ES2141081T5 - Nuevo aislado de hcv j-1. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN DOS NUEVOS AISLAMIENTOS DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C (HCV), J1 Y J7. ESTOS NUEVOS AISLAMIENTOS COMPRENDEN SECUENCIAS NUCLEOTIDAS Y DE AMINOACIDOS QUE SON DISTINTAS DEL PROTOTIPO DE AISLAMIENTO DEL HCV, HCV1. DE ESTA FORMA, J1 Y J7 SUMINISTRAN NUEVOS POLINUCLEOTIDOS Y POLIPEPTIDOS PARA SU USO EN DIAGNOSTICOS, PRODUCCION DE PROTEINA RECOMBINANTE Y DESARROLLO DE VACUNAS.

Description

Nuevo aislado de HCV J-1.

Campo técnico

La presente invención se refiere a nuevos aislados de la clase vírica de la hepatitis C, a polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos derivados de los mismos, así como al uso de tales polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos en ensayos (por ejemplo inmunoensayos, ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, etc.) y en la producción de polipéptidos víricos.

Antecedentes

La hepatitis no-A, no-B (NANBH) es una enfermedad o familia de enfermedades transmisibles que se cree son inducidas por virus, y que se pueden distinguir de otras formas de enfermedades hepáticas asociadas con virus, incluyendo las causadas por los virus conocidos de la hepatitis, es decir, virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis B (HBV), y virus de la hepatitis delta (HDV), así como la hepatitis inducida por citomegalovirus (CMV) o virus de Epstein-Barr (EBV). La NANBH fue identificada por primera vez en individuos transfundidos. La transmisión del hombre al chimpancé y el traspaso en serie en chimpancés han proporcionado pruebas de que la NANBH está causada por un agente o agentes infecciosos transmisibles. La evidencia epidemiológica sugiere que puede haber tres tipos de NANBH: el tipo epidémico transmitido por el agua; el tipo asociado a la sangre o a agujas; y el tipo que ocurre esporádicamente (adquirido en la comunidad). Sin embargo, hasta una fecha reciente no se había identificado ningún agente transmisible responsable de la NANBH.

El diagnóstico e identificación clínicos de la NANBH se han llevado a cabo principalmente por exclusión de otros marcadores víricos. Entre los métodos empleados para detectar antígenos y anticuerpos putativos para la NANBH se encuentran la difusión agar-gel, contrainmunoelectroforesis, microscopía de inmunofluorescencia, microscopía inmuno-electrónica, radioinmunoensayo, y ensayo de inmunosorbente ligado a enzima. Sin embargo, ninguno de estos ensayos ha demostrado ser suficientemente sensible, específico y reproducible para ser utilizado como ensayo diagnóstico para NANBH.

Hasta fecha reciente no ha habido ni claridad ni acuerdo en la identidad o especificidad de los sistemas antígeno-anticuerpo asociados con los agentes de la NANBH. Es posible que la NANBH sea causada por más de un agente infeccioso, y no está claro qué es lo que los ensayos serológicos detectan en el suero de pacientes con NANBH.

En el pasado se han postulado distintos agentes candidatos de la NANBH. Véase, por ejemplo, Prince (1983) Ann. Rev. Microbiol. 37:217; Feinstone & Hoofnagle (1984) New England J. Med. 311:185; Overby (1985) Curr. Heptol. 5:49; Overby (1986) Curr. Heptol. 6:65; Overby (1987) Curr. Heptol. 7:35; e Iwarson (1987) British Med. J. 295:946. Sin embargo, no hay pruebas de que ninguno de estos candidatos representen el agente etiológico de la NANBH.

En 1987, Houghton y otros clonaron el primer virus asociado definitivamente con la NANBH. Véase, por ejemplo, la Publicación EPO número 318.216; Houghton y otros, Science 244:359 (1989). Houghton y otros han descrito en las publicaciones mencionadas la clonación de un aislado de una nueva clase vírica, el virus de la hepatitis C (HCV), denominándose "HCV1" al aislado prototipo descrito en las mismas. HCV es un virus similar a los Flavi-virus, con un genoma de ARN. Houghton y otros han descrito la producción de proteínas recombinantes a partir de secuencias de HCV que son útiles como reactivos de diagnóstico, así como polinucleótidos útiles en ensayos diagnósticos de hibridación y en la clonación de aislados de HCV adicionales.

La demanda de métodos sensibles y específicos para la exploración rápida y la identificación de portadores de NANBH y sangre o productos de la sangre contaminados con NANBH es significativa. La hepatitis post-transfusión (PTH) ocurre en aproximadamente 10% de los pacientes transfundidos, y la NANBH es responsable de hasta 90% de estos casos. Se da una frecuente progresión a lesión hepática crónica (25-55%).

El cuidado de los pacientes, así como la prevención de la transmisión de NANBH por la sangre o productos de la sangre, o por el contacto personal próximo, requiere herramientas de diagnosis y prognosis fiables para detectar ácidos nucleicos, antígenos y anticuerpos relacionados con la NANBH. Además, existe también la necesidad de vacunas y agentes terapéuticos inmunoterapéuticos eficaces para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad.

Aunque se ha identificado al menos un aislado de HCV que es útil para satisfacer las anteriores necesidades, aislados adicionales, en particular los que tengan un genoma divergente, pueden demostrar tener aplicaciones únicas.

Sumario de la invención

Se han caracterizado nuevos aislados de HCV procedentes de donantes de sangre japoneses que han sido identificados como portadores de NANBH. Estos aislados presentan heterogeneidad de secuencia de nucleótidos y de aminoácidos con respecto al aislado prototipo, HCV1, en varios dominios víricos. Se cree que estas secuencias distintas tienen importancia, en particular en ensayos diagnósticos y en el desarrollo de vacunas.

En una realización, la presente invención proporciona un polinucleótido en forma sustancialmente aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos de un aislado de HCV J-1, teniendo dicha secuencia de nucleótidos la secuencia de nucleótidos de la secuencia J-1 de una cualquiera de las Figuras 7 u 8.

En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que:

(a) está codificada por una secuencia de nucleótidos de la invención, estando dicha codificación en consonancia con las secuencias de aminoácidos correspondientes expuestas en las Figuras 7 u 8;

(b) comprende un determinante antigénico codificado por una secuencia de nucleótidos como se define en (a).

Aún otra realización de la presente invención proporciona un polipéptido de la invención inmovilizado sobre soporte sólido.

En una realización adicional de la presente invención se proporciona un inmunoensayo para detectar la presencia de anticuerpos anti-HCV en una muestra de ensayo, que comprende: (a) incubar la muestra de ensayo en condiciones que permitan la formación de complejos antígeno-anticuerpo con polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos de la invención o por la secuencia de nucleótidos presente en cualquiera de los plásmidos pU1-1216c o pS1-713c depositados con los números de acceso BP2594 y BP-2637 respectivamente, en donde el polipéptido no tiene inmunológicamente reactividad cruzada con HCV-1, y (b) detectar cualesquiera complejos antígeno-anticuerpo formados.

Aún otra realización de la presente invención proporciona un método para detectar polinucleótidos de HCV en una muestra de ensayo, que comprende: (a) proporcionar un polinucleótido de la invención en calidad de sonda; (b) poner en contacto la muestra de ensayo y la sonda en condiciones que permitan la formación de un dúplex de polinucleótidos entre la sonda y su complemento en ausencia de formación sustancial de dúplices de polinucleótidos entre la sonda y secuencias de polinucleótidos no-HCV presentes en la muestra de ensayo; y (c) detectar cualesquiera dúplices de polinucleótidos que comprendan la sonda.

Esta y otras realizaciones de la presente invención serán fácilmente evidentes para quienes tengan pericia ordinaria en la técnica, a la vista de la siguiente descripción.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de consenso de la cadena codificadora de un fragmento del dominio J7 C/E, con las heterogeneidades.

La Figura 2 muestra la secuencia de consenso de la cadena codificadora de un fragmento del dominio J1 E, con las heterogeneidades.

La Figura 3 muestra la secuencia de consenso de la cadena codificadora de un fragmento del dominio J1 E/NS1, con las heterogeneidades.

La Figura 4 muestra la secuencia de consenso de la cadena codificadora de un fragmento del dominio J1 NS3, con las heterogeneidades.

La Figura 5 muestra la secuencia de consenso de la cadena codificadora de un fragmento del dominio J1 NS5, con las heterogeneidades.

La Figura 6 muestra la homología de la secuencia de consenso de J7 C/E, con la secuencia de nucleótidos del mismo dominio de HCV1.

La Figura 7 muestra la homología de la secuencia de consenso de J1 E, con la secuencia de nucleótidos del mismo dominio de HCV1.

La Figura 8 muestra la homología de la secuencia de consenso de J1 E/NS1, con la secuencia de nucleótidos del mismo dominio de HCV1.

La Figura 9 muestra la homología de la secuencia de consenso de J1 NS3, con la secuencia de nucleótidos del mismo dominio de HCV1.

La Figura 10 muestra la homología de la secuencia de consenso de J1 NS5, con la secuencia de nucleótidos del mismo dominio de HCV1.

La Figura 11 muestra la organización genómica putativa del genoma de HCV1.

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La Figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos del ORF de HCV1. En la figura, el nucleótido número 1 es la primera A de la metionina iniciadora putativa del ORF grande; los nucleótidos aguas arriba de este nucleótido están numerados con números negativos.

La Figura 13 muestra la secuencia de consenso de la cadena codificadora de un fragmento del dominio J1 NS1 (J1 1519), con la secuencia de nucleótidos del mismo dominio de HCV1. También se muestran los aminoácidos codificados en las mismas.

La Figura 14 muestra una composición de la secuencia de consenso desde el núcleo hasta el dominio NS1 de J1 con la secuencia de nucleótidos del mismo dominio de HCV1. También se muestran los aminoácidos codificados en las mismas.

La Figura 15 muestra una secuencia de consenso de la cadena codificadora del dominio NS1 de J1, tal como se determina en el Ejemplo IV. También se muestran la secuencia de nucleótidos del mismo dominio de HCV1 y los aminoácidos codificados en las secuencias de HCV1 y J1.

La Figura 16 muestra una secuencia de consenso de una cadena codificadora de la región C200 del dominio NS3-NS4 de J1. También se muestran la secuencia de nucleótidos del mismo dominio de HCV1. Se muestran asimismo los aminoácidos codificados en las secuencias.

La Figura 17 muestra una secuencia de consenso de la cadena codificadora del dominio NS1 de J1, tal como se determina en el Ejemplo V. También se muestran la secuencia de nucleótidos del mismo dominio de HCV1 y los aminoácidos codificados en las secuencias.

La Figura 18 muestra una secuencia de consenso de la cadena codificadora de los dominios no traducidos y del núcleo de J1. También se muestran la secuencia de nucleótidos del mismo dominio de HCV1 y los aminoácidos codificados en las secuencias.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la pericia de la técnica. Tales técnicas están explicadas con detalle en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMES I AND II (compilado por D.N. Glover, 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (compilado por M.J. Gait, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (compilado por B.D. Hames & S.J. Higgins, 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (compilado por B.D. Hames & S.J. Higgins, 1984); ANIMAL CELL CULTURE (compilado por R.I. Freshney, 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (compilado por J.H. Miller y M.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzimology, volumen 154 y volumen 155 (compilados respectivamente por Wu y Grossman, y Wu), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, compilado por Mayer y Walker (1987), (Academic Press, Londres), Scopes (1987) PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, segunda edición (Springer-Verlag, N. Y.), y HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, volúmenes I-IV (compilados por D.M. Weir y C.C. Blackwell, 1986). Todas las patentes, solicitudes de patentes, y otras publicaciones mencionadas en la presente memoria, tanto en lo que antecede como en lo que sigue, quedan por la presente incorporadas en la presente memoria por de referencia.

La expresión "virus de la hepatitis C" ha sido reservada por quienes trabajan en el campo, para un agente etiológico, hasta ahora desconocido, de la NANBH. De acuerdo con esto, tal como se emplea en la presente memoria, "virus de la hepatitis C" (HCV) se refiere a un agente causante de NANBH, que ha sido anteriormente denominado NANBV y/o BB-NANBV, de la clase del aislado prototipo, HCV1, descrito por Houghton y otros. Véase, por ejemplo, la Publicación EPO número 318.216 y la solicitud de patente de EE.UU. de número de serie 355.002, presentada el 19 de mayo de 1989 (disponible en solicitudes no estadounidenses que reivindican prioridad de la misma), cuyas memorias descriptivas quedan por la presente incorporadas en la presente memoria por referencia. En la Figura 6 se muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia putativa de aminoácidos de HCV1. Los términos HCV, NANBV, y BB-NANBV se utilizan de manera intercambiable en la presente memoria. Como una extensión de esta terminología, la enfermedad causada por HCV, anteriormente denominada hepatitis NANB (NANBH), se denomina hepatitis C. Los términos NANBH y hepatitis C pueden ser utilizados de manera intercambiable en la presente memoria. El término "HCV", tal como se emplea en la presente memoria, designa una especie vírica cuyas cepas patógenas producen NANBH, así como cepas atenuadas o partículas interferentes defectuosas derivadas de la misma.

El HCV es un virus similar a los Flavivirus. La morfología y composición de partículas de Flavivirus son conocidas, y han sido discutidas por Brinton (1986) THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (serie compilada por Fraenkel-Conrat y Wagner, volumen compilado por Schlesinger y Schlesinger, Plenum Press), páginas 327-374. En general, por lo que se refiere a la morfología, los Flavivirus contienen un nucleocápsido central rodeado por una bicapa lipídica. Los viriones son esféricos y tienen un diámetro de aproximadamente 40-50 nm. Sus núcleos tienen aproximadamente 25-30 nm de diámetro. Sobre la superficie exterior de la envoltura del virión se encuentran proyecciones que tienen aproximadamente 5-10 nm de largo con botones terminales de aproximadamente 2 nm de diámetro.

El genoma de HCV está compuesto por ARN. Se sabe que los virus que contienen ARN tienen frecuencias de mutación espontánea relativamente altas, es decir, según se ha publicado, del orden de 10^{-3} a 10^{-4} por nucleótido incorporado. Por tanto, existen múltiples cepas, que pueden ser virulentas o no virulentas, dentro de la clase o especie HCV.

Se cree que el genoma de aislados de HCV está compuesto por un ORF único de aproximadamente 9.000 nucleótidos hasta aproximadamente 12.000 nucleótidos, que codifica una poliproteína similar en tamaño a la del HCV1, una poliproteína codificada de carácter hidrófobo y antigénico similar a la del HCV1, y la presencia de secuencias peptídicas co-lineales que se conservan con HCV1. Además, se cree que el genoma es un ARN de cadena positiva.

Los aislados de HCV comprenden epítopes que tienen reactividad inmunológica cruzada con epítopes en el genoma de HCV1. Al menos algunos de éstos son epítopes exclusivos de HCV cuando se comparan con otros Flavivirus conocidos. La exclusividad del epítope puede ser determinada por su reactividad inmunológica con anticuerpos anti-HCV y la falta de reactividad inmunológica con anticuerpos contra otras especies de Flavivirus. En la técnica se conocen métodos para determinar reactividad inmunológica, por ejemplo mediante radioinmunoensayo, mediante el ensayo ELISA, mediante hemoaglutinación, y en la presente memoria se ofrecen varios ejemplos de técnicas adecuadas para los ensayos.

