JP2000512129A

JP2000512129A - ブタレトロウィルス

Info

Publication number: JP2000512129A
Application number: JP09537830A
Authority: JP
Inventors: ガルブレイス，ダニエル，ノーマン; ハワース，クリスチーヌ; リース，ジリアン，マーガレット; スミス，ケニス，トーマス
Original assignee: キュー―ワンバイオテックリミテッド; イムトランリミテッド
Priority date: 1996-04-19
Filing date: 1997-04-18
Publication date: 2000-09-19
Also published as: WO1997040167A1; AU2394697A; EP0907739A1; AU721579B2; US6756227B1; CA2251939A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ブタレトロウイルス（porcine retrovirus，PoEV）ポリヌクレオチド断片、特に、少なくとも一つのブタレトロウィルス発現体を符号化するもの、少なくとも一つのポリヌクレオチド断片を含む組換えベクター、生来的ブタレトロウィルスを検出するためにPoEVポリヌクレオチド断片を使用すること、少なくとも一つのPoEVポリヌクレオチド断片を含む宿主細胞、もしくは少なくとも一つのPoEVポリヌクレオチド断片を含む組換えベクター、PoEVポリペプチド、PoEVポリペプチドに対して免疫反応を示す抗体、予防剤および／または治療剤として使用する組換えPoEVポリペプチドを含む薬剤組成物、および、PoEVポリヌクレオチド断片および／またはPoEVポリペプチドを、獣医学を含む医学に、およびこれらの医学に用いる薬剤の調合に用いること、を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ブタレトロウィルス本発明は、なかんずくブタレトロウィルス断片に係り、特に、少なくとも一つのブタレトロウィルス発現体を符号化するブタレトロウィルス（porcine retrov inus，PoEV）断片、少なくとも一つのポリヌクレオチド断片を含む組換えベクター、生来的ブタレトロウィルスを検出するためにPoEVポリヌクレオチド断片を使用すること、少なくとも一つのPoEVポリヌクレオチド断片を含む宿主細胞、もしくは少なくとも一つのPoEVポリヌクレオチド断片を含む組換えベクター、PoEVポリペプチド、PoEVポリペプチドに対して免疫反応を示す抗体、予防剤および／または治療剤として使用する組換えPoEVポリペプチドを含む薬剤組成物、および、 PoEVポリヌクレオチド断片および／またはPoEVポリペプチドを、獣医学を含む医学に、およびこれらの医学に用いる薬剤の調合に用いること、に関する。ブタレトロウィルス（PoEV）は、ブタから隔離され、ブタの物質に誘導された細胞系に発現する、内生的な（遺伝的に得られる）ウィルスである。このウィルスは、ブタのリンパ種に関係しているらしく、これと同類のウィルスは、その他の種の白血病やリンパ種に関係しているが、ブタレトロウィルスそれ自体が、その生来的宿主に及ぼす病理遺伝学的影響については、明らかではない。ブタレトロウィルスは、ブタではない様々な起源から、細胞に感染するということが報告されており、このため、このウィルスは、異種反応型、両性反応型または多重反応型ウィルスと呼ばれている(Lieber MM,Sherr CJ．Benveniste RE,Todaro GJ.1 975年；Strandstrom H,Verjalainen P,Moening V,Hunsmann G,Schwarz H,Schafe r W．1974年；Todaro GJ,Benveniste RE,Lieber MM,She CJ.1974年)。上記のようなウィルスは、ヒトに感染する潜在力を有している可能性があり、病理遺伝学的にも影響を及ぼす可能性があるということが、観察されている。こうした観察が示唆するところは、ブタレトロウィルスの問題は、異種移植のブタ組織または細胞という文脈の中で、取り扱うべき問題だということである。したがって、 PoEVの特性についての情報、および、診断試剤、分子工学的手段、潜在的ワクチン物質の開発に関する情報は、たとえば異種移植テクノロジー等の分野において、多大な重要性を有しているのである。本発明の目的は、上記不都合の少なくともいくつかを未然に防ぎ、および／または軽減することである。本発明は、その態様の一つとして、以下のような隔離PoEVポリヌクレオチド断片を提供する。すなわち、（ａ）少なくとも一つのブタレトロウィルス（PoEV）発現体を符号化し、（ｂ）上記発現体の生理学的に活性な、および／または免役原的な誘導体を符号化し、または、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）に定義したポリヌクレオチド・シーケンスと相補的な、隔離ブタレトロウィルス（PoEV）を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチド断片は、PoEVのギャグ遺伝子(gag)、ポリメラーゼ遺伝子（pol）および／またはエンベローブ遺伝子（env）を符号化する。