FI110099B - Menetelmä hepatiitti C-viruksen (HCV) polypeptidien valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä hepatiitti C-viruksen (HCV) polypeptidien valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI110099B FI110099B FI935808A FI935808A FI110099B FI 110099 B FI110099 B FI 110099B FI 935808 A FI935808 A FI 935808A FI 935808 A FI935808 A FI 935808A FI 110099 B FI110099 B FI 110099B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- hcv
- polypeptide
- amino acids
- sequences
- sequence
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 145
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 134
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 121
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 10
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title description 164
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 63
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 8
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 56
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 55
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 36
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 36
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 28
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 28
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 24
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 24
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 21
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 13
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 12
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 6
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 5
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 5
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010019791 Hepatitis post transfusion Diseases 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N almurtide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CO[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 2
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDAUCYDVXIPBDR-UMSFTDKQSA-N (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) (2r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-tritylsulfanylpropanoate Chemical compound FC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1OC(=O)[C@@H](NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)CSC(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FDAUCYDVXIPBDR-UMSFTDKQSA-N 0.000 description 1
- TZEGAVSWQUEHAQ-QHCPKHFHSA-N (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylbutanoate Chemical compound O=C([C@@H](NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(C)C)OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F TZEGAVSWQUEHAQ-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- WKHPSOMXNCTXPK-QFIPXVFZSA-N (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-phenylpropanoate Chemical compound FC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1OC(=O)[C@@H](NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)CC1=CC=CC=C1 WKHPSOMXNCTXPK-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- NTQJCLLWLHKJLU-IBGZPJMESA-N (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-methylpentanoate Chemical compound O=C([C@@H](NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)CC(C)C)OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F NTQJCLLWLHKJLU-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- OKDPSRDTLNXPFQ-SFHVURJKSA-N (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-methylsulfanylbutanoate Chemical compound O=C([C@@H](NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)CCSC)OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F OKDPSRDTLNXPFQ-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- HLNVSYQQDWNJRI-QFIPXVFZSA-N (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoate Chemical compound O=C([C@@H](NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F HLNVSYQQDWNJRI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- CJXZXBGKOSXBFR-NSHDSACASA-N (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoate Chemical compound O=C([C@@H](NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C)OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F CJXZXBGKOSXBFR-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- FYZSBHSHLNJGPS-RZFZLAGVSA-N (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) (2s,3s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylpentanoate Chemical compound O=C([C@@H](NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)[C@@H](C)CC)OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F FYZSBHSHLNJGPS-RZFZLAGVSA-N 0.000 description 1
- LBSDTBJWUJIFBO-UHFFFAOYSA-N (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) 2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)acetate Chemical compound FC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1OC(=O)CNC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 LBSDTBJWUJIFBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-pyridin-2-ylsulfanylpropanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSC1=CC=CC=N1 QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N (4R)-4-[[(2S,3R)-2-[acetyl-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-4-[(1R)-1-carboxyethoxy]-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoic acid Chemical compound C(C)(=O)N([C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](CCC(=O)O)C(N)=O)C1[C@H](N)[C@@H](O[C@@H](C(=O)O)C)[C@H](O)[C@H](O1)CO YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQBLOHXKGUNWRV-SFHVURJKSA-N 1-o-(9h-fluoren-9-ylmethyl) 2-o-(2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) (2s)-pyrrolidine-1,2-dicarboxylate Chemical compound FC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1OC(=O)[C@H]1N(C(=O)OCC2C3=CC=CC=C3C3=CC=CC=C32)CCC1 CQBLOHXKGUNWRV-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N 6-Maleimidocaproic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 description 1
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108010043938 Ephrin-A4 Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241001529251 Gallinago gallinago Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000489569 Mandevilla x amabilis Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100171805 Mus musculus Efna3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100171811 Mus musculus Efna5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100171815 Mus musculus Efnb1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100444584 Mus musculus Efnb2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100174574 Mus musculus Pikfyve gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108700015872 N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- WINXNKPZLFISPD-UHFFFAOYSA-M Saccharin sodium Chemical compound [Na+].C1=CC=C2C(=O)[N-]S(=O)(=O)C2=C1 WINXNKPZLFISPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000061 acid fraction Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N bromoacetic acid Chemical compound OC(=O)CBr KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- VOAXAOULFRTTAM-UHFFFAOYSA-N chloroform phenol Chemical compound C1(=CC=CC=C1)O.C(Cl)(Cl)Cl.C1(=CC=CC=C1)O.C1(=CC=CC=C1)O VOAXAOULFRTTAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 231100000012 chronic liver injury Toxicity 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124280 l-arginine Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 1
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 1
- 108700007621 mifamurtide Proteins 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
1 1 110099
Menetelmä hepatiitti C -viruksen (HCV) polypeptidien valmistamiseksi Tämä keksintö liittyy aineisiin ja menetelmiin hepatiitti C -5 virus (HCV) -infektion leviämisen taltuttamiseksi. Keksintö koskee erityisemmin menetelmää polypeptidien valmistamiseksi, : jotka ovat käyttökelpoisia immunologisina reagensseina HCV- infektioiden ehkäisemisessä ja hoitamisessa.
10 Houghton et ai. identifioi ja karakterisoi ensimmäisenä HCV:n ei-A,ei-B -hepatiitin (NANBH) aiheuttajana. Tämä johti joi-! denkin imunologisina reagensseina käyttökelpoisten yleisten ja spesifisten polypeptidien julkistamiseen. Lähemmin esim., Houghton et ai., EPO-julkaisu 318 216; Houghton et ai., EPO-15 julkaisu 388 232; Choo et ai., Science (1989) 244:359-362,-
Kuo et ai., Science (1989) 244:362-364; Houghton et ai., Hepatology (1991) 14:381-388. Nämä julkaisut tuovat alalle perusteellisen perustan HCV:stä yleensä, samoin kuin HCV-.n immunologisten polypeptidireagenssien valmistuksesta ja käyttö-20 kohteista. Nämä julkaisut ovat sen vuoksi erityisesti sisällytettyinä lyhyesti tähän yhteyteen viitteinä.
Toiset ovat helposti soveltaneet ja laajentaneet Houghtonin « « · et ai. työtä. Lähemmin, Highfield et ai., GB-patenttihakemus 25 2 239 245 (The Wellcome Foundation Ltd.); Wang, EPO-julkaisu ; 442 394 (United Biomedical Inc.); Leung et ai., EPO-julkaisu j'.'. 445 423 (Abbott Laboratories); Habits et ai., EPO-julkaisu 451 891 (Akzo N.V.); Reyes et ai., PCT-julkaisu WO 91/15516 (Genelabs Inc.); Mäki et ai., EPO-julkaisu 468 657 (Tonen . . 30 Corp.) ja Kamada et ai., EPO-julkaisu 469 348 (Shionogi Sei-;..' yaku K.K.).
: Herkät spesifiset menetelmät HCV-kantajien ja HCV:llä konta- minoidun veren tai verituotteiden seulomiseksi ja identifioisi miseksi ovat tärkeä edistysaskel lääketieteessä. Verensiirron jälkeistä hepatiittia (PTH) esiintyy suunnilleen 10 %:illa ’·*·’ verensiirtopotHaista ja HCV on aiheuttanut jopa 90 % näistä tapauksista. Tärkein ongelma tässä sairaudessa on usein 2 110099 esiintyvä taudin eteneminen krooniseksi maksavaurioksi (25-55 %) . Potilashuolto sekä HCV:n siirtymisen estäminen veren ja verituotteiden tai läheisen henkilökosketuksen välityksellä edellyttävät luotettavia ja ennustavia työvälineitä, kuten 5 esim. HCV-polypeptidejä, HCVrhen liittyvien vasta-aineiden ilmaisemiseksi. Sellaiset polypeptidit ovat käyttökelpoisia myös rokotteina ja immunoterapeuttisinä hoitoaineina sairauden ehkäisemiseksi ja/tai hoitamiseksi.
10 Koska HCV on verrattain uusi agenssi, on jatkuva tarve määritellä immunologisia lisäreagensseja, joiden avulla on mahdollista tutkia taudin kliinistä etenemistä ja HCV:n epidemiologiaa väestössä.
15 Keksintö liittyy uusien HCV-epitooppien karakterisointiin.
Näiden epitooppien karakterisointi mahdollistaa polypeptidi-tuotteiden valmistuksen, jotka reagoivat immunologisesti HCV-vasta-aineiden kanssa ja/tai aiheuttavat anti-HCV -vasta-ainetuotannon in vivo. Nämä polypeptidituotteet ovat käyttökö kelpoisia standardeina tai reagensseina diagnostisissa testeissä ja/tai rokotekomponenteissa. Vasta-aineet, käsittäen esimerkiksi sekä polyklonaaliset että monoklonaaliset vasta- • · .'.· aineet, jotka on kohdistettu näihin polypeptidisekvensseihin sisältyviä HCV-epitooppeja vastaan, ovat myös käyttökelpoisia • : : 25 reagensseja esimerkiksi diagnostisissa testeissä, terapeutti-: sinä aineina, virusvastaisten aineiden seulonnassa ja HCV-po- lypeptidien tai -partikkeleiden eristämiseen tai eristämi-.·:·. seen/puhdistamiseen.
. . 30 Laajimmassa merkityksessään tämä keksintö kohdistetaan poly-peptidien valmistusmenetelmiin, jotka sisältävät tässä esille ;·' tuotavia vasta karakterisoituja HCV-epitooppeja (esim.
: : yhdistelmämenetelmiin tai synteettisiin menetelmiin) . Näihin liittyvät polypeptidien käyttömenetelmät (esim. diagnostiset, . \ 35 rokotteisiin liittyvät ja terapeuttiset) ja valmistus- tuotteet, koostumukset tai formulaatiot, jotka on sovitettu '···’ sellaisia käyttöjä varten (esim. polypeptidit, jotka on kiinnitetty immunomääritysalustaan tai muuhun kantajaan, 3 110099 oraalisiin tai ruiskeena annettaviin farmaseuttisiin koostumuksiin). Tähän keksintöön liittyvät myös vastaavasti vasta-aineet (polyklonaaliset, monoklonaaliset tai niiden vastineet kuten sitoutumisfragmentit, yksiketjuiset 5 antigeeniin tarttuvat proteiinit jne.) tässä esille tuotuja HCV-epitooppeja vastaan, sekä sellaisten vasta-aineiden valmistusmenetelmät, sellaisten vasta-aineiden käyttömenetelmät (esim. diagnostiset, rokotteisiin liittyvät ja terapeuttiset) ja valmistustuotteet, koostumukset tai for-10 mulaatiot, jotka on sovitettu sellaisia käyttöjä varten (esim. vasta-aineet, jotka on kiinnitetty immunomääritysalus-taan tai muihin kantajaan, oraalisiin tai ruiskeina annettaviin farmaseuttisiin koostumuksiin).
15
Keksinnön mukaisia näkökohtia ovat vielä: menetelmä po- lypeptidin tuottamiseksi, joka polypeptidi sisältää vasta esille tuotuja HCV-epitooppeja, joka menetelmä käsittää isän-täsolujen inkuboinnin, jotka on transformoitu ekspressiovek-20 torilla, joka sisältää HCV-epitoopin sisältävää polypeptidiä koodittavan sekvenssin, olosuhteissa, jotka mahdollistavat mainitun polypeptidin ilmentymisen.
• · ·
Rokotteet HCV-infektion hoitamiseksi voivat sisältää tässä . 25 kuvaillun HCV-epitoopin sisältävän itnmunogeenisen peptidin.
Menetelmä HCV-vasta-aineiden tuottamiseksi käsittää eristetyn immunogeenisen polypeptidin, joka sisältää tässä kuvaillun HCV-epitoopin, antamisen henkilölle riittävänä määränä . . 30 aikaansaamaan immuunivasteen.
* · ···’ Voidaan valmistaa kaavan ; * 3.3.χ“ clciy 35 mukaisia epitooppeja, jossa kaavassa aa tarkoittaa ’···* aminohappoa; x ja y ovat kokonaislukuja siten, että y-x > 6; aax-aay esittää osaa kuvion 1 mukaisessa aminohappo 4 110099 sekvenssissä; ja x valitaan ryhmästä: 23-34, 36, 66-79, 81-94, 96-98, 101-103, 186-189, 191, 206, 223, 232, 256, 286, 297-299, 321, 347, 357, 5 413, 414, 432, 465^71, 480-484, 501, 502, 521, 540-549, 579, 594-599, 601- 613, 641, 662-665, 685, 705, 706, 729, 782-789, 801, 851-855, 893, 916, 928, 946, 952-954, 1026, 1072, 1109, 1112-1117,1218, 1240, 1280-1285, 1322, 1338, 1371, 1384, 1410, 1411, 1454, 1492, 1493, 1532-1535, 1560, 1561, 1566-1568, 1571-1577, 1601-1607, 1615-1620, 1655, 1695, 1710-1712, 1728, 1729, 1758-10 1762, 1781, 1808, 1821, 1851, 1880, 1908-1913, 1925, 1940-1948, 1951, 1966- 1969, 1999, 2001-2004, 2006-2014, 2024, 2048-2053, 2055-2057, 2071, 2088-2093, 2108, 2122-2148, 2165, 2187, 2226-2232, 2244-2249, 2267, 2281-2286, 2288, 2289, 2325-2327, 2346, 2347, 2349, 2382, 2401, 2417-2422, 2439-2444, 2446-2456, 2469, 2471-2476, 2495, 2533, 2534, 2573-2578, 2602-2604, 2606-15 2612, 2632-2638, 2660, 2676-2679, 2688-2693, 2707, 2721, 2757-2762, 2779, 2794, 2795, 2797-2799, 2801, 2802, 2817-2843, 2863-2867, 2878-2884, 2886-2895.
20 Edellä määritellyt päämäärät saadaan aikaan myös käyttämällä kaavan mukaisia HCV-epitooppeja 5 110099 y pienempi kuin 2464), 2445 (kun y pienempi kuin 2475), 2470 (kun y pienempi kuin 2490) , 2605 (kun y pienempi kuin 2620) , 2780 (kun y pienempi kuin 2830) , 2796 (kun y pienempi kuin 2886), 2800 (kun y pienempi kuin 2850) ja 2885 (kun y pienem-5 pi kuin 2905).
i Kummassakin edellä määritellyssä kaavassa x-y voi olla vähem män tai yhtä suuri kuin 10, 20, 30, 40 tai 50.
10 Kuvio 1 esittää HCV:n prototyyppieristyksen HCVl:n polyprote-iinia.
Kuvio 2 esittää cDNA-sekvenssikoostetta HCVlrlle.
15 Kuvio 3 esittää ihmisen eristys-23:n konsensusnukleotidisek-venssiä, muunnelmasekvenssit on esitetty sekvenssilinjan alapuolella. Konsensussekvenssissä kooditettuna olevat aminohapot on myös esitetty.
20 Kuvio 4 esittää ihmisen eristys-27:n konsensusnukleotidisek-venssiä, muunnelmasekvenssit on esitetty sekvenssilinjan alapuolella. Konsensussekvenssissä kooditettuna olevat aminoha-.·*.· pot on myös esitetty.
• :·. 25 Kuvio 5 esittää ihmisen eristys-23:n ja eristys-27:n ja : HCVl:n rinnakkain asetettuja nukleotidisekvenssejä. Homo- logiset sekvenssit on esitetty symbolilla (*). Ei-homologiset sekvenssit ovat pienillä kirjaimilla.
. . 30 Kuvio 6 esittää ihmisen eristys-23:n ja eristys-27:n ja HCV1:n rinnakkain asetettuja aminohapposekvenssejä. Homo-·;·* logiset sekvenssit on esitetty symbolilla (*) . Ei-homologiset : sekvenssit ovat pienillä kirjaimilla.
, 35 Kuvio 7 esittää vertailun rinnakkain asetetuista nukleotidi- sekvenssiyhdistelmistä eristyksistä Thorn, EC1, HCT#18 ja ’··· HCV1.
, 11CC99
Kuvio 8 esittää vertailun EC10:n nukleotidisekvensseistä ja HCV1-sekvenssin koosteesta; EC10-sekvenssi käsittää pisteiden yläpuolisen linjan ja HCV1-sekvenssi käsittää pisteiden alapuolella olevan linjan.
5
Kuvio 9 esittää vertailun aminohapposekvensseistä 117-308 (suhteessa HCVl:een), jotka ovat kooditettuina konsensusse-kvenssien "EnvL"-alueissa ihmisen eristyksissä HCT#18, JH23, JH 27, Thorne, EC1 ja HCV1.
10 \ Kuvio 10 esittää vertailun aminohapposekvensseistä 330-360 (suhteessa HCVl:een), jotka ovat kooditettuina konsensusse-kvenssien "EnvR"-alueissa ihmisen eristyksissä HCT#18, JH23, JH 27, Thorne, EC1 ja HCV1.
15 Täydelliset viittaukset tässä referoituihin julkaisuihin voidaan löytää "Tausta"- tai "Kirjallisuus"-jaksoista.
I. Määritelmiä 20 "Hepatiitti C -virus" tai "HCV" tarkoittaa alalla tunnettua viruslajeja, joiden patogeeniset kannat aiheuttavat NANBH:n, ja niistä saatuja heikennettyjä kantoja tai vajavaisia eh-käiseviä partikkeleita. Lähemmin yleisesti julkaisuissa, 25 joita on siteerattu "Tausta"-jaksossa. HCV-genomi on RNA:ta.
: Tiedetään, että RNA:ta sisältävillä viruksilla spontaanimu- taatiofrekvenssit ovat verrattain korkeat, so., ilmoitettuna luokkaa 10'3 - 10'4 inkorporoitua nukleotidiä kohti (Fields & Knipe (1986)) . Koska RNA-viruksille on luonteenomaista geno-... . 30 tyypin heterogeenisuus ja epävakaisuus, HCV-lajin sisällä *... esiintyy sen vuoksi useita kantoja/isolaatteja, jotka voivat “· olla virulentteja tai ei-virulentteja. Kirjallisuudessa on •'1^ hyvin dokumentoituna erilaisten HCV-kantojen tai -eristysten : *: lisääminen, identifiointi, ilmaiseminen ja eristäminen. Sen ; ’· 35 lisäksi, tämän esityksen avulla on mahdollista valmistaa diagnostisia aineita ja rokotteita eri kantoja/isolaatteja *·· varten.
7 110099 Tässä yhteydessä tuodaan esille tietoja useista erilaisista HCV-kannoista/isolaateista, erityisesti kannasta tai isolaa-tista CDC/HCV1 (toiselta nimeltä HCV1). Informaatio yhdestä kannasta tai isolaatista, kuten esimerkiksi osa genomisesta 5 sekvenssistä tai aminohapposekvenssistä on riittävä, jotta alaa tuntevat henkilöt pystyvät standarditekniikkaa käyttäen eristämään uusia kantoja/isolaatteja ja identifioimaan sen, ovatko uudet kannat/isolaatit HCV. Useita erilaisia kantoja/isolaatteja kuvaillaan esimerkiksi jäljempänä. Nämä kan-10 nat, jotka saatiin joistakin ihmisen seerumeista (ja eri maantieteellisiltä alueilta), eristettiin käyttäen hyväksi informaatiota HCVlm genomisesta sekvenssistä.
Tässä yhteydessä annettava informaatio osoittaa, että HCV voi 15 selvästi liittyä flaviviruksiin. Flavivirus-ryhmä sisältää suuren virusjoukon, jotka ovat pieniä vaipallisia ihmispato-geenejä. Flavivirus-partikkeleiden morfologia ja koostumus tunnetaan ja niitä käsittelee Brinton (1986) . Yleisesti ottaen morfologian osalta flavivirukset sisältävät keskisen 20 nukleokapsidin, jota ympäröi lipidikaksoiskerros. Virionit ovat pallomaisia ja niiden läpimitta on noin 40-50 nm. Niiden ydinten läpimitta on noin 25-30 nm. Virionin vaipan ulkopin-.·.· nalla on ulokkeita, jotka ovat noin 5-10 nm pitkiä ja joiden päässä on noin 2 nm läpimittaisia nuppeja. Tyypillisiä esi-25 merkkejä ryhmästä ovat keltakuumevirus, Länsi-Niilin virus ja • dengue-kuumevirus. Niillä on juosteeltaan positiiviset RNA- :·.·. genomit (noin 11 000 nukleotidiä) , jotka ovat vähän suurempia kuin HCV:n genomi ja koodittavat noin 3500 aminohappoa sisältävää polyproteiiniprekursoria. Yksittäiset virusproteiinit . . 30 lohkaistaan tästä prekursoripolypeptidistä.
···* HCV:n genomisen RNA:n genomirakenne ja nukleotidisekvenssi on : f: johdettu. Genomi näyttää olevan yksijuosteista RNArta, joka sisältää noin 10 000 nukleotidiä. Genomi on juosteeltaan po-. 35 sitiivinen ja sisältää yhtenäisen translaationaalisen avoimen lukukehyksen (ORF), joka koodittaa noin 3000 aminohappoa si-'···’ sältävää polyproteiinia. ORF:ssä rakenneproteiini (-prote iinit) näyttää olevan kooditettuna suunnilleen N-pään alueen 110099 ensimmäisessä neljänneksessä, suurimman osan polyproteiinista vastatessa ei-rakenteellisia proteiineja. Verrattaessa kaikkiin tunnettuihin virussekvensseihin, pientä mutta merkittävää kolineaarista homologiaa havaitaan flavivirusryhmän ei-5 rakenteellisten proteiinien suhteen ja pestivirusten suhteen (joiden katsotaan nyt myös olevan osa Flavivirus-ryhmää).
