziu, zaharină sub formă sodică, celuloză, carbonat de magneziu și altele asemănătoare.

Aceste compoziții iau forma soluțiilor, suspensiilor, tabletelor, pilulelor, capsulelor, formulărillor cu eliberare continuă sau pudrelor și conțin 10-95% ingredient activ, preferabil 25-70%.

Proteinele pot fi formulate în vaccin ca forme neutre sau săruri. Sărurile acceptabile farmaceutice includ săruri de adiție a acizilor (formate cu grupurile de aminoacizi liberi ai peptidei) care sunt formate cu acizi anorganici cum ar fi, de exemplu, acizii clorhidric și fosforic, sau acizi organici ca acetic, oxalic, tartric, maleic și alții asemănători.

RO 117329 Bl

Sărurile formate cu grupări carboxil libere pot fi, de asemenea, derivate din baze anorganice cum ar fi, de exemplu, hidroxizi de sodiu, potasiu, amoniu, calciu sau fier și baze organice ca izopropilamina, trimetilamina, 2-etilamina etanol, histidina, procaina și altele asemănătoare.

Dozarea si administrarea vaccinurilor

Vaccinurile sunt administrate într-o manieră comparabilă cu formularea dozării, astfel, încât ca și cantitate va fi eficientă profilactic și/sau terapeutic. Cantitatea de administrat, care, în general, se situează în domeniul 5 g la 250 g de antigen per doză, depinde de subiectul de tratat, capacitatea sistemului imun al subiectului de a sintetiza anticorpi, și gradul de protecție dorit. Cantitățile precise de ingredient activ necesare a fi administrate pot depinde de judecata practicianului și pot fi caracteristice fiecărui subiect.

Vaccinul poate fi administrat într-o singură doză orală, dar, de preferință, într-o doză orală multiplă.

O doză orală multiplă e o doză în care un curs primar al vaccinării poate fi cu 1-10 doze separate, urmată de alte doze date la intervale de timp ulterioare, necesare pentru menținerea și/sau întărirea răspunsului imun, de ex, 1-4 luni pentru o singură doză, și dacă este necesar, într-o doză ulterioară după câteva luni. Regimul dozării va fi, cel puțin în parte, determinat de necesitatea individului și va depinde de judecata practicianului.

în plus, vaccinul care conține antigenii imunogenici HCV poate fi administrat în corelație cu alți agenți imunoreglatori, de exemplu, imunoglobulinele.

Prepararea anticorpilor împotriva epitopilor HCV

Polipeptidele imunogenice descrise aici sunt utilizate pentru a produce anticorpi, inclusiv policlonali și monoclonali. Dacă anticorpii policlonali sunt doriți, se imunizează un mamifer selectat (adică șoarece, iepure, capră, cal, etc.) cu o polipeptidă imunogenică ce poartă unul sau mai mulți HCV.

Se colectează serul de animal imunizat și se tratează conform procedurilor cunoscute. Dacă serul conține anticorpi policlonali pentru un epitop HCV, conține anticorpi pentru alți antigeni, anticorpii policlonali pot fi purificați prin cromatografie de imunoafinitate. Tehnicile pentru producerea și prelucrarea antiserurilor policlonale sunt cunoscute în meserie, vezi, de exemplu Mayer și Walker (1987). în mod alternativ, anticorpii policlonali pot fi izolați dintr-un mamifer care a fost anterior infectat cu HCV.

Anticorpii monoclonali direcționați împotriva epitopilor HCV pot fi, de asemenea, ușor produși de un specialist în domeniu. Metodologia generală pentru producerea anticorpilor monoclonali prin hibridoame se cunoaște foarte bine. Liniile celulare producătoare de anticorpi viabili pot fi create prin fuziune celulară și, de asemenea, prin alte tehnici cum ar fi, transformarea directă a limfocitelor B cu ADN oncogenic sau transfecția cu virus Epstein-Barr (M. Schreir și colab. (1980); Hammerling și colab. (1981); Kennet și colab. (1980); US 4341761; 4399121; 4427783; 4444887; 4466917; 4472500; 4491632 și 4493990) Clonele de anticorpi monoclonali produși împotriva epitopilor HCV pot fi selecționate prin diferite proprietăți, adică prin izotop, afinitate pentru epitop, etc.

Anticorpii, atât monoclonali, cât și policlonali, care sunt direcționați împotriva epitopilor HCV sunt în particular utilizabili în diagnostic și aceea care sunt neutralizați sunt utili în imunoterapia pasivă. Anticorpii, în particular, pot fi utilizați pentru producerea anticorpilor anti-idiotip.

790

795

800

805

810

815

820

825

830

835

RO 117329 Bl

Anticorpii anti-idiotip sunt imunoglobulinele care poartă o “imagina internă” a antigenului a agentului infecțios împotriva căruia se dorește protecția. Vezi, de exemplu, Nisenoff A. și colab. (1981) și Dreesman și colab. (1985). Tehnicile pentru producerea anticorpilor anti-idiotip se cunosc în domeniu, de exemplu Grzych (1985), MacNamara și colab. (1984) și Vytdehaag și colab. (1985). Acești anticorpi antiidiotip pot fi, de asemenea, folosiți pentru tratament, vaccinare și/sau diagnosticarea hepatitei NANBH, ca și pentru o elucidare a regiunilor imunogenice ale antigenilor HCV.

Imunoanaliză și truse de diagnostic

Atât polipetidele, cât și anticorpii prezentei invenții sunt utilizabili în imunoanalize pentru deteminarea prezenței anticorpilor HCV sau prezenței virusurilor sau polipeptidelor HCV (sau epitopi) de exemplu în probele biologice.

Proiectarea unei imunoanalize este obiectul unui volum mare de încercări și se cunosc în domeniu multe variante. Imunoanaliza va utiliza cel puțin un epitop viral derivat din HCV. într-o variantă, imunoanaliza utilizează o combinație a epitopilor virali derivați din HCV. Acești epitopi pot fi derivați din aceeași sau din polipeptide virale diferite și pot fi în polipetide recombinante separate sau naturale sau împreună în aceleași polipeptide recombinante. O imunoanaliză poate utiliza, de exemplu, un anticorp monoclonal direcționat spre unul sau mai mulți epitopi virali, o combinație de anticorpi monoclonali direcționați spre epitopi ai unui antigen viral, anticorpii monoclonali direcționați spre epitopi ai diferitelor antigene virale, anticorpi policlonali direcționați spre același antigen viral sau anticorpi policlonali direcționați spre diferite antigene virale. Protocolurile pot fi bazate, de exemplu, pe competiția sau reacția directă, sau analiză tip sADNwich. Protocolurile pot, de asemenea, de exemplu, să utilizeze suporturi solide sau pot fi prin imunoprecipitare. Majoritatea analizelor implică utilizarea anticorpului marcat sau polipeptidei; markerii pot fi, de exemplu, enzimatici, fluorescenți, chemiluminiscenți, radioactivi sau molecule colorate. Analizele care amplifică semnalele din probe sunt cunoscute, de asemenea; exemple dintre care sunt analizele care utilizează biotina și avidina și imunoanalizele cu enzimă marcată și mediate, cum ar fi analiza ELISA (descrisă mai jos).