したがって、上記発現体は、PoEVのビリオンコアポリペプチド(GAG)、ポリメラーゼ（POL）ポリペプチドおよび／またはエンベローブ（ENV）ポリペプチドであり得る。さらに、本発明は、PoEVの組換えビリオンコアポリペプチド、組換えポリメラーゼポリペプチドおよび／または組換えエンベローブポリペプチドをも提供するのである。「ポリヌクレオチド断片」という語は、ここでは、デオキシリボース核酸（DN A）のようなヌクレオチドの鎖、およびその転写体（たとえば、RNA）を指す。もちろん、当業者であれば、自然に発生するPoEVゲノムのすべてが、ポリヌクレオチド断片の定義に含まれるわけではないことを理解するであろう。ポリヌクレオチド断片は、すべてのゲノムが通常生体内で結びついている生物学的物質から、実質的に解放されているという意味において、隔離することができる。隔離されたポリヌクレオチド断片は、ポリヌクレオチド断片を含む組換え分子を提供するために、クローン化される。このように、「ポリヌクレオチド断片」は、二重および一重によじれたDNA、RNA、およびこれらから誘導されるポリヌクレオチド・シーケンスを含み、たとえば、該断片のシーケンスはいかなる長さであっても、ここに含まれる。核酸が、一重のストランドの場合は、該ストランドおよびこれと相補的のシーケンスの両者が、本発明の範囲に含まれる。一般に、「発現体」という用語は、上記ポリヌクレオチド断片の転写体および翻体の双方を指す。発現体が「ポリペプチド」であるという場合(すなわち、生理学的および／または免疫学的活動を発揮するアミノ酸の鎖またはシーケンスが、PoEVのビリオンコアプロテイン、ポリメラーゼプロテインおよび／またはエンベローブプロテインと実質的に同様である場合)、このことは、該発現体が何か特定の長さを有しているということを意味するわけではない。したがって、当業者であれば、「ポリペプチド」は、PoEVのペプチド、ポリペプチドおよびプロテインを、なかんずく含むものであるということを理解するであろう。必要であれば、ポリペプチドは、生体内および試験管内において、たとえば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化および／またはアミノ酸合成後の細胞分裂により、加減・変更することができる。 PoEVゲノムを包含する部分を含み、逆転写ポジであるブタの腎臓細胞系PK-15 から放出されたレトロウィルス粒子から誘導されたポリヌクレオチド断片が、プラスミドのベクター内に分子的にクローン化された。このことは、PoEVのRNAゲノム（内生的ウィルスを発現するブタの腎臓から発見された）の相補的DNA（cDN A）を合成することにより、達成された。このcDNAを、プラスミドのベクターにクローン化し、隔離されたPoEVのDNA断片を決定した(図１、図２および図３参照 )。図１に示すシーケンスは、最初に決定されたシーケンスであり、その後、図２に示すシーケンスが決定され、最後の図３に示すシーケンスは、最も最近に修正されたシーケンスである。さらに、ヒトの細胞系「Raji」が、ブタの腎臓細胞（PK15）内に存在するPoEVに感染し得るか否かを確認するための研究が、行われた。こうして、Rajiのクローンが作られ、そのエンベローブ遺伝子領域のDNAシーケンスが決定された(図４参照)。図３のDNA断片は、それぞれ５２４個、１１９４個、６５６個のアミノ酸からなる３つのオープン・リーディング・フレーム（ORF）を符号化するために、示されたものである。このアミノ酸シーケンスを、他の種から以前にシーケンスされたレトロウィルスと比較したところ、新しいレトロウィルスのcDNAがすでにクローン化されているのが観察された。DNASTAR社のソフトウェア「Lasergene」を用いて行ったシーケンス分析では、大部分のレトロウィルスが、クローン化されたPoEVのDNAとの相同性を示し、最も近似した相同性を示したのは、ポリメラーゼ（pol）およびエンベローブ（env）領域におけるテナガザル白血病ウィルスのプロウィルスであった。図３における第一のORF（ヌクレオチド588-2162）は、PoEVのビリオンコアポリペプチド（ギャグ遺伝子）を符号化しているものと予測される。第二のORF（ヌクレオチド2163-5747）は、PoEVのポリメラーゼポリペプチド（ポリメラーゼ遺伝子）を符号化しているものと予測される。第三のORF（ヌクレオチド5620-75 90）は、PoEVのエンベローブポリペプチド（エンベローブ遺伝子）を符号化しているものと予測される。当業者であれば、ポリヌクレオチド断片またはその誘導体を、遺伝子的に操作することが可能であることを理解するであろう。この操作は、たとえば、この分野では広く知られている組換えDNAテクノロジーを用いて、遺伝子をクローン化し、そこに符号化されたポリペプチドを、試験管内および／または生体内に発現することにより行われる。