Perustuen pääteltyihin aminohappoihin, jotka ovat kooditet-tuina HCV1:n nukleotidisekvenssissä, ja muuhun todistusai-10 neistoon, kooditetun HCV-polyproteiinin mahdolliset prote-iinidomeenit samoin kuin arvioidut rajakohdat on esitetty seuraavassa:
Oletettu domeeni Arvioidut rajakodonit 15 (aminohapponumerot) C (nukleokapsidiproteiini) 1-191
Ei (virionin vaippaproteiini) 192-383 E2/NS1 (vaippa?) 384-800 20 NS2 (tuntematon funktio) 800-1050 NS3 (proteaasi?) 1050-1650 NS4 (tuntematon funktio) 1651-2100 .·.· NS5 (polymeraasi) 2100-3011 (loppu) 25 Nämä domeenit ovat kuitenkin epävarmoja. E1-NS2 -raja esimer-• kiksi on luultavasti 750-810 -alueella ja NS3-NS4 -raja on suunnilleen 1640-1650. On myös ilmeistä, että 191 ah C-versio on prekursori, joka jatkoprosessoidaan (esim. noin 170 ah pituuteen) , ja että NS2-, NS4 ja NS5-proteiinit jatkoprosessoi-. . 30 daan kukin kahdeksi toimintavalmiiksi proteiiniksi.
·;·* H CV: n eri kantojen, eristysten tai alatyyppien odotetaan si- : sältävän eroavuuksia aminohappojen ja nukleiinihappojen osal- ta verrattuna HCVlreen. Monen isolaatin kokonaisaminohappo-. 35 sekvenssin odotetaan olevan hyvin homologinen (so., enemmän *;;/ kuin noin 40 %) HCVl:n suhteen. Voidaan kuitenkin myös havai- ta, että vähemmän homologisia HCV-isolaatteja löytyy. Nämä määriteltäisiin HCV:ksi erilaisten arviointiperusteiden mu- ! 110099 9 kaan, joita ovat esimerkiksi suunnilleen 9000 - suunnilleen 12000 nukleotidiä sisältävä ORF, joka koodittaa HCVl:n poly-proteiinin kanssa samankokoista polyproteiinia, HCVl:n poly-proteiinin kanssa hydrofobisuudeltaan ja/tai antigeenisuudel-5 taan samanlainen kooditettu polyproteiini ja kolineaaristen peptidisekvenssien läsnäolo, jotka ovat säilyneet HCVl:n suhteen. Lisäksi uskotaan, että genomi olisi juosteeltaan positiivista RNA:ta.
10 HCV koodittaa vähintään yhtä epitooppia, joka on immunologi-sesti identtinen HCVl-polyproteiinin epitoopin kanssa. Epi-tooppi on HCV:lle tunnusomainen verrattaessa aikaisemmin tunnettuihin flaviviruksiin. Epitoopin tunnusomaisuus voidaan määrittää sen immunologisen reaktiivisuuden avulla anti-HCV -15 vasta-aineiden kanssa ja immunologisen reaktiivisuuden puuttumisella tunnettujen Flavivirus-lajien vasta-aineiden suhteen. Alalla tunnetaan menetelmät immunologisen reaktiivisuuden määrittämiseksi, esimerkiksi radioimmunomäärityksen avulla, ELISA-määrityksen avulla, hemagglutinaation avulla, 20 ja tässä esitetään useita esimerkkejä sopivista määritystekniikoista. "Tunnusomaisuuden" arviointiin voidaan vaihtoeh-.. toisesti käyttää HCV-epitoopin sekvenssin vertaamista Flavi- ·’·' virus-ryhmän jäsenten aikaisemmin tunnettuihin sekvensseihin.
·.·.· 25 Edellä esitetyn lisäksi seuraavat parametrit koskien nuk-:,· * leiinihappohomologiaa ja aminohappohomologiaa ovat käyttökel- j ·*: poisia joko yksin tai yhdistelmänä identifioitaessa HCV-kan- ta/isolaatti. Koska HCV-kannat ja -isolaatit ovat kehityksellisesti läheisiä, on odotettavissa, että genomien koko-.·. : 30 naishomologia nukleotiditasolla voi olla noin 10 % tai enem- .···’ män, luultavasti noin 40 % tai enemmän, luultavasti noin 60 % tai enemmän ja vielä luultavammin noin 80 % tai enemmän, ja että ne käsittävät vähintään noin 13 nukleotidiä sisältäviä toisiaan vastaavia viereisiä sekvenssejä. Tulisi huomata, : 35 että HCV-genomin alueella on variaabeleita ja hypervariaabe- leita alueita; homologian näillä alueilla otaksutaan sen vuoksi olevan merkittävästi vähäisempää kuin homologian ko-konaisgenomissa. Vastaavuus HCV-kannan oletetun genomisen 10 11CC99 sekvenssin ja esimerkiksi CDC/HCV1 cDNA:n välillä voidaan määrittää alalla tunnetuilla menetelmillä. Ne voidaan esimerkiksi määrittää vertaamalla suoraan polynukleotidi-informaatiota oletetusta HCV:stä ja tässä kuvailtua HCV cDNA -sek-5 venssiä (sekvenssejä) toisiinsa. Ne voidaan määrittää myös polynukleotidien hybridisaation avulla olosuhteissa, joissa muodostuu pysyviä duplekseja homologisten alueiden välillä (esimerkiksi olosuhteissa, joita käytettäisiin ennen Si-pil-s kontaa), jota hybridisaatiota seuraa pilkkominen yksijuos- 10 teisen spesifisen nukleaasin (nukleaasien) avulla, jota seuraa pilkontafragmenttien koon määrittäminen.
Johtuen HCV-kantojen tai -isolaattien evolutionistisestä yhteydestä, oletetut HCV-kannat tai -isolaatit voidaan identi-15 fioida homologiasta polypeptiditasolla. HCV-kantojen tai -isolaattien homologian otaksutaan yleisesti olevan vähintään 10 %, enemmän kuin noin 40 %, luultavasti enemmän kuin noin 70 % ja vielä luultavammin enemmän kuin noin 80 %, ja joidenkin homologia voi olla jopa enemmän kuin 90 % polypeptidi-20 tasolla. Menetelmät aminohapposekvenssihomologian määrittämiseksi tunnetaan alalla. Aminohapposekvenssi voidaan esimerkiksi määrittää suoraan ja sitä voidaan verrata tässä yhtey-dessä esitettyihin sekvensseihin. Vaihtoehtoisesti voidaan • ii#: määrittää oletetun HCV:n genomisen aineen nukleotidisekvenssi 25 (tavallisesti cDNA-välituotteen kautta) , sen koodittama ole- • tettu aminohapposekvenssi voidaan määrittää ja vastaavia alueita vertailla.
Tässä yhteydessä käytettynä, määrätystä sekvenssistä "saatu" , . 30 polynukleotidi tarkoittaa polynukleotidisekvenssiä, joka kä- ; / sittää sekvenssin, joka sisältää suunnilleen vähintään noin 6 ···’ nukleotidiä, edullisesti vähintään noin 8 nukleotidiä, : edullisemmin vähintään noin 10-12 nukleotidiä ja vielä edul- lisemmin vähintään noin 15-20 nukleotidiä, jotka vastaavat , ·, 35 aluetta määrätyssä nukleotidissä. "Vastaava" tarkoittaa mää- ·;; ’ rätylle sekvenssille homologista tai komplementaarista.
*···’ Alueen sekvenssi, josta polynukleotidi saadaan, on edullises ti homologinen tai komplementaarinen HCV-genomille tunnus- 11
ItCC'i'- ^ «* omaiselle sekvenssille. Se, onko sekvenssi tunnusomainen HCV-genomille, voidaan määrittää alaa tuntevien tuntemilla tekniikoilla. Sekvenssiä voidaan esimerkiksi verrata sekvens-seihin tietopankeissa, esim., Genebank, sen määrittämiseksi, 5 onko se läsnä infektoitumattomassa isännässä tai muissa organismeissa. Sekvenssiä voidaan verrata myös muiden virusten tunnettuihin (kuten prioriteettipäivämäärän) sekvensseihin, mukaan lukien ne, joiden tiedetään aiheuttavan hepatiittia, esim., HAV, HBV ja HDV, ja Flaviviridae-ryhmän jäsenet. Saa-10 dun sekvenssin vastaavuus tai vastaamattomuus muiden sekvenssien suhteen voidaan määrittää myös hybridisäätiön avulla sopivan kovissa olosuhteissa. Hybridisaatiomenetelmät nukleii-nihapposekvenssien komplementaarisuuden määrittämiseksi ovat alalla tunnettuja ja niitä käsitellään jäljempänä. Lähemmin 15 myös esimerkiksi Maniatis et ai., (1982). Sen lisäksi hybri-disaatiolla muodostuneet dupleksipolynukleotidien vastinpa-rittomuudet voidaan määrittää tunnetuilla menetelmillä, mukaan lukien esimerkiksi pilkkominen nukleaasilla kuten Sl:llä, joka pilkkoo spesifisesti yksijuosteiset alueet po-20 lynukleotididuplekseissa. Alueisiin, joista tyypilliset DNA-sekvenssit voidaan "saada", lukeutuvat niihin rajoittumatta . . esimerkiksi spesifisiä epitooppeja koodittavat alueet samoin • · kuin ei-kopioidut ja/tai ei-luetut alueet.
• · • · ·.·’.· 25 Saatu polynukleotidi ei välttämättä ole fysikaalisesti saatu :.· * esitetystä nukleotidisekvenssistä, vaan se voidaan luoda jol- | ‘ i lakin tavalla, mukaan lukien esimerkiksi kemiallinen synteesi tai DNA:n replikaatio tai käänteiskopiointi tai kopiointi. Alueyhdistelmiä, jotka vastaavat määrätyn sekvenssin sekvens-: 30 siä, voidaan lisäksi modifioida alalla tunnetuilla tavoilla
t · I
,<··. aiottua käyttöä vastaavaksi.
• * · * ’.i,*' Polypeptidi- tai aminohapposekvenssi, joka on "saatu" määrä- • i t tystä aminohappo- tai nukleiinihapposekvenssistä, tarkoittaa :35 vastaavasti polypeptidiä, jonka aminohapposekvenssi on ident-tinen polypeptidisekvenssin kanssa, joka on kooditettuna sekvenssissä tai sen osassa, jolloin osa käsittää vähintään 3-5 aminohappoa ja edullisemmin 11-15 aminohappoa, tai joka on „ 1tccre immunologisesti identtinen polypeptidin kanssa, joka on koo-ditettuna sekvenssissä. Tämä terminologia käsittää myös po-lypeptidin, joka on ilmennetty määrätystä nukleiinihapposek-venssistä.
! 5
Yhdistelmäpolypeptidi tai johdettu polypeptidi ei välttämättä ole luettu määrätystä nukleiinihapposekvenssistä; se voidaan saada aikaan jollakin tavalla, joita ovat esimerkiksi kemiallinen synteesi tai yhdistelmäekspressiosysteemin ilmentäminen io tai eristäminen HCV:stä, mukaan lukien mutatoitu HCV. Yhdistelmäpolypeptidi tai johdettu polypeptidi voi sisältää yhden tai useamman aminohappoanalogin tai ei-luonnollisena esiintyvän aminohapon sekvenssissään. Menetelmät aminohappoanalogien liittämiseksi sekvenssiin ovat alalla tunnettuja. Ne voivat 15 sisältää myös yhden tai useamman leiman, jotka ovat alaa tuntevien tiedossa.
Tässä yhteydessä käytettynä ilmaus "yhdistelmäpolynukleotidi" tarkoittaa alkuperältään genomista, cDNA:sta saatua, puo-20 lisynteettistä tai synteettistä polynukleotidiä, joka alkuperänsä tai manipuloinnin nojalla: (1) ei liity kokonaan tai osaksi polynukleotidiä, jonka kanssa se on liittynyt yhteen .·.· luonnossa, (2) on liittynyt polynukleotidiin, joka on eri kuin mihin se on liittynyt luonnossa tai (3) ei esiinny luon-25 nossa.
• · · * 1 · · Tässä yhteydessä käytettynä ilmauksella "polynukleotidi" tar- koitetaan minkä tahansa pituista polymeeristä nukleotidimuo- toa, joko ribonukleotidejä tai deoksiribonukleotidejä. Tämä . . 30 ilmaus tarkoittaa vain molekyylin primäärirakennetta. Tämä • · · ilmaus sisältää siten kaksi- ja yksijuosteisen DNA:n ja • · ;·’ RNA:n. Se sisältää myös tunnetut modifikaatiot, esimerkiksi ; alalla tunnetut leimat, metylaation, "cap"-alueet, yhden tai useamman luonnossa esiintyvän nukleotidin korvaamisen analo-, \ 35 gilla, nukleotidien väliset modifikaatiot, kuten esimerkiksi I t · modifikaatiot varauksettomien liitosten kanssa (esim., metyy- • · '··* lifosfonaatit, fosfotriesterit, fosfoamidaatit, karbamaatit jne.) ja varauksellisten liitosten kanssa (esim., fosforitio- 13 110099 aatit, fosforiditioaatit jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät sivuryhmäosia, kuten esimerkiksi proteiineja (mukaan lukien esim., nukleaasit, toksiinit, vasta-aineet, signaalipep-tidit, poly-L-lysiini jne.), modifikaatiot väliin sijoitettu-5 jen aineiden kanssa (esim., akridiini, psoraleeni jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät kelaatinmuodostajia (esim., metallit, radioaktiiviset metallit, boori, hapettavat metallit jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät alkylaattoreita, modifikaatiot modifioitujen liitosten kanssa (esim., alfa-10 anomeeriset nukleiinihapot jne.) samoin kuin polynukleotidin modifioimattomat muodot.
"Puhdistettu" polypeptidi tarkoittaa polypeptidiä, joka on tilassa, joka ei olennaisesti sisällä muita polypeptidejä, 15 so., koostumuksessa, joka sisältää vähintään noin 50 paino-% (haluttu polypeptidi/kokonaispolypeptidi koostumuksessa), edullisesti vähintään noin 70 % ja vielä edullisemmin vähintään noin 90 % haluttua polypeptidiä välittämättä ei-prote-iinisista aineista koostumuksessa. Alalla tunnetaan menetel-20 mät viruspolypeptidien puhdistamiseksi. Puhdistetut vasta-aineet määritellään samalla tavoin.
,V "Yhdistelmäisäntäsolut", "isäntäsolut", "solut", "solulin- ' jät", "soluviljelmät" ja muut sellaiset ilmaukset, jotka ,V: 25 merkitsevät mikro-organismeja tai korkeampia eukaryoottisia i a • solulinjoja viljeltyinä yksisolukokonaisuuksina, tarkoittavat • « I « soluja, joita voidaan tai joita on käytetty vastaanottajina i « yhdistelmävektorille tai muulle siirto-DNA:lie, ja käsittävät alkuperäisen transfektoidun solun jälkeläisiä. On ymmärrettä- , , 30 vä, että yksittäisen lähtösolun jälkeläiset eivät välttämättä >11 ole täysin identtiset morfologian ja genomisen DNA-.n tai ko- » · ·<·’ konais-DNA:n osalta kuin alkuperäinen lähtösolu johtuen luon- ;nollisesta, satunnaisesta tai tarkoituksellisesta mutaatios-ta.
:· -i * i 'j* "Replikoni" on mikä tahansa geneettinen elementti, esim., I i plasmidi, kromosomi, virus, kosmidi yms., joka käyttäytyy „ 110099 itsenäisen yksikön tavoin polynukleotidireplikaatiossa solussa; so., kykenee itseohjattuun replikaatioon.
"Vektori" on replikoni, johon toinen polynukleotidiosa on 5 kiinnittynyt, jotta saadaan aikaan kiinnittyneen osan repli-kaatio ja/tai ilmentyminen.
"Säätelysekvenssi" tarkoittaa polynukleotidisekvenssejä, jotka ovat välttämättömiä kooditussekvenssien ilmentymisen to-10 teuttamiselle, joihin ne on liitetty. Sellaisten säätelysek-venssien luonne on erilainen isäntäorganismista riippuen; prokaryooteilla sellaiset säätelysekvenssit käsittävät yleensä promoottorin, ribosomin sitoutumiskohdan ja terminaattorit; eukaryooteilla sellaiset säätelysekvenssit käsittävät 15 yleensä promoottorit, terminaattorit ja joissakin tapauksissa tehostinsekvenssit. Ilmauksen "säätelysekvenssit" on tarkoitettu sisältävän ainakin kaikki komponentit, joiden läsnäolo on välttämätön ilmentymiselle, ja siihen voi sisältyä myös lisäkomponentteja, joiden läsnäolo on edullista, esimerkiksi 20 ohjaussekvenssejä.
·,·. "Toimivasti kytketty" viittaa vierekkäisyyteen, jolloin siten • · kuvaillut komponentit ovat yhteydessä toisiinsa, mikä mahdol-i" listaa niiden toiminnan tarkoituksenmukaisella tavalla. Koo- ,·; 25 ditussekvenssiin "toimivasti kytketty" säätelysekvenssi lii- y· · tetään siten, että kooditussekvenssin ilmentyminen saadaan : aikaan olosuhteissa, jotka sopivat säätelysekvensseille.
"Avoin lukukehys" (ORF) on polynukleotidin alue, joka koodit-30 taa polypeptidiä; tämä alue voi käsittää osan kooditussek- • · venssistä tai kokonaisen kooditussekvenssin.
" Koodi tussekvenssi" on polynukleotidisekvenssi, joka kopioi-'·;·* daan mRNArksi ja/tai luetaan polypeptidiksi asetettaessa so- : 35 pivien säätelysekvenssien ohjaukseen. Translaation aloitus- kodoni 51-päässä ja translaation lopetuskodoni 3'-päässä määräävät kooditussekvenssin rajat. Kooditussekvenssi voi is 110099 sisältää niihin rajoittumatta mRNA-, cDNA- ja yhdistelmäpo-lynukleotidisekvenssit.
"Immunologisesti identifioitava" viittaa epitoopin (epitoop-5 pien) ja polypeptidi(e)n läsnäoloon, jotka ovat läsnä myös kyseisessä polypeptidissä (polypeptideissä), tavallisesti HCV-proteiineissa. Immunologinen identtisyys voidaan määrittää vasta-aineen sitoutumisella ja/tai kilpailulla sitoutumisessa; nämä tekniikat ovat tuttuja alaa yleisesti tunteville.
10 "Epitooppi" tarkoittaa tässä yhteydessä käytettäessä polypep-tidin antigeenistä determinanttia. Epitooppi voisi sisältää 3 tai useampia aminohappoja, jotka määräävät vasta-aineen sitoutumiskohdan. Epitooppi sisältää yleensä 5 aminohappoa ja 15 joskus vähintään 8 aminohappoa. Epitooppikartoitusmenetelmät ovat alalla tunnettuja.
Polypeptidi on "immunologisesti reaktiivinen" vasta-aineen kanssa, jos se sitoutuu vasta-aineeseen johtuen vasta-aineen 20 tunnistamisesta spesifisen, polypeptidin sisältämän epitoopin avulla. Immunologinen reaktiivisuus voidaan määrittää vasta-aineen sitoutumisen avulla, erityisemmin vasta-aineen sitou-.’.· misen kinetiikan avulla ja/tai sitoutumiskilpailulla käyttäen kilpailijana (kilpailijoina) tunnettua polypeptidiä (polypep-· 25 tidejä) , joka sisältää epitoopin, jota vastaan vasta-aine on : kohdistettu. Alalla tunnetaan menetelmät sen määrittämiseksi, onko polypeptidi immunologisesti reaktiivinen vasta-aineen kanssa.
. . 30 Ilmauksella "vasta-aine" tarkoitetaan tässä yhteydessä käy-tettynä polypeptidiä tai polypeptidi ryhmää, joka sisältää vähintään yhden vasta-aineen tarttumiskohdan. "Vasta-aineen : : : tarttumiskohta" tai "sitoutumisdomeeni" muodostuu vasta-ai- nemolekyyli(e)n variaabelidomeenien laskostumisesta, jolloin i · · . \ 35 muodostuu kolmiulotteisia sitoutumistiloja, joiden sisäpinnan muoto ja varaus jakautuma ovat komplementaariset antigeenin ’··’ epitoopin tunnusmerkkien kanssa, mikä mahdollistaa immunolo gisen reaktion antigeenin kanssa. Vasta-aineen tarttumiskohta 110099 16 voi olla muodostunut raskas- ja/tai kevytketjudomeenista (VH ja vastaavasti VL) , jotka muodostavat hypervariaabeleita silmukoita, jotka myötävaikuttavat antigeenin sitoutumiseen. Ilmaus "vasta-aine" käsittää esimerkiksi selkärankaisten vasta-5 aineet, hybridivasta-aineet, kimeeriset vasta-aineet, muutetut vasta-aineet, yhdenarvoiset vasta-aineet, Fab-proteiinit ja yksidomeeniset vasta-aineet.
Tässä yhteydessä käytettynä "yksidomeeninen vasta-aine" (dAb) 10 on vasta-aine, joka käsittää VH-domeenin, joka reagoi immuno-logisesti määrätyn antigeenin kanssa. dAb ei sisällä VL-do-meenia mutta se voi sisältää muita antigeenin sitoutumisdo-meeneja, joita tiedetään vasta-aineilla olevan, esimerkiksi kappa- ja lambdadomeeneja. Alalla tunnetaan menetelmiä dAb:n 15 valmistamiseksi. Lähemmin esimerkiksi Ward et ai., (1989).