Se espera también que la homología global a nivel de nucleótido de los genomas de aislados de HCV y de HCV1 sea probablemente alrededor de 40% o superior, probablemente alrededor de 60% o superior, e incluso más probablemente de alrededor de 80% a alrededor de 90% o superior. Además de esto existen muchas secuencias contiguas correspondientes de al menos alrededor de 13 nucleótidos que son completamente homólogas. La correspondencia entre la secuencia de un nuevo aislado y la secuencia de HCV1 puede ser determinada por técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede ser determinada mediante una comparación directa de la información de secuencia del polinucleótido del nuevo aislado y secuencias de HCV1. De manera alternativa, puede determinarse la homología por hibridación de los polinucleótidos en condiciones que forman dúplices estables entre regiones homólogas (por ejemplo aquellas que serían utilizadas antes de la digestión S_{1}), seguida de digestión con nucleasa o nucleasas específicas de cadena sencilla, seguida por determinación del tamaño de los fragmentos digeridos.

Debido a la relación evolutiva de las cepas o aislados de HCV, las cepas o aislados de HCV putativos son identificables por su homología a nivel de polipéptido. Así, se espera que los nuevos aislados de HCV sean más de alrededor de 40% homólogos, probablemente más de alrededor de 70% homólogos, e incluso más probablemente más de alrededor de 80% homólogos, y posiblemente incluso más probablemente más de alrededor de 90% homólogos a nivel de polipéptido. Las técnicas para determinar la homología de la secuencia de aminoácidos son conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar directamente la secuencia de aminoácidos y compararla con las secuencias proporcionadas en la presente memoria. De manera alternativa, se puede determinar la secuencia de nucleótidos del material genómico del HCV putativo, determinar la secuencia de aminoácidos codificada en la misma, y comparar las regiones correspondientes.

La Figura 12 muestra el ORF de HCV1. Han sido predichos para HCV1 (Figura 5) los dominios no estructurales, de núcleo y de envoltura de la poliproteína. Se cree que el polipéptido "C" o de núcleo, está codificado desde el extremo 5' hasta aproximadamente el nucleótido 345 de HCV1. Se cree que el dominio "E" o de envoltura, putativo, de HCV1 está codificado desde aproximadamente el nucleótido 346 hasta aproximadamente el nucleótido 1050. Se piensa que el dominio NS1 putativo, o dominio no estructural uno, está codificado desde aproximadamente el nucleótido 1051 hasta aproximadamente el nucleótido 1953. En cuanto a los dominios restantes, se piensa que el NS2 putativo está codificado desde aproximadamente el nucleótido 1954 hasta aproximadamente el nucleótido 3018, el NS3 putativo desde aproximadamente el nucleótido 3019 hasta aproximadamente el nucleótido 4950, el NS4 putativo desde aproximadamente el nucleótido 4951 hasta aproximadamente el nucleótido 6297, y el NS5 putativo desde aproximadamente el nucleótido 6298 hasta el extremo 3', respectivamente. Los límites anteriores son aproximaciones basadas en el análisis del ORF. Los límites exactos pueden ser determinados por los especialistas en la técnica a la vista de la presente memoria descriptiva.

"HCV1/J1" o "J1" y "HCV1/J7" o "J7" se refieren a nuevos aislados de HCV caracterizados por la secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria, así como a aislados relacionados que sean sustancialmente homólogos a los mismos; es decir, al menos aproximadamente 90% o aproximadamente 95% a nivel de nucleótido. Se cree que las secuencias descritas en la presente memoria caracterizan una subclase de HCV que es predominante en Japón y otros países de Asia y/o la cuenca del Pacífico. Pueden obtenerse aislados J1 y J7 adicionales a la vista de la descripción de la presente memoria y de la Publicación EPO número 318.216. En particular, las secuencias de nucleótido J1 y J7 descritas en la presente memoria, así como las secuencias de HCV1 de la Figura 12, pueden ser utilizadas como cebadores o sondas para clonar dominios adicionales de J1, J7, o aislados adicionales.

Tal como se emplea en la presente memoria, una secuencia de nucleótidos "de" una secuencia o fuente designada se refiere a una secuencia de nucleótidos que es homóloga (es decir, idéntica), o complementaria a la secuencia o fuente designada, o a una porción de la misma. Las secuencias J1 proporcionadas en la presente memoria comprenden la secuencia de las Figuras 7 u 8. La longitud máxima es el genoma vírico completo.

En algunos aspectos de la invención, la secuencia de la región de la cual se deriva el polinucleótido es preferentemente homóloga o complementaria a una secuencia que es exclusiva de un genoma de HCV o el genoma de J1 y J7. El que una secuencia sea o no exclusiva de un genoma puede ser determinado por técnicas conocidas para los especialistas en la técnica. Por ejemplo, se puede comparar la secuencia con secuencias en bancos de datos, por ejemplo Genebank, para determinar si está presente en el organismo huésped sin infectar u otros organismos. También se puede comparar la secuencia con las secuencias conocidas de otros agentes víricos, incluyendo los que se sabe inducen hepatitis, por ejemplo HAV, HBV, y HDV, y otros miembros de los Flaviviridae. La correspondencia o no correspondencia de la secuencia derivada con otras secuencias puede ser determinada también por hibridación en condiciones adecuadamente restrictivas. Las técnicas de hibridación para determinar la complementariedad de secuencias de ácidos nucleicos son conocidas en la técnica. Véase también, por ejemplo, Maniatis y otros (1982) MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Además, mediante técnicas conocidas pueden determinarse las discrepancias de polinucleótidos dúplex formados por hibridación, incluyendo, por ejemplo, la digestión con una nucleasa tal como S1 que digiere específicamente zonas de cadena sencilla en polinucleótidos dúplex. Las regiones de las cuales pueden derivarse secuencias de ADN típicas incluyen, pero sin estar limitadas a las mismas, regiones que codifican epítopes específicos, así como regiones no transcritas y/o regiones no traducidas.

El polinucleótido J1 no se deriva necesariamente de manera física de la secuencia de nucleótidos mostrada, sino que puede ser generado de cualquier manera, incluyendo, por ejemplo, síntesis química o replicación de ADN, o transcripción inversa o transcripción. Además, pueden modificarse combinaciones de regiones correspondientes a las de la secuencia designada, de maneras conocidas en la técnica que sean consistentes con el uso pretendido. Los polinucleótidos pueden contener también una o más marcas, que son conocidas para los especialistas en la técnica.

Una secuencia de aminoácidos "de" un polipéptido designado o fuente de polipéptidos designados significa que la secuencia de aminoácidos es homóloga (es decir, idéntica) a la secuencia del polipéptido designado, o a una porción de la misma. Una secuencia de aminoácidos "de" una secuencia de ácido nucleico designada se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un polipéptido codificado en la secuencia, o a una porción de la misma. Las secuencias de aminoácidos J1 de los polipéptidos de la presente invención comprenden la secuencia de las Figuras 7 u 8.

Los polipéptidos de la presente invención no han sido necesariamente traducidos de una secuencia de ácido nucleico designada; los polipéptidos pueden haber sido generados de cualquier manera, incluyendo, por ejemplo, síntesis química, o expresión de un sistema de expresión recombinante, o aislamiento desde virus. Los polipéptidos pueden incluir uno o más análogos de aminoácidos o aminoácidos no naturales. Los métodos para insertar análogos de aminoácidos en una secuencia son conocidos en la técnica. Los polipéptidos pueden incluir también una o más marcas, que son conocidas por los especialistas en la técnica.

La expresión "polinucleótido recombinante" tal como se emplea en la presente memoria se refiere a un polinucleótido de origen genómico, de cADN, semisintético, o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) está enlazado a un polinucleótido distinto de aquél al cual está enlazado en la naturaleza, o bien (2) no se presenta en la naturaleza.

El término "polinucleótido", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a una forma polímera de nucleótidos de cualquier longitud, bien sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere sólo a la estructura primaria de la molécula. Así, este término incluye ADN de cadena doble y de cadena sencilla, y ARN. También incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo marcas conocidas en la técnica, metilación, "remates terminales", sustitución de uno o más de los nucleótidos que se presentan naturalmente por un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, modificaciones con enlaces sin carga (por ejemplo metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfo-amidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces con carga (por ejemplo fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), modificaciones que contienen restos colgantes tales como, por ejemplo, proteínas (incluyendo por ejemplo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), modificaciones con intercaladores (por ejemplo acridina, psoraleno, etc.), modificaciones que contienen quelantes (por ejemplo metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), modificaciones que contienen alquilantes, modificaciones con enlaces modificados (por ejemplo ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.), así como formas sin modificar del polinucleótido.

"Polinucleótido purificado" se refiere a una composición que comprende un polinucleótido especificado que está sustancialmente exento de otros componentes, comprendiendo de manera típica tal composición al menos aproximadamente 70% del polinucleótido especificado, de manera más típica al menos aproximadamente 80%, 90%, o incluso 95% a 99% del polinucleótido especificado.

"Polipéptido purificado" se refiere a una composición que comprende un polipéptido especificado que está sustancialmente exento de otros componentes, comprendiendo de manera típica tal composición al menos aproximadamente 70% del polipéptido especificado, de manera más típica al menos aproximadamente 80%, 90%, o incluso 95% a 99% del polipéptido especificado.

"Células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares", y otros términos o expresiones semejantes designan a microorganismos o líneas celulares eucarióticas superiores cultivados como entidades unicelulares, que pueden utilizarse, o que han sido utilizados, como recipientes para un vector recombinante u otro ADN de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que ha sido transformada. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede que no sea necesariamente idéntica por completo en morfología o en complemento de ADN genómico o total, al progenitor original, debido a mutación natural, accidental, o deliberada.

Un "replicón" es cualquier elemento genético, por ejemplo un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc., que se comporta como una unidad autónoma de replicación de polinucleótido dentro de una célula; es decir, es capaz de replicación bajo su propio control.

Un "vector de clonación" es un replicón que puede transformar una célula huésped seleccionada y al cual se ha unido otro segmento de polinucleótido, para llevar a cabo la replicación y/o expresión del segmento unido. Típicamente, los vectores de clonación incluyen plásmidos, virus (por ejemplo vectores bacteriófago) y cósmidos.

Un "vector de integración" es un vector que no se comporta como un replicón en una célula huésped seleccionada, sino que tiene la capacidad de integrarse en un replicón (típicamente un cromosoma) residente en el huésped seleccionado, para transformar de manera estable al huésped.

Un "vector de expresión" es una construcción que puede transformar una célula huésped seleccionada y procura la expresión de una secuencia codificadora heteróloga en el huésped seleccionado. Los vectores de expresión pueden ser o bien vectores de clonación o vectores de integración.

Una "secuencia codificadora" es una secuencia de polinucleótidos que es transcrita a mARN y/o traducida a un polipéptido cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia codificadora están determinados por un codón de inicio de traducción en el extremo 5' y un codón de parada de traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, pero sin estar limitada a los mismos, mARN, cADN, y secuencias de polinucleótidos recombinantes.

"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos reguladoras que son necesarias para llevar a cabo la expresión de secuencias codificadoras a las cuales están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. En los procariotas, las secuencias de control incluyen generalmente promotor, sitio de unión ribosómico, y terminadores. En los eucariotas, las secuencias de control incluyen generalmente promotores, terminadores y, en algunos casos, intensificadores. Se pretende que la expresión "secuencias de control" incluya como mínimo todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y puede incluir también componentes ventajosos adicionales.

"Unido funcionalmente" se refiere a una yuxtaposición en la cual los componentes así descritos se encuentran en una relación que los permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida funcionalmente" a una secuencia codificadora está ligada de una manera tal que se consigue la expresión de la secuencia codificadora en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Un "marco de lectura abierta" (en inglés "open reading frame", ORF) es una región de una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora completa.

La expresión "con reactividad inmunológica cruzada" se refiere a dos o más epítopes o polipéptidos que son fijados por el mismo anticuerpo. La reactividad cruzada puede ser determinada por diversas técnicas de inmunoensayo, por ejemplo un ensayo de competición.

Tal como se emplea en la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que comprenden al menos un epítope. Un "sitio de unión de antígeno" se forma por el plegamiento de los dominios variables de una molécula o moléculas de anticuerpo, para formar lugares de unión tridimensionales con una forma superficial interna y una distribución de cargas internas que son complementarias de las características de un epítope de un antígeno, lo cual permite la unión específica para formar un complejo anticuerpo-antígeno. Un sitio de unión de antígeno puede estar formado a partir de un dominio de cadena pesada y/o de cadena ligera (VH y VL, respectivamente) que forman bucles hipervariables que contribuyen a la fijación del antígeno. El término "anticuerpo" incluye, sin limitación, anticuerpos quiméricos, anticuerpos alterados, anticuerpos univalentes, proteínas Fab, y anticuerpos de dominio sencillo. En muchos casos los fenómenos de unión de anticuerpos a antígenos son equivalentes a otras uniones ligando/antiligando.

Tal como se emplea en la presente memoria, un "anticuerpo de dominio único" (dAb) es un anticuerpo que está compuesto por un dominio HL, que se une específicamente con un antígeno designado. Un dAb no contiene un dominio VL, pero puede contener otros dominios de unión a antígeno que se sabe existen en anticuerpos, por ejemplo los dominios kappa y lambda. En la técnica se conocen métodos para preparar dAbs. Véase, por ejemplo, Ward y otros, Nature 341:544 (1989).

Los anticuerpos pueden estar compuestos también por dominios VH y VL, así como otros dominios conocidos de fijación a antígeno. En la técnica se conocen ejemplos de estos tipos de anticuerpos y métodos para la preparación de los mismos (véase por ejemplo la patente de EE.UU. número 4.816.467, que queda por la presente incorporada en la presente memoria por referencia), e incluyen los siguientes. Por ejemplo, "anticuerpos de vertebrados" se refiere a anticuerpos que son tetrámeros o agregados de los mismos, que comprenden cadenas ligeras y pesadas que están agregadas usualmente en una configuración de "Y", y que pueden tener o pueden no tener uniones covalentes entre las cadenas. En los anticuerpos de vertebrados, las secuencias de aminoácidos de las cadenas son homólogas con las secuencias encontradas en anticuerpos producidos en vertebrados, sea in situ o in vitro (por ejemplo en hibridomas). Los anticuerpos de vertebrados incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales purificados y anticuerpos monoclonales, de los cuales se describen más adelante métodos de preparación.

"Anticuerpos híbridos" son anticuerpos en los cuales las cadenas son homólogas por separado con referencia a cadenas de anticuerpos de mamíferos, y representan nuevas combinaciones de las mismas, de manera tal que dos antígenos diferentes son precipitables por el tetrámero o agregado. En anticuerpos híbridos, un par de cadenas pesadas y ligeras son homólogas a las que se encuentran en un anticuerpo producido contra un primer antígeno, mientras que un segundo par de cadenas son homólogas a las que se encuentran en un anticuerpo producido contra un segundo antígeno. Esto da como resultado la propiedad de "divalencia", es decir, la capacidad de fijar simultáneamente dos antígenos. Tales híbridos pueden formarse también empleando cadenas quiméricas, tal como se expone más adelante.

