JPH0330676A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルスのｄｎａ、そのクローン及びこれらの調製法 - Google Patents
非ａ非ｂ型肝炎ウイルスのｄｎａ、そのクローン及びこれらの調製法Info
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- JPH0330676A JPH0330676A JP1163715A JP16371589A JPH0330676A JP H0330676 A JPH0330676 A JP H0330676A JP 1163715 A JP1163715 A JP 1163715A JP 16371589 A JP16371589 A JP 16371589A JP H0330676 A JPH0330676 A JP H0330676A
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- C07K—PEPTIDES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎（以下、単に
ｒＮＡＮＢ、と称する）ウィルスのＤＮＡ、これをクロ
ーン化したベクター及びこれらの調整法に係る。
ーン化したベクター及びこれらの調整法に係る。
（従来の技術）
ＮＡＮＢは輸血に基因する肝炎の９０−９５％を占めて
おり、治療法も未だ確立するに至っていないので、その
診断薬、治療薬、輸血用血液中に場合により存在するＮ
ＡＮＢウィルスを無害化する処理剤、予防用ワクチン等
の開発が強く要望されている。
おり、治療法も未だ確立するに至っていないので、その
診断薬、治療薬、輸血用血液中に場合により存在するＮ
ＡＮＢウィルスを無害化する処理剤、予防用ワクチン等
の開発が強く要望されている。
近年に至り、ＮＡＮＢの抗原研究が進み、１ｏｏｏ。
塩基程度の一本鎖ＲＮＡが関与するのではないかとの報
告がなされており （特開昭６２−２４９９９９及び同
６３−９１３２８）、又最近においては国立予防衛生研
究所グループからＮＡＮＢウィルスを分離した旨の発表
が、更には岡山医大グループからＮＡＮＢウィルス遺伝
子を分離した旨の発表が新聞報道されているが、これら
がＮＡＮＢウィルスやその構造遺伝子であるとの確証を
得るには至っていない。
告がなされており （特開昭６２−２４９９９９及び同
６３−９１３２８）、又最近においては国立予防衛生研
究所グループからＮＡＮＢウィルスを分離した旨の発表
が、更には岡山医大グループからＮＡＮＢウィルス遺伝
子を分離した旨の発表が新聞報道されているが、これら
がＮＡＮＢウィルスやその構造遺伝子であるとの確証を
得るには至っていない。
（発明が解決しようとする課題及び発明の目的）従って
、本発明はＮＡＮＢウィルスを究明することを課題とす
るものであり、バイオテクノロジー技術を利用してその
ＤＮＡの少くとも一部を得、又クローン化し、これによ
ってＮＡＮＢの診断、治療、輸血用血液の処理、ワクチ
ン開発等の可能性をもたらすことを目的とするものであ
る。
、本発明はＮＡＮＢウィルスを究明することを課題とす
るものであり、バイオテクノロジー技術を利用してその
ＤＮＡの少くとも一部を得、又クローン化し、これによ
ってＮＡＮＢの診断、治療、輸血用血液の処理、ワクチ
ン開発等の可能性をもたらすことを目的とするものであ
る。
（課題を解決し、目的を達成する手段及び作用）本発明
者等はＮＡＮＢウィルスについて鋭意検討を重ねた結果
、そのＤＮＡの少くとも一部の断片を得、クローン化に
成功し、構造決定をすることができ、斯くて上記の課題
を解決すると共に、上記の目的を達成するに至ったので
ある。
者等はＮＡＮＢウィルスについて鋭意検討を重ねた結果
、そのＤＮＡの少くとも一部の断片を得、クローン化に
成功し、構造決定をすることができ、斯くて上記の課題
を解決すると共に、上記の目的を達成するに至ったので
ある。
本発明によるＤＮＡは、ＮＡＮＢウィルス道伝子のアミ
ノ酸配列の一部をコードする塩基配列を有しており、約
８５０個のヌクレオチドを含有する一本＠ ＤＮＡ又は
該一本鎖ＤＮＡと相補ＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡで
あることを特徴としている。
ノ酸配列の一部をコードする塩基配列を有しており、約
８５０個のヌクレオチドを含有する一本＠ ＤＮＡ又は
該一本鎖ＤＮＡと相補ＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡで
あることを特徴としている。
本発明による上記のＤＮＡは式
％式％
ＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡ
ＧＴＴＴＧ７３０ ７４０ ７５０Ｇ
ＴＴＴＴＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＧ
ＴＧＴＣ７６０７７０７８０ ＣＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＣＡ
ＣＴＣＡＴ７９０ ８００ ８１０Ｇ
ＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＡ
Ａ−−３’８２０ ８３０ （式中、Ａ、 Ｃ，Ｇ及びＴはそれぞ れアデニン、シトシン、グアニン及び チミン塩基を有するデオキシリボヌク レオチドを意味する〉 にて示される塩基配列を有している。
ＧＴＴＴＧ７３０ ７４０ ７５０Ｇ
ＴＴＴＴＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＧ
ＴＧＴＣ７６０７７０７８０ ＣＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＣＡ
ＣＴＣＡＴ７９０ ８００ ８１０Ｇ
ＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＡ
Ａ−−３’８２０ ８３０ （式中、Ａ、 Ｃ，Ｇ及びＴはそれぞ れアデニン、シトシン、グアニン及び チミン塩基を有するデオキシリボヌク レオチドを意味する〉 にて示される塩基配列を有している。
本発明方法によれば、上記の二本鎖ＤＮＡは非Ａ非Ｂ型
肝炎患者由来の血漿の粒子（３）非Ａ非Ｂ型肝炎患者由
来の精製ＲＮＡを鋳型として作成した二本＠ ＤＮＡ断
片にＥｃｏＲＩリンカ−を付加し、次いでＥｃｏＲＩに
より消化することにより調製することができ、又一本鎖
ＤＮＡはこの二本鎖ＤＮＡを自体周知の手法で分離さ
せることにより、例えば９０℃にて３分間処理し、次い
で水冷することにより得ることができる。血漿からの粒
子画分の分離はＴＥＮ緩衝液［５０ｄ ）リス塩酸ｙ１
衡液（ｐＨ８，０＞、 ２ｍＭ ＥＤＴＡ、 １５０ｎ
ＭＮａＣＩ及び１ｍＭ ＰＭＳＦ］にて可溶化させると
共にポリエチレングリコール溶液にて沈降させ、高速遠
心により沈殿画分を分取し、この両分をＴＥＮ緩衡液に
より可溶化させ高速遠心して不溶画分を除去し、蔗糖溶
液ｉｎ ＴＥＮのクツションに重層し、超遠心して沈殿
画分を得、この操作を繰り返した後に得られた沈殿画分
をＴＥＮ緩衝液にて可溶化させ、この溶液にＧＩＴを添
加し、ＣｓＣｌ ｆｎＴＥＮに重層させ、超遠心して沈
殿画分を分取することにより行うことができる。この沈
殿画分からのＲＮＡの抽出は有機溶媒を用いて行われ、
精製は水溶液となした後に、キャリヤーとしてのグリコ
ーゲンを添加し１次いでエタノールにより沈降させるこ
とにより行うことができる。この精製ＲＮＡからの上記
二本鎖ＤＮＡの調製は自体周知の方法により行うことが
できる０例えば、プライマ及び逆転写酵素の存在下にイ
ンキュベーションして第１段階のストランド合成を行い
（この場合には、鋳型としてのＲＮＡ ！ｉＩと、これ
と相補的なりＮＡ鎖とからなる二本鎖体が作成される）
、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの存在下に
インキュベーションして第２段階のストランド合成を行
い（この場合には、上記の二本鎖体から分離された上記
の一本鎖ＤＮＡと、これと相補的なりＮＡ鎖とからなる
二本鎖体が作成される）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによ
り両端を平滑化し、有機溶媒で抽出し、ＥｃｏＲＩ リ
ガーゼを両端に付加し、ＥｃｏＲＩにより消化すること
により所望の二本鎖 ＤＮＡを得ることができる。上記
のブライマーとしてはランダムヘキサマーやｏｌｉｇｏ
（ｄｔ）を用いることができ、又上記の及びＲＮＡの抽
出に用いられる有機溶媒としてはクロロホルム及びクロ
ロホルムとフェノールとの混液を挙げることができる。
肝炎患者由来の血漿の粒子（３）非Ａ非Ｂ型肝炎患者由
来の精製ＲＮＡを鋳型として作成した二本＠ ＤＮＡ断
片にＥｃｏＲＩリンカ−を付加し、次いでＥｃｏＲＩに
より消化することにより調製することができ、又一本鎖
ＤＮＡはこの二本鎖ＤＮＡを自体周知の手法で分離さ
せることにより、例えば９０℃にて３分間処理し、次い
で水冷することにより得ることができる。血漿からの粒
子画分の分離はＴＥＮ緩衝液［５０ｄ ）リス塩酸ｙ１
衡液（ｐＨ８，０＞、 ２ｍＭ ＥＤＴＡ、 １５０ｎ
ＭＮａＣＩ及び１ｍＭ ＰＭＳＦ］にて可溶化させると
共にポリエチレングリコール溶液にて沈降させ、高速遠
心により沈殿画分を分取し、この両分をＴＥＮ緩衡液に
より可溶化させ高速遠心して不溶画分を除去し、蔗糖溶
液ｉｎ ＴＥＮのクツションに重層し、超遠心して沈殿