în mod tipic, o imunoanaliză pentru unul sau mai mulți anticorpi anti-HCV va implica selectarea și prepararea probei test susceptibilă de a coține anticorpi, cum ar fi, o probă biologică, apoi incubarea ei cu una sau mai multe polipeptide HCV (care conțin epitop) în condiții care permit formarea complexului antigen-anticorp și apoi detectarea formării acestor complexe. Condițiile de incubare adecvată sunt bine cunoscute în domeniu. Imunoanaliza poate fi, fără limitări, într-un format heterogen sau într-unul omogen și de tip stADNard sau competitiv.

într-un format heterogen, polipeptida se leagă tipic de un suport solid pentru a facilita separarea probei de polipeptidă după incubare. Exemple de suporturi solide care pot fi utilizate sunt nitroceluloza (de exemplu, în formă de membrană sau sondă microtitratoare), latex polistirenic (de exemplu, în granule sau plăci de microtitrare), fluorura de polivinilidină (cunoscută ca Immulon®) hârtie diazotată, membrane de nylon, granule activate și granule de Proteină A. De exemplu, plăcile de microtitrare Dynatech Immulon 1 sau Immulon® 2 sau granulele de polistiren de 0,25 inch (Precision Plastic Ball) pot fi utilizate în format heterogen. Suportul solid ce conține polipeptida antigenică este în mod tipic spălat după separarea lui de proba test și înainte de detectarea anticorpilor legați. Sunt cunoscute în domeniu, atât formatele stADNard, cât și competitiv.

RO 117329 Bl în formatul heterogen, proba test este incubată cu antigenul în soluție. De exemplu, aceasta se poate realiza în condițiile în care vor precipita oricare din complexele antigen-anticorp care sunt formate. Se cunosc în domeniu, atât formatele stADNard, cât și competitiv pentru aceste analize.

într-un format standard, cantitatea de anticorpi HCV care formează complexul antigen-anticorp este monitorizată direct. Aceasta poate fi realizată determinând dacă anticorpii marcați anti-xenogenic (de exemplu, anti-uman) care recunosc un epitop pe anticorpii anti-HCV vor lega datorită formării complexului. într-un format competitiv, cantitatea de anticorpi HCV din probă este dedusă prin monitorizarea efectului competitiv asupra legării unei cantități cunoscute de anticorp marcat (sau alt ligand de competiție) în complex.

Complexele formate care cuprind anticorp anti-HCV (sau în cazul analizei competitive, cantitatea de anticorp de competiție) sunt detectate prin oricare din tehnicile cunoscute în funcție de format. De exemplu, anicorpii marcați HCV în complex pot fi detectați utilizând o conjugare a Ig antixenogenic, complexat, cu un marker (adică, o enzimă marker).

în imunoanalizele în care polipeptidele HCV sunt analizatul, proba test, tipic o probă biologică, este incubată complexelor antigen-anticorp. Se pot utiliza diferite formate. De exemplu, se poate utiliza o “ analiză sandwich” în care anticorpul legat la un suport solid este incubat cu proba test; este spălat este incubat cu un al doilea anticorp marcat la analit și suportul este spălat din nou. Analitul se detectează determinând dacă cel de-al doilea anticorp este legat la suport. într-un format competitiv, care poate fi, atât heterogen, cât și omogen, o probă test este incubată de obicei cu anticorp, și un antigen competitiv marcat, de asemenea, incubat, atât ulterior, cât și simultan. Acestea și alte formate sunt bine cunoscute în domeniu.

Sistemele de detecție eficiente pentru infecția HCV pot include utilizarea unei palete de epitopi, așa cum s-a descris mai sus. Epitopii din această paletă pot fi alcătuiți din una sau mai multe polipeptide. Analizele pentru diferiți epitopi pot fi ulterioare sau simultane.

Analiza cu enzimă legată de imunosorbent (ELISA) poate fi utilizată pentru a măsura atât concentrațiile antigenului cât și ale anticorpului. Acesta metodă depinde de conjugarea unei enzime, atât la un antigen, cât și la un anticorp și utilizarea activității enzimei legate ca marker cantitativ. Pentru măsurarea anticorpului, antigenul cunoscut este fixat pe o fază solidă (de exemplu, o microplacă sau un vas de plastic) incubat cu diluțiile serului test, spălat, incubat cu antiimunoglobulină marcată cu o enzimă și spălat din nou.

Enzimele adecvate pentru marcare sunt cunoscute în domeniu și includ de exemplu, peroxidaza din hrean. Activitatea enzimei legate la faza solidă este măsurată prin adăugare de substrat specific și determinarea colorimetrică a formării produsului sau utilizării substratului. Activitatea enzimei legate este o funcție directă de cantitatea de anticorp legat.

Pentru a măsura antigenul, se fixează un antigen specific cunoscut de faza solidă, se adaugă materialul test ce conține antigenul, după incubare faza solidă este spălată și se adaugă al doilea anticorp marcat cu enzimă. După spălare se adaugă substratul și se estimează colorimetric activitatea enzimei și se raportează la concentrația antigenului. Truse adecvate pentru imunodiagnostic și care să conțină reactivii

885

890

895

900

905

910

915

920

925

RO 117329 Bl marcați adecvați sunt alcătuite prin împachetarea materialelor adecvate, inclusiv polipeptidele prezentei invenții ca conțin epitopi HCV sau anticorpi direcționați împotriva epitopilor HCV în case adecvate, împreună cu reactivii rămași și materilele necesare pentru conducerea analizei, ca și setul de instrucțiuni de analiză.

Metode generale

Tehnicile generale folosite în practica prezentei invenții pot fi găsite, de exemplu, în referințele citate aici, în special, în EP 318216 și 388232, ca și referințele din bibliografie, care sunt încorporate aici.

Se prezintă, în continuare, exemplele de relizare a invenției, în legătură cu figurile explicate mai sus.

Exemplul 1.

Cartarea Epitopului Genomului HCV în fig. 1, așa cum s-a arătat în fig. 3-11, există heterogenitate între izolatele HCV, inducând că aceste substituiri ale aminoacizilor pot fi făcute în octamerii descriși mai jos. în plus, la substituțiile cu aminoacizii din localizarea corespunzătoare în alte izolate HCV, substituțiile cu analogi sintetici ale aminoacizilor particulari sau soluții conservate bazate pe sarcină, etc. (în particular, când substituția nu distruge legarea anticorpului) sunt în preocupările acestei invenții.

Sinteza polipeptidelor suprapuse

S-au preparat tuburi de polietilenă dispuse pe un suport, într-o ordine 8x12 (Coselco Mimetopes, Victoria, Australia) prin plasarea tuburilor într-o baie (20% V/V piperidină în dimetilformamidă(DMF) pentru 30 min, la temperatura camerei. Tuburile au fost apoi îndepărtate, spălate în DMF, timp de 5 min, apoi spălate în metanol de 4 ori (2 min/spălare). Tuburile au fost lăsate să se usuce la aer cel puțin 10 min, apoi spălate un timp final în DMF (5 min). S-a dizolvat 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 367 mg) în DMF (80 ml) pentru utilizare în cuplarea aminoacizilor protejați Fmoc; Fmoc-L-Ala□Pfp, Fmoc-L-Cys (Trt)-OPfp, Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OPfp, Fmoc-L-Glu(O-tBu)-OPfp, Fmoc-LPhe-DPfp, Fmoc-Gly-OPfp, Fmoc-L-His(Boc)-OPfp, Fmoc-L-lle-OPfp, Fmoc-L-Lys(Boc)OPfp, Fmoc-L-Leu-OPfp, Fmoc-L-Met-OPfp, Fmoc-L-AsnOPfp, Fmoc-L-Pro-OPfp, Fmoc-LGln-DPfp, Fmoc-LArg(Mtr)-OPfp, Fmoc-L-Ser(t-Bu)-ODhbt, Fmoc-L-Thr(t-Bu)-ODhbt, Fmoc-L-Val-OPfp și Fmoc-L-Tyr-Opfp.