La expresión "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos en los cuales las cadenas pesada y/o ligera son proteínas de fusión. Típicamente, una porción de las secuencias de aminoácidos de la cadena es homóloga a secuencias correspondientes de un anticuerpo derivado de una especie particular o una clase particular, mientras que el segmento restante de la cadena es homólogo a las secuencias derivadas de otra especie y/o clase. Usualmente, la región variable tanto de las cadenas ligeras como de las pesadas imita a las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de vertebrados, mientras que las porciones constantes son homólogas a las secuencias de anticuerpos derivados de otras especies de vertebrados. Sin embargo, la definición no está limitada a este ejemplo particular. También está incluido cualquier anticuerpo en el cual tanto la cadena pesada como la ligera, o ambas, están compuestas por combinaciones de secuencias que imitan las secuencias de anticuerpos de fuentes diferentes, bien sea el origen de estas fuentes clases diferentes o especies diferentes, y esté o no el punto de fusión en la frontera variable/constante. Así, es posible producir anticuerpos en los cuales ni la región constante ni la región variable imitan secuencias de anticuerpos conocidos. Llega a ser posible entonces, por ejemplo, construir anticuerpos cuya región variable tiene una afinidad específica superior para un antígeno particular, o cuya región constante puede originar una fijación de complemento intensificada, o conseguir otras mejoras en propiedades poseídas por una región constante particular.

Otro ejemplo lo constituyen los "anticuerpos alterados", expresión que se refiere a anticuerpos en los cuales se ha hecho variar la secuencia de aminoácidos que se presenta naturalmente en un anticuerpo de vertebrado. Empleando técnicas de ADN recombinante se pueden rediseñar anticuerpos para obtener características deseadas. Las variaciones posibles son muchas, y abarcan desde el cambio de uno o más aminoácidos al rediseño completo de una región, por ejemplo la región constante. Pueden hacerse cambios en la región constante, en general, para conseguir características de proceso celular deseadas, por ejemplo cambios en la fijación del complemento, interacciones con membranas, y otras funciones de efector. Pueden hacerse cambios en la región variable para alterar características de fijación de antígeno. También puede diseñarse el anticuerpo para colaborar en el suministro específico de una molécula o sustancia a una célula o a un lugar de un tejido, específicos. Las alteraciones deseadas pueden ser realizadas mediante técnicas conocidas en biología molecular, por ejemplo técnicas recombinantes, mutagénesis puntual dirigida, etc.

Aún otro ejemplo lo constituyen los "anticuerpos univalentes", que son agregados compuestos de un dímero de cadena pesada/cadena ligera unido a la región Fc (es decir, al tronco) de una segunda cadena pesada. Este tipo de anticuerpos escapa a la modulación antigénica. Véase, por ejemplo, Glennie y otros, Nature 295:712 (1982). También se incluyen dentro de la definición de anticuerpos fragmentos "Fab" de anticuerpos. La región "Fab" se refiere a aquellas porciones de las cadenas pesada y ligera que son aproximadamente equivalentes, o análogas, a las secuencias que constituyen la porción de la rama de las cadenas pesada y ligera, y que han resultado presentar fijación inmunológica a un antígeno especificado, pero que carecen de la porción de efector Fc. "Fab" incluye agregados de una cadena pesada y una cadena ligera (conocidos comúnmente como Fab'), así como terámeros que contienen las cadenas 2H y 2L (denominados F(ab)_{2}), que son capaces de reaccionar selectivamente con un antígeno designado o con una familia de antígenos designados. Los anticuerpos Fab pueden dividirse en subconjuntos análogos a los antes descritos, es decir "Fab de vertebrados", "Fab híbrido", "Fab quimérico", y "Fab alterado". En la técnica se conocen métodos para producir fragmentos Fab de anticuerpos, e incluyen, por ejemplo, proteólisis, y síntesis mediante técnicas recombinantes.

"Epítope" se refiere a un sitio de unión de anticuerpo definido usualmente por un polipéptido, pero también por haptenos no aminoácidos. Un epítope podría comprender 3 aminoácidos en una conformación espacial que es exclusiva del epítope, generalmente un epítope se compone de al menos 5 de tales aminoácidos y, más usualmente, se compone de al menos 8-10 de tales aminoácidos.

"Complejo antígeno-anticuerpo" se refiere al complejo formado por un anticuerpo que está unido específicamente a un epítope de un antígeno.

"Polipéptido inmunogénico" se refiere a un polipéptido que desencadena una respuesta inmune celular y/o humoral en un mamífero, sea solo o unido a un vehículo, en presencia o en ausencia de un coadyuvante.

"Polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos, y no hace referencia a una longitud específica de la molécula. Así, dentro de la definición de polipéptido están incluidos péptidos, oligopéptidos, y proteínas. Este término tampoco hace referencia a, ni excluye, modificaciones del polipéptido posteriores a la expresión, por ejemplo glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Por ejemplo, están incluidos dentro de la definición polipéptidos que contienen uno o más análogos de aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con uniones sustituidas, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto ocurrentes en la naturaleza como no ocurrentes en la naturaleza.

"Transformación", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, con independencia del método empleado para la inserción, por ejemplo incorporación directa, transducción, apareamiento-f, o electroporación. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo un plásmido, o, de manera alternativa, puede quedar integrado en el genoma huésped.

Una célula huésped "transformada" se refiere tanto a la célula inmediata que ha experimentado la transformación, como a su progenie que mantiene el polinucleótido originalmente exógeno.

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"Tratamiento", tal como se emplea en la presente memoria, hace referencia a profilaxis y/o terapia.

"Individuo" se refiere a vertebrados, en particular miembros de especies mamíferas, e incluye, pero sin estar limitados a los mismos, animales domésticos, animales de deporte, y primates, incluyendo seres humanos.

"Cadena de sentido" se refiere a la cadena de una molécula de ADN bicatenario que es homóloga a un transcripto de mARN de la misma. La cadena "anti-sentido" contiene una secuencia que es complementaria de la "cadena de sentido".

"Componente corporal que contiene anticuerpo" se refiere a un componente del cuerpo de un individuo que constituye una fuente de los anticuerpos de interés. Se conocen en la técnica componentes corporales que contienen anticuerpos, e incluyen, pero sin estar limitados a los mismos, sangre entera y componentes de la misma, plasma, suero, fluido espinal, fluido linfático, las secciones externas de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos blancos sanguíneos, y mielomas.

Aislado de "HCV purificado" se refiere a una preparación de partículas de HCV que ha sido aislada de los constituyentes celulares con los cuales está asociado normalmente el virus, y de otros tipos de virus que puedan estar presentes en el tejido infectado. Las técnicas para aislar virus son conocidas por los especialistas en la técnica, e incluyen, por ejemplo, centrifugación y cromatografía de afinidad.

Una "partícula" de HCV es un virión entero, así como partículas que constituyen intermedios en la formación del virión. Las partículas de HCV tienen generalmente una o más proteínas de HCV asociadas con el ácido nucleico de HCV.

"Sonda" se refiere a un polinucleótido que forma una estructura híbrida con una secuencia de un polinucleótido diana, debido a la complementariedad de al menos una región de la sonda con una región de la diana.

"Muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislada de un individuo, que incluye, pero sin estar limitada a los mismos, por ejemplo, sangre entera y componentes de la misma, plasma, suero, fluido espinal, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células de la sangre, tumores, órganos, y también muestras de constituyentes de cultivos de células in vitro (incluyendo, pero sin estar limitados a los mismos, medio acondicionado resultante del crecimiento de células en medio de cultivo celular, células putativamente infectadas por virus, células recombinantes, y componentes celulares).

La invención se refiere al aislamiento y caracterización de J1, un aislado de HCV descubierto de forma novedosa, su secuencia de nucleótidos tal como se muestra en las Figuras 7 y 8, su secuencia proteica, y polinucleótidos y polipéptidos y anticuerpos derivados del mismo. No obstante, también se describe en la presente memoria el aislamiento y caracterización de J7, otro aislado de HCV descubierto de forma novedosa, aunque no forma parte de la invención reivindicada. Los aislados J1 y J7 son nuevos en sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, y se cree son característicos de aislados de HCV procedentes de Japón y otros países asiáticos.

Las secuencias de nucleótido derivadas de HCV J1 son útiles como sondas para diagnosticar la presencia de virus en muestras, y para aislar otras variantes del virus que se presentan en la naturaleza. Estas secuencias de nucleótido también hacen que estén disponibles secuencias de polipéptidos de antígenos de HCV codificados dentro del genoma J1, y permiten la producción de polipéptidos que son útiles como patrones o reactivos en ensayos de diagnóstico y/o como componentes de vacunas. Los anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, dirigidos contra epítopes de HCV contenidos dentro de estas secuencias polipeptídicas, son también útiles para ensayos de diagnóstico, como agentes terapéuticos, para la exploración rápida de agentes antivirales, y para el aislamiento de virus de NANBH. Además, utilizando sondas derivadas de las secuencias descritas en la presente memoria, es posible aislar y secuenciar otras porciones del genoma J1, dando así lugar a sondas y polipéptidos adicionales que son útiles en el diagnóstico y/o tratamiento, tanto profiláctico como terapéutico, de NANBH.

La disponibilidad de las secuencias de nucleótidos de HCV/J1 permite la construcción de sondas de polinucleótidos, y polipéptidos, útiles en el diagnóstico de NANBH debida a infección por HCV, y la exploración rápida en cuanto a infección, de donantes de sangre y de sangre donada y productos de la sangre. Por ejemplo, a partir de estas secuencias es posible sintetizar oligómeros de ADN de aproximadamente 8-10 nucleótidos, o mayores, que son útiles como sondas de hibridación para detectar la presencia de ARN de HCV en, por ejemplo, sueros de sujetos sospechosos de albergar el virus, o para explorar rápidamente sangre donada, en busca de la presencia del virus. Las secuencias HCV/J1 permiten también el diseño y producción de polipéptidos específicos de HCV que son útiles como reactivos de diagnóstico en cuanto a la presencia de anticuerpos generados durante la NANBH. También pueden emplearse anticuerpos contra polipéptidos purificados derivados de las secuencias HCV/J1, para detectar antígenos víricos en individuos infectados y en sangre.

El conocimiento de estas secuencias HCV/J1 permite también el diseño y producción de polipéptidos que pueden ser empleados como vacunas contra HCV, y también para la producción de anticuerpos, los cuales pueden ser empleados a su vez para la protección contra la enfermedad, y/o para la terapia de individuos infectados por HCV. Además, las secuencias HCV/J1 divulgadas permiten la caracterización adicional del genoma de HCV. Pueden utilizarse sondas de polinucleótido derivadas de estas secuencias, así como del genoma de HCV, para realizar una exploración rápida en bibliotecas de cADN en busca de secuencias adicionales de cADN vírico, las cuales pueden ser utilizadas a su vez para obtener secuencias solapantes adicionales. Véase, por ejemplo, la Publicación EPO número 318.216.

Las secuencias de polinucleótidos de HCV/J1, los polipéptidos derivados de las mismas, y los anticuerpos dirigidos contra estos polipéptidos, son útiles en el aislamiento e identificación del agente o agentes BB-NANBV. Por ejemplo, pueden emplearse anticuerpos dirigidos contra epítopes de HCV contenidos en polipéptidos derivados de las secuencias de HCV/J1, en procedimientos basados en cromatografía de afinidad, destinados a aislar el virus. De manera alternativa, pueden utilizarse los anticuerpos para identificar partículas víricas aisladas mediante otras técnicas. Después pueden caracterizarse adicionalmente los antígenos víricos y el material genómico contenido en las partículas víricas aisladas.

La información obtenida de la secuenciación adicional del genoma HCV/J1, así como de la caracterización adicional de los antígenos de HCV/J1, y la caracterización de los genomas, permite el diseño y síntesis de sondas, polipéptidos y anticuerpos adicionales, que pueden ser empleados para el diagnóstico, la prevención, y la terapia de NANBH inducida por HCV, y para la exploración rápida de sangre y productos relacionados con la sangre, infectados.

La disponibilidad de secuencias de cADN de HCV/J1 permite la construcción de vectores de expresión que codifican regiones antigénicamente activas del polipéptido codificado en cualquier cadena. Estas regiones antigénicamente activas pueden derivarse de antígenos de la cubierta o envoltura o bien de antígenos del núcleo, o de antígenos que no son estructurales, incluyendo, por ejemplo, proteínas que fijan polinucleótidos, polimerasa o polimerasas de polinucleótidos, y otras proteínas víricas requeridas para la replicación y/o ensamblaje de la partícula del virus. Los fragmentos que codifican los polipéptidos deseados se derivan de los clones de cADN empleando métodos convencionales de digestión por restricción, o bien por métodos sintéticos, y están ligados a vectores que, por ejemplo, pueden contener porciones de secuencias de fusión tales como beta-galactosidasa o superóxido-dismutasa (SOD). En la Publicación EPO número 196.056 se describen métodos y vectores que son útiles para producir polipéptidos que contienen secuencias de fusión de SOD. En la Publicación EPO número 318.216 se describen vectores que codifican polipéptidos de fusión de SOD y polipéptidos de HCV. Se puede obtener como polipéptido recombinante, tal como una proteína madura o de fusión, cualquier porción deseada del cADN de HCV que contenga un marco de lectura abierto, en cualquier cadena de sentido. De manera alternativa, un polipéptido codificado en el cADN puede ser proporcionado por síntesis química.

El ADN que codifica el polipéptido deseado, sea en forma de fusión o en forma madura, y contenga o no una secuencia de señal para permitir la secreción, puede ser ligado a vectores de expresión apropiados para cualquier huésped conveniente. En la actualidad se emplean sistemas huésped tanto eucarióticos como procarióticos para formar polipéptidos recombinantes, y más adelante se ofrece un sumario de algunos de los sistemas de control y células huésped más comunes. A continuación se aísla de células lisadas o del medio de cultivo el polipéptido producido en dichas células huésped, y se purifica hasta el grado necesario para el uso pretendido. La purificación puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo extracción diferencial, fraccionamiento salino, cromatografía sobre resinas de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, centrifugación, y similares. Véase, por ejemplo, en Methods in Enzymology una variedad de métodos para purificar proteínas.

Estos polipéptidos de HCV recombinantes o sintéticos pueden emplearse como agentes de diagnóstico, o bien aquellos que dan lugar a anticuerpos neutralizadores, pueden ser formulados en vacunas. Los anticuerpos generados contra estos polipéptidos pueden ser utilizados también como agentes de diagnóstico, o bien para la inmunoterapia pasiva. Además, anticuerpos contra estos polipéptidos son útiles para aislar e identificar partículas de HCV.

También pueden aislarse antígenos de HCV de viriones de HCV. Pueden hacerse crecer los viriones en células infectadas por HCV en cultivo de tejidos, o en un huésped infectado.

Aunque los polipéptidos de la presente invención pueden comprender un dominio vírico sustancialmente completo, en muchas aplicaciones todo lo que se requiere es que el polipéptido comprenda una región antigénica o inmunogénica del virus. Una región antigénica de un polipéptido es en general relativamente pequeña - típicamente 8 a 10 aminoácidos de longitud, o menos. Fragmentos tan cortos como 5 aminoácidos pueden caracterizar una región antigénica. Estos segmentos pueden corresponder a regiones de epítopes de HCV/J1. De acuerdo con esto, empleando los cADNs de HCV/J1 como base, se pueden expresar recombinantemente ADNs que codifiquen segmentos cortos de polipéptidos de HCV/J1, bien sea como proteínas de fusión, bien sea como polipéptidos aislados. Además, pueden obtenerse convenientemente por síntesis química secuencias cortas de aminoácidos.