画分を得、この操作を繰り返した後に得られた沈殿画分
をＴＥＮ緩衝液にて可溶化させ、この溶液にＧＩＴを添
加し、ＣｓＣｌ ｆｎＴＥＮに重層させ、超遠心して沈
殿画分を分取することにより行うことができる。この沈
殿画分からのＲＮＡの抽出は有機溶媒を用いて行われ、
精製は水溶液となした後に、キャリヤーとしてのグリコ
ーゲンを添加し１次いでエタノールにより沈降させるこ
とにより行うことができる。この精製ＲＮＡからの上記
二本鎖ＤＮＡの調製は自体周知の方法により行うことが
できる０例えば、プライマ及び逆転写酵素の存在下にイ
ンキュベーションして第１段階のストランド合成を行い
（この場合には、鋳型としてのＲＮＡ ！ｉＩと、これ
と相補的なりＮＡ鎖とからなる二本鎖体が作成される）
、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの存在下に
インキュベーションして第２段階のストランド合成を行
い（この場合には、上記の二本鎖体から分離された上記
の一本鎖ＤＮＡと、これと相補的なりＮＡ鎖とからなる
二本鎖体が作成される）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによ
り両端を平滑化し、有機溶媒で抽出し、ＥｃｏＲＩ リ
ガーゼを両端に付加し、ＥｃｏＲＩにより消化すること
により所望の二本鎖 ＤＮＡを得ることができる。上記
のブライマーとしてはランダムヘキサマーやｏｌｉｇｏ
（ｄｔ）を用いることができ、又上記の及びＲＮＡの抽
出に用いられる有機溶媒としてはクロロホルム及びクロ
ロホルムとフェノールとの混液を挙げることができる。
このようにして得られた二本鎖ＤＮＡは、自体周知の手
法で、ベクター例えばファージベクターやグラスミドベ
クターに組込みクローン１ヒすることができる。このた
めのクローニングには、ベクターとしてファージを採択
する場合には１ｎｖｉ ｔｒｏパッケージング法が有利
であり、一方ブラスミドを採択する場合にはコロニー・
ハイブリダイゼーション法を利用するのが有利である。
法で、ベクター例えばファージベクターやグラスミドベ
クターに組込みクローン１ヒすることができる。このた
めのクローニングには、ベクターとしてファージを採択
する場合には１ｎｖｉ ｔｒｏパッケージング法が有利
であり、一方ブラスミドを採択する場合にはコロニー・
ハイブリダイゼーション法を利用するのが有利である。
得られたクローンについては、該クローンをプローブと
して宿主ＤＮＡとの間でサザン・ハイブリダイゼーショ
ンを行い、該宿主ＤＮＡとホモロジーを有しないもの、
即ちハイブリダイズしないものが、上記の二本＠ ＤＮ
Ａインサートを有するものとして採択された。
して宿主ＤＮＡとの間でサザン・ハイブリダイゼーショ
ンを行い、該宿主ＤＮＡとホモロジーを有しないもの、
即ちハイブリダイズしないものが、上記の二本＠ ＤＮ
Ａインサートを有するものとして採択された。
上記の本発明による二本鎖ＤＮＡがＮＡＮＢウィルスの
遺伝子であるのか否かについて、従って上記の本発明に
よるベクタークローンがＮＡＮＢウィルス由来のものな
のか否かは、現在確認されるに至っていないが、上記の
事実、即ち当該クローンをプローブとした場合に宿主Ｄ
ＮＡとハイブリダイズ（交叉）しない点から、上記の二
本ｇ ＤＮＡはＮＡＮＢウィルスの構造遺伝子の少くと
も特徴的な一部分に係るものと推定される。
遺伝子であるのか否かについて、従って上記の本発明に
よるベクタークローンがＮＡＮＢウィルス由来のものな
のか否かは、現在確認されるに至っていないが、上記の
事実、即ち当該クローンをプローブとした場合に宿主Ｄ
ＮＡとハイブリダイズ（交叉）しない点から、上記の二
本ｇ ＤＮＡはＮＡＮＢウィルスの構造遺伝子の少くと
も特徴的な一部分に係るものと推定される。
尚、上記のベクターとして、ファージに関してはλｇｔ
１０、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等を、プラスミ
ドに関してはｐＵｃ１１８、ｐｔＪｃ１１９等を例示す
ることができ、これらは周知の発現ベクターであるため
に、このクローン化ベクターを大腸菌、酵母等の微生物
又は動物細胞に取り込ませ、該微生物又は動物細胞を培
養すれば、ＮＡＮＢウィルスに基因する抗原性物質を大
量に産出させることができる。
１０、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等を、プラスミ
ドに関してはｐＵｃ１１８、ｐｔＪｃ１１９等を例示す
ることができ、これらは周知の発現ベクターであるため
に、このクローン化ベクターを大腸菌、酵母等の微生物
又は動物細胞に取り込ませ、該微生物又は動物細胞を培
養すれば、ＮＡＮＢウィルスに基因する抗原性物質を大
量に産出させることができる。