Vasta-aineet voivat koostua myös VH- ja VL-domeeneista samoin kuin muista antigeeniä sitovista domeeneista. Esimerkkejä tämäntyyppisistä vasta-aineista ja menetelmistä niiden val-20 mistamiseksi tunnetaan alalla (lähemmin esim., US-patentti 4 816 467, joka on tässä sisällytetty viitteenä) ja sisältävät seuraavia. Esimerkiksi "selkärankaisen vasta-aineet" tarkoit- • · tavat vasta-aineita, jotka ovat tetrameerejä tai niiden yh-distelmiä, jotka sisältävät raskas- ja kevytketjuja, jotka ·,·*.· 25 ovat tavallisesti ryhmittyneet "Y"-konfiguraatioon, ja joiden : ketjujen välillä voi olla tai ei ehkä ole kovalenttisia si- doksia. Selkärankaisten vasta-aineissa tietyn vasta-aineen .·;·. kaikkien ketjujen aminohapposekvenssit ovat homologisia ketjujen kanssa, joita tavataan lymfosyytin yhdessä vasta-. . 30 aineessa, joka lymfosyytti tuottaa mainittua vasta-ainetta in situ tai in vitro (esimerkiksi hybridoomissa) . Selkäran-·; kaisten vasta-aineet käsittävät tyypillisesti natiiveja vas- : : : ta-aineita, esimerkiksi puhdistettuja polyklonaalisia vasta- aineita ja monoklonaalisia vasta-aineita. Esimerkkejä näiden I I t . \ 35 vasta-aineiden valmistusmenetelmistä kuvaillaan jäljempänä.
I » i · • > *···' "Hybridivasta-aineet" ovat vasta-aineita, joissa yksi raskas- ja kevytketjupari on homologinen ensimmäisen vasta-aineen 110099 17 raskas- ja kevytketjuparin kanssa, kun taas toinen raskas- ja kevytketjupari on homologinen toisen, erilaisen vasta-aineen raskas- ja kevytketjuparin suhteen. Kumpikin näistä kahdesta parista sitoo tyypillisesti erilaisia epitooppeja, erityises-5 ti eri antigeenien pinnoilla. Tästä on seurauksena "kaksiarvoisuus" -ominaisuus, so., kyky sitoa kahta antigeeniä samanaikaisesti. Sellaisia hybridejä voidaan muodostaa myös käyttäen kimeerisiä ketjuja kuten jäljempänä on esitetty.
10 "Kimeeriset vasta-aineet" ovat vasta-aineita, joissa raskas-ja/tai kevytketjut ovat fuusioproteiineja. Ketjujen konstant-tialue on tyypillisesti yhdestä tietystä lajista ja/tai ryhmästä ja variaabelidomeenit ovat eri lajista ja/tai ryhmästä. Mukaan luetaan myös mikä tahansa vasta-aine, jossa jompikumpi 15 tai kumpikin raskas- ja kevytketjuista koostuvat sekvenssiyh-distelmistä, jotka jäljittelevät vasta-ainesekvenssejä eri lajeissa, olivatpa nämä lähteet peräisin eri ryhmistä tai eri lajeista, ja sijaitsipa fuusiokohta variaabeli/konstanttira-jalla tai ei. On mahdollista siten tuottaa vasta-aineita, 20 joissa sekä konstantti- että variaabelialue ei jäljittele tunnettuja vasta-ainesekvenssejä. Sen jälkeen oli mahdollista ·.·. konstruoida vasta-aineita, joiden variaabelialueella on kor- .···. keammat spesifiset af f iinisuudet tiettyyn antigeeniin, tai joiden konstanttialue voi saada aikaan komplementin fiksaati-.* ! 25 on, tai tehdä muita parannuksia tietylle konstanttialueelle ;;·/ kuuluvissa ominaisuuksissa.
’ Toinen esimerkki käsittää "muunnetut vasta-aineet", joka tar koittaa vasta-aineita, joissa luonnollisena esiintyvä amino-: 30 happosekvenssi selkärankaisen vasta-aineessa on vaihdettu ·*”: toiseen. Käyttämällä hyväksi yhdistelmä-DNA -menetelmiä voidaan konstruoida vasta-aineita haluttujen ominaisuuksien saavuttamiseksi. Mahdollisia muunnelmia on useita ja ne kä-sittävät yhden tai useamman aminohapon vaihtamisen tai alu-I I | 35 een, esimerkiksi konstanttialueen kokonaan uudelleenkonst-ruoinnin. Muutoksia konstanttialueella voidaan yleisesti tehdä, jotta saadaan aikaan haluttuja soluprosessiominaisuuksia, esim., muutoksia komplementin fiksaatiossa, vuorovaikutukses- 1S 110099 sa membraaneilla ja muita säätelytekijäfunktioita. Muutoksia variaabelialueella voidaan tehdä antigeenin sitovissa ominaisuuksissa. Vasta-aine voidaan myös muokata, kun halutaan auttaa molekyylin tai aineen spesifisessä kuljetuksessa tiettyyn 5 soluun tai kudospaikkaan. Halutut muutokset voidaan tehdä tunnetuilla molekyylibiologian menetelmillä, esim., yhdistel-mä-DNA -menetelmillä, paikkakohdennetun mutatoinnin avulla jne.
10 Vielä toisena esimerkkinä ovat "yhdenarvoiset vasta-aineet", jotka ovat yhdistelmiä, jotka käsittävät raskasketju/kevyt-ketjudimeerin sitoutuneena toisen raskasketjun Fc (so., konstanttiin) -alueeseen. Tämäntyyppinen vasta-aine välttyy antigeeniseltä modulaatiolta. Lähemmin esim., Glennie et ai., 15 (1982).
Vasta-ainemääritelmä pitää sisällään myös vasta-aineiden "Fab"-fragmentit. "Fab"-alue tarkoittaa niitä raskas- ja kevytketjujen osia, jotka ovat suunnilleen vastaavia tai 20 analogisia sekvensseihin nähden, jotka käsittävät raskas- ja kevytketjujen haarautuneen osan, ja joiden on osoitettu im-munologisesti sitoutuvan spesifiseen antigeeniin, mutta jois-.·.* ta puuttuu Fc-säätelyosa. "Fab" sisältää yhden raskasketjun ja yhden kevytketjun yhdistelmiä (tunnetaan yleensä nimellä 25 Fab1) samoin kuin tetrameerejä, jotka sisältävät 2H- ja 2L-: :*: ketjut (nimellä F(ab)2), jotka kykenevät valikoivasti reagoi- maan määrätyn antigeenin tai antigeeniperheen kanssa. "Fab"-.·;·. vasta-aineet voidaan jakaa alaryhmiin analogisesti edellä kuvailtujen ryhmien kanssa, so., "selkärankaisen Fab", "hyb-. 30 ridi-Fab", "kimeerinen Fab" ja "muunnettu Fab". Alalla tunne-taan menetelmät vasta-aineiden "Fab"-palojen tuottamiseksi, ·;· esimerkiksi proteolyysi ja synteesi yhdistelmämenetelmien avulla.
• * • « · . ’. 35 Ilmaukseen "vasta-aineet" luetaan myös yksiketjuiset antigeeni,’ nin sitovat (SCA) proteiinit kuten sellaiset, joita Schlom, ···’ J. on kuvaillut julkaisussa Cancer research, 15. kesäkuuta, 1992 (samoin kuin siinä siteeratuissa artikkeleissa).
19 ΠΟΟρρ Tässä yhteydessä käytettynä ilmaus "immunogeeninen polypepti-di" on polypeptidi, joka saa aikaan soluun liittyvän tai elimistön nesteisiin liittyvän immuunivasteen, joko yksin tai 5 kytkettynä kantajaan adjuvanssin läsnäollessa tai sen puuttuessa.
Ilmaus "polypeptidi" tarkoittaa aminohappopolymeeriä eikä viittaa tuotteen määrättyyn pituuteen; polypeptidimääritelmän 10 piiriin luetaan siten peptidit, oligopeptidit ja proteiinit.
Tämä ilmaus ei myöskään tarkoita polypeptidin ilmenemisen jälkeisiä modifikaatioita eikä sulje niitä pois, esimerkiksi glykosylaatio, asetylaatio, fosforylaatio ja vastaavat modifikaatiot. Määritelmä sisältää esimerkiksi polypeptidit, 15 jotka sisältävät yhden tai useamman aminohappoanalogin (mukaan lukien esimerkiksi luonnossa esiintymättömät aminohapot jne.), polypeptidit, joiden sidokset on korvattu, samoin kuin muut alalla tunnetut modifikaatiot, sekä luonnollisina esiintyvät että ei-luonnollisina esiintyvät.
20 "Transformaatiolla" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä Y: ulkopuolisen polynukleotidin liittämistä isäntäsoluun, riip- .···. pumatta liittämiseen käytetystä menetelmästä, esimerkiksi ·,·. suora sisäänotto, transduktio, f-pariutus tai elektroporaa- ;Yt 25 tio. Ulkopuolinen polynukleotidi voidaan säilyttää ei-integ-• · · Y.’ roituvana vektorina, esimerkiksi plasmidina, tai se voidaan γ; vaihtoehtoisesti integroida isännän genomiin.
• * · 30 "Yksilöllä" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä sel-' Y kärankaisia, erityisesti nisäkkäisiin kuuluvia jäseniä, ja . ’·. termi käsittää niihin rajoittumatta eläimet (esim. koirat, Y kissat, nautakarjan, siat, vuohet, kanit, hiiret, rotat, Y marsut jne.) ja kädelliset, mukaan lukien apinat, simpanssit, : 35 paviaanit ja ihmiset.
Tässä yhteydessä käytettynä nukleiinihapon "templaattijuoste" ("sense strand") sisältää sekvenssin, joka on sekvenssihomo- 110099 loginen mRNA:n kanssa. "Kooditusjuoste" ("anti-sense strand") sisältää sekvenssin, joka on komplementaarinen "templaatti-juosteen" sekvenssin kanssa.
5 Tässä yhteydessä käytettynä viruksen "juosteeltaan positiivinen genomi" on genomi, joko RNA tai DNA, joka on yksijuostei-nen, ja koodittaa viruspolypeptidiä (-polypeptidejä). Esimerkkeihin juosteeltaan positiivisista RNA-viruksista lukeutuvat ryhmät Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picor-10 naviridae ja Caliciviridae. Mukaan luetaan myös ryhmä Fla-viviridae, joka aikaisemmin luokiteltiin ryhmään Togaviridae.
Katso Fields & Knipe (1986).
Ilmauksella "vasta-aineen sisältävä kehon osa" tarkoitetaan 15 tässä yhteydessä yksilön kehon osaa, joka on kiinnostuksen kohteena olevan vasta-aineen lähde. Alalla tunnetaan vasta-ainetta sisältäviä kehon osia ja niitä ovat niihin rajoittumatta esimerkiksi plasma, seerumi, selkäydinneste, imuneste, ihon ulkopuoliset osat, hengitys-, suolisto- ja sukupuoli- ja 20 virtsaelinkanavat, kyyneleet, sylki, maito, valkosolut ja myeloomat.
"Biologisella näytteellä" tarkoitetaan tässä yhteydessä käy- • · * tettynä yksilöstä eristettyä kudos- tai nestenäytettä, mukaan • 25 lukien niihin rajoittumatta esimerkiksi plasma, seerumi, sel-:käydinneste, imuneste, ihon ulkopuoliset osat, hengitys-, suolisto- ja virtsa- ja sukupuolielinkanavat, kyyneleet, • · sylki, maito, verisolut, tuumorit, elimet ja myös näytteet in vitro soluviljelyaineosista (mukaan lukien niihin rajoittu-. . 30 matta solujen osittain käyttämä alusta, joka on tuloksena !..* solujen kasvusta soluviljelyalustassa, oletettavasti virusin- fektoidut solut, yhdistelmäsolut ja solukomponentit).
• t * II. Keksinnön kuvailu : !·. 35
Keksinnön mukaisessa käytännössä käytetään, ellei toisin ole ’···’ ilmoitettu, molekyylibiologian, mikrobiologian, yhdistelmä- DNA -tekniikan ja immunologian tavanomaisia menetelmiä, jotka ! 21 110099 ovat alan tietämyksen mukaisia. Sellaisia menetelmiä tuodaan esille kokonaisuudessaan kirjallisuudessa. Lähemmin, esimerkiksi Maniatis, Fitsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 81982); "DNA Cloning, volyymit I ja II (D.N.
5 Glover edit. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait edit. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins edit. 1984); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins edit. 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney edit. 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL 10 Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984); Sarja "Methods in Enzymology" (Academic Press Inc.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.H. Miller ja M.P. Calos edit. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth. Enzymol. Vol. 154 ja 155 (Wu ja Grossman, ja vastaavas-15 ti Wu, edit.), Mayer ja Walker, edit. (1987), "Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology" (Academic Press, London) ; Scopes, (1987) "Protein Purification: Principles and
Practice", toinen painos (Springer-Verlag, N.Y.); ja "Handbook of Experimental Immunology", volymit I-IV (D.M. Weir ja 20 C.C. Blackwell edit. 1986). Kaikki tässä yhteydessä mainitut patentit, patenttihakemukset ja julkaisut, sekä edellä että . . jäljempänä, ovat tässä sisällytettyinä viitteinä.
25 II.A. Typistettyjä HCV-polypeptideiä • V Tämän keksinnön mukaiset menetelmät tehdään mahdollisiksi : : ; identifioimalla jäljempänä uusia HCV-epitooppeja. Tietämys näistä epitoopeista (tai antigeenisistä alueista) \ j 30 mahdollistaa typistettyjä HCV-sekvenssejä sisältävien poly-.*··. peptidien konstruoinnin, joita voidaan käyttää immunologisina ’·’ reagensseina.
* · » Vähintään yhden virusepitoopin koodin sisältävät typistetyt : 35 HCV-aminohapposekvenssit ovat käyttökelpoisia immunologisina . ··, reagensseina. Esimerkiksi, polypeptidejä, jotka sisältävät sellaisia typistettyjä sekvenssejä, voidaan käyttää reagensseina immunomäärityksessä. Nämä peptidit ovat myös ehdolla 110099 22 olevia antigeenialayksikköjä koostumuksissa antiseerumituotantoon tai rokotteisiin. Vaikka näitä typistettyjä sekvenssejä voidaan tuottaa natiivin virusproteiinin erilaisten tunnettujen käsittelyjen avulla, on yleensä edullista valmistaa 5 HCV-sekvenssin sisältäviä synteettisiä peptidejä tai yhdis-telmäpolypeptidejä. Näitä typistettyjä HCV-sekvenssejä sisältäviä polypeptidejä voidaan valmistaa kokonaan HCV-sekvens-seistä (yksi tai useampi epitooppi, joko vierekkäinen tai ei-vierekkäinen) tai HCV-sekvensseistä ja heterologisista sek-10 vensseistä fuusioproteiinissa. Käyttökelpoisia heterologisia sekvenssejä ovat sekvenssit, jotka saavat aikaan erittymisen yhdistelmäisännästä, tehostavat HCV-epitoopin (-epitooppien) immunologista reaktiivisuutta tai helpottavat polypeptidin kytkemistä imunomäärityskantajaan tai rokotekantajaan. Lähem-15 min esim., EPO-julkaisu 116 201; US-patentti 4 722 840; EPO-julkaisu 259 149; US-patentti 4 629 783, jotka julkaisut ovat tässä sisällytettyinä viitteenä.
Typistettyjä HCV-sekvenssejä sisältävien peptidien koko voi 20 vaihdella laajasti, minimikoon ollessa HCV-epitoopin aikaansaamiseksi riittävän kokoinen sekvenssi, kun taas maksimikoko Y: ei ole ratkaiseva. Maksimikoko ei mukavuussyistä tavallisesti • · ole olennaisesti suurempi kuin mikä tarvitaan aikaansaamaan * » · ·.·. halutut HCV-epitoopit ja heterologisen sekvenssin toiminto • · · • 25 (toiminnot), jos mahdollista. Typistetyn HCV-aminohapposek- • · · !!Y venssin koko vaihtelee tyypillisesti alueella noin 5 (tai 8) - noin 100 aminohappoa pituutta. Tyypillisemmin kuitenkin • « » ’·* ’ HCV-sekvenssi on pituudeltaan enintään 50 (tai 40) aminohap poa, ja joskus enintään noin 20, 25 tai 30 aminohappoa. On Y*: 30 tavallisesti edullista valita HCV-sekvenssit sisältämään vä- hintään noin 8, 10, 12 tai 15 aminohappoa.
* * · « · *
Esimerkkejä typistetyistä, käyttökelpoisista tässä kuvail- » · luista HCV-aminohapposekvensseistä (oktameereistä) esitetään i 35 jäljempänä esimerkeissä. Tulisi ymmärtää, että nämä peptidit Y,! eivät välttämättä kartoita täsmällisesti yhtä epitooppia.
Sekvenssin ei-immunogeeniset osat voidaan määritellä käyttäen tavanomaisia menetelmiä ja poistaa kuvailluista sekvensseis- 110099 23 tä. Sen lisäksi voidaan identifioida muita typistettyjä HCV-aminohapposekvenssejä, jotka sisältävät epitoopin tai ovat immunogeenisiä kuten tässä on kuvailtu.
5 Polypeptidituotteita, jotka sisältävät jäljempänä esitettäviä typistettyjä HCV-aminohapposekvenssejä, voidaan valmistaa erillisinä peptideinä tai liitettyinä suurempaan polypepti-diin, ja niille voi olla käyttöä kuten tässä on kuvailtu. Edullisissa käyttösovellutuksissa typistetyillä sekvensseillä 10 El- ja/tai E2-domeeneista on käyttöä rokotteissa ja terapeuttisissa tuotteissa. Vaikka yleisesti ottaen kaikilla domee-neilla on jonkin verran diagnostista käyttöä, C, NS3, NS4 ja NS5 ovat erityisen edullisia, C-epitooppien yhdistelmien epitooppien kanssa yhdestä tai useammasta NS3-, NS4- tai NS5-15 domeenista ollessa erityisen edullisia.
II.B. Polypeptidien valmistaminen HCV-aminohapposekvenssejä koodittavien DNA-sekvenssien saata-20 vuus mahdollistaa ekspressiovektoreiden konstruoinnin, jotka koodittavat polypeptidin antigeenisesti aktiivisia alueita Y; (lähemmin esim. kuvio 2) . Näitä antigeenisesti aktiivisia alueita voidaan saada kuoren tai vaipan antigeeneistä tai * I ft ·.·, ydinantigeeneistä tai antigeeneistä, jotka eivät ole raken- • · · 25 teellisiä, esimerkiksi polynukleotidin sitoutumisproteiinit, * « * polynukleotidipolymeraasi (t) ja muut virusproteiinit, joita tarvitaan replikaatioon ja/tai viruspartikkein kokoamiseen.
• · · ’·* Haluttuja peptidejä koodittavat fragmentit saadaan esimerkik si virus-cDNA -klooneista käyttäen tavanomaista restriktio-Y'! 30 pilkontaa tai synteettisillä menetelmillä, ja ligoidaan vek-\,,J toreihin, jotka voivat esimerkiksi sisältää osia fuusiosek- , ]·, vensseistä, kuten esimerkiksi beeta-galaktosidaasi tai supe- » · roksididismutaasi (SOD), edullisesti SOD. Menetelmiä ja vek- i » toreita, jotka ovat käyttökelpoisia polypeptidien tuotantoon, t » ;,· i 35 jotka sisältävät SOD-fuusiosekvenssejä, kuvaillaan EP-jul-Υ,ί kaisussa 0196056, julkaistu 1. lokakuuta, 1986. Jaksoissa IV.B.l, IV.B.2 ja vastaavasti IV.B.4 kuvaillaan vektoreita, jotka koodittavat SOD- ja HCV-polypeptidien fuusiopolypepti- 110099 24 dejä, so., NANB5-i-i, NANB8i ja C100-3, joka on kooditettuna HCV-cDNA -yhdistelmässä. Mitä tahansa HCV cDNA:n osaa, joka sisältää avoimen lukukehyksen (tai sen synteettisen version), voidaan käyttää yhdistelmäpolypeptidin kuten valmiin proteii-5 nin tai fuusioproteiinin ilmentämiseksi.
HCV-epitooppeja sisältävä polypeptidi voidaan vaihtoehtoisesti saada aikaan kemiallisen synteesin avulla käyttäen va-kiomenetelmiä, jotka perustuvat kuvioiden ja esimerkkien 10 mukaiseen aminohapposekvenssiin.
Haluttua polypeptidiä koodittava DNA, joko fuusiomuodossa tai fuusioitumattomana, ja joko sisältäen tai ei sisältäen erityksen mahdollistavan signaalisekvenssin, voidaan liittää 15 ekspressiovektoreihin, jotka sopivat mille tahansa sopivalle isännälle. Tällä hetkellä käytetään sekä eukaryoottisia että prokaryoottisia isäntäsysteemejä yhdistelmäpolypeptidien muodostamiseen ja isäntäsolulinjoja esitetään EPO-julkaisussa 318 216. Polypeptidi eristetään sen jälkeen solulysaatista 20 tai kasvualustasta ja puhdistetaan aiottua käyttöä varten tarvittavassa määrin. Puhdistus voidaan suorittaa alalla . . tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi differentiaaliuutolla, suolafraktioinnilla, kromatografoimalla ioninvaihtohartseil-la, af f initeettikromatograf iällä, sentrifugoimalla ja vastaa-25 villa menetelmillä. Lähemmin esimerkiksi, Methods in Enzymo- i.i : logy, erilaisia menetelmiä proteiinien puhdistamiseksi. Sel- • .·' laisia peptidejä voidaan käyttää diagnostisina aineina, tai : : : ne, jotka synnyttävät neutraloivia vasta-aineita, voidaan formuloida rokotteiksi. Näitä peptidejä vastaan tehtyjä ;*.(j 30 vasta-aineita voidaan myös käyttää diagnostisina aineina tai « 4 .··. passiiviseen immunoterapiaan. Kuten jäljempänä on kuvailtu, vasta-aineet näitä polypeptidejä vastaan ovat lisäksi käyttö- • · · *·:·* kelpoisia esimerkiksi eristettäessä ja identifioitaessa HCV- partikkeleita.
i 35 .···. HCV-polypeptidit voidaan eristää myös HCV-virioneista ja typistää (jos eivät jo ole). Virioneja voidaan kasvattaa 110099 25 HCV:llä infektoiduissa soluissa kudosviljelmässä tai infektoituneessa isännässä.