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En los casos en que el polipéptido sintetizado está configurado correctamente para proporcionar el epítope correcto, pero es demasiado pequeño para ser inmunogénico, puede unirse el polipéptido a un vehículo apropiado. En la técnica son conocidas diversas técnicas para conseguir tal unión, incluyendo la formación de uniones disulfuro empleando N-succinimidil-3-(2-piridil-tio)propionato (SPDP) y 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) obtenidos de Pierce Company, Rockford, Illinois (si el péptido carece de grupo sulfhidrilo, puede proporcionarse éste mediante la adición de un residuo de cisteína. Estos reactivos crean una unión disulfuro entre ellos mismos y residuos de cisteína del péptido en una proteína, y una unión amida a través del amino-épsilon de una lisina, u otro grupo amino libre, en la otra. Son conocidos varios de tales agentes formadores de bisulfuro/amida. Véase, por ejemplo, Immun. Rev. (1982) 62:185. Otros agentes copulantes bifuncionales forman un tioéter en lugar de un enlace disulfuro. Muchos de estos agentes formadores de tio-éteres están disponibles comercialmente, e incluyen ésteres reactivos de ácido 6-maleimidocaproico, ácido 2-bromoacético, ácido 2-yodoacético, ácido 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxílico, y similares. Los grupos carboxilo pueden ser activados combinándolos con succinimida o con sal sódica de ácido 1-hidroxi-2-nitro-4-sulfónico. Métodos adicionales para copular antígenos emplean el sistema de rotavirus/"péptido fijador" descrito en la Publicación EPO número 259.149, cuya descripción queda incorporada en la presente memoria, por referencia. No se pretende que la lista precedente sea exhaustiva, y claramente pueden utilizarse modificaciones de los compuestos mencionados.

Puede utilizarse cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos nocivos para el huésped. Los vehículos apropiados son típicamente grandes macromoléculas que se metabolizan lentamente, tales como proteínas; polisacáridos, tales como sepharosa funcionalizada en látex, agarosa, celulosa, perlas de celulosa, y similares; aminoácidos polímeros, tales como poli(ácido glutámico), polilisina, y similares; copolímeros de aminoácidos; y partículas de virus inactivas. Son sustratos de proteína especialmente útiles: albúminas de suero, hemocianina de lapa de ojo de cerradura (familia Fissurellidiae), moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide del tétanos, y otras proteínas bien conocidas por los especialistas en la técnica.

Además de proteínas víricas de longitud completa, son reactivos inmunológicos útiles polipéptidos que comprenden secuencias truncadas de aminoácidos de HCV que codifiquen al menos un epítope vírico. Por ejemplo, pueden utilizarse como reactivos en un inmunoensayo polipéptidos que comprendan tales secuencias truncadas. Estos polipéptidos son también antígenos de subunidad candidatos en composiciones para la producción de antisueros o vacunas. Aunque estas secuencias truncadas pueden ser producidas mediante diversos tratamientos conocidos de la proteína vírica nativa, se prefiere generalmente preparar polipéptidos sintéticos o recombinantes que comprendan una secuencia de HCV. Los polipéptidos que comprenden estas secuencias truncadas de HCV pueden estar constituidos por entero por secuencias de HCV (uno o más epítopes, bien sea contiguos o no contiguos), o secuencias de HCV y secuencias heterólogas en una proteína de fusión. Las secuencias heterólogas útiles incluyen secuencias que procuran la secreción desde un huésped recombinante, intensifican la reactividad inmunológica del epítope o epítopes de HCV, o facilitan la copulación del polipéptido a un soporte de inmunoensayo o a un vehículo de vacuna. Véanse, por ejemplo, la Publicación EPO número 116.201, la patente de EE.UU. número 4.722.840; la Publicación EPO número 259.149; y la patente de EE.UU. número 4.629.783, cuyas descripciones quedan incorporadas en la presente memoria por referencia.

El tamaño de los polipéptidos que comprenden las secuencias truncadas de HCV puede variar ampliamente, siendo el tamaño mínimo una secuencia de tamaño suficiente para proporcionar un epítope de HCV, mientras que el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo no es sustancialmente superior, por lo general, al requerido para proporcionar los epítopes de HCV la función o funciones de la secuencia heteróloga, en caso de que exista. Típicamente, la secuencia truncada de aminoácidos de HCV abarcará de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. Más típicamente, sin embargo, la secuencia de HCV tendrá un máximo de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, preferentemente un máximo de aproximadamente 30 aminoácidos. Por lo general, es deseable seleccionar secuencias de HCV de al menos aproximadamente 10, 12 o 15 aminoácidos, hasta un máximo de aproximadamente 20 o 25 aminoácidos.

Las secuencias truncadas de aminoácidos de HCV que comprenden epítopes pueden ser identificadas de varias maneras. Por ejemplo, se puede explorar rápidamente toda la secuencia de proteína vírica preparando una serie de péptidos cortos que abarquen en conjunto toda la secuencia de proteína. Comenzando, por ejemplo, con polipéptidos 100-meros, sería rutinario ensayar cada polipéptido en cuanto a la presencia de uno o varios epítopes que presentasen una reactividad deseada, y ensayar después fragmentos de un 100-mero identificado, solapantes y progresivamente más pequeños, para mapear el epítope de interés. La exploración rápida de tales péptidos en un inmunoensayo está dentro de la pericia de la técnica. También es conocido llevar a cabo un análisis por ordenador de una secuencia de proteína para identificar epítopes potenciales, y preparar después oligopéptidos que comprendan las regiones identificadas para el examen detallado. Los especialistas en la técnica apreciarán que tal análisis de antigenicidad por ordenador no siempre identifica un epítope que existe en la realidad, y también puede identificar incorrectamente una región de una proteína como contenedora de un epítope.

La relación observada de las poliproteínas putativas de HCV y los Flavivirus permite una predicción sobre los dominios putativos de las proteínas "no estructurales" (NS) de HCV. Las localizaciones de las proteínas NS individuales en la poliproteína precursora putativa de Flavivirus son bastante bien conocidas. Además, éstas coinciden también con grandes fluctuaciones observadas en el perfil de hidrofobicidad de la poliproteína. Está establecido que NS5 de Flavivirus codifica la polimerasa del virión, y que NS1 corresponde a un antígeno de fijación de complemento que ha resultado ser una vacuna eficaz en animales. Recientemente se ha demostrado que en NS3 reside una función de proteasa flavivírica. Gracias a las similaridades observadas entre HCV y Flavivirus, son posibles deducciones acerca de las localizaciones aproximadas de los correspondientes dominios de proteína y funciones en la poliproteína de HCV. La Figura 11 es un esquema de dominios putativos de la poliproteína de HCV. La expresión de polipéptidos que contuviesen estos dominios en una variedad de células huésped recombinantes, que incluyen, por ejemplo, bacterias, levaduras, células de insectos y de vertebrados, debería dar lugar a importantes reactivos inmunológicos que podrían ser usados para el diagnóstico, la detección y vacunas.

Aunque la región de proteína no estructural de las poliproteínas putativas del aislado de HCV descrito en la presente memoria, y de los Flavivirus, parecen ser similares en general, existe menos similaridad entre las regiones estructurales putativas que se encuentran cerca del extremo N-terminal. En esta región, existe una mayor divergencia en la secuencia y, además, el perfil hidrófobo de las dos regiones presenta menos similaridad. Esta "divergencia" comienza en la región N-terminal del dominio NS1 putativo de HCV, y se extiende hasta el presunto extremo N-terminal. De todos modos, aún es posible predecir las localizaciones aproximadas del dominio putativo del nucleocápsido (dominio básico N-terminal) y del dominio E (generalmente hidrófobo) dentro de la poliproteína de HCV. A partir de estas predicciones puede ser posible identificar regiones aproximadas de la poliproteína HCV que podrían corresponder a reactivos inmunológicos útiles. Por ejemplo, se sabe que las proteínas E y NS1 de Flavivirus tienen eficacia como vacunas protectoras. Estas regiones, así como algunas de las cuales se ha demostrado que son antígenas en el HCV1, por ejemplo las re-
giones situadas dentro de los NS3, C, y NS5, etc, putativos, deberían proporcionar también reactivos para diagnóstico.

La inmunogenicidad de las secuencias de HCV puede ser intensificada también preparando las secuencias fusionadas a o ensambladas con proteínas formadoras de partículas tales como, por ejemplo, antígeno superficial de hepatitis B o antígeno de rotavirus VP6. Las construcciones en las cuales el epítope de HCV está unido directamente a las secuencias codificadoras de proteínas formadoras de partículas producen híbridos que son inmunogénicos con respecto al epítope de HCV. Además, todos los vectores preparados incluyen epítopes específicos para HBV, que tienen diversos grados de inmunogenicidad, tales como, por ejemplo, el péptido pre-S. Así, partículas construidas a partir de proteínas formadoras de partículas que incluyen secuencias de HCV son inmunogénicas con respecto a HCV y a la proteína formadora de partículas. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Número 4.722.840; la Publicación EPO número 175.261; la Publicación EPO número 259.149; Michelle y otros (1984) Int. Symposium on Viral Hepatitis.

Pueden prepararse vacunas a partir de uno o más polipéptidos inmunogénicos derivados de HCV/J1. La homología observada entre HCV y Flavivirus proporciona información concerniente a los polipéptidos que probablemente sean los más eficaces como vacunas, así como acerca de las regiones del genoma en las cuales estén codificados. La estructura general del genoma de los Flavivirus se discute en Rice y otros (1986) THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (serie compilada por Fraenkel-Conrat y Wagner, volumen compilado por Schlesinger y Schlesinger, Plenum Press). Se cree que el ARN genómico de Flavivirus es la única especie de mARN específico de virus, y es traducido a las tres proteínas estructurales víricas, es decir, C, M, y E, así como dos grandes proteínas no estructurales, NV4 y NV5, y un conjunto complejo de proteínas no estructurales más pequeñas. Se sabe que epítopes neutralizantes principales para Flavivirus residen en la proteína E (de envoltura). Roehrig (1986) en THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (serie compilada por Fraenkel-Conrat y Wagner, volumen compilado por Schlesinger y Schlesinger, Plenum Press). El correspondiente gen E de HCV y la región que codifica el polipéptido pueden ser predichos basándose en la homología con los Flavivirus. Así, las vacunas pueden estar compuestas de polipéptidos recombinantes que contienen epítopes de HCV E. Estos polipéptidos pueden ser expresados en bacterias, levaduras, o células de mamíferos, o bien, de manera alternativa, pueden ser aislados de preparaciones de virus. También se prevé que las otras proteínas estructurales puedan contener también epítopes que den lugar a anticuerpos anti-HCV protectores. Así, pueden emplearse también polipéptidos que contienen los epítopes de E, C, y M, sea de manera individual o en combinación, en vacunas contra HCV.

Además de lo antes indicado, se ha demostrado que la inmunización con NS1 (proteína no estructural 1) da como resultado protección frente a la fiebre amarilla. Schlesinger y otros (1986) J. Virol. 60:1153. Esto es cierto aunque la inmunización no dé lugar a anticuerpos neutralizantes. Así, y particularmente porque esta proteína parce estar conservada en gran medida entre los Flavivirus, es probable que NS1 de HCV sea también protectora frente a la infección por HCV. Además, se ha demostrado también que proteínas no estructurales pueden proporcionar protección frente a patogenicidad vírica, incluso aunque no provoquen la producción de anticuerpos neutralizantes.

A la vista de lo anterior, las vacunas multivalentes contra HCV pueden estar compuestas por uno o más epítopes procedentes de una o más proteínas estructurales, y/o uno o más epítopes procedentes de una o más proteínas no estructurales. Estas vacunas pueden estar compuestas, por ejemplo, por polipéptidos de HCV recombinantes y/o polipéptidos aislados de los viriones. En particular, se contemplan vacunas que comprenden una o más de las siguientes proteínas de HCV, o antígenos subunidad derivados de las mismas: E, NS1, C, NS2, NS3, NS4 y NS5. Son particularmente preferidas vacunas que comprendan E y/o NS1, o subunidades de las mismas. Además, puede ser posible emplear HCV inactivado en vacunas; la inactivación puede producirse mediante la preparación de lisados víricos, o mediante otros medios conocidos en la técnica que causan inactivación de Flavivirus, por ejemplo tratamiento con disolventes orgánicos o detergentes, o tratamiento con formalina. Además, pueden prepararse también vacunas a partir de cepas de HCV atenuadas o a partir de virus híbridos tales como vectores de viruela vacuna conocidos en la técnica [Brown y otros, Nature 319:549-550 (1986)].

La preparación de vacunas que contienen uno o más polipéptidos inmunogénicos como ingredientes activos es conocida por los especialistas en la técnica. Típicamente, tales vacunas se preparan como inyectables, bien sea como soluciones líquidas o como suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión, en líquido antes de la inyección. También puede emulsionarse la preparación, o encapsular en liposomas la proteína. Con frecuencia se mezclan los ingredientes inmunológicamente activos con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Son excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades secundarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores del pH, y/o coadyuvantes que incrementan la eficacia de la vacuna. Los ejemplos de coadyuvantes que pueden ser eficaces incluyen, pero sin estar limitados a éstos: hidróxido de aluminio, N-acetil-N-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, denominada nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoíl-sn-glicerol-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, denominado MTP-PE), y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil-lípido A, dimicolato de trehalosa, y esqueleto de pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión con 2% de escualeno/Tween 80. La eficacia de un coadyuvante puede determinarse midiendo la cantidad de anticuerpos dirigidos contra un polipéptido inmunogénico que contiene una secuencia antigénica de HCV resultante de la administración de este polipéptido en vacunas que están compuestas también por los distintos coadyuvantes.

Convencionalmente, las vacunas son administradas por vía parenteral, usualmente por inyección, bien sea subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son apropiadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios pueden ser preparados a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferentemente 1%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes normalmente utilizados tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, celulosa, carbonato magnésico, y similares. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, o polvos, y contienen 10-95% de ingrediente activo, preferentemente 25-70%.

Las proteínas pueden ser formuladas en la vacuna en forma neutra o en forma de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales por adición de ácidos (formadas con grupos amino libres del péptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido fosfórico, o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, maleico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivarse también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, de potasio, de amonio, de calcio, o férrico, y de bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, y similares.

Las vacunas son administradas de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sea profiláctica y/o terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar, que se sitúa generalmente en el intervalo de 5 microgramos a 250 microgramos de antígeno por dosis, depende del sujeto a tratar, de la capacidad del sistema inmune del sujeto para sintetizar anticuerpos, y del grado de protección deseado. Las cantidades exactas de ingrediente activo que han de administrarse pueden depender del juicio del facultativo, y pueden ser peculiares para cada sujeto.

La vacuna puede ser administrada en un programa de dosis única o bien, preferentemente, en un programa de múltiples dosis. Un programa de múltiples dosis es aquél en el cual un tratamiento primario de vacunación puede consistir en 1-10 dosis separadas, seguidas de otras dosis administradas a intervalos de tiempo posteriores requeridos para mantener y/o reforzar la respuesta inmune, por ejemplo 1-4 meses para una segunda dosis y, si se precisa, una o más dosis subsiguientes al cabo de varios meses. El régimen de dosificación estará determinado también, al menos en parte, por la necesidad del individuo, y dependerá del juicio del facultativo.