（実施例等）
次に、調製例等により、本発明を更に詳細に且つ具体的
に説明する。
に説明する。
１糺１ユ
（Ａ） ＮＡＮＢウィルスのｍＲＮＡを含むＲＮＡの分
離精製 ＮＡＮＢ患者由来の血漿に２０％ポリエチレングリコー
ル溶液ｉｎ ＴＥＮ （ＴＥＮ緩衝液）を添加し、攪拌
した後に約３０分間静置し、次いで高速遠心して沈殿画
分を分取した。
離精製 ＮＡＮＢ患者由来の血漿に２０％ポリエチレングリコー
ル溶液ｉｎ ＴＥＮ （ＴＥＮ緩衝液）を添加し、攪拌
した後に約３０分間静置し、次いで高速遠心して沈殿画
分を分取した。
この沈殿画分に５倍量のＴＥＮを添加して可溶化させ、
次いで高速遠心して不溶画分を除去した。
次いで高速遠心して不溶画分を除去した。
得られた液分を、１５％及び６０％蔗糖溶液１ｎＴＥＮ
のクツションに重層し、Ｓｉｌ＋ ２８０−ターを用い
２５００Ｏｒｐｍで１２時間超遠心して沈殿画分を得た
。この操作を繰り返した後に、得られた粒子画分を、１
５％蔗糖溶液ｉｎ ＴＥＮのクツションに重層し、ＳＷ
２８０−ターを用い２５００Ｏｒｐｍで１２時間超遠
心して沈殿画分を得、この両分をＴＥＮに溶解させた。
のクツションに重層し、Ｓｉｌ＋ ２８０−ターを用い
２５００Ｏｒｐｍで１２時間超遠心して沈殿画分を得た
。この操作を繰り返した後に、得られた粒子画分を、１
５％蔗糖溶液ｉｎ ＴＥＮのクツションに重層し、ＳＷ
２８０−ターを用い２５００Ｏｒｐｍで１２時間超遠
心して沈殿画分を得、この両分をＴＥＮに溶解させた。
この溶液にＧＩＴを添加し、ＣｓＣ１ｉｎ ＴＥＮ （
密度１．７）に重層し、ＳＷ ２８０−ターを用い３５
０００ｒｐｍで１２時間超遠心して沈殿画分を得、この
画分をＲＮＡ画分とする。
密度１．７）に重層し、ＳＷ ２８０−ターを用い３５
０００ｒｐｍで１２時間超遠心して沈殿画分を得、この
画分をＲＮＡ画分とする。
このＲＮＡ画分にクロロフォルム／フェノール混液を添
加してＲＮＡを抽出し、次いで更にクロロホルムを用い
て抽出する８分離された水相にキャリヤーとしてのグリ
コーゲンを添加しく最終濃度２０μｇ／ｌ）、次いでエ
タノールの添加により沈降させ遠心して沈殿画分を分取
し、これを精製ＲＮＡとした。
加してＲＮＡを抽出し、次いで更にクロロホルムを用い
て抽出する８分離された水相にキャリヤーとしてのグリ
コーゲンを添加しく最終濃度２０μｇ／ｌ）、次いでエ
タノールの添加により沈降させ遠心して沈殿画分を分取
し、これを精製ＲＮＡとした。
（Ｂ）精製ＲＮＡからのｍＲＮＡの分離及びＤＮＡの合
成 上記の（Ａ）項で得た精製ＲＮＡに対して、ブライマー
としてｏｌｉｇｏ（ｄＴ）を用い（ランダム・ヘキサマ
ーであっても差し支えない）、逆転写酵素（２００）の
存在下に４２℃で４５分間インキュベーションすること
により第１段階のストランド合成を行ったｆ鋳型として
のＲＮＡと、それと相補的なりＮＡ （ｃＤＮＡ）とが
結合している産物が合成される１゜ 次いで、ＲＮａｓｅ Ｈ（０，８Ｕ）及びＤＮＡポリメ
ラーゼ（２３Ｕ）を添加し、１２℃で６０分間、２２°
Ｃで６０分間、７０℃で１０分間インキュベーションす
ることにより第２段階のストランド合成を行った（これ
らの操作により、上記のｃＤＮＡ合成反応産物から一本
鎖ＤＮＡが分離され、この−木調ＤＮＡと、それと相補
的な一本鎖ＤＮＡとで所望の二本鎖ＤＮＡが合成される
）。
成 上記の（Ａ）項で得た精製ＲＮＡに対して、ブライマー
としてｏｌｉｇｏ（ｄＴ）を用い（ランダム・ヘキサマ
ーであっても差し支えない）、逆転写酵素（２００）の
存在下に４２℃で４５分間インキュベーションすること
により第１段階のストランド合成を行ったｆ鋳型として
のＲＮＡと、それと相補的なりＮＡ （ｃＤＮＡ）とが
結合している産物が合成される１゜ 次いで、ＲＮａｓｅ Ｈ（０，８Ｕ）及びＤＮＡポリメ
ラーゼ（２３Ｕ）を添加し、１２℃で６０分間、２２°
Ｃで６０分間、７０℃で１０分間インキュベーションす
ることにより第２段階のストランド合成を行った（これ
らの操作により、上記のｃＤＮＡ合成反応産物から一本
鎖ＤＮＡが分離され、この−木調ＤＮＡと、それと相補
的な一本鎖ＤＮＡとで所望の二本鎖ＤＮＡが合成される
）。
その後に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（２，ＯＵ）と添加
し、３７℃で１０分間インキュベーションすることによ
り、得られたＤＮＡ断片の両端を平滑化した。
し、３７℃で１０分間インキュベーションすることによ
り、得られたＤＮＡ断片の両端を平滑化した。
このＤＮＡ断片をフェノール及びクロロホルムにて抽出
し、Ｔ４リガーゼにより両端にＥｃｏＲＩリンカ−を付
加し、ＥｃｏＲＩにより消化処理した後に精製して所望
のＤＮＡ断片を得た。
し、Ｔ４リガーゼにより両端にＥｃｏＲＩリンカ−を付