Aminoacizii protejați au fost plasați în sonda de plasare cu plăci de microtitrare cu BtDH și suportul cu tuburi plasat peste placă, imersând tuburile în sonde. Ansamblul a fost apoi închis într-o pungă de plastic și lăsat să reacționeze, la 25°C, timp de 18 h pentru a cupla aminoacizii inițiali la tuburi. Suportul a fost apoi îndepărtat și tuburile spălate cu DMF (2 min), MeQH (4x2 min) și din nou cu DMF (2 min) pentru a curăța și deproteja aminoacizii legați. Procedeul a fost repetat pentru fiecare aminoacid cuplat, până când s-au preparat toți octamerii.

Capetele N-terminale libere au fost apoi acetilate pentru a compensa amida liberă, astfel că cea mai mare parte din epitopi nu s-a găsit la capătul N-terminal și astfel nu vor avea sarcina pozitivă asociată. Acetilarea a fost însoțită de umplerea sondelor unei plăci de microtitrare cu DMF/ anhidridă acetică/trietilamină (5:2:1 V/V/V) și lăsate tuburile să reacționeze în sonde, timp de 90 min, la 2Q°C. Tuburile au fost spălate cu DMF (2 min) și MeOH (4x2 min) și uscate la aer cel puțin 10 min.

Grupările protectoare din lanțul lateral s-au îndepărtat prin tratarea tuburilor cu acid trifluoracetic/fenol/ditioetan (95:2,5:2,5, v/v/v) în pungi de polietilenă, timp

I

RO 117329 Bl

980 de 4 h, la temperatura camerei. Tuburile au fost apoi spălate în diclormetan (2x2 min], 5% diizopropiletilamină/diclormetan (2x5 min] diclormetan (5 min) și uscare în aer, timp de cel puțin 10 min. Tuburile au fost apoi spălate în apă (2 min), MeQH (18 h), uscate în vid și depozitate în pungi sigilate de plastic pe silicagel.

Analiza peptidelor

Tuburile care conțin octamerul preparat ca mai sus au fost inițial tratate prin sonicare, timp de 30 min. într-un tampon de desfacere (1% dodecil sulfat de sodiu 0,1% 2-mercaptoetanol, 0,1 M NaH₂P0₄) la 60°C. Tuburile au fost imersate de câteva ori în apă (60°C), urmată de fierberea MeOH (2 min) și uscarea la aer. Tuburile au fost apoi preacoperite, timp de 1 h, la 20°Cîn sonde de microtitrare ce conțin 200 ml tampon de blocare (1% ovalbumină, 1% BSA, 0,1% Tween^R și 0,04 % NaNgîn PBS), cu agitare. Tuburile au fost apoi imersate în sonde de microtitrare ce conțin 175 pl antiser obținut de la pacienții umani diagnosticați ca având HCV și lăsate să incubeze, la 4°C peste noapte. Tuburile au fost analizate împotriva serului de la trei pacienți individuali. Specimenul 17 PAA 3662-S (R“) a manifestat recție puternică la punctele Western HCV, HCV competitiv ELISA la clona C 100-3 (la diluție 1:1000) și răspunsurile RIBA de 44 + la C 100, 5-1-1 și C 33c (C22 nu a fost făcut] (numele antigen/clonă sunt, în EP 318216 și 388232, ca și acelea descrise în literatura privind imunoanaliza HCV accesibilă din sistemele de Diagnostic Orto, Inc). Plasma curată a fost diluată 1:500 în tampon de blocare. Specia PAA 33028 (B”) a manifestat reacția puternică la punctele Western HCV, HCV competitiv ELISA, HCV ELISA la clona C 100-3 (la diluție 1:500] și răspunsurile RIBA de 4 la C 100, 5-1-1, C33 și C 22. Antiserurile policlonale au fost parțial purificate prin trecerea printr-o coloană cu proteina A și a fost utilzată la o diluțe 1:200 în tampon de blocare. Specia PAA 32931 (“C”) a manifestat reacție moderată la punctele Western HCV (3+), HCV competitiv ELISA, HCV ELISA la clona C 100-3 (la diluție 1:64) și răspunsurile RIBA la 3 și 4 la C 100 și 5-1-1, respectiv, (C33c și C22 nu s-a făcut). Antiserul policlonal a fost parțial purificat prin trecerea pe coloană cu proteină A și s-a utilizat la o diluție 1:500 în tampon de blocare.

Tuburile au fost spălate în PBS/Tween^R 20(4 x 10 min), la temperatura camerei, apoi incubate în sonde de microtitrare ce conțin peroxidază din sânge de cel marcat cu antiser Ig antiuman de capră (175 ml, diluție 1:2000 în tampon de blocare fără NaN3), timp de 1 h, la 25°C, cu agitare. Antiserul antiuman este specific pentru lanțurile grele și ușoare de Ig umană și reacționează, atât cu clasele IgG, cât și IgM. Tuburile au fost din nou spălate în PBS/Tween^R 20(4 x 10 min), la temperatura camerei. Soluția de substrat a fost preparată prin diluarea NaH2P0₄ (1M, 200ml) și acid citric (1M, 160 ml) la 2 I cu apă distilată, ajustând pH-ul la 4,0. S-au adăugat azino-di-3-etilbenztiazodinsulfonat (ABTS, 50 mg) și peroxid de hidrogen (0,3 μΙ/ml) la 100 ml de tampon imediat înainte de a se utiliza la realizarea soluției de substrat. Soluția de substrat (150 pl)s-a adăugat la fiecare din sonda unei plăci de microtitrare, și tuburile s-au imersatîn sonde și incubate, la 25°C, la întuneric. După developarea culorii, reacțiile s-au oprit prin îndepărtarea tuburilor și s-a citit absorbanța soluțiilor,la 405 nm.

□ctamerii listați mai jos au fost imunoreactivi cu antiserul anti-HCV. Peptidele care au reacționat cu toate cele trei antiserurile sunt listate ca epitopi, în timp ce peptidele care au reacționat numai cu unul sau două antiseruri sunt considerate ca

985

990

995

1000

1005

1010

1015

1020

RO 117329 Bl epitopi slabi (indicate prin Epitopii puternici sunt marcați în special cu litere mai degrabă decât cu numere (de exemplu, EpAA).