Además, la vacuna que contiene el antígeno o antígenos inmunogénicos de HCV puede ser administrada conjuntamente con otros agentes inmunorreguladores, por ejemplo inmunoglobulinas.

Los polipéptidos inmunogénicos preparados de la manera antes descrita se utilizan para producir anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales. Si se desean anticuerpos policlonales, se inmuniza un mamífero seleccionado (por ejemplo ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con un polipéptido inmunogénico portador de uno o más epítopes de HCV. Se extrae suero del animal inmunizado, y se trata de acuerdo con procedimientos conocidos. Si el suero que contiene anticuerpos policlonales para un epítope de HCV contiene anticuerpos para otros antígenos, pueden purificarse los anticuerpos policlonales mediante cromatografía de inmunoafinidad. Las técnicas para producir y elaborar antisueros policlonales son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Mayer y Walker, compiladores, (1987) INMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, Londres).

También un especialista en la técnica puede producir fácilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopes de HCV. La metodología general para preparar anticuerpos monoclonales mediante hibridomas es bien conocida. Mediante fusión celular pueden crearse líneas celulares inmortales, productoras de anticuerpos, y también mediante otras técnicas tales como la transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o transfección con virus de Epstein-Barr. Véase, por ejemplo, M. Schreier y otros (1980) HYBRIDOMA TECHNIQUES; Hammerling y otros (1981) MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS; Kennett y otros (1980) MONOCLONAL ANTIBODIES; véanse también las patentes de EE.UU. números 4.341.761, 4.399.121, 4.427.783, 4.444.887, 4.466.917, 4.472.500, 4.491.632 y 4.493.890. Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra epítopes de HCV pueden ser explorados en busca de diversas propiedades: por ejemplo en cuanto a isotipo, afinidad hacia el epítope, etc.

Los anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales, que están dirigidos contra epítopes de HCV son particularmente útiles en el diagnóstico, y los que son neutralizantes son útiles en la inmunoterapia pasiva. Los anticuerpos monoclonales, en particular, pueden ser utilizados para producir anticuerpos anti-idiotipo.

Los anticuerpos anti-idiotipo son inmunoglobulinas que portan una "imagen interna" del antígeno del agente infeccioso contra el cual se desea protección. En la técnica son conocidas técnicas para producir anticuerpos anti-idiotipo. Véase, por ejemplo, Grzych (1985), Nature 316:74; MacNamara y otros (1984), Science 226:1325; Uytdehaag y otros (1985), J. Immunol. 134:1225. Estos anticuerpos anti-idiotipo pueden ser útiles también para el tratamiento y/o diagnóstico de NANBH, así como para la elucidación de las regiones inmunogénicas de antígenos de HCV.

Empleando las secuencias del polinucleótido HCV/J1 como base, pueden prepararse oligómeros de aproximadamente 8 nucleótidos o más, bien sea por escisión o sintéticamente, que se hibridan con el genoma de HCV y son útiles en la identificación del agente o agentes víricos, en la caracterización adicional del genoma o genomas víricos, así como en la detección del virus o los virus en individuos enfermos. Las sondas para polinucleótidos de HCV (naturales o derivados) tienen una longitud que permite la detección de secuencias víricas exclusivas por hibridación. Aunque se puede trabajar con una longitud de 6-8 nucleótidos, se prefieren secuencias de aproximadamente 10-12 nucleótidos, y parecen óptimos alrededor de 20 nucleótidos. Estas sondas pueden ser preparadas empleando métodos de rutina que incluyen métodos automatizados de síntesis de oligonucleótidos. Entre las sondas útiles se encuentran, por ejemplo, los clones descritos en la presente memoria, así como los diversos oligómeros útiles en el sondeo de bibliotecas de cADN, expuestos más adelante. Será satisfactorio un complemento para cualquier porción exclusiva del genoma de HCV. Para el uso como sondas es deseable la complementariedad completa, aunque puede ser innecesaria a medida que se incrementa la longitud del fragmento.

Para el uso de tales sondas como agentes de diagnóstico, puede tratarse, si se desea, la muestra biológica a analizar, tal como sangre o suero, para extraer los ácidos nucleicos contenidos en la misma. Puede someterse el ácido nucleico resultante de la muestra a electroforesis en gel u otras técnicas de separación por tamaño; de manera alternativa, puede realizarse la tinción de puntos sobre la muestra de ácido nucleico sin separación por tamaño. A continuación se marcan las sondas. En la técnica son conocidas marcas adecuadas, y métodos para marcar sondas, e incluyen, por ejemplo, marcas radiactivas incorporadas por traslación de muesca o tratamiento con kinasas, biotina, sondas fluorescentes, y sondas quimioluminiscentes. A continuación se tratan los ácidos nucleicos extraídos de la muestra con la sonda marcada, en condiciones de hibridación de restrictividad adecuada. Generalmente son deseables condiciones de alta restrictividad para evitar falsos positivos. La restrictividad de la hibridación viene determinada por varios factores durante la hibridación y durante el procedimiento de lavado, que incluyen la temperatura, la fuerza iónica, el tiempo transcurrido, y la concentración de formamida. Estos factores están bosquejados, por ejemplo, en Maniatis, T. (1982) MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

En general, se espera que las secuencias de genoma de HCV estén presentes en el suero de individuos infectados a niveles relativamente bajos, es decir, a niveles de aproximadamente 10^{2}-10^{3} dosis infecciosas para chimpancés (CID) por ml. Este nivel puede requerir utilizar técnicas de multiplicación en ensayos de hibridación. Tales técnicas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, el sistema "Bio-Bridge" de Enzo Biochemical Corporation emplea desoxinucleótido terminal-transferasa para añadir colas de 3'-poli-DT sin modificar a una sonda de ADN. Se hibrida la sonda con cola de poli-DT a la secuencia nucleotídica diana, y a continuación a una poli-A modificada con biotina. La solicitud PCT número 84/03520 y la Publicación EPO número 124.221 describen un ensayo de hibridación de ADN en el cual: (1) se reanilla analito a una sonda de ADN monocatenaria que es complementaria a un oligonucleótido marcado con enzima; y (2) se hibrida el dúplex con cola resultante a un oligonucleótido marcado con enzima. La Publicación EPO número 204.510 describe un ensayo de hibridación con ADN en el cual se pone en contacto ADN analito con una sonda que tiene una cola, tal como una cola poli-DT, una cadena multiplicadora que tiene una secuencia que se hibrida a la cola de la sonda, tal como una secuencia poli-A, y que es capaz de fijar una pluralidad de cadenas marcadas.

Una técnica particularmente deseable puede implicar en primer lugar la multiplicación en un factor de aproximadamente 10.000 de las secuencias de HCV del suero, es decir, hasta aproximadamente 10^{6} secuencias/ml. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita por Saiki y otros (1986), Nature 324:163, Mullis, patente de EE.UU. número 4.683.195, y Mullis y otros, patente de EE.UU. número 4.683.202. A continuación pueden detectarse la secuencia o secuencias multiplicadas empleando un ensayo de hibridación que está descrito en la Publicación Europea número 317-077, también pendiente, y la Solicitud Japonesa número 63-260437, que están cedidas al mismo cesionario de la presente, y quedan incorporadas en la presente memoria por referencia. Estos ensayos de hibridación, que deben detectar secuencias al nivel de 10^{6}/ml, utilizan multímeros de ácido nucleico que se unen a ácido nucleico analito de cadena única, y que se unen también a una multiplicidad de oligonucleótidos marcados, de cadena única. En la Publicación EPO número 225.807, que queda incorporada en la presente memoria por referencia, se describen un ensayo en emparedado, en fase de solución, adecuado, que puede ser utilizado con sondas de polinucleótido marcadas, y los métodos para preparar las sondas.

Las sondas pueden ser envasadas en equipos de diagnóstico. Los equipos de diagnóstico incluyen el ADN sonda, que puede estar marcado; de manera alternativa, el ADN sonda puede estar sin marcar, y pueden estar incluidos en el equipo, en recipientes separados, los ingredientes para el marcado. El equipo puede contener también otros reactivos y materiales, adecuadamente envasados, necesarios para el protocolo de hibridación particular, por ejemplo patrones, tampones de lavado, así como instrucciones para llevar a cabo el ensayo.

Tanto los polipéptidos HCV/J1 que reaccionan inmunológicamente con suero que contiene anticuerpos de HCV, como los anticuerpos producidos contra epítopes específicos de HCV en estos polipéptidos, son útiles en inmunoensayos con el fin de detectar la presencia de anticuerpos para HCV, o bien la presencia del virus y/o antígenos víricos en muestras biológicas. El diseño de los inmunoensayos está sujeto a amplia variación, y son conocidos en la técnica varios de ellos. Un inmunoensayo para anticuerpo anti-HCV puede utilizar un epítope vírico o varios epítopes víricos. Cuando se emplean múltiples epítopes, los epítopes pueden derivarse del mismo polipéptido vírico o de polipéptidos víricos diferentes, y pueden encontrarse en polipéptidos separados, recombinantes o naturales, o bien juntos en los mismos polipéptidos recombinantes.

Un inmunoensayo para antígeno viral puede utilizar, por ejemplo, un anticuerpo monoclinal dirigido contra un epítope vírico, una combinación de anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopes de un polipéptido vírico, anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopes de polipéptidos víricos diferentes, anticuerpos policlonales dirigidos contra el mismo antígeno vírico, anticuerpos policlonales dirigidos contra antígenos víricos diferentes, o una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales.

Los protocolos de inmunoensayo pueden estar basados, por ejemplo, en ensayos de competición, de reacción directa, o de tipo emparedado. Los protocolos pueden utilizar también, por ejemplo, soportes sólidos, o bien pueden estar basados en la inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos implican el uso de anticuerpos o polipéptidos marcados. Las marcas pueden ser, por ejemplo, fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas, o moléculas de colorante. También son conocidos ensayos que amplifican las señales de la sonda. Son ejemplos de dichos ensayos, ensayos que utilizan biotina y avidina, e inmunoensayos marcados con enzima y mediados por enzimas, tales como ensayos ELISA.

Típicamente, un inmunoensayo para anticuerpo anti-HCV implicará seleccionar y preparar la muestra de ensayo, por ejemplo una muestra biológica, y después incubarla con un polipéptido de HCV antigénico (es decir, que contenga epítope), en condiciones que permitan que se formen complejos antígeno-anticuerpo. Tales condiciones son bien conocidas en la técnica. En un formato heterogéneo, el polipéptido está unido a un soporte sólido para facilitar la separación de muestra y polipéptido después de la incubación. Son ejemplos de soportes sólidos que pueden utilizarse: nitrocelulosa, en membrana o en forma de pocillo de microtitulación, poli(cloruro de vinilo), en láminas o en forma de pocillos de microtitulación, látex de poliestireno, en perlas o en pocillos de microtitulación, poli(fluoruro de vinilideno), conocido como Immobulon^{TM}, papel diazotado, membranas de nylon, perlas activadas, y perlas de proteína A. Muy preferentemente se emplean en el formato heterogéneo la placa de titulación Dynatech Immulon^{TM} 1, o las perlas de poliestireno de 6,4 mm (0,25 pulgadas) Spec, acabadas por Precision Plastic Ball. Típicamente, se lava el soporte sólido después de separarlo de la mezcla de ensayo. En un formato homogéneo se incuba la mezcla de ensayo con antígeno en solución, en condiciones que precipitan cualesquiera complejos antígeno-anticuerpo que se formen, tal como es conocido en la técnica. A continuación se separan los complejos precipitados de la muestra de ensayo, por ejemplo mediante centrifugación. Después se detectan los complejos formados que contienen anticuerpo anti-HCV, por cualquiera de diversas técnicas. Dependiendo del formato, pueden detectarse los complejos con Ig anti-xenogénica marcada o, si se emplea un formato competitivo, midiendo la cantidad de anticuerpo competidor marcado fijado.

En inmunoensayos en los cuales el analito lo constituyen polipéptidos de HCV, se incuba la muestra de ensayo, típicamente una muestra biológica, con anticuerpos anti-HCV, nuevamente en condiciones que permitan la formación de complejos antígeno-anticuerpo. Pueden emplearse diversos formatos, tales como un ensayo en "emparedado" en el cual se incuba con la muestra de ensayo anticuerpo fijado a un soporte sólido; se lava; se incuba con un segundo anticuerpo para el analito, marcado; y se lava nuevamente el soporte. El analito es detectado determinando si el segundo anticuerpo está unido al soporte. En un formato competitivo, que puede ser tanto heterogéneo como homogéneo, usualmente se incuba una muestra de ensayo con un anticuerpo y un antígeno competidor marcado, bien sea de manera secuencial o simultánea. Estos y otros formatos son bien conocidos en la técnica.

El modelo de Flavivirus para HCV permite predicciones en cuanto a la localización probable de epítopes diagnósticos para las proteínas estructurales del virión. Los dominios C, pre-M, M y E contienen cada uno probablemente epítopes con potencial significativo para detectar antígenos víricos, y en particular para el diagnóstico. De manera similar, se espera que dominios de las proteínas no estructurales contengan importantes epítopes de diagnóstico (por ejemplo, NS5 que codifica una polimerasa putativa; y NS1 que codifica un antígeno putativo fijador de complemento). Los polipéptidos recombinantes, o polipéptidos víricos, que incluyan epítopes de estos dominios específicos pueden ser útiles para la detección de anticuerpos víricos en donantes de sangre infecciosos y pacientes infectados. Además, pueden emplearse anticuerpos dirigidos contra las proteínas E y/o M en inmunoensayos para la detección de antígenos víricos en pacientes con NANBH causada por HCV, y en donantes de sangre infecciosos. Además, estos anticuerpos pueden ser extremadamente útiles para detectar donantes y pacientes en fase aguda.

Pueden mapearse regiones antigénicas de la poliproteína putativa, e identificarse mediante exploración de la antigenicidad de productos de expresión bacteriana de cADNs de HCV que codifican porciones de la poliproteína. Pueden detectarse otras regiones antigénicas de HCV expresando las porciones de los cADNs de HCV en otros sistemas de expresión, incluyendo sistemas de levadura y sistemas celulares derivados de insectos y vertebrados. Además, los estudios que dan lugar a al índice de antigenicidad y al perfil de hidrofobia/hidrofilia proporcionan información concerniente a la probabilidad de la antigenicidad de un región. Los sistemas de detección eficaces pueden incluir el empleo de paneles de epítopes. Los epítopes del panel pueden estar construidos en uno o múltiples polipéptidos.

Se elaboran equipos adecuados para el inmunodiagnóstico, y que contienen los reactivos adecuadamente marcados, envasando en recipientes adecuados los materiales apropiados, que incluyen los polipéptidos de la invención que contienen epítopes de HCV o anticuerpos dirigidos contra epítopes de HCV, junto con el resto de los reactivos y materiales requeridos para la realización del ensayo (por ejemplo tampones de lavado, medios de detección tales como Ig anti-humana marcada, anti-HCV marcado, o antígeno de HCV marcado), así como un conjunto adecuado de instrucciones para el ensayo.