II.C. Antigeenisten polypeptidien valmistaminen ja 5 konjugointi kantajaan
Peptidin antigeeninen alue on yleensä verrattain pieni-- tavallisesti pituudeltaan 8-10 aminohappoa tai vähemmän. Niinkin vähän kuin 5 aminohappoa sisältävät fragmentit voivat 10 karakterisoida antigeenisen alueen. Nämä osat voivat vastata HCV-antigeenin alueita. Sen mukaisesti, käytettäessä HCV:n cDNA:ta pohjana, HCV-polypeptidien lyhyitä osia koodittavat DNA:t voidaan ilmentää yhdistelmämuodossa joko fuusioprote-iineina tai eristettyinä polypeptideinä. Lyhyitä aminohappo-15 sekvenssejä voidaan lisäksi saada kemiallisen synteesin avulla. Tapauksissa, joissa syntetisoitu peptidi on oikeassa konfiguraatiossa niin, että saadaan aikaan oikea epitooppi mutta on liian pieni ollakseen immunogeeninen, peptidi voidaan kiinnittää sopivaan kantajaan.
20
Muutamia menetelmiä sellaisen liitoksen aikaansaamiseksi tun- .. netaan alalla, mukaanlukien disulfidisidosten muodostaminen • » käyttäen N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyylitio) propionaattia '···’ (SPDP) ja sukkinimidyyli-4-(N-maleimido-metyyli) sykloheksaa- *·'·' 25 ni-l-karboksylaattia (SMCC) saatuina Pierce Companyltä, Rock-: ford, Illinois, (jos peptidistä puuttuu sulfydryyliryhmä, tä- ; 't: mä voidaan saada aikaan lisäämällä kysteiinitähde). Nämä rea- : : : genssit muodostavat disulfidisidoksen niiden ja toisen prote iinin peptidikysteiinitähteiden välille ja amidisidoksen ly-30 siinissä olevan epsilon-aminon välityksellä, tai muun vapaan « · .·*·. aminoryhmän välille toisessa proteiinissa. Useita sellaisia disulfidi/amidin muodostavia aineita tunnetaan. Lähemmin esim. Immun. Rev. (1982) 62:185. Toiset bifunktionaaliset kytkentäaineet muodostavat tioeetterisidoksen ennemmin kuin : .·. 35 disulfidisidoksen. Monet näistä tioeetterin muodostavista « · * » .·>·. aineista ovat kaupallisesti saatavissa ja sisältävät 6-malei- midokapronihapon, 2-bromietikkahapon, 2-jodietikkahapon, 4-N-maleimido-metyyli)sykloheksaani-l-karboksyylihapon ja vastaa- 26 110099 vien happojen reaktiivisia estereitä. Karboksyyliryhmät voidaan aktivoida yhdistämällä ne sukkinimidin tai 1-hydrok-syyli-2-nitro-4-sulfonihapon natriumsuolan kanssa. Muissa menetelmissä antigeenien kytkemiseksi käytetään rotavi-5 rus/"sitoutumispeptidi"-systeemiä, jota kuvaillaan EPO-jul kaisussa 259 149, joka julkaisu on sisällytetty tässä yhteydessä viitteenä. Edellä olevan luettelon ei ole tarkoitettu olevan kattava ja mainittujen yhdisteiden modifikaatioita voidaan selkeästi käyttää.
10
Mitä tahansa kantajaa voidaan käyttää, joka ei itse aiheuta isännälle haitallisten vasta-aineiden tuotantoa. Sopivat kantajat ovat tavallisesti suuria, hitaasti metaboloituvia makromolekyylejä kuten proteiineja; polysakkarideja, kuten 15 lateksifunktionalisoitu SepharoseR, agaroosi, selluloosa, selluloosahelmet ja vastaavat; polymeerisiä aminohappoja kuten polyglutamiinihappo, polylysiini ja vastaavat; amino-happokopolymeerejä ja inaktiivisia viruspartikkeleita (lähemmin esimerkiksi Jakso II.D.). Erityisen käyttökelpoisia pro-20 teiinisubstraatteja ovat seerumin albumiinit, maljakotilon hemosyaniini, immunoglobuliinimolekyylit, tyroglobuliini, . . munanvalkuainen, tetanustoksoidi ja muut alaa tuntevien hyvin tuntemat proteiinit.
*·'·’ 25 II.D. HCV-epitooppeja sisältävien hybridipartikkeli-immuno :.: : geenien valmistaminen : HCV-epitooppien immunogeenisuutta voidaan myös tehostaa val mistamalla ne nisäkäs- tai hiivasysteemeissä yhdistettynä tai ;\j 30 kokoonpantuna partikkelin muodostavan proteiinin kanssa, ku- • · ten esimerkiksi sellaisen, joka liittyy hepatiitti B -pinta-antigeeniin. Lähemmin esim. US-patentti 4 722 840. Rakenteet, *·:·' joissa HCV-epitooppi on kytketty suoraan partikkelin muodos- *...· tavaan proteiiniin, kooditussekvenssit tuottavat hybridejä, | 35 jotka ovat immunogeenisiä HCV-epitoopin suhteen. Kaikki val- .···. mistetut vektorit sisältävät lisäksi HBV:lle spesifisiä epi- tooppeja, joiden immunogeenisuusaste vaihtelee, kuten esimerkiksi pre-S -peptidi. Partikkelin muodostavasta proteiinista 110099 27 konstruoidut partikkelit, jotka sisältävät HCV-sekvenssejä, ovat siten immunogeenisiä HCV:n ja HBV:n suhteen.
Hepatiittipinta-antigeenin (HBSAg) on osoitettu muodostuvan 5 ja tiivistyvän partikkeleiksi S. cerevisiaessa (P. Valenzuela et ai. (1982)) samoin kuin esimerkiksi nisäkässoluissa (P.
Valenzuela et ai. (1984). Sellaisten partikkeleiden muodostumisen on osoitettu tehostavan monomeerialayksikön immunogee-nisuutta. Rakenteet voivat sisältää myös immunodominoivan 10 HBSAg:n epitoopin, joka sisältää esipinta (pre-S) -alueen 55 aminohappoa. Neurath et ai. (1984). Hiivassa ilmentyviä pre- S-HBSAg -partikkelirakenteita kuvaillaan EPO-julkaisussa 174 444, julkaistu 19. maaliskuuta, 1986; hybridejä, jotka sisältävät heterologisia virussekvenssejä hiivaekspressiota var-15 ten, kuvaillaan EPO-julkaisussa 175 261, julkaistu 26. maaliskuuta, 1966. Nämä rakenteet voidaan ilmentää myös nisäkässoluissa kuten kiinanhamsterin munasarjan (CHO) -soluissa käyttäen SV40-dihydrofolaattireduktaasivektoria (Michelle et ai. (1984)).
20
Osia partikkelin muodostavan proteiinin kooditussekvensseistä • · ,V voidaan lisäksi korvata HCV-epitooppia koodittavilla kodo- • « » neilla. Tässä korvauksessa alueet, joita ei tarvita välittä-.V: mään yksikköjen kasautumista immunogeenisten partikkeleiden j 25 muodostamiseksi hiivassa tai nisäkkäässä, voidaan poistaa eliminoiden siten antigeenisten HBV-lisäpaikkojen kilpailu HCV-epitoopin kanssa.
. . Rokotteet '· 30 • ♦ · ···’ Rokotteita voidaan valmistaa yhdestä tai useammasta HCV-pe- : räisestä immunogeenisestä polypeptidistä. Nämä polypeptidit voidaan ilmentää erilaisissa isäntäsoluissa (esim., bakteeri-, hiiva-, hyönteis- tai nisäkässoluissa) tai ne voidaan • * « ··· : 35 vaihtoehtoisesti eristää virusvalmisteista tai valmistaa syn- "···* teettisesti. Yksi- tai moniarvoiset rokotteet HCV:tä vastaan voivat sisältää yhden tai useamman epitoopin yhdestä tai useammasta rakenneproteiinista, ja/tai yhden tai useamman 110099 28 epitoopin yhdestä tai useammasta ei-rakenneproteiinista. Nämä rokotteet voivat sisältää esimerkiksi yhdistelmä-HCV -polypeptide jä ja/tai polypeptidejä, jotka on eristetty virioneis-ta. Rokotteiden katsotaan erityisesti sisältävän yhden tai 5 useamman seuraavista HCV-proteiineista tai niistä saaduista alayksikköantigeeneistä: El, E2, C, NS2, NS3, NS4 ja NS5.
Erityisen edullisia ovat rokotteet, jotka sisältävät El: n ja/tai E2:n tai niiden alayksikköjä.
10 Edellä olevien lisäksi on mahdollista valmistaa myös eläviä rokotteita heikennetyistä mikro-organismeista, jotka ilmentävät yhtä tai useampaa yhdistelmä-HCV -polypeptidiä. Alalla tunnetaan sopivia heikennettyjä mikro-organismeja ja niitä ovat esimerkiksi virukset (esim., lehmärokkovirus (Brown et 15 ai. (1986)) samoin kuin bakteerit.
Immunogeenisen peptidin (peptidejä) aktiivisena aineosana sisältävien rokotteiden valmistaminen on alaa tuntevien tiedossa. Sellaiset rokotteet valmistetaan tyypillisesti 20 ruiskeina, joko nestemäisinä liuoksina tai suspensioina; kiinteitä muotoja, jotka ovat sopivia liuoksena tai suspen-. . siona nesteessä ennen ruiskutusta, voidaan myös valmistaa.
Valmiste voidaan myös emulgoida tai proteiini voidaan kapse-loida liposomeihin. Aktiiviset aineosat sekoitetaan usein .·.· 25 täyteaineiden kanssa, jotka ovat farmaseuttisesti hyväksyttä-;.· · viä ja yhteensopivia aktiivisen aineosan kanssa. Sopivia • ' täyteaineita ovat esimerkiksi vesi, saliini, dekstroosi, glyseroli, etanoli tai vastaava ja niiden yhdistelmät. Rokote voi haluttaessa sisältää lisäksi vähäisiä määriä lisäaineita .·. : 30 kuten kostutusaineita tai emulgoivia aineita, pH-puskuriai-,···, neita ja/tai adjuvansseja, jotka tehostavat rokotteen tehoa.
Esimerkkejä adjuvansseista, jotka voivat olla tehokkaita, ovat niihin rajoittumatta: alumiinihydroksidi, N-asetyyli- muramyli-L-treonyyli-D-isoglutamiini (thr-MDP) , N-asetyyli-: .·. 35 nor-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiini (CGP 11637, nimitet-
• * I
·-·, tynä nor-MDP) , N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isogluta- minyyli-L-alaniini-2-(1',21-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hyd-roksifosforyylioksi)-etyyliamiini (CGP 19835A, nimitettynä 110099 29 MTP-PE) ja RIBI, joka sisältää kolme bakteereista uutettua komponenttia, monofosforyylilipidi A:n, trehaloosidimykolaa-tin ja soluseinärungon (MPL+TDM+CWS) 2 %:isessa skvalee-ni/Tween 80 -emulsiossa. Adjuvanssin tehokkuus voidaan mää-5 rittää mittaamalla vasta-aineiden määrä, jotka on kohdistettu immunogeenistä polypeptidiä vastaan, joka sisältää HCV:n antigeenisen sekvenssin, joka määrä on tuloksena tämän peptidin antamisesta rokotteissa, jotka sisältävät myös erilaisia ad-juvansseja.
10
Rokotteet annetaan tavanomaisesti parenteraalisesti ruiskeena, esimerkiksi joko subkutaanisesti tai intramuskulaarises-ti. Muita formulaatioita, jotka ovat sopivia muiksi antotavoiksi, ovat peräpuikot ja joissakin tapauksissa oraaliset 15 formulaatiot. Peräpuikkoihin voi sisältyä tavanomaisia sideaineita ja kantajia, esimerkiksi polyalkyleeniglykoleja tai triglyseridejä; sellaiset peräpuikot voidaan muodostaa seoksista, jotka sisältävät aktiivisen aineosan pitoisuusalueella 0/5 % - 10 %, edullisesti 1 % - 2 %. Oraaliset koostumukset 20 sisältävät sellaisia tavallisesti käytettyjä täyteaineita kuin esimerkiksi farmaseuttista laatua olevat mannitoli, lak-.. toosi, tärkkelys, magnesiumstearaatti, natriumsakkariini, selluloosa, magnesiumkarbonaatti ja vastaavat. Nämä koostu-'···’ mukset saavat muodon liuoksina, suspensioina, tabletteina, 25 pillereinä, kapseleina, pidättävästä päästävinä formulaatioi-!.: i na tai jauheina, ja sisältävät 10-95 % aktiivista aineosaa, • edullisesti 25 % - 70 %.
Proteiinit voidaan formuloida rokotteeksi neutraalina tai .'. : 30 suolamuodossa. Farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ovat .···. happoadditiosuolat (muodostettu peptidin vapaiden aminoryhmi- en avulla) ja ne on muodostettu epäorgaanisten happojen, ku-ten esimerkiksi kloorivety- ja fosforihappojen kanssa, tai orgaanisten happojen, kuten etikka-, oksaali-, viini- maleii-: 35 nihappojen ja vastaavien happojen kanssa. Suoloja, jotka on ,···. muodostettu vapaiden karboksyyliryhmien kanssa, voidaan saada myös epäorgaanisista emäksistä, kuten esimerkiksi natrium-, kalium-, ammonium-, kalsium- tai ferrihydroksideista ja sei- 110099 30 laisista orgaanisista emäksistä kuin isopropyyliamiinista, trimetyyliamiinistä, 2-etyyliaminoetanolista, histidiinistä, prokaiinista ja vastaavista emäksistä.
5 II.F. Rokotteiden annostus ja anto
Rokotteet annetaan tavalla, joka sopii yhteen annostusformu-laation kanssa ja sellaisena määränä, joka on profylaktisesti ja/tai terapeuttisesti tehokas. Annettava määrä, joka on 10 yleensä alueella 5 pg - 250 pg antigeeniä/annos, riippuu hoidettavasta kohteesta, kohteen immuunijärjestelmän kyvystä syntetisoida vasta-aineita ja halutusta suoja-asteesta. Aktiivisen aineosan täsmälliset määrät, joita edellytetään annettavaksi, riippuvat lääkärin harkinnasta ja voivat olla 15 ominaisia kullekin kohteelle.
Rokote voidaan antaa yhden annoksen antosuunnitelman mukaisesti tai edullisesti moniannoksisesti. Moniannosanto on sellainen, jossa primäärirokotussuoritus voidaan tehdä 1-20 10:llä erillisellä annoksella, joita seuraavat muut annokset annettuina myöhempinä aikaväleinä, jotka tarvitaan immuuni-vasteen ylläpitoon ja vahvistamiseen, esimerkiksi 1-4 kuukau-: : den kohdalla toisen annoksen osalta ja tarvittaessa seuraava annos (annokset) usean kuukauden kuluttua. Annostusohje mää-| 25 räytyy ainakin osaksi yksilön tarpeen mukaan ja se on riippu- vainen hoitavan lääkärin harkinnasta.
Immunogeenisen HCV-antigeenin (antigeenejä) sisältävä rokote . . voidaan antaa lisäksi yhdessä muiden immunologisesti säätele- 30 vien aineiden kuten esimerkiksi immunoglobuliinien kanssa.
II.G. Vasta-aineiden valmistaminen HCV-epitooppeja vastaan ' 35 Tässä kuvailtuja immunogeenisiä polypeptidejä käytetään vas- ta-aineiden, mukaan lukien polyklonaaliset ja monoklonaaliset vasta-aineet, tuottamiseen. Jos halutaan polyklonaalisia vasta-aineita, valikoitu nisäkäs (esim., hiiri, kani, vuohi, he- 110099 31 vonen yms.) immunisoidaan HCV-epitoopin (epitooppeja) sisältävän immunogeenisen polypeptidin kanssa. Immunisoidun eläimen seerumi kerätään talteen ja käsitellään tunnetuilla menetelmillä. Jos seerumi, joka sisältää polyklonaalisia vasta-5 aineita HCV-epitoopille, sisältää vasta-aineita muille antigeeneille, polyklonaaliset vasta-aineet voidaan puhdistaa immunoaffiniteettikromatografiän avulla. Alalla tunnetaan tekniikat polyklonaalisten antiseerumien tuottamiseen ja prosessointiin, lähemmin esimerkiksi Mayer ja Walker (1987).
10 Polyklonaalisia vasta-aineita voidaan vaihtoehtoisesti eristää nisäkkäästä, joka on aikaisemmin infektoitunut HCV-.llä.
HCV-epitooppeja vastaan kohdistettuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan myös helposti tuottaa alaa tuntevan henkilön 15 toimesta. Yleinen teknologia monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi hybridoomien avulla on hyvin tunnettua. Jatkuvasti lisääntyviä, vasta-aineita tuottavia solulinjoja voidaan saada aikaan solufuusion kautta ja myös muilla menetelmillä, kuten esimerkiksi B-lymfosyyttien suoralla trans-20 formoinnilla onkogeenisella DNA:11a tai transfektoinnilla Epstein-Barr -viruksen avulla. Lähemmin, esimerkiksi M.
. . Schreier et ai. (1980); Hammerling et ai. (1981); Kennett et ai. (1980); myös US-patentit 4 341 761; 4 399 121; 4 427 783; ·...* 4 444 887; 4 466 917; 4 472 500; 4 491 632 ja 4 493 890. HCV- 25 epitooppeja vastaan tuotettujen monoklonaalisten vasta-ainei- : den paneeleista voidaan seuloa erilaisia ominaisuuksia; so., • isotooppi, epitooppiaffiinisuus jne.
Vasta-aineet, sekä monoklonaaliset että polyklonaaliset, jot-.·. : 30 ka on kohdistettu HCV-epitooppeja vastaan, ovat erityisen .···, käyttökelpoisia diagnoosissa ja neutraloivat vasta-aineet ovat käyttökelpoisia passiivisessa immunoterapiassa. Erityi- t · · sesti monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää aikaan-saamaan anti-idiotyyppisiä vasta-aineita.
: 35 .···. Anti-idiotyyppiset vasta-aineet ovat immunoglobuliineja, jot ka sisältävät infektiivisen agenssin antigeenin "sisäisen kuvan", jota vastaan suojaa halutaan. Lähemmin esimerkiksi 110099 32
Nisonoff, A., et ai., (1981) ja Dreesman et ai. , (1985).
Alalla tunnetaan menetelmät anti-idiotyyppisten vasta-aineiden tekemiseksi. Lähemmin esimerkiksi Grzych (1985), MacNama-ra et ai. (1984) ja Vytdehaag et ai. (1985). Nämä anti-idio-5 tyyppiset vasta-aineet voivat olla käyttökelpoisia myös NANBHm hoitamiseen, rokottamiseen ja/tai diagnoosiin samoin kuin HCV-antigeenien immunogeenisten alueiden selvittämiseen.
II .H.
10 III. Yleiset menetelmät
Yleiset menetelmät tämän keksinnön mukaiseen käytäntöön voidaan löytää esimerkiksi tässä siteeratuista viitejulkaisuis-15 ta, erityisesti EPO-julkaisuista 318 216 ja 388 232, sekä kirjallisuusluettelon viitejulkaisuista, jotka on tässä sisällytetty viitteinä.
IV. Esimerkit 20 Jäljempänä on kuvailtu tämän keksinnön mukaiset esimerkit, jotka esitetään valaiseviin tarkoituksiin eivätkä ne rajoita : tämän keksinnön piiriä. Tämän selityksen valossa lukuista .V: suoritusmuodot patenttivaatimuksien puitteissa selviävät alaa \ 25 tavallisetsi tunteville henkilöille.
IV.A. HCV-genomin epitooppikartoitus . . Seuraava esimerkki on tulosta epitooppikartoituskokeesta, / 30 joka on suoritettu HCVl-polyproteiinisekvenssillä, joka on • esitetty kuviossa 1. Kuten kuvioissa 3-11 on esitetty, HCV- : isolaattien joukossa esiintyy heterogeenisuuksia, mikä osoit- taa, että nämä aminohapposubstituutiot voidaan tehdä oktamee-, ·, reissä kuvattuna jäljempänä. Substituutioiden lisäksi amino-
I » I
35 hapoilla vastaavasta paikasta muissa HCV-isolaateissa, subs-tituutiot tiettyjen aminohappojen synteettisillä analogeilla tai konservatiiviset, varaukseen perustuvat yms. substituuti 110099 33 ot (erityisesti, kun substituutio ei tuhoa vasta-aineen sitoutumista) kuuluvat keksinnön piiriin.
IV.A.1. Peittävien peptidien synteesi 5
Polyetyleenikärjet, järjestettyinä kasettiin 8x12 järjestyksessä (Coselco Mimetopes, Victoria, Australia) preparoidaan sijoittamalla kärjet hauteeseen (20 % tilavuus/tilavuus pi-peridiini dimetyyliformamidissa (DMF)) 30 min. ajaksi huo- 10 neenlämpötilassa. Kärjet poistettiin, pestiin DMF:ssä 5 minuutin ajan, pestiin sen jälkeen metanolissa neljä kertaa (2 min/pesu). Kärkien annettiin ilmakuivua vähintään 10 minuutin ajan ja pestiin sen jälkeen viimeisen kerran DMF:ssä (5 min.). 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBt, 367 mg) liuotettiin 15 DMFrään (80 μΐ) käytettäväksi Fmoc-suojattujen aminohappojen kytkentään:
Fmoc-L-Ala-OPfp, Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp, Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OPfp, Fmoc-L-Glu(O-tBu)-OPfp, Fmoc-L-Phe-OPfp, Fmoc-Gly-OPfp, Fmoc-L-His(Boc)-OPfp, Fmoc-L-Ile-OPfp, Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp, 20 Fmoc-L-Leu-OPfp, Fmoc-L-Met-OPfp, Fmoc-L-Asn-OPfp, Fmoc-L-Pro-OPfp, Fmoc-L-Gln-OPfp, FMoc-L-Arg(Mtr)-OPfp, Fmoc-L-.. Ser(t-Bu)-ODhbt, Fmoc-L-Thr(t-Bu)-ODhbt, Fmoc-L-Val-OPfp ja
Fmoc-L-Tyr-OPfp.