Secvența AA Secvența AA

1025

23	KEPGGGQA	87	GNEGCGWA
	24	EPGGGQAV Ep2
	25	PGGGQAVG	88	NEGCGWAG
	26	GGGQAVGG	⁸⁹	EGCGWAGW
1030	27	GGQAVGGV	90	GCGWAGWL
	28	GQAVGGVY	91	CGWAGWLL
	29	□AVGGVYL ~	92	GWAGWLLS
	30	AVGGVYLL	93	WAGWLLSP
	31	VGGVYLLP	94	AGWLLSPR
1035	32	GGVYLLPR	95	GWLLSPRG
	33	GVYLLPRR	96	WLLSPRGS
	34	VYLLPRRG	97	LLSPRGSR
	35	YLLPRRGP	98	LSPRGSRP
	36	LLPRRGPR	99	SPRGSRPS
1040	66	PKARRPEG Ep1	100	PRGSRPSW Ep3
	67	KARRPEGR	101	RGSRPSWG
	68	ARRPEGRT	102	GSRPSWGP
	69	RRPEGRTW	103	SRPSWGPT
	70	RPEGRTWA
1045	71	PEGRTWAQ	186	TVPASAYQ Ep4
	72	EGRTWAQP	187	VPASAYQV
	73	GRTWAQPG EpA	188	PASAYQVR
	74	RTWAQPGY	189	ASAYQVRN
	75	TWAQPGYP	190	SAYQVRNS
1050	76	WAQPGYPW	191	AYQVRNST
	77	AOPGYPWP
	78	QPGYPWPL	206	DCPNSSIV ~
	79	PGYPWPLG
	80	GYPWPLYG	223	TPGCVPCV ~
1055	81	YPWPLYGN
	82	PWPLYGNE	232	EGNASRCW Ep5
	83	WPLYGNEG
	84	PLYGNEGC	256	TQLRRHID ~
	85	LYGNEGCG
1060	86	YGNEGCGW	286	LVGQLFTF ~
			297	RHWTTQGC Ep6
			298	HWTTQGCN
			299	WTTQGCNC
			321	MMMNWSPI ~
1065			347	DmlAGAHW Ep7
			357	LAGIAYFS Ep8
	413	LINTNGSW EpB	594	YSRCGSGP F_a

I

RO 117329 Bl

414	INTNGSWH		595	SRCGSGPW
			596	RCGSGPWL
432	SLNTGWLA ~		597	CGSGPWLT	1070
			598	GSGPWLTP
465	FDQGWGPI EpC		599	SGPWLTPR
466	DQGWGPIS		600	GPWLTPRC
467	QGWGPISY		601	PWLTPRCL
468	GWGPISYA		602	WLTPRCLV	1075
469	WGPISYAN		603	LTPRCLVD EpF
470	GPISYANG		604	TPRCLVDY
471	PISYANGS		605	PRCLVDYP
			606	RCLVDYPY
480	PDQRPYCW EpD		607	CLVDYPYR	1080
481	DQRPYCWH		608	LVDYPYRL
482	QRPYCWHY		609	VDYPYRLW
483	RPYCWHYP		610	DYPYRLWH
484	PYCWHYPP		611	YPYRLWHY F_b
			612	PYRLWHYP	1085
500	KSVCGPVY Ep9		613	YRLWHYPC
501	SVCGPVYC
502	VCGPVYCE	EP12	641	EAACNWTR
521	RSGAPRYS Ep10		662	LSPLLLII Ep13	1090
540	NNTRPPLG EpE		663	SPLLLIII
541	NTRPPLGN		664	PLLLIIIQ
542	TRPPLGNW		665	LLLIIIQW
543	RPPLGNWF				1095
544	PPLGNWFG		685	LSTGIHL ~
545	PLGNWFGC
546	LGNWFGCT		705	VGSSIASW -
547	GNWFGCTW		706	GSSIASWA
548	NWFGCTWM				1100
549	WFGCTWMN		729	ARVCSCIW Ep14
579	LHCPTDCF ~	EpG	782	WVPGAVYT
			783	VPGAVYTF
			784	PGAVYTFY	1105
			785	GAVYTFYG
			786	AVYTFYGM
			787	VYTFYGMW
			788	YTFYGMWP
			789	TFYGMWPL	1110
			801	LALPQRAY ~
851	RVEAQLHV EpH		1384	VIKGGRHL Ep20
852	VEAQLHVW

RO 117329 Bl

	853	EAQLHVWI	1410	LGINAVAY Ep21
1115	854	AQLHVWIP		1411	GINAVAYY
	855	QLHVWIPP		1454	CNTCVIOT ~
	893	LAVFGPLW ~		1492	GRGKPGIY Ep22
1120	916	QGLLRFCA ~		1493	RGKPGIYR
	928	MIGGHYVQ Ep15		1532	PAETTVRL Ep23
				1533	AETTVRLR
	946	TGTYVYNH Epl		1534	ETTVRLRA
				1535	TTVRLRAY
1125	952	NHLTPLRD EpJ
	953	HLTPLRDW		1560	GVFIGLIH Ep24
	954	LTPLRDWA		1561	VFIGLIHI
	1026	LAPITAYA ~	Ep25	1581	ENLPYLVA
1130	1072	TCINGVCW EpK		1567	NLPYLVAY
				1568	LPYLVAYQ
	1109	LVGWPAPQ Ep16		1569	PYLVAYQA
				1570	YLVAYQAT
	1171	CPAGHAVG Ep17		1571	LVAYQATV
1135	1113	PAGHAVGI		1572	VAYQATVC
	1114	AGHAVGIF		1573	AYQATVCA
	1115	GHAVGIFR		1574	YQATVCAR
	1116	HAVGIFRA		1575	QATVCARQ
	1117	AVGIFRAA		1576	ATVCARQA
1140	1218	WPQSEQV EpL		1577	TVCARQAP
				1601	PPSWDQMW
	1240	VPAAYAAQ ~	Ep26	1602	PSWDQMWK
1145	1260	ATLGFGAY ~		1603	SWDOMWKC
				1604	WDQMWKCL
	1280	GVRITTGS Ep18		1605	DQMWKCLI
	1281	VRITTGSP		1606	QMWKCLIR
	1282	RITTGSPI		1607	MWKCLIRL
1150	1283	ITTGSPIT
	1284	TTGSPITY		1615	KPTLHGPI Ep27
	1285	TGSPITYG		1616	PTLHGPIP
				1617	TLHGPIPL
	1322	DATSILGI ~		1618	LHGPIPLL
1155				1619	HGPIPLLY
	1338	TAGARLW ~		1620	GPIPLLYR
	1371	GEIPFYGK Ep19		1655	WTSTWVL ~
	1694	IIPDREVL EpM		1966	SECTIPCS EpS