La información de la secuencia de nucleótidos de HCV/J1 descrita en la presente memoria puede ser utilizada para adquirir más información sobre la secuencia de los genomas de HCV, y para identificar y aislar aislados de HCV adicionales relacionados con J1. Esta información, a su vez, puede conducir a sondas polinucleotídicas adicionales, polipéptidos derivados del genoma de HCV, y anticuerpos dirigidos contra epítopes de HCV que serían útiles para el diagnóstico y/o tratamiento de NANBH causada por HCV.

La información de la secuencia de nucleótidos de HCV/J1 de la presente memoria es útil para el diseño de sondas para aislar secuencias adicionales que se deriven de regiones aún no definidas de los genomas de HCV de los cuales se deriva la secuencia J1. Por ejemplo, sondas marcadas que contengan una secuencia de aproximadamente 8 o más nucleótidos, y preferentemente 20 o más nucleótidos, que se deriven de regiones cercanas al extremo 5' o al extremo 3' de la familia de secuencias de cADN de HCV descrita en los ejemplos, pueden ser utilizadas para aislar secuencias de cADN solapantes de bibliotecas de cADN de HCV. Estas secuencias que solapan los cADNs de los clones antes mencionados, pero que contienen también secuencias derivadas de regiones del genoma de las cuales no se deriva el cADN de los clones antes mencionados, pueden utilizarse entonces para sintetizar sondas con el fin de identificar otros fragmentos solapantes que no solapan necesariamente los cADNs descritos más adelante. En la técnica se conocen métodos para construir bibliotecas de cADN. Véase, por ejemplo, la Publicación EPO número 318.216. Se prefiere particularmente preparar bibliotecas procedentes del suero de pacientes japoneses y de otros países asiáticos a quienes se ha diagnosticado NANBH, que demuestren anticuerpos para antígenos de HCV1. Se cree que estos pacientes son los candidatos más probables a ser portadores de aislados HCV/J1 o relacionados.

Pueden aislarse partículas de HCV del suero de individuos con NANBH o a partir de cultivos celulares, por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, técnicas basadas en la discriminación por tamaño tales como métodos de sedimentación o de exclusión, o bien técnicas basadas en la densidad tales como ultracentrifugación en gradientes de densidad, o precipitación con agentes tales como polietilenglicol, o cromatografía sobre una diversidad de materiales tales como materiales de intercambio de aniones o de cationes, y materiales que fijan en relación con la hidrofobia.

Un método preferido para aislar partículas de HCV o de antígeno lo constituyen las columnas de inmunoafinidad. En la técnica se conocen técnicas para la cromatografía de inmuno-afinidad, incluyendo técnicas para fijar anticuerpos a soportes sólidos de manera tal que conserven su actividad inmunoselectiva. Las técnicas pueden ser aquellas en las cuales se adsorben anticuerpos al soporte (véase, por ejemplo, Kurstak en ENZYME IMMUNODIAGNOSIS, páginas 31-37) así como aquellas en las cuales se unen covalentemente los anticuerpos al soporte. En general, las técnicas son similares a las empleadas para la unión covalente de antígenos a un soporte sólido, descrita más arriba. Sin embargo, pueden incluirse grupos espaciadores en los agentes copulantes bifuncionales, de manera tal que permanezca accesible el lugar del anticuerpo para fijación del antígeno. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, y puede ser deseable purificar los anticuerpos antes de emplearlos en el inmunoensayo.

Las técnicas generales empleadas en la extracción del genoma de un virus, preparar y sondear una biblioteca de cADN, secuenciar clones, construir vectores de expresión, transformar células, llevar a cabo ensayos inmunológicos tales como radioinmunoensayos y ensayos ELISA, hacer crecer células en cultivo, y similares, son conocidas en la técnica, y están disponibles manuales de laboratorio que describen estas técnicas. No obstante, y como una guía general, a continuación se exponen algunas fuentes disponibles en la actualidad para tales procedimientos, y materiales útiles para llevarlos a cabo.

Para expresar secuencias codificadoras deseadas, cuando se usan secuencias de control adecuadas que son compatibles con el huésped diseñado, pueden emplearse células huésped tanto procariotas como eucariotas. Entre los huéspedes procariotas, se utiliza muy frecuentemente E. coli. Las secuencias de control de la expresión para procariotas incluyen promotores, que opcionalmente contienen porciones de operador, y lugares de unión de ribosomas. Los vectores de transferencia compatibles con huéspedes procariotas se derivan comúnmente de, por ejemplo, pBR322, un plásmido que contiene operones que confieren resistencia a ampicilina y a tetraciclina, y los distintos vectores pUC, que también contienen secuencias que confieren resistencia a antibióticos. Estos marcadores pueden ser empleados para obtener transformantes útiles por selección. Las secuencias de control procariotas comúnmente empleadas incluyen los sistemas de promotor de beta-lactamasa (penicilinasa) y de lactosa (Chang y otros (1977), Nature 198:1056, el sistema de promotor de triptófano (trp) (Goeddel y otros (1980) Nucleic Acid Res. 8:4057), el promotor P_{L} lambda-derivado, el sitio de unión para ribosoma del gen N (Shimatake y otros (1981), Nature 292:128) y el promotor tac híbrido (De Boer y otros (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292:128) derivado de secuencias de los promotores trp y lac UV5. Los sistemas antedichos son particularmente compatibles con E. coli; si se desea, pueden emplearse otros huéspedes procarióticos tales como cepas de Bacillus o Pseudomonas, con secuencias de control
correspondientes.

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Los huéspedes eucarióticos incluyen levaduras y células de mamíferos en sistemas de cultivo. Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Klebsiella lactis y Pichia pastoris son las levaduras huéspedes más comúnmente utilizadas, y son huéspedes fúngicos convenientes. Los vectores compatibles con levaduras llevan marcadores que permiten la selección de transformantes satisfactorios que confieren prototrofía a mutantes auxotróficos o resistencia frente a a metales pesados a cepas de tipo salvaje. Los vectores compatibles con levaduras pueden emplear el origen de replicación de 2 micras (Broach y otros (1983) Math. Enz. 101:307), la combinación de CEN3 y ARS1 u otros medios para asegurar la replicación, tales como secuencias que dan como resultado la incorporación de un fragmento apropiado en el genoma de la célula huésped. En la técnica son conocidas secuencias de control para vectores de lavadura, e incluyen promotores para la síntesis de enzimas glicolíticos (Hess y otros (1968) J. Adv. Enzyme Eng. 7:149; Holland y otros (1978), J. Biol. Chem. 256:1385), incluyendo el promotor para 3-fosfogliceratoquinasa (Hitzeman (1980), J. Biol. Chem. 255:2073). Pueden incluirse también terminadores, tales como los derivados del gen de la enolasa (Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385). Son sistemas de control particularmente útiles los que comprenden el promotor de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) o el promotor regulable de alcohol-deshidrogenasa (ADH), terminadores también derivados de GAPDH, y si se desea secreción, secuencia guía de factor alfa de levadura. Además, la región reguladora transcripcional y la región de iniciación transcripcional, que están unidas operativamente, pueden ser tales que no estén asociadas naturalmente en el organismo de tipo salvaje. Estos sistemas están descritos con detalle en la Publicación EPO número 120.551; la Publicación EPO número 116.201; y la Publicación EPO número 164.556, todas las cuales quedan incorporadas en la presente memoria por referencia.

En la técnica son conocidas líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión, e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), incluyendo células HeLa, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de cría de hámster (BHK), y diversas líneas celulares más. También son conocidos en la técnica promotores apropiados para células de mamíferos, e incluyen promotores víricos tales como los del virus simio 40 (SV40) (Fiers (1978), Nature 273:113), virus del sarcoma de Rous (RSV), adenovirus (ADV), y virus de papiloma bovino (BPV). Las células de mamífero pueden requerir también secuencias de terminador y secuencias de adición de poli-A; también pueden incluirse secuencias intensificadoras que incrementan la expresión, y pueden ser también deseables secuencias que provocan la multiplicación del gen. Estas secuencias son conocidas en la técnica. Los vectores apropiados para la replicación en células de mamífero pueden incluir replicones víricos, o bien secuencias que aseguren la integración de las secuencias apropiadas que codifican epítopes de NANBV en el genoma del huésped.

También puede emplearse el sistema del virus de la viruela vacuna para expresar ADN extraño en células de mamífero. Para expresar genes heterólogos, usualmente se inserta el ADN extraño en el gen de la timidina-quinasa del virus de la viruela vacuna, y entonces pueden seleccionarse las células infectadas. Este procedimiento es conocido en la técnica, y puede encontrarse información adicional en estas referencias [Mackett y otros, J. Virol. 49:857-864 (1984), y el capítulo 7 de DNA Cloning, volumen 2, IRL Press].

Además, pueden expresarse antígenos víricos en células de insectos mediante el sistema de Baculovirus. Una guía general para la expresión de Baculovirus, por Summer y Smith, es A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures (Texas Agricultural Experiment Station Bulletin número 1555). Para incorporar el gen heterólogo en el genoma de Baculovirus, primeramente se clona el gen en un vector de transferencia que contenga algunas secuencias de Baculovirus. Este vector de transferencia, cuando es co-transfectado con virus de tipo salvaje en células de insecto, se recombinará con el virus de tipo salvaje. Usualmente, se habrá sometido a ingeniería el vector de transferencia de manera tal que el gen heterólogo romperá el gen del poliedro del Baculovirus de tipo salvaje. Esta ruptura permite una fácil selección de los virus recombinantes, ya que las células infectadas con el virus recombinante aparecerán fenotípicamente diferentes de las células infectadas con el virus de tipo salvaje. Puede emplearse el virus recombinante purificado para infectar células con el fin de expresar el gen heterólogo. Puede secretarse la proteína extraña en el medio si se une un péptido de señal en consonancia con el gen heterólogo; de otro modo, la proteína quedará fijada en los lisados celulares. Para más información véase Smith y otros, Mol. & Cell. Biol. 3:2156-2165 (1983), o Luckow y Summers, en Virology 17:31-39 (1989).

La transformación puede realizarse por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, que incluyen, por ejemplo, el empaquetar el polinucleótido en un virus, y transducir con el virus una célula huésped, y mediante inclusión directa del polinucleótido. El procedimiento de transformación empleado depende del huésped a transformar. La transformación bacteriana por inclusión directa emplea generalmente un tratamiento con cloruro de calcio o de rubidio (Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110; Maniatis y otros (1982), MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). La transformación en levaduras mediante la inclusión directa puede llevarse a cabo empleando el método de Hinnen y otros (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929. Las transformaciones en mamíferos por inclusión directa pueden llevarse a cabo empleando el método de precipitación con fosfato cálcico de Graham y Van der Eb (1978), Virology 52:546 o las diversas modificaciones conocidas del mismo.

La construcción de vectores emplea técnicas que son conocidas en la técnica. La escisión de ADN específica en cuanto al lugar se realiza tratando con enzimas de restricción apropiadas, en condiciones que generalmente son especificadas por el fabricante de estas enzimas comercialmente disponibles. Los fragmentos escindidos pueden ser separados empleando técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida o de agarosa, de acuerdo con los procedimientos generales que se encuentran en Methods in Enzymology (1980) 65:499-560. Los extremos pegajosos de los fragmentos de escisión pueden ser transformados en extremos romos empleando ADN-polimerasa I (Klenow) de E. coli en presencia de los trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs) apropiados presentes en la mezcla. También puede emplearse el tratamiento con nucleasa S1, dando como resultado la hidrólisis de cualesquiera porciones de ADN de cadena sencilla.

Las ligaciones se llevan a cabo empleando condiciones estándar de tampón y temperatura, empleando ADN-ligasa T4 y ATP; las ligaciones de extremo pegajoso requieren menos ATP y menos ligasa que las ligaciones de extremos romos. Cuando se emplean fragmentos de vectores como parte de una mezcla de ligación, a menudo se trata el fragmento de vector con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) o fosfatasa alcalina intestinal de bovino, para eliminar el 5'-fosfato y así evitar la religación del vector; de manera alternativa, para evitar la ligación puede emplearse la digestión mediante enzimas de restricción de fragmentos indeseados. Las mezclas de ligación son transformadas en huéspedes de clonación adecuados, tales como E. coli, y se seleccionan los transformantes que han tenido éxito, por ejemplo, en virtud de la resistencia a antibióticos, y son analizados en cuanto a la construcción correcta.

Pueden prepararse oligonucleótidos sintéticos empleando un sintetizador automatizado de oligonucleótidos tal como ha sido descrito por Warner (1984), DNA 3:401. Si se desea, las cadenas sintéticas pueden ser marcadas con ^{32}P mediante tratamiento con polinucleótido-quinasa en presencia de ^{32}P-ATP, empleando condiciones estándar para la reacción. Las secuencias de ADN, incluyendo las aisladas de bibliotecas de cADN, pueden ser modificadas mediante técnicas conocidas, incluyendo, por ejemplo, la mutagénesis puntual dirigida, tal como ha sido descrita por Zoller (1982), Nucleic Acid Res. 10:6487.

Las bibliotecas de ADN pueden ser sondeadas empleando el procedimiento de Grunstein y Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3961. Brevemente, en este procedimiento se inmoviliza sobre filtros de nitrocelulosa el ADN que ha de ser sondeado, se desnaturaliza, y se prehibrida con un tampón. El porcentaje de formamida en el tampón, así como las condiciones de tiempo y temperatura de la prehibridación y las etapas de hibridación subsiguientes, dependen de la restrictividad requerida. Las sondas oligómeras que requieren menores condiciones de restrictividad se emplean generalmente con bajos porcentajes de formamida, temperaturas inferiores, y tiempos de hibridación superiores. Las sondas que contienen más de 30 o 40 nucleótidos, tales como las derivadas de cADN o secuencias genómicas, emplean generalmente temperaturas superiores, por ejemplo aproximadamente 40-42ºC, y un porcentaje elevado, por ejemplo 50%, de formamida. Después de la pre-hibridación, se añade al tampón sonda de oligonucleótido marcada con 5'-^{32}P, y se incuban los filtros en esta mezcla en condiciones de hibridación. Después del lavado, se someten a autorradiografía los filtros tratados para mostrar la localización de la sonda hibridada; se emplea el ADN en localizaciones correspondientes sobre las placas de agar originales como fuente del ADN deseado.

Puede emplearse un ensayo de inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) para medir la concentración del antígeno o la concentración del anticuerpo. Este método depende de la conjugación de un enzima a un antígeno o a un anticuerpo, y emplea la actividad de la enzima ligada como una marca cuantitativa. Para medir el anticuerpo, se fija el antígeno conocido a una fase sólida, (por ejemplo una microplaca o una copa plástica), se incuba con diluciones de suero de ensayo, se lava, se incuba con anti-inmunoglobulina marcada con una enzima, y se lava de nuevo. En la técnica son conocidas enzimas adecuadas para el marcado, e incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante. La actividad de la enzima ligada a la fase sólida se mide añadiendo el sustrato específico, y determinando colorimétricamente la formación de producto o la utilización de sustrato. La actividad de la enzima ligada es función directa de la cantidad de anticuerpo ligado.

Para medir el antígeno, se fija a la fase sólida un anticuerpo específico conocido, se añade el material de ensayo que contiene antígeno, se lava la fase sólida después de una incubación, y se añade un segundo anticuerpo marcado con enzima. Después del lavado se añade sustrato, y se estima colorimétricamente la actividad enzimática, que se relaciona con la concentración de antígeno.

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Ejemplos

I

Este ejemplo describe la clonación de las secuencias de nucleótido de HCV/J1 y HCV/J7.