’·'·* 25 Suojatut aminohapot sijoitettiin mikrotitrauslevyn kaivoihin i.i : HOBt:n kanssa ja kärkikasetti asetettiin levyn päälle, upot- i V taen kärjet kaivoihin. Kokoonpano suljettiin sitten muovipus- : : siin ja sen annettin reagoida 25°C:ssa 18 tunnin ajan ensim mäisten aminohappojen liittämiseksi kärkiin. Kasetti poistet-30 tiin sitten ja kärjet pestiin DMFrllä (2 min.), MeOH:lla (4 x .*··. 2 min.) ja jälleen DMF:llä (2 min.) sitoutuneiden aminohap pojen puhdistamiseksi ja suojauksen poistamiseksi. Menettely toistettiin kunkin lisäksi kytketyn aminohapon osalta kunnes kaikki oktameerit oli valmistettu.
: 35 * I » · .···. Vapaat N-päät asetyloitiin sen jälkeen vapaalla amidilla kom- I I · pensoimiseksi, koska useimmat epitoopeista eivät sijaitse N-päässä eikä se siten sisältäisi siihen liittyvää positiivista i 34 110099 varausta. Asetylointi suoritettiin täyttämällä mikrotitraus-levyn kaivot liuoksella DMF/asetanhydridi/trietyyliamiini (5:2:1 tilavuus/tilavuus/tilavuus) ja antamalla kärkien reagoida kaivoissa 90 minuuttia 20°C:ssa. Kärjet pestiin sen 5 jälkeen DMF:llä (2 min.) ja MeOH:lla (4x, 2 min.) ja ilma-kuivattiin vähintään 10 minuuttia.
Sivuketjujen suojaryhmät poistettiin käsittelemällä kärkiä trifluorietikkahappo/fenoli/ditioetaanilla (95:2,5:2,5, ti-10 lavuus/tilavuus/tilavuus) polypropyleenipusseissa 4 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kärjet pestiin sitten dikloorime-taanissa (2x2 min.), 5 %:isessa di-isopropyylietyyliamii-ni/dikloorimetaanissa (2x5 min.), dikloorimetaanissa ja ilmakuivattiin vähintään 10 minuutin ajan. Kärjet pestiin 15 sitten vedessä (2 min.), MeOH:ssa (18 tuntia), kuivattiin alipaineessa ja säilytettiin tiiviisti suljetuissa muovipusseissa silikageelin päällä.
IV.A.2 Peptidimääritykset 20
Edellä kuvaillulla tavalla valmistetut oktameerin omaavat . . kärjet käsiteltiin ensin sonikoimalla 3 0 minuuttia hajotus- puskurissa (1 % natriumdodekyylisulfaattia, 0,1 % 2-merkap-···' toetanolia, 0,1 M NaH2P04:ää) 60°C:ssa. Kärjet kastettiin sen 25 jälkeen useita kertoja veteen (60°C) , jota seurasi keittämi-: nen MeOH:ssa (2 min.), ja annettiin ilmakuivua. Kärkiä esi- • '/· päällystettiin sitten 1 tunnin ajan 25°C:ssa mikrotitraus- :T: kaivoissa sekoituksessa, jotka sisältävät 200 μΐ sulkupusku- ria (1 % munanvalkuaista, 1 % BSA:ta, 0,1 % Tweeniä ja 0,05 % . \ : 30 NaN3:a PBS:ssä) . Kärjet upotettiin sitten mikrotitraus-,···, kaivoihin, jotka sisältävät 175 μΐ antiseerumeita, jotka on saatu ihmispotilaista, joista oli diagnosoitu HCV, ja annet-tiin inkuboitua 4°C:ssa yli yön. Kärjet määritettiin vas-taseerumeita vastaan kolmesta yksittäisestä henkilöstä. Näyte : 35 #PAA 3663-s ("A) reagoi voimakkaasti HCV:n western-blottei- ,·*. hin, HCV:n kompetitiiviseen ELISA:aan, HCV-ELISA:aan klooniin C100-3 (1:1000 laimennuksessa) ja RIBA-vasteisiin >4+ C100:aan, 5-l-l:een ja C33c:hen (C22 ei tehty). (Antigee- I 110099 35 ni/klooninimet ovat EPO-julkaisun 318 216 ja 388 232 mukaiset kuten ne, joita on kuvailtu kirjallisuudessa koskien HCV-immunomäärityksiä, jotka on saatavissa Ortho Diagnostics Systems Inc.'lta). Raakaa plasmaa laimennettiin 1:500 esto-5 puskuriin. Näyte #PAA 33028 ("B") reagoi voimakkaasti HCV:n I western-blotteihin, HCV:n kompetitiiviseen ELISA:aan, HCV- ELISA:aan klooniin C100-3 /1:500 laimennuksessa) ja RIBA- vasteisiin >4 + C100:aan, C33C:hen ja C22:een. Polyklonaaliset vastaseerumit puhdistettiin osittain ajamalla proteiini A -10 kolonnin läpi ja käytettiin laimennuksessa 1:200 estopusku-rissa. Näyte #PAA S32931 ("C") reagoi kohtalaisesti HCV:n western-blotteihin (3+), HCV:n kompetitiiviseen ELISA:aan, HCV-ELISA:aan klooniin C100-3 (1:64 laimennuksessa) ja RIBA- vasteisiin 3+ ja 4+, C100:aan ja vastaavasti 5-l-l:een (C33c 15 ja C22 ei tehty). Polyklonaaliset vastaseerumit puhdistettiin osittain ajamalla proteiini A -kolonnin läpi ja käytettiin laimennuksessa 1:500 estopuskurissa.
Kärjet pestiin PBS/TweenR 20:ssä (4 x 10 min.) huoneen lämpö- 20 tilassa, inkuboitiin sen jälkeen mikrotitrauskaivoissa, jotka sisälsivät piparjuuriperoksidaasilla leimattuja vuohen anti- .·.* ihminen Ig -vastaseerumeita (175 μΐ, 1:2000 laimennus esto- • * · ·,,,! puskurissa ilman NaN3:a) 1 tunnin ajan 25°C:ssa sekoittaen.
•V: Anti-ihminen vastaseerumi on spesifinen ihmisen Ig:n kevyt- • 25 ja raskasketjuille ja reagoi sekä IgG- että IgM-ryhmien kanssa. Kärjet pestiin jälleen PBS/TweenR 20:ssä (4 x 10 * min.) huoneen lämpötilassa. Substraattiliuos valmistettiin « · · liuottamalla NaH2P04:ää (1 M, 200 ml) ja sitruunahappoa (1 M, . . 160 ml) 2 l:aan tislattua vettä säätäen pH arvoon 4,0. Atsi- I * · ),,· 30 no-di-3-etyylibentstiatsodiinisulfonaattia (ABTS, 50 mg) ja *;·' vetyperoksidia (0,3 μΐ/ml) lisättiin 100 ml:aan puskuria vä- : :’: littömästi ennen käyttöä substraattiliuoksen täydentämiseksi.
Substraattiliuosta (150 μΐ) lisättiin kuhunkin mikrotitraus- , levyn kaivoon ja kärjet kastettiin kaivoihin ja inkuboitiin • « · *;;/ 35 25°C:ssa pimeässä. Värin kehittymisen jälkeen reaktiot py- '···' säytettiin poistamalla kärjet ja liuosten absorbanssit luet tiin 405 nm:ssä.
110099 36 Jäljempänä luetellut oktameerit olivat immunoreaktiivisia anti-HCV-antiseerumien kanssa. Peptidit, jotka reagoivat kaikkien kolmen antiseerumin kanssa, luetellaan epitooppeina, kun taas peptidit, jotka reagoivat vain yhden tai kahden 5 antiseerumin kanssa, luetellaan heikkoina epitooppeina (osoitettu "~":lla). Erityisen voimakkaat epitoopit on merkitty kirjaimilla mieluummin kuin numeroilla (esim., EpAA).
* · • · I t • * . I · C f * # » I * · I · · * ! · · I t ) ( * * t t * # · * * » * * • * % * t » 0 · 1 · « t · » ( I I « t
It* * t * I · I » I * I I »
I * I
> > I » I « I » I I » „ 110099 AA# Sekvenssi AA# Sekvenssi
23 KEPGGGQA 87 GNEGCGWA
24 EPGGGQAV Ep2
5 25 PGGGQAVG 88 NEGCGWAG
26 GGGQAVGG 89 EGCGWAGW
27 GGQAVGGV 90 GCGWAGWL
28 GQAVGGVY 91 CGWAGWLL
29 QAVGGVYL - 92 GWAGWLLS
30 AVGGVYLL 93 WAGWLLSP
31 VGGVYULP 94 AGWLLSPR
10 32 GGVYLLPR 95 GWLLSPRG
33 GVYLLPRR 96 WLLSPRGS
34 VYLLPRRG 97 LLSPRGSR
35 YLLPRRGP 98 LSPRGSRP
36 LLPRRGPR 99 SPRGSRPS
66 PKARRPEG Epl 100 PRGSRPSW Ep3
15 67 KARRPEGR 101 RGSRPSWG
68 ARRPEGRT 102 GSRPSWGP
69 RRPEGRTW 103 SRPSWGPT
70 RPEGRTWA
71 PEGRTWAQ 186 TVPASAYQ Ep4
72 EGRTWAQP 187 VPASAYQV
73 GRTWAQPG EpA 188 PASAYQVR
20 74 RTWAQPGY 189 ASAYQVRN
75 TWAQPGYP 190 SAYQVRNS
76 WAQPGYPW 191 AYQVRNST
77 AQPGYPWP
78 QPGYPWPL 206 DCPNSSIV -
79 PGYPWPLG
80 GYPWPLYG 223 TPGCVPCV -
V. 25 81 YPWPLYGN
82 PWPLYGNE 232 EGNASRCW Ep5
: 83 WPLYGNEG
-V 84 PLYGNEGC 256 TQLRRHID -
: V 85 LYGNEGCG
86 YGNEGCGW 286 LVGQLFEF - 30 297 RHWTTQGC Ep6
298 HWTTQGCN
299 WTTQGCNC
321 MMMNWSPI - ;··*: 347 DMIAGAHWEp7 ti* 35 ; 357 LAGIAYFS Ep8 J10099
413 UNTNGSW EpB 594 YSRCGSGP FA
414 INTNGSWH 595 SRCGSGPW
596 RCGSGPWL
5 432 SLNTGWLA - 597 CGSGPWLT
598 GSGPWLTP
465 FDQGWGPI EpC 599 SGPWLTPR
466 DQGWGP1S 600 GPWLTPRC
467 QGWGP1SY 601 PWLTPRCL
468 GWGPISYA 602 WLTPRCLV
469 WGPISYAN 603 LTPRCLVD EpF
10 470 GHSYANG 604 TPRCLVDY
471 HSYANGS 605 PRCLVDYP
606 RCLVDYPY
480 PDQRPYCW 607 CLVDYPYR
481 DQRPYCWH 608 LVDYPYRL
482 QRPYCWHY 609 VDYPYRLW
483 RPYCWHYP 610 DYPYRLWH
15 484 PYCWHYPP 611 YPYRLWHY FB
612 PYRLWHYP
500 KSVCGPVY Ep9 613 YRLWHYPC
501 SVCGPVYC
502 VCGPVYCE 641 EAACNWTR
Epl2 521 RSGAPTYS ^>10 20 662 LSPIJJJI Epl3
540 NNTRPPLG EpE 663 SPLLLHI
541 NTRPPLGN 664 PLLLmQ
542 TRPPLGNW 665 TJJ.TTTQW
543 RPPLGNWF
544 PPLGNWFG 685 LSTGUHL -
545 PLGNWFGC
·.··.: 25 546 LGNWFGCT 705 VGSSIASW ~
: 547 GNWFGCTW 706 GSSIASWA
548 NWFGCTWM
549 WFGCTWMN 729 ARVCSCIW Epl4
:·' ’* 579 LHCPTDCF - 782 WVPGAVYT
EpG
.·. . 30 783 VPGAVYTF
784 . PGAVYTFY
• 785 GAVYTFYG
786 AVYTFYGM
787 VYTFYGMW
788 YTFYGMWP
789 TFYGMWPL
801 LALPQRAY - » · * : .·. 35 ι 39 110099 851 RVEAQLHV EpH 1384 VEKGGRHL Ep20
852 VEAQLHVW
853 EAQLHVWI 1410 LGINAVAY Ep21
5 854 AQLHVWIP 1411 GINAVAYY
855 QLHYWIPP
1454 CNTCVIQT - 893 LAVFGPLW - 1492 GRGKPGIY ^>22
916 QGLLRFCA ~ 1493 RGKPGIYR
10 928 MIGGHYVQ Epl5 1532 PAETTVRL Ep23
1533 AETTVRLR
946 TGTYVYNH EpI 1534 ETTVRLRA
1535 TTVRLRAY
952 NHLTPLRD EpJ
953 HLTPLRDW 1560 GVFIGUH Ep24
954 LTPLRDWA 1561 VFIGLIHI
15
1026 ΙΑΡΓΓΑΥΑ - 1581 ENLPYLVA
Ep25
1072 TCINGVCW EpK 1567 NLPYLVAY
1568 LPYLVAYQ
1109 LVGWPAPQ ^)16 1569 PYLVAYQA
1570 YLVAYQAT
20 1171 CPAGHAVG Epl7 1571 LVAYQATV
1113 PAGHAVGI 1572 VAYQATVC
1114 AGHAVGEF 1573 AYQATVCA
1115 GHAVGIFR 1574 YQATVCAR
1116 HAVGEFRA 1575 QATVCARQ
1117 AVGIFRAA 1576 ATVCARQA
1577 TVCARQAP
I". 25 1218 WPQSEQVEpL
1601 PPSWDQMW
: 1240 VPAAYAAQ - Ep26
1602 PSWDQMWK
: V 1260 ATLGFGAY * 1603 SWDQMWKC
·:·. 1604 WDQMWKCL
1280 GVRITTGS Epl8' 1605 DQMWKCU
30 1281 VRITTGSP 1606 QMWKCLIR
1282 RITTGSPI 1607 MWKCIiRL
1283 nTGSprr 1284 TTGSPTTY 1615 KPTLHGPI Έρ2Ί
1285 TGSPITYG 1616 PTLHGPIP
:,i.: 1617 TLHGPIPL
1322 DATSILGI - 1618 LHGPIPLL
35 1619 HGPIPLLY
.·. 1338 TAGARLW — 1620 GPIPLLYR
1371 GHPFYGK Epl9 1655 WTSTWVL ~ 110099 40
1694 IIPDREVL ΕρΜ 1966 SECI1PCS EpS
I 1695 IPDSEVLY 1967 ECTIPCSG
1968 CITPCSGS
5 1710 ECSQHLPY EpN 1969 UPCSGSW
1711 CSQHLPYI
1712 SQHLPYIE 1999 LMPQLPGI EpT
2000 MPQLPGIP
1728 EKQKALGL EpO 2001 PQLPGIPE
1729 XQKALGLL 2002 QLPGIPEV
2003 LPdPEVS
10 1758 ETEWAXLM EpP 2004 PGIPEVSC
1759 EEWAKLMW 2005 GIPEVSCQ
1760 EWAKLMWN 2006 IPEVSCQR
1761 WAKLMWNE 2007 PEVSCQRG
1762 AKLMWNEI 2008 EVSCQRGY
2009 VSCQRGYK
1781 LPGNPAIA - 2010 SCQRGYKG
15 2011 CQRGYKGV
1808 LFNILGGW Ep28 2012 QRGYKGVW
2013 RGYKGVWR
1821 AAPGAATA ~ 2014 GYKGVWRG
1851 ELAGYGAG Ep29 2024 IMHIRCHC
Ep31 20 1880 VNLLPAIL -
2048 VGPRICRN EpU
1908 PGEGAVQW EpG 2049 GPRICRNY
1909 GEGAVQWM 2050 PRICRNYW
1910 EGAVQWMN 2051 RICRNYWS
1911 GAVQWMNR 2052 ICRNYWSG
1912 AVQWMNRL 2053 CRNYWSGT
25 1913 VQWMNRLI 2054 RNYWSGTE
2055 NYWSGTEP
i 1925 RGNHVSP1 EpR 2056 YWSGTEPI
2057 WSGTEPIN
i 1940 AAARVTAI Ep30 :··*: 1941 AARVTAEL 2071 TPLPAPNY Ep32
1942 ARVTAILS
30 1943 RVTAILSS 2088 EEYVIRQV EpV
1944 VTAUSSL 2089 EYVIRQVG
:./ 1945 TAILSSLV 2090 YVIRQVGD
1946 AELSSLVT 2091 VIRQVGDF
1947 ILSSLVTQ 2092 IRQVGDFH
1948 LSSLVTQL 2093 RQVGDFHY
1949 SSLVTQLL
’ 35 1950 SLVTQLLR 2108 DNLKCPCQ -
... 1951 LVTQLLRR
110099 41
2122 HELDGVR EpW 2280 REAQALPV EpZ
2123 IELDGVRL 2281 EAQALPVW
2124 ELDGVRLH 2282 AQALPVWA
5 2125 LDGVRLHR 2283 QALPVWAR
2126 DGVRLHRF 2284 ALPVWARP
2127 GVRLHRFA 2285 LPVWARPD
2128 VRIHRFAP 2286 PVWARPDY
2129 RLHRFAPP 2287 VWARPDYN
2130 LHRFAPPC 2288 WARPDYNP
2131 HRFAPPCK 2289 AJRPDYNPP
10 2132 RFAPPCKP 2290 RPDYNPPL
2133 FAPPCKPL
2134 APPCKPLL 2325 PPPRKKRT Ep35
2135 PPCKPLLR 2326 PPRKKRTV
2136 PCKPLLRE 2327 PKKKRTW
2137 CKPLLREE
2138 KPLLREEV 2345 AELASRSE Ep36
I5 2139 PLLREEVS 2346 ELASRSEG
2140 LLREEVSF EpX 2347 LASRSEGS
2141 LREEVSFR 2348 ASRSEGSS
2142 REEVSFRV 2349 SRSEGSSS
2143 EEVSFRVG
2144 EVSERVGL 2382 AESYSSMP Ep37
2145 VSFRVGLH
20 2146 SFRVGLHE 2401 SDGSWSTV
2147 FRVGLHEY Ep38
2148 RVGLHEYP
2417 WCCSMSY
2165 EPEPDVAV - EpAA
;···; 2418 VCCSMSYW
: 2187 GRRLARGS - 2419 CCSMSYWI
V.: 25 2420 CSMSYWIG
2226 LIEANLLW EpY 2421 SMSYWIGA
: 2227 IEANLLWR 2422 MSYWIGAL
;"·*·· 2228 EANLLWRQ
2229 ANLLWRQE
2230 NLLWRQEM
2231 LLWRQEMG
: 30 2232 LWRQEMGG
I · 2244 VESENKW Ep33
2245 ESENKWI
: 2246 SENKWIL
.·*!. 2247 ENKWDlD
:···: 2248 NKWILDS
: 2249 KWHDSF
:·· : 2250 WILDSFD
2267 EISVPAEiQ)34 I 110099
! 2439 QXLHNAL EpBB 2602 LPLAVMGS
2440 KLPINALS EpDD
2441 LPINALSN 2603 PLAVMGSS
5 2442 PINALSNS 2604 LAVMGSSY
2443 INALSNSL 2605 AVMGSSYG
2444 NALSNSLL 2606 VMGSSYGE
2445 ALSNSLLR 2607 MGSSYGEQ
2446 LSNSLLRH 2608 GSSYGEQR
2447 SNSLLRHH 2609 SSYGEQRV
2448 NSLLRHHN 2610 SYGEQRVE
10 2449 SLLRHHNL 2611 YGEQRVEE
2450 LLRHHNLV 2612 GEQRVEEL
2451 LRHHNLVY
2452 RHHNLVYS 2632 KTPMGFSY
2453 HHNLVYST Ep41
2454 HNLVYOT 2633 TPMGFSYD
2455 ΝΕνΥ5Ή8 2634 PMGFSYDT
15 2456 LVYSTISR 2635 MGFSYDTR
2636 GFSYDTRC
2469 QKKVTFDR Ep39 2637 FSYDTRCE
2470 KKVTFDRL 2638 SYDTRCED
2471 KVTFDRLQ
2472 VTFDRLQV 2660 YQCCDLDP -
2473 TFDRLQVL
20 im FDRLQVLD 2676 LTERLYVG
2475 DRLQVUDS EpEE
2476 RLQVLDSH 2677 TERLYVGG
2678 ERLYVGGP
V; 2495 ASKVKANL - 2679 RLYVGGPL
2533 RKAVTHINEpCC 2688 NSRGENCG
•. . 25 2534 KAVTHINS EpFF
/V 2689 SRGENCGY
• : - 2573 GRKPARLI Ep40 2690 RGENCGYR
2574 RKPARIIV 2691 GENCGYRR
: ·' 2575 KPARLTVF 2692 ENCGYRRC
2576 PARLIVFP 2693 NCGYRRCR
2577 ARUVFPD
30 2578 RUVFPDL 2707 TSCGNTU Ep42 .·./ 2721 AACRAAGL -
. X 2757 AFTEAMTR
^>43
2758 FTEAMTRY
'·' 35 2759 TEAMTRYS
: 2760 EAMTRYSA
X'.; 2761 AMTRYSAP
2762 MTRYSAPP
43 110099 2779 DLELUSC Ep44 2878 DLPPHQR Ep47
2780 LEUISCS 2879 LPPHQRL
2880 PPHQRLH
2794 HDGAGKRV 2881 PHQRLHG
5 Ep45 2882 IIQRLHGL
2795 DGAGKRVY 2883 IQRLHGLS
2796 GAGKRVYY 2884 QRLHGLSA
2797 AGKRVYYL 2885 RLHGLSAF
2798 GKRVYYLT 2886 LHGLSAFS
2799 KRVYYLTR 2887 HGLSAFSL
2800 RVYYLTRD 2888 GLSAFSLH
10 2801 VYYLTRDP 2889 LSAFSLHS
2802 YYLTRDPT 2890 SAFSLHSY
2891 AFSLHSYS
2817 WETARHTP 2892 FSLHSYSP
EpGG 2893 SLHSYSPG
2818 ETARHTPV 2894 LHSYSPGE
2819 TARHTPVN 2895 HSYSPGE1
I5 2820 ARHTPVNS
2821 RHTPVNSW
2822 HTPVNSWL
2823 TPVNSWLG
2824 PVNSWLGN
2825 VNSWLGNI
2826 NSWLGNH
20 2827 SWLGNHM
2828 WLGNIIME
2829 LGNUMEA
2830 GNIIMEAP
2831 ΝΠΜΕΑΡΤ
2832 EMEAPTL
2833 IMEAPTLW
·.:.·· 25 2834 MEAPTLWA
: .·. 2835 EAPTLWAR
:·: : 2836 APTLWARM
2837 PTLWARMI
2838 TLWARMIL
2839 LWARMILM
2840 WARMUMT
; 30 2841 ASMILMTH
2842 RMimiHF
2843 MILMTHFE
: 2863 LDCETYGA^>46
’·” 2864 DCEIYGAC
2865 CHYGACY
: ’· 35 2866 EIYGACYS
:·: : 2867 IYGACYSI
44 110099
2912 LGVPPLRA Ep48 5 2913 GVPPLRAW
2914 VPPLRAWR
2938 AAICGKYL Ep49
2939 AICGKYLE
2940 ICGKYLEN
10 2966 DLSGWETA
EpHH
2984 VSHARPRW ΕρΠ 15 IV.B. Erottava määritys 20 Seuraava määritys suoritettiin aikaisten antigeenien erottamiseksi myöhäisistä antigeeneistä. Vasta-aineet aikaisille antigeeneille voidaan ilmaista ja käyttää HCV-infektion diag-noosiin nopeammin.