RO 117329 Bl

1695	IPDREVLY	1967 1968	ECTIPCSG CTIPCSGS	1160
1710	ECSQHLPY EpN	1969	TIPCSGSW
1711	CSQHLPYI
1712	SQHLPYIE	1999	LMPQLPGI EpT
		2000	MPQLPGIP	1165
1728	EKQKALGL EpO	2001	PQLPGIPE
1729	KQKALGLL	2002	QLPGIPEV
		2003	LPGIPEVS
1758	EIEWAKLM EpP	2004	PGIPEVSC
1759	IEWAKLMW	2005	GIPEVSCQ	1170
1760	EWAKLMWN	2006	IPEVSCQR
1761	WAKLMWNE	2007	PEVSCQRG
1762	AKLMWNEI	2008	EVSCQRGY
		2009	VSCQRGYK
1781	LPGNPAIA ~	2010	SCQRGYKG	1175
		2011	CQRGYKGV
1808	LFNILGGW Ep28	2012	QRGYKGVW
		2013	RGYKGVWR
1821	AAPGAATA ~	2014	GYKGVWRG
				1180
1851	ILAGYGAG Ep29	2024	IMHTRCHC
		Ep31
1880	VNLLPAIL ~
		2048	VGPRICRN EpU
1908	PGEGAVQW EpG	2049	GPRICRNY	1185
1909	GEGAVQWM	2050	PRICRNYW
1910	EGAVQWMN	2051	RICRNYWS
1911	GAVQWMNR	2052	ICRNYWSG
1912	AVQWMNRL	2053	CRNYWSGT
1913	VQWMNRLI	2054	RNYWSGTE	1190
		2055	NYWSGTEP
1925	RGNHVSPI EpR	2056	YWSGTEPI
		2057	WSGTEPIN
1940	AAARVTAI Ep30
1941	AARVTAIL	2071	TPLPAPNY Ep32	1195
1942	ARVTAILS
1943	RVTAILSS	2088	EEYVIRQV EpV
1944	VTAILSSL	2089	EYVIRQVG
1945	TAILSSLV	2090	YVIRQVGD
1946	AILSSLVT	2091	VIRQVGDF	1200
1947	ILSSLVTQ	2092	IRQVGDFH
1948	LSSLVTQL	2093	RQVGDFHY
1949	SSLVTQLL
1950	SLVTQLLR	2108	DNLKCPCQ~
1951	LVTQLLRR			1205

RO 117329 Bl

2122	EIELDGVR EpW	2280	REAQALPV EpZ
	2123	IELDGVRL	2281	EAQALPVW
	2124	ELDGVRLH	2282	AQALPVWA
	2125	LDGVRLHR	2283	QALPVWAR
1210	2126	□GVRLHRF	2284	ALPVWARP
	2127	GVRLHRFA	2285	LPVWARPD
	2128	VRLHRFAP	2286	PVWARPDY
	2129	RLHRFAPP	2287	VWARPDYN
	2130	LHRFAPPC	2288	WARPDYNP
1215	2131	HRFAPPCK	2289	ARPDYNPP
	2132	RFAPPCKP	2290	RPDYNPPL
	2133	FAPPCKPL
	2134	APPCKPLL	2325	PPPRKKRT Ep35
	2135	PPCKPLLR	2326	PPRKKRTV
1220	2136	PCKPLLRE	2327	PRKKRTW
	2137	CKPLLREE
	2138	KPLLREEV	2345	AELASRSE Ep36
	2139	PLLREEVS	2346	ELASRSEG
	2140	LLREEVSF EpX	2347	LASRSEGS
1225	2141	LREEVSFR	2348	ASRSEGSS
	2142	REEVSFRV	2349	SRSEGSSS
	2143	EEVSFRVG
	2144	EVSFRVGL	2382	AESYSSMP Ep37
	2145	VSFRVGLH
1230	2146	SFRVGLHE	2401	SDGSWSTV
	2147	FRVGLHEY Ep38
	2148	RVGLHEYP
			2417	WCCSMSY
	2165	EPEPDVAV ~ EpAA
1235			2418	VCCSMSYW
	2187	GRRLARGS ~	2419	CCSMSYWI
			2420	CSMSYWIG
	2226	LIEANLLW EpY	2421	SMSYWIGA
	2227	IEANLLWR	2422	MSYWIGAL
1240	2228	EANLLWRQ
	2229	ANLLWRQE
	2230	NLLWRQEM
	2231	LLWRQEMG
	2232	LWRQEMGG
1245
	2244	VESENKW Ep33
	2245	ESENKWI
	2246	SENKWIL
	2247	ENKWILD
1250	2248	NKWILDS
	2249	KWILDSF
	2250	WILDSFD

RO 117329 Bl

EISVPAEI Ep34
QKLPINAL EpBB	2602	LPLAVMGS
KLPINALS EpDD			1255
LPINALSN	2603	PLAVMGSS
PINALSNS	2604	LAVMGSSY
INALSNSL	2605	AVMGSSYG
NALSNSLL	2606	VMGSSYGE
AISNSLLR	2607	MGSSYGEQ	1260
LSNSLLRH	2608	GSSYGEQR
SNSLLRHH	2609	SSYGEQRV
NSLLRHHN	2610	SYGEQRVE
SLLRHHNL	2611	YGEQRVEE
LLRHHNLV	2612	GEQRVEEL	1265
LRHHNLVY
RHHNLVYS	2632	KTPMGFSY
HHNLVYST Ep41
HNLVYSTI	2633	TPMGFSYD
NLVYSTIS	2634	PMGFSYDT	1270
LVYSTISR	2635	MGFSYDTR
	2636	GFSYDTRC
QKKVTFDR Ep39	2637	FSYDTRCE
KKVTFDRL	2638	SYDTRCED
KVTFDRLQ			1275
VTFDRLQV	2660	YQCCDLDP ~
TFDRLQVL
FDRLQVLD	2676	LTERLYVG
DRLQVLDS EpEE
RLQVLDSH	2677	TERLYVGG	1280
	2678	ERLYVGGP
ASKVKANL ~	2679	RLYVGGPL
RKAVHIN EpCC	2688	NSRGENCG
KAVTMINS EpFF			1285
	2689	SRGENCGY
GRKPARLI Ep40	2690	RGENCGYR
RKPARLIV	2691	GENCGYRR
KPARLIVF	2692	ENCGYRRC
PARLIVFP	2693	NCGYRRCR	1290
ARLIVFPD
RLIVFPDL	2707	TSCGNTLI Ep42
	2721	AACRAAGL ~
			1295
	2757	AFTEAMTR
Ep43
	2758	FTEAMTRY

RO 117329 Bl

	2759	TEAMTRYS
1300			2760	EAMTRYSA
			2761	AMTRYSAP
			2762	MTRYSAPP
	2779	DLELIISC Ep44	2878	DLPPIIQR Ep47
	2780	LELIISCS	2879	LPPIIQRL
1305			2880	PPIIQRLH
	2794	HDGAGKRV	2881	PIIQRLHG
	Ep45		2882	IIQRLHGL
	2795	DGAGKRVY	2883	IQRLHGLS
	2796	GAGKRVYY	2884	QRLHGLSA
1310	2797	AGKRVYYL	2885	RLHGLSAF
	2798	GKRVYYLT	2886	LHGLSAFS
	2799	KRVYYLTR	2887	HGLSAFSL
	2800	RVYYLTRD	2888	GLSAFSLH
	2801	VYYLTRDP	2889	LSAFSLHS
1315	2802	YYLTRDPT	2890	SAFSLHSY
			2891	AFSLHSYS
	2817	WETARHTP	2892	FSLHSYSP
	EpGG		2893	SLHSYSPG
	2818	ETARHTPV	2894	LHSYSPGE
1320	2819	TARHTPVN	2895	HSYSPGEI
	2820	ARHTPVNS
	2821	RHTPVNSW
	2822	HTPVNSWL
	2823	TPVNSWLG
1325	2824	PVNSWLGN
	2825	VNSWLGNI
	2826	NSWLGNII
	2827	SWLGNIIM
	2828	WLGNIIME
1330	2829	LGNIIMEA
	2830	GNIIMEAP
	2831	NIIMEAPT
	2832	IIMEAPTL
	2833	IMEAPTLW
1335	2834	MEAPTLWA
	2835	EAPTLWAR
	2836	APTLWARM
	2837	PTLWARMI
	2838	TLWARMIL
1340	2839	LWARMILM
	2840	WARMILMT
	2841	ARMILMTH
	2842	RMILMTHF
	2843	MILMTHFE

L

RO 117329 Bl

EpHH

2863	LDCEIYGA Ep46	1345
2864	DCEIYGAC
2865	CEIYGACY
2866	EIYGACYS
2867	IYGACYSI
2912	LGVPPLRA Ep48	1350
2913	GVPPLRAW
2914	VPPLRAWR
2938	AAICGKYL Ep49
2939	AICGKYLE	1355
2940	ICGKYLEN
2966	DLSGWETA
		1360
2984	VSHARPRW Epll

Analiza diferențială

Următoarea analiză s-a realizat pentru a distinge antigenele timpurii de antigenele ulterioare. Anticorpii corespunzători antigenelor târzii pot fi detectați și utilizați 1365 la diagnosticarea mai rapidă a infecției HCV.