Las dos muestras de sangre que se utilizaron como fuente de viriones HCV resultaron ser positivas en un ensayo para anticuerpos anti-HCV. Los aislados de HCV de estas muestras fueron denominados HCV/J1 y HCV/J7. La infectividad de la muestra sanguínea que contenía el aislado J1 fue confirmada mediante un estudio prospectivo de recipientes de transfusiones sanguíneas. El Dr. Tohru Katayama, del Departamento de Cirugía del National Tokyo Chest Hospital, extrajo sangre de pacientes que habían contraído hepatitis no A, no B, post-transfusión. Extrajo también muestras de sangre de los donantes de sangre respectivos de dichos pacientes. A continuación se ensayaron las muestras en busca de anticuerpos para el antígeno HCV1 C100-3 (Publicación EPO número 318.216), y la sangre de uno de los donantes resultó ser positiva.

El aislamiento del ARN de las muestras de sangre comenzó peletizando los viriones de la muestra de sangre por medio de ultracentrifugación [Bradley, D.W., McCaustland, K.A., Cook E.H., Schable, C.A., Ebert, J.W. y Maynard, J.E. (1985) Gastroenterology 88, 773-779]. A continuación se extrajo ARN del pellet mediante el método de cloruro de cesio/guanidinio [Maniatis T., Fritsch, E.F., y Sambrook J. (1982), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor], y se purificó adicionalmente mediante extracción con fenol/cloroformo en presencia de urea, [Berk, A.J., Lee, F., Harrison, T., Williams, J., y Sharp, P.A. (1979) Cell 17, 935-944].

De los dominios C/E, E, E/NS1, NS3 y NS5 de la secuencia de nucleótidos de HCV1 se designaron cinco pares de cebadores sintéticos de oligonucleótido, para aislar fragmentos de los genomas J1 y J7. El primer conjunto de cebadores estaba destinado a aislar la secuencia del dominio del núcleo y algo de dominio de la envoltura. El segundo conjunto de cebadores estaba destinado a aislar las secuencias del dominio de la envoltura. El tercer conjunto de cebadores estaba destinado a aislar un fragmento que solapaba los dominios putativos de la envoltura y el no estructural NS1. El cuarto y quinto conjunto de cebadores fueron utilizados para aislar fragmentos de los dominios no estructurales tres y cinco, NS3 y NS5. A continuación se exponen las secuencias de los distintos cebadores:

Las secuencias de los cebadores para la región C/E eran:

100

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Las secuencias de los cebadores para la región E eran:

101

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Las secuencias de los cebadores para la región E/NS1 eran:

102

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Las secuencias de los cebadores para la región NS3 eran:

103

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Las secuencias de los cebadores para la región NS5 eran:

104

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Se añadió 1 \mug de los cebadores antisentido 166A, 526A, o 917A, a 10 unidades de transcriptasa inversa (Biorad) a fin de sintetizar fragmentos de cADN a partir del ARN aislado, como plantilla. A continuación se multiplicaron los fragmentos de cADN mediante una reacción en cadena de la polimerasa, estándar [Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn G.T., Erlich, H.A., y Arnheim, N. (1985), Science 230, 1350-1354] después de haber añadido 1 \mug del cebador apropiado de sentido, 21S, 71S, 127S, 464S u 870S.

Se aislaron en gel los fragmentos de cADN multiplicados mediante el método PCR, y se clonaron mediante ligación de extremos romos en el sitio SmaI de pUC119 [Vieira, J. y Messing, J. (1987) Methods in Enzymology 153, 3-11] o en el sitio SnaBI del carómido SB, un derivado del carómido del vector de clonación 9-42 [Saito, I. y Stark, G. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8664-8668. Se construyeron con éxito clones que contenían los fragmentos de los cinco dominios víricos.

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II

De la reacción PCR de los aislados japoneses J1 y J7 se han secuenciado, por el método de terminación de cadena didesoxi, tres clones independientes de cada región, C/E, E, E/NS1, NS3 y NS5.

La secuencia de todas las regiones salvo la C/E ha sido aislada del aislado J1. Sólo la secuencia de la región C/E ha sido aislada del aislado J7. De manera sorprendente, los fragmentos aislados de ambos aislados no son ni más largos ni más cortos que lo que podría predecirse a partir del genoma HCV1. Sin embargo, existe heterogeneidad entre clones que contienen secuencia de la misma región. En consecuencia, se construyó una secuencia de consenso para cada uno de los dominios, C/E, E, E/NS1, NS3, y NS5, tal como se muestra, respectivamente, en las Figuras 1 a 5. Estas diferencias pueden ser explicadas como artefactos que ocurren al azar durante la multiplicación PCR [Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn G.T., Erlich, H.A., y Arnheim, N., (1985) Science 230, 1350-1354]. Otra explicación reside en que en el plasma de un único portador sano está presente más de un genoma vírico, y que estos genomas son heterogéneos a nivel de nucleótido.

Para clarificar este punto, se determinó cuántas de estas diferencias de nucleótidos conducirían a cambios de aminoácidos, empleando como ejemplo la secuencia del dominio NS3 del aislado J1. De las cinco diferencias de nucleótidos, tres caen en la tercera posición del codón de aminoácido, y no cambian la secuencia de aminoácidos. Los dos restantes cambios de nucleótido caen en la primera posición del codón de aminoácido, y generan cambios de aminoácido, de treonina a alanina, y de prolina a alanina, todos los cuales son residuos de aminoácidos neutros y pequeños. De manera similar, cuando se analizan las diferencias de nucleótidos en otros dominios, se encuentran muchas mutaciones silenciosas y conservadas. Estos resultados sugieren que las secuencias de nucleótidos de los genomas de HCV en el plasma de un único donante sano, son heterogéneas a nivel de nucleótido.

Además, una vez que se compilaron las secuencias de consenso para cada uno de los fragmentos, se comparó cada secuencia con el aislado HCV1 de las Figuras 6 a 10. En la Figura 6, el fragmento de la región C/E del aislado J7 muestra una homología de nucleótidos de 92,8%, 512/552, y una homología de aminoácidos de 97,4%, 150/154, con el aislado HCV1. El fragmento del dominio E de J1 muestra una homología de nucleótidos y aminoácidos con HCV1 de la Figura 7 ligeramente menor, de 76,2% y 82,9%, respectivamente. El fragmento del aislado J1 que solapa los dominios de envoltura y no estructural, muestra la menor homología con HCV1, tal como se observa en la Figura 8, en la cual el aislado J1 tiene una homología de nucleótidos de 71,5% y una homología de aminoácidos de 73,5% con HCV1. La Figura 9 muestra una comparación del fragmento del dominio NS3 de J1 con HCV1. La homología entre las secuencias de nucleótidos es 79,8%, mientras que la homología de aminoácidos entre los aislados es bastante alta, 92,2% o 179/194 aminoácidos. La Figura 10 muestra la homología entre las secuencias NS5 de J1 y HCV1. Las secuencias tienen una homología de nucleótidos de 84,3% y de aminoácidos de 88,7%.

Los vectores descritos en los ejemplos precedentes han sido depositados en el Patent Microorganism Depository, Fermentation Institute, Agency of Industrial Science and Technology, en 1-3, Higashi 1-chome Tsukuba-chi, Ibaragiken 305, Japón, y serán mantenidos de acuerdo con lo estipulado en el tratado de Budapest. Los números de registro y las fechas de depósito se exponen más adelante, en la página 68.

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III

Utilizando esencialmente las técnicas antes descritas se aisló un clon de HCV/J1, J1-1519. Sin embargo, los cebadores utilizados en el aislamiento fueron J159S y 199A. Las secuencias de los cebadores oligómeros J159S y 199A, que se indican a continuación, estaban basadas en las de J1-1216 y en HCV-1.

105

El clon J1-1519 está compuesto por una secuencia de cADN de HCV de 367 nucleótidos que abarca la mayoría de la mitad 5' de la región NS1, y solapa al clon de la región E, J1-1216, en 31 nucleótidos. Se secuenciaron tres clones independientes que abarcaban esta región; las secuencias obtenidas de los tres clones dentro de esta región eran idénticas. En la Figura 13 se muestran la secuencia del cADN de HCV en J1-1216 (mostrado en la figura como J1) y los aminoácidos codificados por la misma (mostrados encima de la secuencia de nucleótidos). La Figura 13 muestra también las diferencias de secuencia entre J1-1216 en la región comparable del cADN del HCV1 prototipo (indicada en la figura como PT), y los cambios resultantes en los aminoácidos codificados. La homología entre J1-1216 y el cADN de HCV1 es aproximadamente 70% a nivel de nucleótido, y aproximadamente 75% a nivel de aminoácido.

En la Figura 14 se muestra una composición de las secuencias desde el núcleo putativo hasta la región NS1 del aislado J1; también se muestran en la figura los aminoácidos codificados en la secuencia J1. La variación respecto a la secuencia del prototipo HCV1 se muestra en la línea debajo de la secuencia de nucleótidos de J1; las líneas de trazos indican secuencias homólogas. Los aminoácidos no homólogos codificados en la secuencia del prototipo HCV1 se muestran debajo de la secuencia de nucleótidos de HCV1.

El material clonado que contiene el cADN de HCV J1/1519 (pS1-1519) ha sido mantenido en DH5\alpha, y ha sido depositado en el Patent Microorganism Depository.

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IV

Utilizando el método PCR se multiplicaron varias regiones del aislado J1, incluyendo la región C200-C100 de la región NS3-NS4 putativa (que abarca la región que codifica el polipéptido 5-1-1 en HSV1 (véase la Publicación EPO número 318.216), y la región NS1-E putativa. La región C200-C100 incluye los nucleótidos 3799 a 5321 del HCV1 prototipo. Se extrajo ARN tal como se ha descrito antes, excepto que la extracción se realizó con tiocianato de guanidinio en presencia de proteinasa K y dodecilsulfato de sodio (SDS) (Maniatis (1982), más arriba). Se transcribió el ARN a cADN de HCV mediante incubación en una reacción de 25 \mul que contenía cada cebador en una concentración 1 \muM, 40 unidades de inhibidor de ARNasa (RNASIN), 5 unidades de transcriptasa inversa AMV, y sales y tampón necesarios para la reacción. La multiplicación de un segmento del cADN de HCV de la región designada se llevó a cabo empleando pares de cebadores 16-meros oligómeros sintéticos. La multiplicación PCR se realizó en tres rondas (PCR I, PCR II y PCR III). La segunda y tercera rondas de la multiplicación PCR (PCR II y PCR III) utilizaron conjuntos distintos de cebadores de PCR; la primera reacción de PCR fue diluida 10 veces, y se realizaron múltiples iteraciones de multiplicación PCR con los nuevos cebadores, de manera que al final habían sido remultiplicados hasta 50% de los productos de la primera reacción PCR (PCR I). Los cebadores utilizados para la multiplicación de las regiones fueron los siguientes. Estos cebadores, con la excepción de J1C200-3, que se derivaba de la secuencia del aislado J1, se derivaban de la secuencia del HCV1 prototipo.

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Cebadores para la multiplicación de la región "5-1-1" de NS3-NS4

PCR I

511/16A (de sentido, derivado de nucleótidos que comienzan en el número 1528 de HCV1)

106

511/16B (anti-sentido, derivado de nucleótidos que terminan en el número 5260 de HCV1)

107

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PCR II

511/35A (de sentido, la porción de HCV derivada de nucleótidos que comienzan en el número 5057 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

108

511/35B (anti-sentido, la porción de HCV derivada de nucleótidos que terminan en el número 5233 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

109

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PCR III

511/35A (véase más arriba)

VSNrc7 (antisentido, derivado de nucleótidos que terminan en el número 5804 de HCV1)

110

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Cebadores para la multiplicación de la región "NS1/E"

PCR I

J1(E2)3 (de sentido, la porción de HCV derivada de nucleótidos que comienzan en el número 953 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

111

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J1(E)4 (de sentido, la porción de HCV derivada de nucleótidos que comienzan en el número 1087 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

112

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J1rc12 (anti-sentido, la porción de HCV derivada de nucleótidos que terminan en el número 1995 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

113

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J1rc13 (anti-sentido, la porción de HCV derivada de nucleótidos que terminan en el número 1941 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

114

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PCR II

J1rc13 (véase más arriba)

J1IZ-1 (de sentido, la porción de HCV se deriva de nucleótidos que comienzan en el número 1641 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

115

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J1IZ-2 (de sentido, la porción de HCV se deriva de nucleótidos que comienzan en el número 1596 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

116

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Cebadores para la región C200-C100 de la región "NS3-NS4"

PCR I

J1C200-1 (de sentido, derivado de nucleótidos que comienzan en el número 3478 de HCV1)

117

J1C200-3 (anti-sentido, derivado de nucleótidos que terminan en el número 4402 de HCV1)

118

J1rc52 (anti-sentido, la porción de HCV derivada de nucleótidos que terminan en el número 5853 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

119

511/16A (véase más arriba)

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PCR II

J1C200-2 (de sentido, la porción de HCV derivada de nucleótidos que comienzan en el número 3557 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

120

J1C200-4 (anti-sentido, la porción de HCV derivada de nucleótidos que terminan en el número 4346 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

121

511/35A (véase más arriba)

J1rc51 (anti-sentido, la porción de HCV derivada de nucleótidos que terminan en el número 5826 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

122

O bien se secuenciaron directamente, sin clonación, los cADNs de HCV multiplicados, o bien fueron clonados, o ambas cosas. La secuenciación se llevó a cabo empleando una técnica PCR asimétrica, esencialmente tal como ha sido descrita por Shyamala y Ames, J. Bacteriology 171:1602 (1989). En esta técnica, la multiplicación del cADN se lleva a cabo con una concentración limitante de uno de los cebadores (usualmente en una proporción de aproximadamente 1:50) a fin de conseguir la multiplicación preferencial de una cadena. A continuación se secuencia, mediante el método de terminación de la cadena didesoxi, la cadena preferencialmente multiplicada.

Los cebadores utilizados para la secuenciación asimétrica por el método PCR fueron los siguientes. Para la región NS1: J1lZ-1 y J1rc13 (secuenciada con ambos); J1lZ-2, J1rc13 (confirmada en ambas cadenas). Para la región NS3-NS4, que incluye la región N-terminal C200-C100, la región C-terminal C200-C100, y la región 5-1-1: J1C200-2 y J1C200-7 (para la región N-terminal C200-C100), y J1C200-4 y J1C200-6 (para la región C-terminal C200-C100); y 511/35A y hep 4 (para la región 5-1-1). Las secuencias de J1C200-2, J1C200-4 y 511/35A han sido mostradas más arriba; las secuencias de hep 4, J1C200-6, y J1C200-7 son las siguientes:

hep 4 (derivada de nucleótidos que comienzan en el número 5415 de HCV1)

123

J1C200-6 (la porción de HCV derivada de nucleótidos que comienzan en el número 3875 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

124

J1C200-7 (la porción de HCV derivada de nucleótidos que comienzan en el número 3946 de HCV1; el sitio de la enzima de restricción está subrayado)

125

En la Figura 15 y en la Figura 16 se muestran, respectivamente, las secuencias obtenidas por secuenciación asimétrica de la región "NS1", la región C200-C100, y la región 5-1-1. En las figuras, los aminoácidos codificados en la secuencia J1 están indicados encima de la secuencia de nucleótidos J1. Las diferencias entre la secuencia J1 y la secuencia de nucleótidos prototipo HCV1 se indican debajo de la secuencia J1 (las líneas de trazos indican nucleótidos homólogos en ambas secuencias). Los aminoácidos codificados que difieren en la secuencia prototipo HCV1 se indican debajo de la secuencia de nucleótidos de HCV1.