• · '·*·’ 25 Verinäytesarja saatiin potilaasta, jolla oli kohonnut ALT, : mutta joka oli negatiivinen anti-C100-3 -vasta-aineen suh- • teen. Viisi verinäytettä, jotka saatiin ennen täydellistä •V ·* serokonversiota (C100-3 -positiiviset) koottiin yhteen ja käytettiin määrityksessä laimennuksessa 1:2000. Määritys :*·,· 30 suoritettiin kuten jaksossa IV.A. edellä on kuvailtu. Kuiten-kin toista kaksoiskärkisarjaa inkuboitiin piparjuuriperoksi-daasi-leimattujen vuohen anti-ihminen IgG-spesifisten anti- · · seerumien kanssa, kun taas toista ryhmää inkuboitiin pipar-juuriperoksidaasi-leimattujen vuohen anti-ihminen IgM-spesi- • 35 fisten antiseerumien kanssa. IgM-vasta-aineiden kanssa immu- • · · * ;**. noreaktiiviset epitoopit ovat aikaisia epitooppeja.
Tulokset osoittivat, että useimmat aikaiset epitoopit tava- 45 110099 taan alueella, joka ulottuu aminohaposta noin 480 aminohappoon noin 650. Erityisen voimakkaita IgM-epitooppeja olivat oktameerit, jotka alkoivat aminohapoilla 506, 510, 523, 553, 562, 580 ja alue 590-620. Määritykset, joissa käytetään an- 5 tigeenejä, jotka sisältävät epitooppeja tältä alueelta, mahdollistavat HCV-infektion diagnoosin varhaisessa vaiheessa verrattuna määrityksiin, joissa käytetään muita antigeenejä.
Keksinnön mukaisesti on lisäksi testattu plasmanäytesarjoja, 10 jotka on otettu viideltä potilaalta, joilla on avatun sydämen jälkitransfuusio -NANB-hepatiitti, ja tutkimuksia on jatkettu 3-12 vuotta. Alkuverinäytepäivät olivat alle yhden viikon sisällä toisistaan. Kustakin näytteestä testattiin IgG ja IgM EIA: n avulla yhtä ydinantigeeniä (C22), kahta vaippa-15 antigeeniä (El ja E2) ja kolmea ei-rakenteellisen alueen antigeeniä (C33c, C100 ja NS5) vastaan. Todettiin, että IgM-vaste C22:een ja C33c:hen edelsi IgG-vastetta noille antigeeneille. NS5 aiheutti myös IgM-vasteen mutta tämä vaste ei edeltänyt IgG-vastetta tuole antigeenille. Voidaan siten 20 valmistaa määrityksiä, joiden avulla kyetään määrittämään infektion hyvin varhaiset vaiheet käyttäen hyväksi epitooppeja, jotka on saatu C22- ja C33c-alueilta ja määrittämällä .*.· IgM-sitoutuminen. C33c-alueen vasta-aineet pysyivat pisimmän ajan viitaten siihen, että C33c:hen suunnatut diagnostiset 25 määritykset olisivat luotettavimpia.
• · · • < · · • * *· IV.C. Sekvenssivaihtelut HCV-isolaateissa eri yksilöistä • · HCV-isolaatit, jotka sisältävät sekvenssejä, jotka poikkeavat . . 30 CDC/HCV1:stä, identifioitiin ihmisyksilöissä, joista jotkut *..* olivat serologisesti positiivisia anti-C100-3 -vasta-aineille • » ·;·’ (EC10 oli vasta-ainenegatiivinen) . Näiden uusien isolaattien : : : identifiointi suoritettiin kloonaamalla ja sekvensoimalla HCV-genomin osaset, jotka oli monistettu PCR-tekniikalla . 35 käyttäen CDC/HCV1-sekvenssejä. Menetelmässä käytetään aluk- • · *
keitä ja koettimia, jotka perustuvat tässä kuvailtuihin HCV
• I
’··** cDNA -sekvensseihin. Menetelmän ensimmäinen vaihe käsittää cDNA-synteesin joko HCV-genomiin tai sen repiikoituvaan 110099 46 välituotteeseen käyttäen käänteistranskriptaasia. HCV cDNA:n synteesin jälkeen ja ennen monistamista näytteen sisältämä RNA hajotetaan alalla tunnetuilla menetelmillä. Määrätty osa HCV cDNA:sta monistetaan sitten käyttäen sopivia alukkeita.
5 Monistetut sekvenssit kloonataan ja monistettuja sekvenssejä sisältävät kloonit ilmaistaan koettimen avulla, joka on komplementaarinen alukkeiden välissä sijaitsevan sekvenssin suhteen, mutta joka ei peitä alukkeita.
10 IV.C.l. HCV-isolaatit, jotka on eristetty ihmisistä USA:ssa
Verinäytteet, joita käytettiin HCV-virionilähteenä, saatiin the American Red Cross'lta, Charlotte, North Carolina, ja the Community Blood Center of Kansas'lta, Kansas City, Missouri. 15 Näytteistä seulottiin vasta-aineet HCV cl00-3 -antigeenille käyttäen ELISA-määritystä ja niillä suoritettiin täydentävä western-blot -analyysi käyttäen polyklonaalista vuohen anti-ihminen HRP:tä anti-HCV -vasta-aineiden määrittämiseksi. Kaksi näytteistä the American Red Cross'lta ja vastaavasti 20 the Community Blood Center of Kansas'lta määritettiin HCV-positiivisiksi näillä määrityksillä.
• · • · • t ,···, Näiden näytteiden seerumissa läsnäolevat viruspartikkelit ·,·. eristettiin ultrasentrifugoimalla Bradleyn et ai. (1985) .‘ ! 25 kuvailemissa olosuhteissa. RNA uutettiin partikkeleista pilkkomalla proteinaasi K: 11a ja SDS:llä loppupitoisuuksien • ;* ollessa 10 pg/ml proteinaasi Kita ja 0,1 % SDSiää, pilkkomi- *·* ' nen kesti 1 tunnin 37°C:ssa. Virus-RNA jatkopuhdistettiin uuttamalla kloroformi-fenolilla.
30 ' RNA-valmisteen HCV RNA käänteiskopioitiin cDNAiksi. Sen jäl- , j·, keen kun kumpikin cDNA-juosteista oli syntetisoitu, tuloksena • t · !!.’ saatu cDNA monistettiin PCR-menetelmän avulla. HCV cDNAit • · *; kolmessa kloonissa, jotka saatiin kustakin HCV-isolaatista, |,| · 35 sekvenssianalysoitiin. Analyysi oli pääasiallisesti Chen ja : : Seeburgin (1985) kuvaileman menetelmän mukainen.
HCVistä näytteissä 23 ja 27 saatujen kloonien konsensusse- 47 110099 kvenssit esitetään kuviossa 3 ja vastaavasti 4. Variaabelit sekvenssit esitetään myös näissä kuvioissa kuten myös konsen-sussekvenssien koodittamat aminohapot.
5 Kuviot 5 ja 6 esittävät vertailuja rinnakkain asetetuista positiivisen juosteen nukeotidisekvensseistä (kuvio 5) ja oletetuista aminohapposekvensseistä (kuvio 6) näytteistä 23, 27 ja HCV1. HCVl:n aminohapposekvenssi kuviossa 6 edustaa aminohapponumeroita 129-467 HCV-polyproteiinissa, joita koo-10 dittaa suuri ORF HCV:n genomisessa RNA:ssa. Kuvien 5 ja 6 tarkastelu osoittaa, että kolmen eristetyn kloonin sekvensseissä esiintyy vaihteluja. Sekvenssivaihtelut nukleotidi-tasolla ja aminohappotasolla esitetään tiivistettynä taulukossa välittömästi jäljempänä. Taulukossa S:llä ja NSl:llä 15 merkityt polypeptidit edustavat aminohapponumeroita 130 -380 ja vastaavasti 380 - -470, koska nuo domeenit olivat ennalta tunnettuja. Numerointi alkaa oletetusta initiaattori-metioninista. Terminologia S ja NS1 perustuvat sekvenssien sijoitteluun, jotka koodittavat polypeptidejä, käyttäen 20 flavivirusmallia. Kuten edellä kuitenkin on esitetty, viine-aikaiset todisteet viittaavat siihen, että HCV:n ja flavivi- V. rusten välillä ei ole kokonaiskorrelaatiota mitä tulee virus- * | I · ten polypeptididomeeneihin, erityisesti oletettuihin E/NS1-·,·, domeeneihin. HCV:n polypeptidit ja niiden kooditusdomeenit * i » ! 25 voivat todellakin poiketa olennaisesti flavivirusmallista.
Ilt III · • ( · • * * Taulukko: I I t • · * V ' Sekvenssihomologia
Nukleotidi koodit. Aminohappo koodit.
: 30 • · ’ * * *: kokon. S NS1 kokon. S NS1 * i » * o, o. o, o. o, o, » "O "O Ό “O *0 Ί3 • * »
I I I
111 ‘•I*’ HCV1/HCV23 93 95 91 92 95 87 j,;’; 35 HCV1/HCV27 89 93 84 89 95 82 HCV23/HCV27 89 93 85 90 93 84
Vaikka vasta eristetyissä HCV-sekvensseissä esiintyy vaih-
III
48 110099 teluita, kloonatut sekvenssit näytteistä 23 ja 27 (nimeltä HCV23 ja HCV27) sisältävät kukin 1019 nukleotidiä, mikä osoittaa deleetio- ja additiomutanttien puuttumisen tällä alueella valituissa klooneissa. Sekvenssit kuvioissa 5 ja 6 5 osoittavat myös, että eristetyt sekvenssit eivät ole uudel-leenjärjestäytyneet tällä alueella.
Konsensussekvenssien vertailu HCVl:n osalta ja muiden HCV-isolaattien osalta esitetään tiivistettynä taulukossa edellä.
10 Sekvenssivaihtelut simpanssi HCV-isolaatin ja ihmisestä eristetyn HCV:n välillä ovat suunnilleen samat, jotka havaitaan ihmisalkuperäisissä HCV-sekvensseissä.
On kiinnostavaa, että sekvenssivaihtelut kahdessa oletetussa 15 domeenissa eivät ole yhtenäisiä. Sekvenssi oletetussa S- alueessa näyttää olevan verrattain vakio ja umpimähkäisesti hajautuneena alueelle. Päinvastaisesti, oletettu NSl-alue vaihtelee suuremmassa määrin kuin kokonaissekvenssi ja vaihtelevuus näyttää olevan hypervariaabelissa, 28 aminohappoa 20 sisältävässä taskussa, joka sijaitsee noin 70 aminohapon päässä oletetun polyproteiinin oletetun N-pään alapuolella.
i." Vaikka voidaan väittää, että havaitut vaihtelut tuotettiin !'! monistusprosessin aikana, on epätodennäköistä, että kaikki / 25 vaihtelut ovat seurausta tästä. On arvioitu, että Taq-polyme- :: : raasi saa aikaan virheitä sekvenssiin tasolla suunnilleen • .* yksi emäs/10 kiloemästä DNA-templaatissa jaksoa kohti (Saiki V · et ai. (1988)). Tähän arviointiin perustuen, enintään 7 vir hettä voi olla tuotettu 1019 ep DNA-fragmentin PCR-monistuk-30 sen aikana. HCV-23:n ja HCV-27:n kolme alakloonia tuottivat kuitenkin 29 ja vastaavasti 14 muunnelmaa. Seuraavassa esite-\ tään, että nämä variaatiot ovat luonnollisina esiintyviä.
;;; Noin 60 % emäsmuutoksista on hiljaisia mutaatioita, joissa '·;·* aminohappo ei muutu. Taq-polymeraasin PCR-monistuksen aikana i 35 tuottamien vaihteluiden odottaisi tapahtuvan sattumanvarai-sesti; tulokset osoittavat kuitenkin, että muunnelmasekvens-sit ovat ryhmittyneet vähintään yhdellä spesifisellä alueella.
" 110099 IV.C.2. HCV-isolaatit ihmisistä Italiassa ja USA:ssa HCV RNA:n osia eri isolaateista monistettiin HCV/cPCR-mene-5 telmällä. Nämä osat kattoivat alueen -0,6 ke - -1,6 ke oletetun HCV-polyproteiinin metioniinia koodittavan aloituskodonin alapuolella. Eristykset ovat biologisista näytteistä, jotka on saatu HCV-infektoituneista yksilöistä. Erityisemmin, eristys HCT#18 on ihmisen plasmasta henkilöstä USArssa, EC1 ja 10 EC10 ovat italialaisen potilaan maksabiopsiästä ja Th on amerikkalaisen potilaan perifeeriveren mononukleosyyttifrak-tiosta. Vastaavat HCV RNA -osat on eristetty simpanssista.
RNA uutettiin ihmisen plasmanäytteistä käyttäen fenoli:-15 CHC13:isoamyylialkoholiuuttoa. Joko 0,1 ml tai 0,01 ml plasmaa laimennettiin lopputilavuuteen 1,0 ml TENB/proteinaasi K/SDS -liuoksella (0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,001 M EDTA, 0,1 M NaCl, 1 mg/ml proteinaasi K ja 0,5 % SDS), joka sisälsi 10-40 pg/ml polyadenyylihappoa, ja inkuboitiin 37°C:ssa 60 mi-20 nuuttia. Tämän proteinaasi K:11a pilkonnan jälkeen tuloksena saadut plasmat deproteinoitiin uuttamalla TE-puskurilla (50 mM Tris.HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) kyllästetyllä fenolilla ·’·' pH:ssa 6,5. Fenolifaasi erotettiin sentrifugoimalla ja uutet- tiin uudelleen TENB:llä, joka sisälsi 0,1 % SDS:ää. Kustakin *.·.· 25 uutosta tuloksena saadut vesifaasit koottiin yhteen ja uutet-I tiin kahdesti vastaavalla tilavuudella fenoli:kloroformi:iso- amyylialkoholia [1:1(99:1)], ja sen jälkeen kahdesti vastaa-valla tilavuudella 99:1 seosta kloroformi/isoamyylialkoholia. Faasien tultua erotetuiksi sentrifugoimalla vesifaasin loppu-.·. : 30 pitoisuudeksi säädettiin 0,2 M Na-asetaattia ja nukleiinihapot saostettiin lisäämällä kaksi tilavuutta etano-T lia. Saostetut nukleiinihapot otettiin talteen ultrasentrifu- goimalla SW 41 -roottorissa 38K, 60 minuutin ajan 4°C:ssa tai mikrofugissa 10 minuutin ajan 10K:ssa, 4°C:ssa.
: ’ ·. 35
Maksabiopsiasta uutettu RNA saatiin Dr. F. Boninolta, Ospeda-le Maggiore di S. Giovanni Battista, Torino, Italia. Mononuk-leosyyttifraktio saatiin laskeuttamalla yksilön verinäyte-erä 50 110099
Ficoll-PaquenR läpi (Pharmacia Corp.) käyttäen valmistajan ohjeita. Kokonais-RNA uutettiin fraktiosta käyttäen Choon et ai. (1989) kuvailemaa guanidiinitiosyanaattimenetelmää.
5 HCV cDNA:n synteesi näytteistä suoritettiin käyttäen kään-teistranskriptaasia. Etanolisaostuksen jälkeen saostettu RNA tai nukleiinihappofraktio kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen DEPCrllä käsiteltyyn tislattuun veteen. Nukleiinihappojen sekundäärirakenteet hajotettiin kuumentamalla 65°C:ssa 10 10 minuutin ajan ja näytteet jäähdytettiin välittömästi jäi den päällä. cDNA syntetisoitiin käyttäen 1-3 pg kokonais-RNA:ta maksasta tai nukleiinihapoista (tai RNA:sta) uutettuna 10-100 piistä plasmaa. Synteesissä käytettiin hyväksi kään-teistranskriptaasia ja se suoritettiin 25 pl:n reaktiossa 15 käyttäen valmistajan BRL määräämää toimintaohjetta. Kaikki reaktioseokset cDNA-synteesiä varten sisälsivät 23 yksikköä RNaasin inhibiittoria, RNasiiniaR (Fisher/Promega). cDNA-synteesin jälkeen reaktioseokset laimennettiin vedellä, keitettiin 10 minuutin ajan ja jäähdytettiin nopeasti jäiden 20 päällä.
'm·' Kullekin näyteryhmälle suoritettiin kaksi PCR-monistusjaksoa.
Alukkeet reaktioihin valittiin alueiden "EnvL" ja "EnvR" mo-;·; nistamiseksi. "EnvL"-alue käsittää nukleotidit 669-1243 ja 25 oletetut aminohapot 117-308; "EnvR"-alue käsittää nukleotidit : 1215-1629 ja koodittaa oletettuja aminohappoja 300-408 (ole- i tetut aminohapot numeroidaan lähtien oletetusta metioniini- ·/· · aloituskodonista) .
;*,· 30 PCR-reaktiot suoritettiin olennaisesti valmistajan (Cetus-.···. Perkin-Elmer) ohjeiden mukaisesti, lukuunottamatta 1 pg:n •t RNaasi A -lisäystä. Reaktiot suoritettiin lopputilavuudessa ’···’ 100 pl. PCR:n suoritus käsitti 30 jaksoa, käyttäen ohjelmaa 94°C (1 min.), 37°C (2 min.) ja 72°C (3 min.), käyttäen 7 j ;·; 35 minuutin pidennystä 72°C:ssa viimeisen jakson osalta. Näyt-.···. teet uutettiin sen jälkeen fenoli :CHC13:11a, saostettiin etanolilla kaksi kertaa, suspendoitiin uudelleen 10 mM Tris-HClriin pH 8,0 ja väkevöitiin käyttäen Centricon-30 (Amicon) 51 1 10099 -suodatusta. Tämä menettely poistaa tehokkaasti oligonukle-otidit, joiden pituus on vähemmän kuin 30 nukleotidiä; näin ollen alukkeet PCR-monistuksen ensimmäiseltä kierrokselta poistetaan.
5
Centricon-30:llä väkevöidyt näytteet vietiin sen jälkeen toiselle PCR-monistuskierrokselle. PCR-monistus käsitti 35 jaksoa, joissa käytettiin ohjelmaa 94°C (1 min.), 60°C (1 min.) ja 72°C (2 min.), käyttäen 7 minuutin pidennystä 72°C:-10 ssa viimeisessä jaksossa. Näytteet uutettiin sen jälkeen fenoli :kloroformilla, saostettiin kaksi kertaa ja pilkottiin EcoRI;llä. PCR-reaktiotuotteet analysoitiin erottamalla tuotteet elektroforeesin avulla 6 %:isillä polyakryyliamidigee-leillä. DNA, jonka koko vastasi suunnilleen arvioitua odotet-15 tua PCR-tuotetta, elektroeluoitiin geeleistä ja subkloonat-tiin joko pGEM-4 -plasmidivektoriin tai Xgtll:iin. Odotetut tuotekoot EnvL:lle ja EnvR:lle ensimmäisen monistuskieron jälkeen olivat 615 ep ja vastaavasti 683 ep; toisen monistus-kierroksen jälkeen odotetut tuotekoot EnvL:lle ja EnvRtlle 20 olivat 414 ep ja vastaavasti 575 ep. Monistettuja tuotteita sisältäviä plasmideja käytettiin isäntäsolujen transformoin-tiin; pGEM-4 -plasmidia käytettiin transformoitaessa DH5-alfa, ja Agtllra käytettiin transformoitaessa C600 delta-HFL. \\ Transformoitujen solujen kloonit, jotka joko hybridisoituivat : 25 sopiviin HCV-koettimiin, tai joissa oli sopivankokoiset in- XV sertit, valikoitiin. Insertit kloonattiin sen jälkeen M13:iin ja sekvensoitiin. Koettimet kaikille HCV/cPCR-tuotteille kä-*·’ ’ sittivät 32P-leimattuja osia HCV cDNA:sta, joka oli valmis tettu PCR-monistuksella.