S-a recoltat sânge uman în serie de la pacienții umani care prezentau un ALT evaluant, dar negativ pentru anti-C1OO-3. Cele 5 sângerări obținute înainte de seroconversia completă (C1OO-3 pozitiv] au fost unite și utilizate în anliză la o diluție de 1:2OOO. Analiza s-a realizat așa cum scrie în Secțiunea IV A, de mai sus. 1370

Totuși, un set duplicat de tuburi a fost incubat cu antiser specific cu peroxidază din hrean marcat cu Ig G anti-umană, de capră, în timp ce alt set a fost incubat cu antiser specific peroxidază din hrean - marcată cu Ig M anti-umană de capră. Epitopii imunoreactivi cu anticorpii Ig M sunt epitopii timpurii.

Rezultatele au indicat că cea mai mare parte a epitopilor timpurii s-au găsit în 1375 regiunea cuprinsă între aproximativ aminoacidul 480 până la, aproximativ, aminoacidul 650. în particular, epitopii tari la Ig N sunt octamerii ce încep cu aminoacizii numărul 506, 510, 523, 562, 580 și regiunea dintre 590 la 620. Analizele care folosesc antigenii care poartă epitopii din acestă regiune vor permite diagnosticarea infecției HCV la începutul evoluției față de analizele care folosesc alți antigeni. 1380 în plus, s-au testat serii de plasmă luate de la cinci pacienți cu hepatită NANB post-transfuzională survenită în urma unei operații pe cord deschis, studii care au urmat 3-12 ani. Perioadele inițiale de sânge care au fost mai mici decât o săptămână separat. Fiecare a fost testat pentru IgG și IgM prin EIA, împotriva unui antigen miez (C 22), doi antigeni de învelire (E1 și E2) și trei regiuni antigenice nestructurale [C 33c 1385

C1000șiNS%).

S-a constatat că răspunsurile Ig M la C 22 și C 33c au depășit răspunsul IgG pentru acei antigeni. MS%,de asemenea, a inclus un răspuns IgM, dar acest răspuns nu a depășit răspunsul Ig G pentru acel antigen. Astfel cineva poate prepara analize de determinare a stadiilor foarte timpurii ale infecției prin utilizarea epitopilor derivați 1390

RO 117329 Bl din regiunile C 22 și C 33c și analizarea pentru legarea IgM. Anticorpii corespunzători regiunii C 33c persistă cea mai lungă perioadă de timp, sugerând că analizele de diagnostic direcționate spre C 33c trebiue să fie cele mai de încredere.

Exemplul 2.

Variațile secvenței în izolatele HCV de la diferiți indivizi

Izolatele de HCV care conțin secvențe care derivă din CDC/HCV 1 au fost identificate în indivizi umani, câțiva dintre aceștia au fost serologic pozitivi pentru anticorpii anti-C 1OO-3 (EC 10 a fost anticorp negativ). Identificarea acestor noi izolate a fost însoțită de donare și segmentele de secvențializare ale genomului HCV care au fost amplificate prin tehnica PCR folosind secvențe CDC/HC1. Metoda utilizează primeri și probe bazate pe secvențele cADN a fiecărui genom HCV, sau intermediarul ei replicativ, utilizând reverstranscriptaza. După sinteza cADN al HCV și amplificarea anterioară, ARN din probă este degradat prin tehnicile cunoscute în domeniu. Un segment desemnat de cADN al HCV este apoi amplificat prin utilizarea primerilor adecvați. Segmentele amplificate sunt etalonate, și clonele conținând secvențele amplificate sunt detectate printr-o probă care este complementa unei secvențe așezate între primeri, dar care nu intensifică primerii.

Izolatele HCV izolate în Statele Unite de la oameni

Probele de sânge care au fost folosite ca sursă de virioni HCV au fost obținute de la American Red Cross din Charlotte, Carolina de Nord, și din Community Blood Center of Kansas, Kansas City, Missouri. Probele au fost selecționate pentru anticorpi ai antigenului HCV C 1DOO - 3, utilizând o analiză ELISA și se supune suplimentar analizei punctul Western folosind un HRP policlonal, anti-uman, de capră pentru a măsura anticorpii anti-HCV. Două probe 23 și 27 de la American Red Cross și, respectiv, de la Comunity Blood Center din Kansas, au fost determinate ca fiind HCV pozitive prin aceste analize.

Particulele virale prezente în serul acestor probe au fost izolate prin ultracentrifugare în condițiile descrise de Bradley și colab. (1985). ARN-ul a fost extras din particule prin digestie cu proteinază K și SDS la concentrații finale de 10 g/ml proteinază K și 0,1% SDS; digestia a fost, timp de 1 h, la 37°C. ARN-ul viral a fost mai departe purificat prin extracție cu cloroform-fenol.

ARN-ul din HCV în prelucrarea ARN a fost reverstranscris în cADN. După ce ambele seruri cADN au fost sintetizate, cADN-ul rezultat a fost apoi amplificat prin metoda PCR. cADN-ul din HCV-ul a trei clone derivate din fiecare izolat HCV, a fost supus analizei secvențiale.

Analiza s-a realizat în esență prin metoda descrisă de Chen și Seeburg (1985).

Secvențele consens ale clonelor derivate din HCV în proba 23 și 27 sunt arătate în fig. 3 (și, respectiv, fig. 4.).

Secvențele variabile sunt, de asemenea, arătate în aceste figuri, așa cum sunt aminoacizii codificați în secvențele consens.

Fig. 5 și 6 arată comparațiile secvențelor de nucleotide ale șirului aliniat pozitiv (fig. 5) și secvențele presupuse de aminoacizi (fig. 6 ale probelor 2.27. și HCV 1. Secvențe de aminoacizi a HCV 1 ,din fig. 6, reprezintă aminoacizii cu 129-467 ai polipeptidei HCV codificate printr-un ORF mare din genomul ARN al HCV.