Se clonaron cADNs de HCV de la región NS1, de la región C200-C100, y de la región 5-1-1. Se clonaron un fragmento de 300 pares de bases (bp) y un fragmento de 230 bp, de la región NS1 putativa, en un derivado del vector comercialmente disponible pGEM-3Z, en huésped HB101, y fueron depositados en la ATCC como AW-300bp. Los vectores derivados mantienen los polienlazadores pGEM-3Z originales, un gen Amp^{r} intacto, y los genes requeridos para la replicación en E. coli. Los fragmentos de cADN de HCV pueden ser separados con SacI y XbaI. Se clonaron en pM1E en HB101, cADNs de HCV que contenían fragmentos N-terminales de 770 bp de C200; se reunieron 12 clones y fueron depositados en la ATCC como AW-770bp-N; el cADN de HCV puede ser separado del vector con HaeII. El fragmento HaeII resultante contendrá ADN vector de 300 bp y 250 bp en los extremos 5' y 3', respectivamente. Se clonaron en M13mp10 cADNs de HCV que contenían fragmentos C-terminales de 700 bp de C200 (AW-700bp-C), y se mantuvieron en el huésped DH5\alpha-F'; la clonación se realizó en el sitio de polienlazador del vector. Se reunieron los fagos resultantes, y fueron depositados en la ATCC el 11 de septiembre de 1990 como AW-700bp-N o AW-700bp-C. Se clonó cADN de HCV del equivalente en J1 a la región 5-1-1 de HCV1, en el sitio mp19 EcoRI, y se mantuvo en DH5\alpha-F'. Se reunieron varios sobrenadantes de fagos m13 de esta clonación, y fueron depositados en la ATCC como J1 5-1-1, el 11 de septiembre de 1990. A partir del fago pueden obtenerse los cADNs de HCV mediante tratamiento con EcoRI. Los números de entrada para J1 5-1-1, AW-700bp-N o AW-700bp-C pueden obtenerse telefoneando a la ATCC al número (301) 881-2600.

El material clonado antes descrito ha sido depositado en la American Type Culture Collection (ATCC).

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V

Mediante clonación direccional en \lambda-gt22 se creó una biblioteca de cADN de HCV que contenía secuencias de la región "NS1" putativa del aislado J1. La región "NS1" se extiende desde aproximadamente el nucleótido 1460 hasta aproximadamente el nucleótido 2730, empleando el sistema de numeración de la secuencia del ácido nucleico prototipo HCV1, en la cual el nucleótido 1 es el primer nucleótido del codón de metionina iniciadora de la poliproteína putativa. La clonación se llevó a cabo empleando esencialmente el método descrito por Han y Rutter en GENETIC ENGINEERING, volumen 10 (editado por J.K. Setlow, Plenum Publishing Co., 1988), salvo que los cebadores para la síntesis de la primera y segunda cadena de cADN de HCV fueron JHC67 y JHC68, respectivamente, y la fuente de ARN fue el plasma J1. En este método se extrae el ARN con tiocianato de guanidinio a baja temperatura. A continuación se convierte el ARN a cADN de longitud completa, que es clonado en una orientación definida en relación con el promotor lacZ en el \lambda-fago. Empleando este método, se insertaron los cADNs de HCV a ARN J1, en el sitio NotI de \lambda-gt22. La presencia de secuencias "NS1" en la biblioteca fue detectada empleando la sonda Alx54.

La secuencia de una región de "NS1" aguas abajo de la región mostrada en la Figura 14, pero que solapa la región en aproximadamente 20 nucleótidos, fue determinada empleando la técnica de secuenciación asimétrica antes descrita, pero utilizando como cebadores para la multiplicación PCR, Alx 61 y Alx 62. En la Figura 17 se muestra la secuencia resultante (debe señalarse que la multiplicación PCR se realizó de una región desde aproximadamente el nucleótido 1930 hasta aproximadamente el nucleótido 2340; esta región está comprendida también en la secuencia mostrada en la Figura 15). Las secuencias de los cebadores y sondas utilizados para obtener la biblioteca de cADN de HCV en \lambda-gt22, y para secuenciar la porción de la región "NS1", fueron las siguientes.

126

Se clonó en pGEM3z un fragmento de 400 bp de cADN de HCV J1, derivado de la región secuenciada, y se mantuvo en HB101; el cADN de HCV puede ser separado del vector con SacI y XbaI. Se han depositado en la ATCC células huésped transformadas con el vector (JH-400bp).

Se creó una biblioteca combinada de cADN procedente del suero J1; la biblioteca combinada abarca el genoma J1, y está identificada como HCV-J1 \lambda-gt22. La biblioteca combinada de cADN fue creada reuniendo alícuotas de 11 bibliotecas de cADN individuales, que habían sido preparadas empleando la técnica de clonación direccional antes descrita, salvo que se crearon las bibliotecas a partir de cebadores que habían sido diseñados para proporcionar cADNs de HCV que abarcasen el genoma. Los cebadores se derivaban de la secuencia de HCV1, e incluían JHC 67 y JHC 68. Se insertaron los cADNs de HCV en el sitio NotI de \lambda-gt22. La biblioteca combinada de cADN, HCV-J1 \lambda-gt22, ha sido depositada en la ATCC.

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VI

Se determinó la secuencia de una región del polinucleótido aguas arriba de la mostrada en la Figura 14. Esta región comienza en el nucleótido -267 con respecto al HCV-1 (véase la Figura 12), y se extiende durante 560 nucleótidos. La secuenciación se llevó a cabo preparando cADN de HCV a partir de ARN extraído de suero J1, y multiplicando el cADN de HCV mediante el método PCR.

Se extrajo ARN de 100 \mul de suero después del tratamiento con proteinasa K y dodecilsulfato de sodio (SDS). Se extrajeron las muestras con fenol-cloroformo, y se precipitó el ARN con etanol.

Se preparó cADN de HCV a partir del aislado J1 desnaturalizando el ARN precipitado con MeHgOH 0,01M; al cabo de diez minutos a temperatura ambiente se añadió 2-mercaptoetanol para secuestrar los iones mercurio. Inmediatamente se añadió la mezcla para la síntesis de la primera cadena de cADN, y se continuó la incubación durante 1 hora a 37ºC. Las condiciones para la síntesis de la cadena anti-sentido fueron las siguientes: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 75 mM, MgCl_{2} 3 mM, ditiotreitol 10 mM, cada uno de los trifosfatos de desoxinucleótido a una concentración 500 \muM, 250 pmol de cebador r25 de cADN antisentido específico, 250 unidades de transcriptasa inversa MMLV. Para sintetizar la segunda cadena (de sentido), se añadieron los componentes de la reacción de síntesis, y se incubaron durante 1 hora a 14ºC. Los componentes para la reacción de la segunda cadena fueron los siguientes: Tris HCl 14 mM, pH 8,3, KCl 68 mM, sulfato amónico 7,5 mM, MgCl_{2} 3,5 mM, ditiotreitol 2,8 mM, 25 unidades de ADN-polimerasa I, y una unidad de ARNasa H. Las reacciones fueron finalizadas calentando las muestras a 95ºC durante 10 minutos, seguido de enfriamiento en hielo.

El cADN de HCV fue multiplicado mediante dos rondas de PCR. La primera ronda se llevó a cabo empleando 20 \mul de la mezcla de cADN. Las condiciones para la reacción PCR fueron las siguientes: Tris HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,002%, cada uno de los trifosfatos de desoxinucleótido a una concentración 200 mM, y 2,5 unidades de Amplitaq. El ciclo térmico de la PCR fue el siguiente: 94ºC durante un minuto, 50ºC durante un minuto, 72ºC durante un minuto, repetido 40 veces, seguido por siete minutos a 72ºC. La segunda ronda de PCR se llevó a cabo empleando cebadores anidados (es decir, cebadores que se unen a una región interna de producto multiplicado en la primera ronda de PCR) a fin de incrementar la especificidad de los productos de PCR. Un uno por ciento de la primera reacción de PCR fue multiplicado esencialmente como en la primera ronda, salvo que se sustituyeron los cebadores, y el segundo paso en la reacción de PCR se realizó a 60ºC en lugar de a 50ºC. Los cebadores utilizados para la primera ronda fueron ALX90 y r14. Los cebadores usados para la segunda ronda de PCR fueron r14 y p14.

Las secuencias de los cebadores para la síntesis de cADN de HCV, y para el método PCR, fueron las siguientes.

127

Se purificaron en gel los productos de PCR, se aisló el material que migraba como si tuviese aproximadamente 615 bp, y se secuenció mediante una modificación del método de terminación de cadena de didesoxi de Sanger, empleando ^{32}P-ATP como marca. En el método modificado, la secuencia de replicación fue cebada empleando como cebadores P32 y R31; el ADN bicatenario fue fundido durante 3 minutos a 95ºC antes de la replicación, y se catalizó la síntesis de polinucleótidos terminados con didesoxi, marcados, mediante Bst-polimerasa (obtenida de BioRad Corp.), siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación se llevó a cabo empleando de 500 ng a 1 \mug de producto de PCR por reacción de secuenciación.

Los cebadores P32 (de sentido) y R31 (antisentido) se derivaban de los nucleótidos -137 a -115, y de los nucleótidos 192 a 173, respectivamente, de la secuencia de HCV1. Las secuencias de los cebadores son la siguientes.

Cebador P32

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Cebador R31

129

en donde X = A o G.

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En la Figura 18 se muestra la secuencia de la región del aislado J1 que comprende la región 5'-no traducida así como una parte de la región del "núcleo" putativo. En la figura se indican encima de la secuencia de nucleótidos los aminoácidos codificados en la secuencia J1. Debajo de la secuencia J1 se muestra la secuencia del prototipo HCV1; las líneas a trazos indican homología de secuencia con J1. Debajo de la secuencia de HCV1 se indican los aminoácidos diferentes codificados en la secuencia HCV1.

Se clonó en pGEM3Z un fragmento de cADN de HCV representativo de la secuencia de 600 bp de J1 antes descrita (TC 600 bp), y se mantuvo en el huésped HB101; el fragmento de cADN de HCV puede ser separado con SacI y XbaI. Este material ha sido depositado en la ATCC.

Depositado en el Patent Microorganism Depository bajo los términos del Tratado de Budapest.

130

Los siguientes vectores descritos en los Ejemplos han sido depositados en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, y se les han asignado los siguientes números de entrada. Los depósitos se hicieron bajo los términos del Tratado de Budapest.

1

Estos depósitos están previstos para conveniencia de los especialistas en la técnica. Estos depósitos no constituyen una admisión de que tales depósitos sean necesarios para poner en práctica la presente invención ni de que realizaciones equivalentes no estén dentro de la pericia en la técnica a la vista de la presente descripción. La disponibilidad pública de estos depósitos no es una cesión de una licencia para preparar, usar o vender los materiales depositados bajo esta o cualquier otra patente. Las secuencias de ácido nucleico de los materiales depositados están incorporadas en la presente memoria descriptiva por referencia, y son dirimentes si existe conflicto con cualesquiera secuencias descritas en la presente memoria.

Aunque la presente invención ha sido descrita por medio de ejemplos específicos para beneficio de quienes trabajan en este campo, el alcance de la invención no está limitado, ya que a partir de la presente descripción se harán evidentes realizaciones adicionales a los especialistas en la técnica.

Claims (9)

1. Un método para preparar un polinucleótido en forma sustancialmente aislada que comprende una secuencia de nucleótidos de un aislado de HCV J-1, teniendo dicha secuencia de nucleótidos la secuencia de nucleótidos de la secuencia J-1 de una cualquiera de las Figuras 7 u 8, comprendiendo dicho método:

a) síntesis química por métodos en sí conocidos; o

b) replicación de ADN por métodos en sí conocidos; o

c) transcripción o transcripción inversa por métodos en sí conocidos; o

d) digestión mediante enzimas de restricción y ligación en un vector mediante técnicas de ADN recombinante en sí conocidas.

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2. Un método para preparar un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que

(a) está codificada por una secuencia de nucleótidos como se define en la reivindicación 1, estando dicha codificación en consonancia con las secuencias de aminoácidos correspondientes expuestas en las Figuras 7 u 8;

(b) comprende un determinante antigénico codificado por la secuencia de nucleótidos como se define en (a);

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comprendiendo dicho método:

(i) síntesis química por métodos en sí conocidos; o

(ii) traducción desde la correspondiente secuencia de ácido nucleico por métodos en sí conocidos; o

(iii) expresión de un sistema de expresión recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, por métodos en sí conocidos; o

(iv) aislamiento a partir de virus por métodos en sí conocidos.

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3. Un método para detectar polinucleótidos de HCV en una muestra de ensayo, que comprende.

(a) proporcionar un polinucleótido tal como se ha definido en la reivindicación 1 como una sonda;

(b) poner en contacto la muestra de ensayo y la sonda en condiciones que permitan la formación de un dúplex de polinucleótido entre la sonda y su complemento en ausencia de sustancial formación de dúplices de polinucleótidos entre la sonda y secuencias de polinucleótidos no-HCV presentes en la muestra de ensayo; y

(c) detectar cualesquiera dúplices de polinucleótidos que comprendan la sonda.

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4. Un inmunoensayo para detectar la presencia de anticuerpos anti-HCV en una muestra de ensayo, que comprende:

(a) incubar la muestra de ensayo en condiciones que permitan la formación de un complejo antígeno-anticuerpo con un polipéptido que está codificado por una secuencia de nucleótidos tal como se ha definido en la reivindicación 1 o una secuencia de un aislado de HCV J-1 presente en uno cualquiera de los plásmidos pU1-1216c o pS1-713c, depositados con los números de entrada BP-2594 y BP-2637 respectivamente, estando dicha codificación en consonancia con las correspondientes secuencias de aminoácidos expuestas en las Figuras 7 u 8, polipéptido que comprende un determinante antigénico codificado por la secuencia de nucleótidos como se define en la reivindicación 1, e inmunológicamente no tiene reactividad cruzada con HCV-1; y

(b) detectar cualesquiera complejos antígeno-anticuerpo formados.

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5. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual la muestra de ensayo comprende sangre humana o una fracción de la misma.

6. Un polinucleótido en forma sustancialmente aislada que comprende una secuencia de nucleótidos de un aislado de HCV J-1, teniendo dicha secuencia de nucleótidos la secuencia de nucleótidos de la secuencia J-1 de una cualquiera de las Figuras 7 u 8.

\newpage

7. Un polinucleótido que comprende la secuencia de un aislado de HCV J-1 presente en uno cualquiera de los plásmidos pU1-1216c o pS1-713c, depositados con los números de registro BP-2594 y BP-2637, respectivamente.

8. Un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos que:

(a) está codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se ha definido en la reivindicación 6, o en las secuencias de HCV depositadas y definidas en la reivindicación 7, estando dicha codificación en consonancia con las correspondientes secuencias de aminoácidos expuestas en las Figuras 7 u 8; y

(b) comprende un determinante antigénico codificado por la secuencia de nucleótidos como se define en la etapa (a).

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9. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 8, inmovilizado sobre un soporte sólido.