加し、ＥｃｏＲＩにより消化処理した後に精製して所望
のＤＮＡ断片を得た。
この二本Ｍ ＤＮＡ断片は常法により処理することによ
り一本鎖のものに分離させ、ることができる。
り一本鎖のものに分離させ、ることができる。
Ｌ１鮭（ＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列）調製例１
で得たＤＮＡ断片の塩基配列を自体公知の手法（Ｍａｘ
ａｍ−Ｇｉ Ｉｂｅｒｔ法等）を用いて調べた結果は第
１図に示される通りであり、鎖長は８３７ ｂｐ （塩
基対）であった、第１図に示されている配列において、
第４行目はｍＲＮＡを鋳型として作成された一本鎖ＤＮ
Ａの塩基配列であり、第５行目はチミン（Ｔ）【ウラシ
ル（Ｕ）とも称されている１から始まる上記ＤＮＡ配列
における塩基の番号であり、第６行目は上記−本領ＤＮ
Ａと相補的な一本ｉ ＤＮＡの塩基配列であり、第１−
３行目及び第７−９行目は第４行目及び第６行目の塩基
配列からそれぞれ想定されるアミノ酸配列を示しており
、これらの想定アミノ酸配列中の符号’＃ｔｔ＃」は塩
基配列から「終止コドン（Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃ
ｏｄｏｎ）」と想定され得る部位を示している。
で得たＤＮＡ断片の塩基配列を自体公知の手法（Ｍａｘ
ａｍ−Ｇｉ Ｉｂｅｒｔ法等）を用いて調べた結果は第
１図に示される通りであり、鎖長は８３７ ｂｐ （塩
基対）であった、第１図に示されている配列において、
第４行目はｍＲＮＡを鋳型として作成された一本鎖ＤＮ
Ａの塩基配列であり、第５行目はチミン（Ｔ）【ウラシ
ル（Ｕ）とも称されている１から始まる上記ＤＮＡ配列
における塩基の番号であり、第６行目は上記−本領ＤＮ
Ａと相補的な一本ｉ ＤＮＡの塩基配列であり、第１−
３行目及び第７−９行目は第４行目及び第６行目の塩基
配列からそれぞれ想定されるアミノ酸配列を示しており
、これらの想定アミノ酸配列中の符号’＃ｔｔ＃」は塩
基配列から「終止コドン（Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃ
ｏｄｏｎ）」と想定され得る部位を示している。
乱ｌ肚ユ
（Ａ）ベクターへのＤＮＡの組込み
ベクターとしてファージベクターであるλｇｔｌＯを採
択し、これをＥｃｏＲＩにて切断した。
択し、これをＥｃｏＲＩにて切断した。
調製例１にて得られ且つＥｃｏＲＩ認識部位（ｓｉｔｅ
）を両端に有するＤＮＡ断片と上記のようにして得たλ
ｇｔｌｏアームとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより接合し、
ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング法によリスクリーニン
グして上記のＤＮＡインサートを有するクローンを単離
することによりファージベ（Ｂ）クローンの選択 調製例２で得たクローンをプローブとして宿主ＤＮＡと
ホモロジーを有しないクローンをサザン・ハイブリダイ
ゼーションにより選択しな。
）を両端に有するＤＮＡ断片と上記のようにして得たλ
ｇｔｌｏアームとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより接合し、
ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング法によリスクリーニン
グして上記のＤＮＡインサートを有するクローンを単離
することによりファージベ（Ｂ）クローンの選択 調製例２で得たクローンをプローブとして宿主ＤＮＡと
ホモロジーを有しないクローンをサザン・ハイブリダイ
ゼーションにより選択しな。
宿主ＤＮＡとハイブリダイズ（交叉）しないクローンは
ＮＡＮＢウィルスの遺伝子ＤＮＡを有しているものと推
定され、このクローンが本発明によるクローン化ＮＡＮ
ＢウィルスＤＮＡである。
ＮＡＮＢウィルスの遺伝子ＤＮＡを有しているものと推
定され、このクローンが本発明によるクローン化ＮＡＮ
ＢウィルスＤＮＡである。
（発明の効果）
本発明によれば非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子のアミノ
酸配列の少くとも一部をコードする塩基配列を有する一
本鎖ＤＮＡ断片、該−本頒ＤＮＡとそのｃＤＮＡとから
なる二本鎖ＤＮＡ、これらＤＮＡ断片の調整法、上記二
本鎖ＤＮＡ断片の組込まれたベクターが提供される。
酸配列の少くとも一部をコードする塩基配列を有する一
本鎖ＤＮＡ断片、該−本頒ＤＮＡとそのｃＤＮＡとから
なる二本鎖ＤＮＡ、これらＤＮＡ断片の調整法、上記二
本鎖ＤＮＡ断片の組込まれたベクターが提供される。
従って、上記の一本ｉｉ ＤＮＡは、当然のことながら
、これをプローブとして用いることにより、遺伝子レベ