Examinarea comparativă a fig. 5 și 6 arată că există variații în secvențele celor trei clone izolate. Variațiile secvenței la nivel de nucleotidă și la nivel de aminoacid sunt

RO 117329 Bl rezumate în tabelul imediat de mai jos. în tabel polipeptidele desemnate S și MS 1 reprezintă aminoacizii cu numerele 130 la 380 și, respectiv, 380 la 470, ca cele din domeniile cunoscute anterior. Enumerarea este de la înlocuitorul presupus al metioninei. Terminologia S și MS, se bazează pe poziționarea segmentelor ce codifică 1440 polipeptidele utilizând ca model Flavivirusul. Așa cum s-a discutat mai sus, totuși, evidența recentă sugerează că nu este o corelație totală între HCV și Flavivirusuri în legătură cu domeniile de polipeptide, în particular domeniile presupuse l/MS. într-adevăr, polipeptidele HCV și domeniile de codificare pot manifesta deviație substanțială de la modelul Flavivirusurilor. 1445

	□moloaie Secvențe	1450
Nucleotidă generală %	Codificare	Aminoacid	Codificare NS 1 %
S %	NS 1 %	general %	S %
HCV 1/HCV 23	93	95	91	92	95	87
HCV 1/HCV 27	89	93	84	89	95	82
HCV 23/HCV 27	89	93	85	90	93	84

1455

Deși, există variații în noile segmente HCV izolate, secvențele donate din probele 23 și 27 (numite HCV 23 și HCV 27), conțin fiecare 1018 nucleotide, indicând o lipsă de deleție și mutanți suplimentari în această regiune din clonele selectate.

Secvențele din fig 5 și 6 arată, de asemenea, că secvențele de izolat nu sunt nearanjate în această regiune. 1460 comparație a secvențelor consens pentru HCV și pentru alte izolate ale HCV este rezumată în tabelul de mai sus. Variațiile secvențelor din izolatul de cimpanzeu HCV și izolatul uman HCV sunt aproximativ aceleași, așa cum se vede între HCV de origine umană.

Este de interes că variațiile secvențelor în două din domeniile presupuse nu 1465 este uniformă. Secvența din regiunea presupusă S pare a fi relativ constantă și împrăștiată la întâmplare prin regiune, spre deosebire de aceasta, regiunea presupusă MS 1 are un grad de variabilitate mai mare decât întreaga secvență și variația pare a fi într-un buzunar hipervariabil de aproximativ 70 aminoacizi în aval de capătul Nterminal presupus al polipeptidei presupuse. 1470

Deși, se poate argumenta că variațiile detectate sunt induse în timpul procesului de amplificare este surprinzător că toate variațiile sunt din acest rezultat. S-a estimat că polimeraza Teg introduce erori într-o secvență la aproximativ o fază de 10 kilobaze, de model ADN per ciclu (Saiki și colab., 1988). Bazat pe această estimare, pot fi incluse până la 7 erori în timpul amplificării PCR a fragmentului ADN de 1019 pb. 1475

Totuși, trei subclone de HCV - 23 și HCV - 27 au produs 29 și,respectiv, 14 variații de baze. Următoarea sugerează că aceste variații sunt apariții naturale. Aproximativ 60% din sarcinile bazei sunt mutații tăcute care nu schimbă secvența aminoacizilor.

Variațiile introduse prin polimeraza Taq în timpul amplificării PCR se așteaptă 1480 la întâmplare, totuși, rezultatele arată că secvențele care variază, sunt adunate în cel puțin o regiune specifică.

RO 117329 Bl

Izolate HCV de la oameni în Italia și Statele Unite

Segmentele ARN ale HCV prezente în diferite izolate au fost amplificate prin metoda HCV/cPCR.

Aceste segmente traversează o regiune de 0,6 Kb la 1,6 Kbîn aval de codonul de start al poliproteinei presupuse HCV.

Izolatele sunt specii biologice obținute de la indivizi infectați cu HCV. Mai specific, izolatul HCV 18 este din plasma umană, de la un individ din S.U.A., EC 1 și EC 10 provin de la biopsia ficatului unui pacient italian și Th este o fracție mononucleotidică a sângelui periferic al unui pacient american. Segmentele comparabile ale ARN aHCV au fost izolate din cimpanzeu.

ARN-ul a fost extras din specii de plasă umană utilizând extracție cu fenol:CHCI₃; alcool izoamilic 0,1 ml sau 0,01 ml de plasmă au fost diluați la un volum final de 1,0 ml, cu o soluție TEMB/proteinazăK/SDS (0,05 M Tris - HCI, pH = 8,0; 0,001 M EDTA, 0,1M NaCI, 1 mg/ml proteinază K și 0,5% SDS) conținând 10-40 g/ml acid poliadenilic și incubate la 37°C, timp de 60 min. După acestă digestie cu proteinază K, fracțiunile de plasmă rezultate au fost deproteinizate prin extracție cu TE (50 mM Tris-HCI, pH=8,0 1m M EDTA) saturate cu fenol, pH=6,5. Faza fenolică a fost separată prin centrifugare și a fost reextrasă cu TENB conținând 0,1% SDS. Fazele apoase rezultate din fiecare extracție au fost reunite și extrase de două ori cu un volum egal de fenol/cloroform/alcool izoamilic (1:1 (99:1)) și apoi cu un volum egal dintr-un amestec de 99:1 cloroform/alcool izoamilic. Faza următoare de separare prin centrifugare, faza apoasă, a fost adusă la o concentrație finală de 0,2M acetat și acizii nucleici au fost precipitați prin adăugarea a două volume de etanol. Acizii nucleici precipitați au fost recuperați prin ultracentrifugare într-un rotor SW 41 la 38 K, timp de 60 min, la 4°C sau într-o microcentrifugă, timp de 10 min, la 10K, 4°C.

ARN-ul extras din biopsia ficatului a fost furnizat de Dr. F. Bonina, Ospadale Maggiore di S. Giovanni Battista, Torino, Italia. Fracțiunea mononucleotidică a fost obținută prin sedimentarea alicoților de sânge de la indivizi prin Ficoll-Paque (Pharmacia Corp), utilizând indicațiile fabricantului. ARN-ul total a fost extras din fracție utilizând procedeul cu tiocianat de guanidină descris de Chae și colab. (1989).

Sinteza cADN-ului HCV din probe a fost realizată folosind reverstrancriptaza. După precipitarea cu etanol, ARN-ul precipitat sau fracția de acid nucleic s-a uscat și resuspendat în DEPC tratată cu apă distilată. Structurile secundare din acizii nucleici au fost rupte, prin încălzire, la 65°C, timp de 10 min, iar probele au fost imediat răcite pe gheață. cADN-ul s-a sintetizat folosind 1-3 g ARN total din ficat din extractele de acizi nucleici (sau ARN) din 10 la 1001 plasmă. Sinteza a utilizat reverstranscriptază și a fost în 25 I reacție, folosind protocolul specificat de producător, BRL. Toate amestecurile de reacție pentru sinteza cADN-ului au conținut 23 unități de inhibitor al ARN-azei, Rnazin⁹ (Ficher/Promega). După sinteza cADN-ului, amestecurile de reacție au fost diluate cu apă, fierte și răcite rapid pe gheață.