:.i 30 W Sekvenssi-informaatio muunnelmille EnvL-alueella saatiin 3 . .·. kloonista HCT#18:sta, 2 kloonista TH:sta, 3 kloonista ECl:stä X·' ja HCV1 -klooneista. Vertailu kunkin näistä klooneista saadun isolaatin yhdistelmänukleotidisekvensseistä esitetään kuvios-;.· · 35 sa 7. Kuviossa kukin sekvenssi esitetään 51-31-suunnassa *.#V EnvL-alueen templaattijuosteelle (sense) ja sekvenssit on asetettu rinnakkain. Pystyviivat ja isot kirjaimet osoittavat sekvenssihomologian, viivan ja isojen kirjainten puuttuminen 110099 osoittavat homologian puuttumisen. Riveissä esitetyt sekvenssit ovat seuraavat: rivi 1, Thorn; rivi 2, EC1; rivi 3, HCT#18; rivi 4, HCV1.
5 Sekvenssi-informaatio muunnelmille EnvR-alueella saatiin kahdesta EC10:n kloonista ja HCV1-klooneista. Kaksi EClO-kloonia erosivat vain yhden nukleotidin osalta. EC10:n nukleotidisek-venssien (klooni 2) ja HCVl:n yhdistelmäsekvenssien vertailu esitetään kuviossa 8; kukin sekvenssi on esitetty 5'-3'-suun-10 nassa EnvR-alueen templaattijuosteelle (sense) ja sekvenssit on asetettu rinnakkain. Kaksoispisteet sekvenssien välissä osoittavat sekvenssihomologian.
Vertailu aminohapposekvensseistä, jotka ovat kooditettuina 15 EnvL-alueella (aminohapot #117-308) ja EnvR-alueella (aminohapot #300-438) kullakin isolaatilla esitetään kuviossa 9 ja vastaavasti kuviossa 10. Kuvioissa on esillä sekvenssit iso-laateille JH23 ja JH27, joita edellä on kuvailtu. Esitettynä ovat myös sekvenssit japanilaisesta eristyksestä; nämä sek-20 venssit toimitti Dr. T. Miyamura, Japani. Kuvioissa alueen aminohapposekvenssi esitetään kokonaisuudessaan HCVl:lle ja V; ei-homologiset aminohapot eri isolaateilla on osoitettu.
• · ·.·. Kuten kuviosta 9 nähdään, EnvL-alueella vallitsee kaikkiaan : 25 noin 93 %:n homologia HCVl:n ja muiden isolaattien välillä.
Y.‘ HCT18, Th ja EC1 ovat noin 97 %:isesti homologisia HCVl:n suhteen; JH23 ja JH27 ovat noin 96 %:isesti ja vastaavasti ·’ noin 95 %:isesti homologiset HCVl:n suhteen. Kuvio 10 osoit taa, että homologiat EnvR-alueella ovat merkittävästi pienem-Υ'ί 30 mät kuin EnvL-alueella; sen lisäksi yksi alaalue näyttää Y,: olevan hypervariaabeli (so., aminohaposta 383-405). Nämä . .·. tulokset esitetään tiivistettynä taulukossa välittömästi .···. jäljempänä.
:.: : 35 110099
Taulukko: EnvR-alueen homologia
Eristys Homologiaprosentti HCVl:n suhteen AA330-AA438 AA383-AA405 5 JH23 (U.S.) 83 57 JH27 (U.S.) 80 39 japanil. 73 48 EC10 (Italia) 84 48 10 VI. Teollinen käytettävyys Tässä identifioituja epitooppeja voidaan käyttää polypep-tidituotteiden valmistukseen kuten edellä on kuvailtu käyttösovellutuksiin, joita ovat HCV-infektion seulonta verestä, 15 HCV:n klininen diagnoosi, vasta-ainetuotanto ja lääkkeiden valmistaminen. Muita käyttösovellutuksia on kuvailtu edellä ja vielä muut sovellutukset tulevat helposti selviksi alaa tunteville henkilöille.
• · i i i • I < · 54 110099
Eir^sllisuusluattalo
Bair et al, Biotechniqnes (1986) 1:428.
Bradley et al, Gastroenterology (1985) 18:773.
5 Bobein, gene (1979) £:17.
M.A. BriBtoa, (1986) julkaisussa "The Viruses: The Togaviridae and Flaviviridae" eos. i'laenkei-Coarat ja Wagner, vol. edit. Schlesinger ja Schlesinger, Plenum Press), s. 327-374.
Broach (1981) julkaisussa: "Molecular Biology of the Yeast-Saccharomyces", 10
Voi. 1, s. 445, Cold Spring Harbor Press.
Broach ex al., Meth Enzymol (1983) 101:307.
Catty (1988), "Antibodies, Volume 1: A Practical Approach" (IRL Press).
Chaney et al, Cell Mol Genet (1986) 12:237.
15 Chakrabard et al., Mol Cell Biol (1985) 5:3403.
Chang et al., Nature (1977) 12£: 1056.
Chen j a Seeburg. DNA (19851 4:165.
Cbirgwin et al, Biochemistry (1979) 11:5294.
Chomczynski ja Sacchi, Anal Blochem (1987) 162:156.
20 Choo et al., Science (1989) 244:359.
Cle^eB et al, Proc Natl Acad _Sci USA (1969) 52:1159.
Clewell, J Bacteriol (1972) Hfl:667.
;;;' Cohen, Proc Natl Acad Sci USA (1972) 52:2110.
' · · ^ Cousens et al, Gene (1987) 51:265.
De Boer et al.. Proc Natl Acad Sci USA (19831 292:128.
: : : Dreesman et al., J Infect Pis (1985) 151:761.
»« « : · ‘ S.M. Fein stone ja J.H. Hocfhagle, ftew Engl J Med (1984) 311:185.
'·' Feigner et al., Proc Natl Acad Sci USA (1937) £4:7413.
in Fields & Snipe (1986), 'Fundamental Virology' (Saven Press, N.Y.).
• " · · ~i vr-.________ 171.11¾ • · lUCIS ci ut., iiatmc tllio) Lf 3.113.
..} S.J. GzTStyetal. julkaisussa "Viral Hepatitis and Liver Disease" (B.N. Vyas, : J.L. Dienstag, ja J.H. Hoofnagle, eds) : : Glennie et al., Nature (1932) 295:712.
Gluzman, Cell (1931) 22:175.
Goeddel et al., Nuc Adds Res (1980) £:4057.
== 110099
Graham ja Van der Eb, Virology (1978) 52:546.
Gmsstsm jaEogness, Proc Natl Acad Sci USA (1975) 22:3961.
Grych it al., Nature (1985) 316:74.
Gubier ja Hoffman Gene (1983) 25:263.
Hahn, Virology (1988) 132:167.
Hammerilng eiaL, (1981), "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hyhridomas*.
Han, Biochemistry (1987) 23:1617. l 0 Hdfman, Pros Natl Acad Sci USA (1983) 3Q:31.
Hess et al., J Adv Enzyme Re; (1963) 2:149.
Hinaen el al., Proc Natl Acad Sci USA (1978) 75:1929.
Kitzsman et al., J Biol Cbem (1980) 255:2073.
Holland el oL, Biochemistry (1978) 17:4900.
15 Holland, 1 Biol Cbem (1981) 253:1385.
Holland ja Holland, J Biol Chem (1980) 255:2596.
Hoopes et al.. Nuc Acids Res (198119:5493.
Houghton el aL, Nuc Acids Res (1981) 2:247 T.V. Hunyh et al., (1985) in "DNA Cloning Techniques; A Practical Approach’ 20 (D. Glover, Ed., IRL Press, Oxford, U.X.) ss. 49-78.
MiBltiLBex (1982) 32:185.
Ito et al, Agric Biol Chem (1984) 4g:341.
. ' .' Iwarsoa, British Medical J (1987) 295:946.
" £5* Kenned et al. (19S0) "Monoclonal Antibodies".
Kniskem era/., Gens (1986) 43:135.
:.: : Kyte ja Doolittle, J Mol Bio (1982) 152:105-132.
j/ Laemmli, Nature (1970) 222:680.
·Lee et al., Science (1988) 222:1288.
30 Luckcw ja Summers, Virol (1989) 12:31. biacker, et al., J Virol (1984) 42:857.
/,/ T. Maniatis et al. (1982) "Molecular Cloning; A Laboratory Manual" (Cold ./. Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
. * · ·. Sambreok et al. (1989), "Molecular Cloning; A laboratory Manual", Second 'Ji· * , *. Edition (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
*// Manning ia Mccarski. Virol (1988) 167:477.
56 110099
Mayer 3a Walker, eds. (1987), "Immunochemical Methods Ia Cell And Molecular Biology" (Academic Press, tendon).
_ Maxam et al., Meth Enzvmol (1980) £5:499.
5
MacNaznara et al., Science (1984) 226:1325.
Messing et al., Nuc Acids Res (1981) 2:309.
Messing, Meth Enzvmol (1983) 101:20-37.
Michelle et al., lat. Symposium on Viral Hepatitis.
10 Mcnath (1986) julkaisussa "The Viruses: The Togaviradae and Flaviviridae" i^ialeiie^Comi Da Wagner, vol. edit. Schlesinger ja Schlesinger, Plenum Press),ss. 375-440.
Moss (1987) julkaisussa "Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells" (Miller 5¾ ,C6ci<f Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), p. 10.
15 Nagahuma et al., Anal Biochem (1984) 141:74.
Neuraih et al., Science (1984) 224:392.
Nisonoff et al., Clin Immunol Immunopathol (1981) 21:397-406.
L.R. Overby, Carr Hepatol (1985) 5:49.
L.R. Overby, Curr Hepatol (1986) £:65.
L.R. Overby, Carr Hepatol (1987) 7:35.
Pachl et al., J Virol (1987) ¢1:315.
•. . Peleg, Nature (1969) 221:193.
.·**. Pfefferkorn and Shapiro (1974), julkaisussa "Comprehensive virology”, Vol. 2 25. (Fraenkel-Conrat & Wagner, edit. Plenum, N.Y.) ss. 171-230.
: A.M. Prince. Ann Rev Microbiol (19831 37:217.
: , . Rice et al., Science (1985) 222:726.
. : . Sice et al. (1986) '-julkaisussa "The Viruses: life Ttxpviridae and Flaviviridae" (Series eds. Fraenkel-Conrat ja Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), p.279-328.
Roehrig (1986) julkaisussa "The Viruses; The Tbgaviridae and Haviviridae" (Series edit.
' · ‘ Fraenkel-Conrat ja Wagner, vol. edit. Schleringpr ja Schlesingm:, Pierun '·'·· Press) ’y' Sadler et al., Gene (1930) £:279.
: :: SaOri et al., Nature (1986) 22|: 163.
: : Ssiki et al., Science (1988) 239:487.
57 110 0 9 9
Sanger et al., Proc Natl Acad Sei USA (1977) 74:5463.
Setlow, ed. (1988), "Genetic Engineering" Vol. 10, Ss. 195-219 (Plenum _ Publishing Co., N.Y.
5
Schlesinger et ai., J Virol (1986) £0:1153.
M. Schreier etal., (1980) "Hybridoma Techniques"
Scopes (1984), "Protein Purification, Principles and Practice" t 2. painos (Springer-Verlag, N.Y.).
2 0 Shimatake et aL, Nature (1981) 292:128.
Singh et al., Nuc Acids Res (1983) 11:4049.
Sippel, Eur J Biochem (1973) 22:31.
Smith et al., Mol Cell Biol (1983) 2:2156-2165.
Steimer et aL, J Virol (1986) 58*.9.
15 Stollar (1980), in "The Togavimses’(R.W. Schlesinger, edit.), ss. 584-622.
Stuve et aL, J Virol (1987) £1:326.
Sumiyoshi et al., Virol (1987) 161:497.
Taylor et aL, Biochim Biophys Acta (1976) 442:324.
Towbin et al., Proc Natl Acad Sri USA (1979) 20:4350.
Tsu ja Herzenberg (1980), in "Selected Methods In Cellular Immunology" (W.H. Freeman and Co.) ss, 373-391.
Vytdehaag et al, J Immunol (1985) 134:1225.
•' P. Valenzuela et al., Nature (1982) 298:344.
‘ -25 P. Valenzuela et al., (1984), in "Hepatitis B” (I. MUlman et al, ed, Plenum ·.'·* Press) ss. 225-236. ' : :: Warner. DNA Π984) 3:401.
: Ward et al, Nature (1989) 341:544.
*.' * Wu iaGrossman. MethEnzvmol (1987). 154 "RecombinantDNA". Osa E.
30 Wu, Meth Enzvmol (1987), 155. "Recombinant DNA", osa F.
:.'* *: ZoUer, Nuc Acids Res (1982) 1Q:6487.
‘...: us-patientH nro 4,341,761 OB-pabsntti nro. 4,466,917 : ;*; LE^atentti nrq 4,399,121 iB^ateTOti nro 4,472,500 .···. lE-pata±ti nro 4,427,783 IB^atentti nro 4 491 632 '35. ‘ : lE-pataentti nro 4,444,887 lE-pert^±ti nro· 4·»493,890 ,···, US-patentti nro 4·»816,467
Claims (13)
1. Menetelmä HCV-vasta-aineen kanssa immunoreaktiivisen polypeptidin valmistamiseksi, jossa polypeptidissä mainitun
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun segmentin pituus on enintään noin 20 aminohappoa.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun segmentin pituus on enintään noin 15 Y; aminohappoa.
4. Menetelmä HCV-vasta-aineen kanssa immunoreaktiivisen ' 25 oktameeri-polypeptidin valmistamiseksi, jossa oktameerillä on asemissa 2280-2287 (AA2280 - AA2287) esitetty • f aminohapposekvenssi kuvion 1 mukaisesti, tunnettu siitä, että a) valmistetaan ekspressiovektori, joka sisältää mainittua polypeptidiä koodaavaa DNA:ta ja ilmennetään ja eristetään ‘,'•[30 mainittu polypeptidi, tai \Y b) syntetisoidaan mainittu polypeptidi kemiallisesti in , , ·, vitro.
5. Menetelmä HCV-vasta-aineen kanssa immunoreaktiivisen Y j35 polypeptidin valmistamiseksi, jossa polypept idissä mainitun ; HCV-vasta-aineen kanssa reaktiivinen, immunoreaktiivinen osuus on HCV-polypeptidin segmentti, joka käsittää aminohapot 540-547 (AA540 - AA547) kuvion 1 mukaisesti, ja jossa 110099 mainitun segmentin pituus on enintään noin 25 aminohappoa, tunnettu siitä, että a) valmistetaan ekspressiovektori, joka sisältää mainittua polypeptidiä koodaavaa DNA:ta ja ilmennetään ja eristetään 5 mainittu polypeptidi, tai b) syntetisoidaan mainittu polypeptidi kemiallisesti in vitro.
5 HCV-vasta-aineen kanssa reaktiivinen, immunoreaktiivinen osuus on HCV-polypeptidin segmentti, joka käsittää aminohapot 413-420 (AA413 - AA420) kuvion 1 mukaisesti, ja jossa mainitun segmentin pituus on enintään noin 25 aminohappoa, tunnettu siitä, että 10 a) valmistetaan ekspressiovektori, joka sisältää mainittua polypeptidiä koodaavaa DNA:ta ja ilmennetään ja eristetään I mainittu polypeptidi, tai b) syntetisoidaan mainittu polypeptidi kemiallisesti in vitro. 15
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 10 että mainitun segmentin pituus on enintään noin 20 aminohappoa.
7. Menetelmä HCV-vasta-aineen kanssa immunoreaktiivisen polypeptidin valmistamiseksi, jossa polypeptidissä mainitun
15 HCV-vasta-aineen kanssa reaktiivinen, immunoreaktiivinen osuus on HCV-polypeptidin enintään 20 aminohapon segmentti, jonka aminoterminaalinen aminohappo on kuvion 1 aminohappo 1218, tunnettu siitä, että a) valmistetaan ekspressiovektori, joka sisältää mainittua 20 polypeptidiä koodaavaa DNA:ta ja ilmennetään ja eristetään mainittu polypeptidi, tai b) syntetisoidaan mainittu polypeptidi kemiallisesti in . · ’ ·. vitro. '.25
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, HV että mainitun HCV-vasta-aineen kanssa reaktiivinen, immunoreaktiivinen osuus koostuu kuvion 1 aminohapoista 1218-’’ 1225. •, · ;30
9. Menetelmä HCV-vasta-aineen kanssa immunoreaktiivisen ' polypeptidin valmistamiseksi, jossa polypeptidissä mainitun HCV-vasta-aineen kanssa reaktiivinen, immunoreaktiivinen ! osuus on HCV-polypeptidin segmentti, joka käsittää aminohapot V 465-472 (AA465 - AA472) kuvion 1 mukaisesti, ja jossa : * ;35 mainitun segmentin pituus on enintään noin 20 aminohappoa, : tunnettu siitä, että a) valmistetaan ekspressiovektori, joka sisältää mainittua polypeptidiä koodaavaa DNA:ta ja ilmennetään ja eristetään 60 110099 mainittu polypeptidi, tai b) syntetisoidaan mainittu polypeptidi kemiallisesti in vi tro.
10. Menetelmä HCV-vasta-aineen kanssa immunoreaktiivisen polypeptidin valmistamiseksi, jossa polypeptidissä mainitun HCV-vasta-aineen kanssa reaktiivinen, immunoreaktiivinen osuus on HCV-polypeptidin segmentti, joka käsittää aminohapot 2244-2251 (AA2244 - AA2251) kuvion 1 mukaisesti, ja jossa 10 mainitun segmentin pituus on enintään noin 25 aminohappoa, tunnettu siitä, että a) valmistetaan ekspressiovektori, joka sisältää mainittua polypeptidiä koodaavaa DNA:ta ja ilmennetään ja eristetään mainittu polypeptidi, tai 15 b) syntetisoidaan mainittu polypeptidi kemiallisesti in vitro.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun segmentin pituus on enintään noin 20 20 aminohappoa.