ルでの非Ａ非Ｂ型肝炎の診断に利用することができ、一
方上記の二本＠ ＤＮＡはその侭或は制限酵素により適
宜の鎖長を有するものとなして構造と生理活性との相関
究明等に利用することかできる。
、これをプローブとして用いることにより、遺伝子レベ
ルでの非Ａ非Ｂ型肝炎の診断に利用することができ、一
方上記の二本＠ ＤＮＡはその侭或は制限酵素により適
宜の鎖長を有するものとなして構造と生理活性との相関
究明等に利用することかできる。
尚、二本鎖ＤＮＡ断片の組込まれるべき上記のベクター
は、当然のことながら、発現ベクターであり、従って本
発明による遺伝子組換えベクターを大腸菌、酵母等の微
生物や動物細胞に取り込ませ、該微生物又は動物細胞を
培養すれば、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに基因する抗原性
物質を大量に産生させることができ、従って、この産物
を研究用として豊富に供給することが可能となる。
は、当然のことながら、発現ベクターであり、従って本
発明による遺伝子組換えベクターを大腸菌、酵母等の微
生物や動物細胞に取り込ませ、該微生物又は動物細胞を
培養すれば、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに基因する抗原性
物質を大量に産生させることができ、従って、この産物
を研究用として豊富に供給することが可能となる。
更に、この産物を継代免疫等の手法により弱毒化させる
ことによりワクチン開発の途が開かれ、上記の産物を動
物に免疫させることにより抗体性物質を産生させ、これ
を取得すれば治療薬や輸血血液の処理剤を提供すること
ができ、該抗体性物質をモノクローン又はポリクローン
化させれば治療薬等としての安定供給が可能となり、更
に上記の抗体性物質を用いて稀釈系列を作成すれば、非
Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに基因する肝炎や肝癌の進行程度
、回復の程度を診断することが可能となり、又キャリヤ
ーの診断も可能となる。
ことによりワクチン開発の途が開かれ、上記の産物を動
物に免疫させることにより抗体性物質を産生させ、これ
を取得すれば治療薬や輸血血液の処理剤を提供すること
ができ、該抗体性物質をモノクローン又はポリクローン
化させれば治療薬等としての安定供給が可能となり、更
に上記の抗体性物質を用いて稀釈系列を作成すれば、非
Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに基因する肝炎や肝癌の進行程度
、回復の程度を診断することが可能となり、又キャリヤ
ーの診断も可能となる。
第１図は本発明によるＤＮＡ断片に関して決定された塩
基配列と、この塩基配列から想定される種々のアミノ酸
配列とを示すものである。 手続補正書（方式） 平成１年１０月４日
基配列と、この塩基配列から想定される種々のアミノ酸
配列とを示すものである。 手続補正書（方式） 平成１年１０月４日
Claims (5)
- （１）非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子のアミノ酸配列の
一部をコードする塩基配列を有しており、約８５０個の
ヌクレオチドを含有する一本鎖ＤＮＡ又は該一本鎖ＤＮ
Ａと相補ＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡ。 - （２）式 ５’−−−ＴＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＧＡ
ＡＴＧＣＴＣＡＴＡＴ １０
２０ ３０ ＡＣＡＡＡＡＧＣＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧＡＡＧＴ
ＧＧＡＧＴ ４０ ５０
６０ ＴＡＡＣＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣＡＴ
ＴＡＣＡＡ ７０ ８０
９０ ＡＣＣＣＴＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＡＴＧＡＧＡ
ＡＡＧＴＡ １００ １１０
１２０ ＧＧＣＴＴＡＴＴＡＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＴＴＡＴＣＴ
ＣＧＣＣＴ １３０ １４０
１５０ ＴＴＴＡＴＣＴＡＣＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴ
ＡＡＣＴＴ １６０ １７０
１８０ ＡＴＡＡＡＣＡＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＡＡＧＣＧＣＴＧ
ＴＧＧＣＣ １９０ ２００