Fiecare set de probe ă fost supus la două runde de amplificare PCR. Primerii pentru reacții au fost selectați pentru amplificarea regiunilor desemnate “EnvL” și EnvR”. Regiunea “EnvL” cuprinde nucleotidele 669-1243 și aminoacizii presupuși de la 117 la 308; regiunea “EnvR” cuprinde nucleotidele 1215-1625 și codifică aminoacizii presupuși 300-408 (aminoacizii presupuși sunt numărați pornind de la codonul presupus de inițiere a metioninei).

t

RO 117329 Bl

1530

Reacțiile PCR s-au realizat în esență în conformitate cu indicațiile producătorului (Cetus-Perkin-Elmer), cu excepția adăugării de 1g de ARNază. Reacțiile s-au efectuat într-un volum final de 100 pl. PCR s-a realizat pentru 30 cicluri, utilizând un regim de 94°C (1 min), 37°C (2 min) și 72°C [3 min) cu o extensie, de 7 min pentru ultimul ciclu. Probele au fost apoi extrase cu fenol:CHCH₃, precipitate de două ori cu etanol, resuspendate în 10 mM Tris HCI, pH=8,0 și concentrate utilizând filtrare cu Centricon - 30 (Amicon). Acest procedeu îndepărtează eficient oligonucleotidele, mai puțin ca 30 nucleotide în mărime; astfel, primerii din prima rundă de amplificare PCR au fost îndepărtați.

Probele concentrate pe Centricon 30 au fost apoi supuse unei a doua runde de amplificare PCR. Amplificarea prin PCR a fost pentru 35 cicluri, utilizând un regim, de 94°C (1 min), 60°C (1 min), 72°C (2 min) cu o extensie, de 7 min, la 72°C pentru ultimul ciclu. Probele au fost apoi extrase cu fenol: CHCI₃, precipitate de două ori și digerate cu EcoRI. Produsele de reacție PCR au fost analizate prin separarea produselor prin electroforază pe geluri de poliacrilamidă 6%. ADN-ul de mărime aproximativ estimată a produsului PCR așteptat pentru EnvL și EnvR, după prima rundă de amplificare, sunt 615 bp și respectiv 683 bp; după a doua rundă de amplificare mărimile produsului așteptate pentru EnvL și EnvR sunt 414 bp și 575 bp. Plasmidele conținând produsele amplificate au fost folosite pentru a transforma celulele gazdă; plasmida pGEM-4 a fost folosită pentru a transforma DH5-alfa și Ăgt11 a fost folosit pentru a transforma C6D0 delta-HFL. Au fost selecționate clonele celulelor transformate care, fie au hibridizat la probe HCV adecvate, fie acelea care au inserții de mărime corectă. Inserțiile au fost apoi donate în M13 și secvențializate. Probele pentru toate produsele HCV/cPCR au constat din secțiuni marcate cu ³²P ale ADN din HCV care au fost preparate prin amplificare PCR.

Informația secvenței pe variante în regiunea EnvL a fost obținută de la 3 clone din HCV#18, 2 clone din TH, 3 clone din EC 1, și din clonele HCV1. O comparație a secvenței nucleotidice compozite a fiecărui izolat derivat din aceste clone este arătată în fig.7. în figură, se arată fiecare secvență 5' la 3' pentru sensul șirului pentru regiunea EnvL, iar secvențele au fost aliniate. Liniile verticale și majusculele indică omologia de secvența, absența unei linii și o literă mică indică lipsa omologiei. Secvențele arătate pe linii sunt după cum urmează: linia 1, Thorn; linia 2, EC1; linia 3, HCT#18; linia 4, HCV1.

Informația secvenței pe variante în regiunea EnvR a fost obținută din două clone EC10 și din clonele HCV1. Cele două clone EC10 au diferit printr-o singură nucleotidă. □ comparație a secvențelor nucleotidelor din EC10 (clona 2) și un compozit a secvențelor HCV1 este arătată în fig. 8; fiecare secvență este arătată, de la 5' la 3' pentru sensul șirului din regiunea EnvR și secvențele au fost aliniate. Linia punctată dublă dintre secvențe indică omologia de secvență.

în fig. 9 și, respectiv, în fig. 10 se redă o comparație a secvențelor de aminoacizi codificată în EnvL (aminoacizii #117-306) și regiunea EnvR (aminoacizii #300438) pentru fiecare din izolate. Incluse în figuri sunt secvențele pentru izolatele JH23 și JH27, descrise mai sus. De asemenea, sunt indicate secvențele dintr-un izolat japonez; aceste secvențe au fost furnizate de dr. T. Miyamura, Japonia. în figuri, secvența de aminoacizi pentru regiune este dată în întregime pentru HCV1 și sunt indicați și aminoacizii neomologi din diferite izolate.

1535

1540

1545

1550

1555

1560

1565

1570

1575

RO 117329 Bl

Așa cum se observă din fig. 9, în regiunea EnvL este aproape 93% omoloagie între HCV1 și celelalte izolate. HCT 18, Th și EC1 au, aproximativ, o omologie de 97% cu HCV1; JH 23 și JH27 au aproximativ o omologie de 96% și, respectiv, aproximativ, 95% omologie în raport cu HCV1. Fig. 10 arată că omologiile din regiunea EnvR sunt semnificativ mai mici decât în regiunea EnvL; mai mult, o subregiune apare a fi hipervariabilă (adică, de la aminoacidul 383 la 405). Aceste date sunt rezumate în tabelul imediat următor:

Omologia regiunii EnvR

Izolat Procent de omologie cu HCV 1

AA33O-AA438 AA383-AA4O5

JH23 (U.S.)	83	57
JH27 (U.S.)	80	39
Japonez	73	48
EC1Q (Italia)	84	48

Aplicabilitatea industrială

Epitopii identificați aici pot fi utilizați pentru producerea de produși polipeptidici, așa cum se descrie mai sus pentru aplicații cum ar fi, selecționarea sângelui pentru infecția HCV, pentru diagnosticul clinic al HCV, generarea de anticorpi și prepararea de medicamente.

Revendicări

Claims

1. Polipeptide cuprinzând o secvență trunchiată de virus al hepatitei C (HVC) având o lungime maximă, de 25 amînoacizi, caracterizate prin aceea că secvența trunchiată HVC cuprinde un octamer HVC conținând un epitop selectat din:

GRTWAQPC

LINTNGSW

NNTRPPLG

WPQSEQV

AAARVTAI SEVENKW

2. Polipeptide, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că secvența HVC trunchiată are o lungime maximă, de aproximativ 20 amînoacizi.

3. Polipeptide, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că secvența HVC trunchiată are o lungime maximă, de aproximativ 15 amînoacizi.

4. Polipeptide, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că secvența HVC trunchiată are o lungime maximă, de aproximativ 10 aminoacizi.

5. Polipeptide cuprinzând o secvență HVC trunchiată, caracterizate prin aceea că secvența HVC trunchiată constă dintr-un octamer HCV conținând un epitop selectat din:

PKARRPEG

GRTWAQPC

LINTNGSW t

RO 117329 Bl

NNTRPPLG

WPQSEQV

AAARVTAI

SEVENKW

EAQALPVW

6. Polipeptide octamer HCV izolată conținând epitop, caracterizate prin aceea că este selectată din grupul constând din:

PKARRPEG

GRTWAQPC

LINTNGSW

NNTRPPLG

WPQSEQV

AAARVTAI

SEVENKW EAQALPVW

7. Polipeptide, conform oricăreia dintre revendicările 1 ...6, caracterizate prin aceea că se utilizează într-un imuno-test.

8. Polipeptide, conform oricăreia dintre revendicările 1 ...6, caracterizate prin aceea că se prepară prin exprimare recombinantă sau sinteză chimică.