·.·. 12. Menetelmä HCV-vasta-aineen kanssa immunoreaktiivisen polypeptidin valmistamiseksi, jossa polypeptidissä mainitun HCV-vasta-aineen kanssa reaktiivinen, immunoreaktiivinen ,· :25 osuus on HCV-polypeptidin enintään 20 aminohapon segmentti, · · ·” · jonka aminoterminaalinen aminohappo on kuvion 1 aminohappo • .* 1940, tunnettu siitä, että v · a) valmistetaan ekspressiovektori, joka sisältää mainittua polypeptidiä koodaavaa DNA:ta ja ilmennetään ja eristetään '/'.ho mainittu polypeptidi, tai b) syntetisoidaan mainittu polypeptidi kemiallisesti in vitro. i t » • I · I
> '··*' 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu : :‘|35 siitä, että mainitun HCV-vasta-aineen kanssa reaktiivinen, immunoreaktiivinen osuus koostuu kuvion 1 aminohapoista 1940-1947. ei 110099
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US72248991A | 1991-06-24 | 1991-06-24 | |
US72248991 | 1991-06-24 | ||
US9205388 | 1992-06-24 | ||
PCT/US1992/005388 WO1993000365A2 (en) | 1991-06-24 | 1992-06-24 | Hepatitis c virus (hcv) polypeptides |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI935808A0 FI935808A0 (fi) | 1993-12-22 |
FI935808A FI935808A (fi) | 1994-02-21 |
FI110099B true FI110099B (fi) | 2002-11-29 |
Family
ID=24902063
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI935808A FI110099B (fi) | 1991-06-24 | 1993-12-22 | Menetelmä hepatiitti C-viruksen (HCV) polypeptidien valmistamiseksi |
FI20021626A FI111645B (fi) | 1991-06-24 | 2002-09-11 | Immuunimäärityksen reagenssi ja menetelmä hepatiitti C-viruksen (HCV) vasta-aineiden havaitsemiseksi |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI20021626A FI111645B (fi) | 1991-06-24 | 2002-09-11 | Immuunimäärityksen reagenssi ja menetelmä hepatiitti C-viruksen (HCV) vasta-aineiden havaitsemiseksi |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6346375B1 (fi) |
EP (1) | EP0591431B1 (fi) |
JP (9) | JP3516681B2 (fi) |
KR (1) | KR0185426B1 (fi) |
AT (1) | ATE229543T1 (fi) |
BG (1) | BG61843B1 (fi) |
CA (1) | CA2110058C (fi) |
DE (1) | DE69232871T2 (fi) |
ES (1) | ES2188583T3 (fi) |
FI (2) | FI110099B (fi) |
HU (1) | HU227547B1 (fi) |
NO (1) | NO309528B1 (fi) |
RO (1) | RO117329B1 (fi) |
RU (1) | RU2148587C1 (fi) |
UA (1) | UA40572C2 (fi) |
WO (1) | WO1993000365A2 (fi) |
Families Citing this family (85)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6861212B1 (en) | 1987-11-18 | 2005-03-01 | Chiron Corporation | NANBV diagnostics and vaccines |
US5698390A (en) * | 1987-11-18 | 1997-12-16 | Chiron Corporation | Hepatitis C immunoassays |
US5712088A (en) * | 1987-11-18 | 1998-01-27 | Chiron Corporation | Methods for detecting Hepatitis C virus using polynucleotides specific for same |
US5714596A (en) * | 1987-11-18 | 1998-02-03 | Chiron Corporation | NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus |
US6171782B1 (en) | 1987-11-18 | 2001-01-09 | Chiron Corporation | Antibody compositions to HCV and uses thereof |
US6027729A (en) * | 1989-04-20 | 2000-02-22 | Chiron Corporation | NANBV Diagnostics and vaccines |
US5582968A (en) * | 1990-02-16 | 1996-12-10 | United Biomedical, Inc. | Branched hybrid and cluster peptides effective in diagnosing and detecting non-A, non-B hepatitis |
US5639594A (en) * | 1990-02-16 | 1997-06-17 | United Biomedical, Inc. | Linear and branched peptides effective in diagnosing and detecting non-A, non-B hepatitis |
GB9204274D0 (en) * | 1992-02-28 | 1992-04-08 | Wellcome Found | Novel peptides |
US6709828B1 (en) | 1992-03-06 | 2004-03-23 | N.V. Innogenetics S.A. | Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes and their use in a process for determination of antibodies or biotinylated peptides corresponding to immunologically important epitopes, a process for preparing them and compositions containing them |
US6667387B1 (en) | 1996-09-30 | 2003-12-23 | N.V. Innogenetics S.A. | HCV core peptides |
DE4240980A1 (de) * | 1992-08-07 | 1994-02-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV |
BR9405334A (pt) | 1993-04-27 | 1999-05-25 | Innogenetics Nv | Novas sequências de genótipos de vírus da hepatite c e seu uso como agentes terapêuticos e diagnóstico |
US7255997B1 (en) | 1993-04-27 | 2007-08-14 | N.V. Innogenetics S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
PL175338B1 (pl) | 1993-05-10 | 1998-12-31 | Chiron Corp | Polipeptyd i reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) |
CA2162557C (en) | 1993-05-12 | 2004-09-28 | Amy J. Weiner | Conserved motif of hepatitis c virus e2/ns1 region |
US5514539A (en) * | 1993-06-29 | 1996-05-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
US5639856A (en) * | 1993-09-13 | 1997-06-17 | The Regents Of The University Of California | Semaphorin gene family |
EP0729973A4 (en) * | 1993-10-29 | 1998-12-30 | Srl Inc | AN ANTIQUE PEPTIDE COMPOUND AND IMMUNOASSAY PROCEDURE |
US6555114B1 (en) | 1993-11-04 | 2003-04-29 | Innogenetics N.V. | Immunodominant human T-cell epitopes of hepatitis C virus |
US5709995A (en) | 1994-03-17 | 1998-01-20 | The Scripps Research Institute | Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses |
DE69526973T3 (de) * | 1994-10-21 | 2010-01-07 | Innogenetics N.V. | Sequenzen von hepatitis-c-virus genotype 7, und deren verwendung als vorbeugende, therapeutische und diagnostische mittel |
GB2294690B (en) * | 1994-11-01 | 1998-10-28 | United Biomedical Inc | Peptides effective for diagnosis and detection of hepatitis C infection |
US6034064A (en) * | 1995-04-07 | 2000-03-07 | Hoechst Pharmaceuticals & Chemicals K.K. | Peptides and therapeutic agent for autoimmune diseases containing the same |
JPH08333390A (ja) * | 1995-04-07 | 1996-12-17 | Hoechst Japan Ltd | ペプチド及びそれからなる自己免疫疾患治療剤 |
WO1996034013A1 (fr) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Srl, Inc. | Compose peptidique antigenique et methode de dosage immunologique |
GB9513261D0 (en) * | 1995-06-29 | 1995-09-06 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
US6127116A (en) | 1995-08-29 | 2000-10-03 | Washington University | Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof |
JP3945822B2 (ja) * | 1996-05-24 | 2007-07-18 | カイロン コーポレイション | 複数エピトープ融合タンパク質 |
US6514731B1 (en) | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
US7049428B1 (en) | 1998-03-04 | 2006-05-23 | Washington University | HCV variants |
US7338759B1 (en) | 1997-03-04 | 2008-03-04 | Washington University | HCV variants |
ES2316171T3 (es) | 1997-09-22 | 2009-04-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Tampones para estabilizar antigenos hcv. |
DK1471074T3 (da) * | 1998-04-17 | 2008-11-17 | Innogenetics Nv | Fremgangsmåder til forbedring af konformationen af proteiner ved hjælp af reduktionsmidler |
US7052830B1 (en) * | 1998-06-09 | 2006-05-30 | Branch Andrea D | Hepatitis C virus peptides and uses thereof |
US7052696B2 (en) * | 1998-07-10 | 2006-05-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Antigenic epitopes and mosaic polypeptides of hepatitis C virus proteins |
US6191256B1 (en) * | 1998-11-20 | 2001-02-20 | Bayer Corporation | Recombinant factor VIII binding peptides |
WO2001021189A1 (en) * | 1999-07-19 | 2001-03-29 | Epimmune Inc. | Inducing cellular immune responses to hepatitis c virus using peptide and nucleic acid compositions |
ATE348337T1 (de) | 2000-06-15 | 2007-01-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Hcv-antigen/antikörper-kombinations-assay |
ATE517184T1 (de) | 2000-08-17 | 2011-08-15 | Tripep Ab | Hcv ns3/4a kodierende nukleinsäure |
US6858590B2 (en) | 2000-08-17 | 2005-02-22 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
US6680059B2 (en) | 2000-08-29 | 2004-01-20 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
US7022830B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
EP1195381A1 (de) * | 2000-09-28 | 2002-04-10 | Immusystems GmbH | CD4+ T-Lymphozyten spezifische Hepatitis C Virus-Epitope |
US7048930B2 (en) | 2001-04-24 | 2006-05-23 | Innogenetics N.V. | Expression of core-glycosylated HCV envelope proteins in yeast |
AU2002311897A1 (en) * | 2001-05-09 | 2002-11-18 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid detection in pooled samples |
US7196183B2 (en) | 2001-08-31 | 2007-03-27 | Innogenetics N.V. | Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent |
US20030100467A1 (en) * | 2001-09-12 | 2003-05-29 | Wolfgang Aehle | Binding phenol oxidizing enzyme-peptide complexes |
AR045702A1 (es) | 2001-10-03 | 2005-11-09 | Chiron Corp | Composiciones de adyuvantes. |
US7332269B2 (en) * | 2001-11-11 | 2008-02-19 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | HCV core protein sequences |
AU2003214076A1 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-09 | Intercell Ag | Method for isolating ligands eg T cell epitopes |
AU2003218111B8 (en) * | 2002-03-11 | 2008-11-20 | Lab 21 Limited | Methods and compositions for identifying and characterizing hepatitis C |
AU2003301865A1 (en) * | 2002-05-16 | 2004-06-07 | The General Hospital Corporation | Epitopes of hepatitis c virus |
FR2839722A1 (fr) * | 2002-05-17 | 2003-11-21 | Bio Merieux | Nouvelles compositions peptidiques et leur utilisation notamment dans la preparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l'hepatite c |
AU2003254585A1 (en) * | 2002-07-24 | 2004-02-16 | Intercell Ag | Antigens encoded by alternative reading frame from pathogenic viruses |
EP1546414B1 (en) | 2002-09-09 | 2008-10-08 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Hcv assay |
AU2003258672B2 (en) | 2002-09-13 | 2008-10-30 | Intercell Ag | Method for isolating hepatitis C virus peptides |
CN1756843B (zh) | 2003-03-04 | 2012-03-21 | 英特塞尔股份公司 | 化脓链球菌抗原 |
AU2004224746B2 (en) | 2003-03-24 | 2009-04-23 | Valneva Austria Gmbh | Improved vaccines |
AU2004224747A1 (en) * | 2003-03-24 | 2004-10-07 | Intercell Ag | Use of Alum and a th1 immune response inducing adjuvant for enhancing immune responses |
AU2004230244B2 (en) | 2003-04-15 | 2011-09-22 | Intercell Ag | S. pneumoniae antigens |
US7731967B2 (en) | 2003-04-30 | 2010-06-08 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Compositions for inducing immune responses |
CN1822856B (zh) | 2003-07-11 | 2010-04-28 | 英特塞尔股份公司 | Hcv疫苗 |
US20050202036A1 (en) * | 2003-07-22 | 2005-09-15 | Branch Andrea D. | Alternate reading frame polypeptides drived from hepatitis C and methods of their use |
US8124747B2 (en) | 2003-08-29 | 2012-02-28 | Innogenetics | HCV clade and prototype sequences thereof |
FR2859909B1 (fr) | 2003-09-22 | 2007-09-07 | Biomerieux Sa | Procede de preparation de microparticules bioresorbables, microparticules obtenues et utilisation |
EP1735336A2 (en) * | 2004-04-16 | 2006-12-27 | Genentech, Inc. | Omi pdz modulators |
ATE542140T1 (de) * | 2004-08-27 | 2012-02-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Nichtstrukturelle hcv-proteinmutanten und verwendungsmöglichkeiten dafür |
JP4897792B2 (ja) | 2005-04-20 | 2012-03-14 | ビロメッド カンパニー, リミテッド | 融合タンパク質の分離のための組成物および方法 |
EP1888751A2 (en) * | 2005-05-25 | 2008-02-20 | Tripep Ab | A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene |
JP5474547B2 (ja) | 2006-08-25 | 2014-04-16 | ノバルティス アーゲー | Hcv融合ポリペプチド |
JP4975600B2 (ja) * | 2007-03-16 | 2012-07-11 | シスメックス株式会社 | Hcv抗体測定用試薬キット及びhcv抗体測定方法 |
US20090214593A1 (en) * | 2007-08-16 | 2009-08-27 | Tripep Ab | Immunogen platform |
EP2185195A2 (en) | 2007-08-16 | 2010-05-19 | Tripep Ab | Immunogen platform |
EP3067048B1 (en) | 2007-12-07 | 2018-02-14 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Compositions for inducing immune responses |
US20100104555A1 (en) * | 2008-10-24 | 2010-04-29 | The Scripps Research Institute | HCV neutralizing epitopes |
EP3424495A1 (en) | 2011-07-06 | 2019-01-09 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids |
CA2840965C (en) | 2011-07-06 | 2021-03-02 | Novartis Ag | Cationic oil-in-water emulsions |
FR2984328B1 (fr) | 2011-12-20 | 2016-12-30 | Bio-Rad Innovations | Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c |
WO2013150450A1 (en) * | 2012-04-02 | 2013-10-10 | Universidade Do Porto | Hcv homolog fragments, cell-lines and applications thereof |
EP2968526A4 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-09 | Abbott Lab | ANTIGEN-ANTIBODY COMBINATION ASSAY OF HEPATITIS C VIRUS AND METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE THEREWITH |
CN105209616A (zh) | 2013-03-14 | 2015-12-30 | 雅培制药有限公司 | 用于改进的抗体检测的hcv ns3重组抗原及其突变体 |
CN113549148A (zh) | 2013-03-14 | 2021-10-26 | 雅培制药有限公司 | Hcv核心脂质结合结构域单克隆抗体 |
JP6859314B2 (ja) | 2015-03-27 | 2021-04-14 | オーソ−クリニカル・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッドOrtho−Clinical Diagnostics, Inc. | Hcv ns4a/改変されたns3ポリペプチド及びその使用 |
CN111153963B (zh) * | 2020-01-19 | 2021-08-10 | 华南理工大学 | 抗炎五肽及其提取分离方法和在改善记忆中的应用 |
Family Cites Families (50)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4861588A (en) * | 1985-02-05 | 1989-08-29 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
US5350671A (en) * | 1987-11-18 | 1994-09-27 | Chiron Corporation | HCV immunoassays employing C domain antigens |
YU48038B (sh) | 1987-11-18 | 1996-10-18 | Chiron Corp. | Postupak za dijagnostiku ne-a, ne-v hepatitisa |
CN1049686C (zh) * | 1987-11-18 | 2000-02-23 | 希龙股份有限公司 | 非a和非b肝炎病毒的诊断及疫苗 |
US5312737A (en) | 1988-03-11 | 1994-05-17 | Abbott Laboratories | CKS method of HCV protein synthesis |
KR0185373B1 (ko) * | 1989-03-17 | 1999-05-01 | 로버트 피. 블랙버언 | Hcv 폴리단백질에서 유래되는 hcv 아미노산 서열 부분을 포함하는 폴리펩티드 및 그 사용 |
EP0416725A3 (en) | 1989-07-14 | 1991-03-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Blood-borne non-a, non-b hepatitis specific protein, dna encoding it, and process for its production |
JP2818761B2 (ja) | 1989-09-14 | 1998-10-30 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 非a非b型肝炎ウイルス抗原をコードする核酸断片およびその利用法 |
JP3156200B2 (ja) * | 1989-09-15 | 2001-04-16 | 国立予防衛生研究所長 | 新規のhcv分離株 |
US5372928A (en) | 1989-09-15 | 1994-12-13 | Chiron Corporation | Hepatitis C virus isolates |
NO905438L (no) * | 1989-12-18 | 1991-06-19 | Wellcome Found | Virusmiddel. |
JPH03190898A (ja) | 1989-12-21 | 1991-08-20 | Shima Kenkyusho:Kk | 合成ポリペプチド及びそれを用いたhcv抗体測定試薬 |
AU638304B2 (en) * | 1989-12-22 | 1993-06-24 | Abbott Laboratories | Hepatitis c assay |
EP0435229A1 (en) | 1989-12-27 | 1991-07-03 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | DNA of non-A, non-B hepatitis virus gene, its clone and use thereof |
KR940000755B1 (ko) * | 1990-02-16 | 1994-01-29 | 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 | Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드 |
US5106726A (en) * | 1990-02-16 | 1992-04-21 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV |
AU7675491A (en) | 1990-04-04 | 1991-10-30 | Chiron Corporation | Hepatitis c virus protease |
AU660925B2 (en) * | 1990-04-06 | 1995-07-13 | Genelabs Technologies, Inc. | Hepatitis C virus epitopes |
JPH044880A (ja) | 1990-04-20 | 1992-01-09 | Terumasa Arima | 非a非b型肝炎抗原をコードするdna及びポリペプチド |
JP3268502B2 (ja) | 1990-06-12 | 2002-03-25 | 徹雄 中村 | 非a非b型肝炎ウイルス関連ポリヌクレオチド、ポリペプ タイド |
JPH0446196A (ja) | 1990-06-13 | 1992-02-17 | Kuraray Co Ltd | 抗原蛋白質およびそれをコードしているdna断片 |
EP0464287A1 (en) | 1990-06-25 | 1992-01-08 | The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University | Non-A, non-B hepatitis virus genomic cDNA and antigen polypeptide |
AU652941B2 (en) | 1990-06-25 | 1994-09-15 | Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University, The | Non-A, Non-B hepatitis virus particles |
KR0181517B1 (ko) | 1990-07-09 | 1999-04-01 | 나까하라 노부유끼 | 비-에이 비-비형 간염-특이 항원 및 간염 진단에서 그의 용도 |
JPH04126086A (ja) | 1990-07-12 | 1992-04-27 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | 非a非b型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、該抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを用いた非a非b型肝炎の診断法 |
CA2047792C (en) | 1990-07-26 | 2002-07-02 | Chang Y. Wang | Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to hcv, diagnosis of hcv infection and prevention thereof as vaccines |
HUT69140A (en) | 1990-08-10 | 1995-08-28 | Chiron Corp | Nanbv diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis c virus |
CA2049679C (en) | 1990-08-24 | 2005-06-21 | Sushil G. Devare | Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens |
KR920004577A (ko) | 1990-08-24 | 1992-03-27 | 원본미기재 | 단백질 합성의 cks 방법 |
ATE346302T1 (de) | 1990-08-25 | 2006-12-15 | Bioprocess Pty Ltd | Nicht-a, nicht-b hepatitis virus antigen, und diagnostische verfahren. |
JP3055793B2 (ja) | 1990-09-07 | 2000-06-26 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 非a非b型肝炎ウイルス融合ペプチドおよびその製法 |
JPH04144686A (ja) | 1990-10-04 | 1992-05-19 | Kunitada Shimotoono | 構造蛋白質遺伝子、組換えベクター、それにより形質転換された大腸菌、ポリペプチドおよびポリペプチドの製造方法 |
JPH04159298A (ja) | 1990-10-19 | 1992-06-02 | Olympus Optical Co Ltd | Hcvペプチド |
ATE206717T1 (de) | 1990-11-03 | 2001-10-15 | Dade Behring Marburg Gmbh | Hcv-spezifische peptide, mittel dazu und ihre verwendung |
EP0485209A1 (en) | 1990-11-08 | 1992-05-13 | Immuno Japan Inc. | Non A, non B hepatitis virus related antigen, antibody detection systems, polynucleotides and polypeptides |
JPH04179482A (ja) | 1990-11-11 | 1992-06-26 | Kunitada Shimotoono | C型肝炎ウイルス由来の遺伝子 |
JPH04187090A (ja) | 1990-11-22 | 1992-07-03 | Toshio Shikata | 非a非b型肝炎抗原をコードするdna及びポリペプチド |
KR920703640A (ko) | 1990-11-29 | 1992-12-18 | 테루카츄 아리마 | 비a비b형 간염 바이러스 항원 단백질 |
DE69030124T2 (de) * | 1990-12-14 | 1997-09-18 | Innogenetics Nv | Synthetische Antigene zum Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis C-Virus |
DK0569537T3 (da) | 1991-01-31 | 1999-04-06 | Abbott Lab | Monoklonale antistoffer mod formodede HCV-kapperegioner og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
JP3244284B2 (ja) | 1991-02-14 | 2002-01-07 | 武田薬品工業株式会社 | C型肝炎ウイルス関連抗体および抗原の測定法 |
US5574132A (en) | 1991-04-05 | 1996-11-12 | Biochem Immunosystems Inc. | Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV) |
JPH0568562A (ja) | 1991-05-30 | 1993-03-23 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | ヒトC型肝炎ウイルスのcDNA、そのクローン及びこれらの利用法 |
JP3055964B2 (ja) | 1991-05-31 | 2000-06-26 | 株式会社トクヤマ | Hcv 抗原活性ポリペプチド、ポリペプチドの製造方法、形質転換された大腸菌、および抗hcv 抗体の検出方法 |
FR2677372B1 (fr) | 1991-06-06 | 1994-11-10 | Pasteur Institut | Sequences nucleotidiques et peptidiques d'un isolat de virus de l'hepatite c, applications diagnostiques et therapeutiques. |
CA2111108A1 (en) | 1991-06-10 | 1992-12-23 | Joong Myung Cho | Hepatitis c diagnostics and vaccines |
CA2070952A1 (en) | 1991-06-11 | 1992-12-12 | Makoto Seki | Gene of hepatitis c virus or fragment thereof, polypeptide encoded by the same |
CA2087974A1 (en) | 1991-06-13 | 1992-12-14 | David C. Leahy | Immunoassay for non-a non-b hepatitis |
JP3103180B2 (ja) | 1992-01-30 | 2000-10-23 | 昭和電工株式会社 | 軟質性合成樹脂製シート |
JP3190898B2 (ja) | 1998-11-09 | 2001-07-23 | 米沢日本電気株式会社 | ノート型パーソナルコンピュータ |
-
1992
- 1992-06-24 RO RO93-01778A patent/RO117329B1/ro unknown
- 1992-06-24 RU RU93058563A patent/RU2148587C1/ru active
- 1992-06-24 ES ES92914835T patent/ES2188583T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-24 UA UA93004481A patent/UA40572C2/uk unknown
- 1992-06-24 EP EP92914835A patent/EP0591431B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-24 WO PCT/US1992/005388 patent/WO1993000365A2/en active IP Right Grant
- 1992-06-24 KR KR1019930704022A patent/KR0185426B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-06-24 DE DE69232871T patent/DE69232871T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-24 AT AT92914835T patent/ATE229543T1/de active
- 1992-06-24 JP JP50167193A patent/JP3516681B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-24 HU HU9303703A patent/HU227547B1/hu unknown
- 1992-06-24 CA CA002110058A patent/CA2110058C/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-12-10 NO NO934542A patent/NO309528B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-12-22 FI FI935808A patent/FI110099B/fi not_active IP Right Cessation
- 1993-12-23 BG BG98332A patent/BG61843B1/bg unknown
-
1995
- 1995-03-14 US US08/403,590 patent/US6346375B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-18 US US08/444,818 patent/US6150087A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-11-25 JP JP33516799A patent/JP3514680B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-09-11 FI FI20021626A patent/FI111645B/fi not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-02-28 JP JP2003054819A patent/JP3514751B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-14 JP JP2003385979A patent/JP3619827B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-09-27 JP JP2004280446A patent/JP3926817B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-11-21 JP JP2006314880A patent/JP4456595B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2006-11-21 JP JP2006314881A patent/JP4456596B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-08-21 JP JP2007215324A patent/JP2008001716A/ja not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-10-20 JP JP2008270386A patent/JP2009084285A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI110099B (fi) | Menetelmä hepatiitti C-viruksen (HCV) polypeptidien valmistamiseksi | |
KR0185373B1 (ko) | Hcv 폴리단백질에서 유래되는 hcv 아미노산 서열 부분을 포함하는 폴리펩티드 및 그 사용 | |
RU2136311C1 (ru) | Иммуногенная полипептидная композиция, способ получения композиции, способ продуцирования и способ обнаружения антител, набор | |
ES2141081T5 (es) | Nuevo aislado de hcv j-1. | |
AU671594C (en) | Hepatitis C virus (HCV) polypeptides | |
FI105046B (fi) | Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen polypeptidin valmistamiseksi, rekombinanttivektori ja isäntäsolu | |
KR100187483B1 (ko) | Hcv 폴리뉴클레오티드 및 그 사용 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS, INC. Free format text: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS, INC. |
|
MA | Patent expired |