２１０ ＧＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＡＴＧＴＧＴＣＡＡＴＡＡＡＴ
ＧＡＡＴＴ ２２０ ２３０
２４０ ＴＡＡＴＣＣＡＴＡＧＡＡＴＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＴＴ
ＣＡＣＴＡ ２５０ ２６０
２７０ ＣＴＴＡＴＴＡＡＧＡＴＡＴＴＧＴＡＡＣＡＡＡＴＣＡ
ＣＧＧＡＡ ２８０ ２９０
３００ ＧＴＧＴＧＧＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＧＧＣＴＴＴＴ
ＡＡＴＴＡ ３１０ ３２０
３３０ ＡＡＣＡＣＴＡＡＡＣＡＣＡＡＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡＡ
ＡＡＴＧＧ ３４０ ３５０
３６０ ＣＡＣＧＧＧＣＴＴＴＡＴＧＣＣＣＴＧＣＴＡＣＡＡＧ
ＴＴＡＴＣ ３７０ ３８０
３９０ ＡＣＧＡＡＣＡＧＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＧＴＣＡＣＡ
ＣＡＣＣＴ ４００ ４１０
４２０ ＧＴＡＴＡＡＡＣＴＣＣＧＴＣＣＣＡＡＣＡＣＡＧＡＡ
ＣＡＡＣＧ ４４０ ４５０
４３０ ＡＣＡＴＧＣＡＡＴＴＡＧＡＡＣＡＧＴＡＡＧＧＡＡＣ
ＡＴＴＧＴ ４６０ ４７０
４８０ ＴＡＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＴＴＧＡＣＡＴＧＴＡＴＡＴ
ＡＴＧＴＣ ４９０ ５００
５１０ ＴＡＴＧＣＧＣＴＴＴＧＡＣＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＴ
ＣＴＡＴＧ ５２０ ５３０
５４０ ＣＧＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＴＴＡＴ
ＧＴＧＣＣ ５５０ ５６０
５７０ ＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＣＡＴＴＡＴＧＧＧＧＣＧＡＣＴ
ＡＴＧＣＣ ５８０ ５９０
６００ ＡＡＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣ
ＣＴＴＡＴ ６１０ ６２０
６３０ ＣＧＣＧＣＴＧＡＣＴＴＧＴＣＣＣＡＧＣＣＣＴＡＣＣ
ＣＣＡＧＣ ６４０ ６５０
６６０ ＡＣＣＴＡＡＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴ
ＴＣＴＧＣ ６７０ ６８０
６９０ ＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＡＡＧＧＴＧ
ＴＴＴＣＴ ７００ ７１０
７２０ ＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡ
ＧＴＴＴＧ ７３０ ７４０
７５０ ＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡ
ＧＴＧＴＣ ７６０ ７７０
７８０ ＣＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＣＡ
ＣＴＣＡＴ ７９０ ８００
８１０ ＧＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧ
ＡＡ−−３’ ８２０ ８３０ （式中、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニン、シトシ
ン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリボヌク
レオチドを意味する）にて示される塩基配列を有してい
ることを特徴とする、請求項（１）に記載の一本鎖ＤＮ
Ａ又は該一本鎖ＤＮＡと相補ＤＮＡとからなる二本鎖Ｄ
ＮＡ。 - （３）非Ａ非Ｂ型肝炎患者由来の血漿の粒子画分からＲ
ＮＡを抽出して精製し、この精製ＲＮＡを鋳型として作
成した二本鎖ＤＮＡ断片にＥｃｏＲＩリンカーを付加し
、次いでＥｃｏＲＩにより消化し、得られた日本鎖ＤＮ
Ａ断片を、必要に応じ、一本鎖ＤＮＡに分離させること
を特徴とする、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のアミノ
酸配列の一部をコードする塩基配列を有しており、約８
５０個のヌクレオチドを含有する一本鎖ＤＮＡ又は該一
本鎖ＤＮＡと相補ＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡの調整
法。 - （４）非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のアミノ酸配列の
一部をコードする塩基配列を有しており、約８５０個の
ヌクレオチドを含有する一本鎖ＤＮＡと相補ＤＮＡとか
らなる二本鎖ＤＮＡが組込まれていることを特徴とする
、発現用のクローン化ベクター。 - （５）非Ａ非Ｂ型肝炎患者由来の血漿の粒子画分からＲ
ＮＡを抽出して精製し、この精製ＲＮＡを鋳型として作
成した二本鎖断片にＥｃｏＲＩリンカーを付加し、次い
でＥｃｏＲＩにより消化し、得られた短鎖化二本鎖ｃＤ
ＮＡ断片とベクターの断片とを接合してベクターを再構
築し、次いでクローニングにより上記のＤＮＡインサー
トを有するクローンを単離し、該クローンをプローブと
して、宿主ＤＮＡとホモロジーを有しないクローンをサ
ザン・ハイブリダイゼーションにより選択することを特
徴とする、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子のアミノ酸配
列の一部をコードする塩基配列を有しており、約８５０
個のヌクレオチドを含有する一本鎖ＤＮＡを相補ＤＮＡ
とからなる二本鎖ＤＮＡが組込まれている発現用のクロ
ーン化ベクター。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1163715A JPH0330676A (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルスのｄｎａ、そのクローン及びこれらの調製法 |
| EP90100047A EP0406511A1 (en) | 1989-06-28 | 1990-01-02 | Cloning of non A non B hepatitis virus gene and expression thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1163715A JPH0330676A (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルスのｄｎａ、そのクローン及びこれらの調製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0330676A true JPH0330676A (ja) | 1991-02-08 |
Family
ID=15779266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1163715A Pending JPH0330676A (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルスのｄｎａ、そのクローン及びこれらの調製法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0406511A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0330676A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3156200B2 (ja) * | 1989-09-15 | 2001-04-16 | 国立予防衛生研究所長 | 新規のｈｃｖ分離株 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5032511A (en) * | 1987-03-31 | 1991-07-16 | Mitsubishi Kasei Corporation | DNA fragments coding for antigens specific to non-A non-B hepatitis, expression vectors containing said DNA fragments, transformants and process for producing said antigens |
| DE3886363T3 (de) * | 1987-11-18 | 2004-09-09 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | NANBV-Diagnostika |
-
1989
- 1989-06-28 JP JP1163715A patent/JPH0330676A/ja active Pending
-
1990
- 1990-01-02 EP EP90100047A patent/EP0406511A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0406511A1 (en) | 1991-01-09 |
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