図１、図２、図３および／または図４に示されたポリヌクレオチド・シーケンスを有するポリヌクレオチド断片、またはこれらのDNA／RNA誘導体は、診断上の手段として、またはドナー動物の核酸内からPoEV核酸を検出するための試剤として、あるいはワクチンとして、用いられることになろう。本発明をこうした側面から見た場合に、好ましい断片は、次のようなポリヌクレオチド断片である。すなわち、（ａ）図１、図２、図３および／または図４に示されたアミノ酸シーケンスを有する１〜３のポリペプチドの少なくとも一つを符号化し、（ｂ）上記（ａ）に定義されたポリペプチドの少なくとも一つにおいて、生理学的に活性な、および／または免役原的な誘導体であるポリペプチドを符号化し、または、（ｃ）上記に定義したポリヌクレオチド・シーケンスと相補的なポリヌクレオチド断片、または、（ａ）図１、図２、図３および／または図４に示されたORFの少なくとも一つ、またはこれに対応するRNAシーケンスを含み、（ｂ）上記（ａ）に記述したシーケンスと実質的に同一なヌクレオチド・シーケンスを有するシーケンスを含み、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）に記述したシーケンスと相補的なシーケンスを含むポリヌクレオチド断片が好ましい。なお、ここおける「実質的なシーケンスの同一性」という表現は、少なくとも５０％（好ましくは、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）のシーケンスの同一性を意味する。本発明のポリヌクレオチド断片は、ドナー動物、およびドナー動物から得た細胞、組織または器官の中に、PoEVウィルスの発現および／または存在があるかどうかを検査し、これらが異種移植に適しているかどうか（すなわち、PoEVを含んでいないということ）を確かめるために用いられるであろう。さらに、ブタの細胞、組織または器官の受容者側を直接調べることにより、また、検出細胞の培養または感染により、PoEVウィルスの存在および／または発現を検査することも可能である。本発明のポリヌクレオチド断片は、PoEVゲノム内における、PoEVに特有なポリヌクレオチド・シーケンスを識別するためにも(すなわち、完全なPoEVゲノムが識別される必要はない)、用いられるであろう。このようなPoEV特有のポリヌクレオチド・シーケンスは、たとえば、移植細胞、組織または器官のようなサンプル内に、PoEV核酸が存在するかどうかを確かめるために用いられるであろうし、 PoEV用の終局的な検査には、不可欠となろう。さらに、本発明は、特に、PoEVポリヌクレオチド・シーケンスと混成することが可能な、隔離PoEVポリヌクレオチド断片を提供する。このように、本発明は、生体外および／または原位置における、PoEVウィルスの検出研究、発現研究用プローブおよび／またはプライマーを提供する。典型的な検出研究は、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）研究、ハイブッリド形成研究またはシーケンス研究を含む。上記に示したPoEVシーケンスから得られる、PoEVに特有なポリヌクレオチド・シーケンスは、どれもみな原則として、検出研究および／または発現研究に用いることができる。ここで、「特に、PoEVポリヌクレオチド・シーケンスと混成することが可能な」とは、該ポリヌクレオチド断片は、他のウィルス、動物（特に、ブタやヒトのシーケンス）および／またはその他の種のポリヌクレオチド・シーケンスに優先して、好ましくPoEVポリヌクレオチド・シーケンスと混成するということを意味する。昇進において、このPoEV断片は、特に、生来的PoEVポリヌクレオチド・シーケンス、またはその部分と結合するのである。本発明は、特に、PoEVポリヌクレオチド・シーケンス、またはその部分と混成することが可能な、ポリヌクレオチド・シーケンスを含む。ただし、この場合、必ずしも該PoEVポリヌクレオチド・シーケンス、またはその部分と、完全な相補関係にある必要はない。たとえば、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％の相補性があればよい。もちろん、シーケンスが、正しく完璧に補填され(１００％の相補性)、あるいは完璧に近く補填される（たとえば、１０未満、好ましくは５未満の不一致）場合もあり得る。このように、本発明はまた、特に、開示されたDNAシーケンスと混成することが可能な、アンチセンス・ヌクレオチド・シーケンスまたは相補的ヌクレオチド・シーケンスを提供する。PoEV特有のポリヌクレオチドが、プライマーとして、ポリメラーゼ鎖反応研究および／またはシーケンス研究に用いられるならば、該ポリヌクレオチドは、PoEVの核酸と混成することができるあろうし、鎖の伸張をポリヌクレオチドの３’端から開始することも可能となるに違いない。ただし、PoEVではないシーケンス（特にヒトのシーケンス、またはPoEVではないブタのシーケンス）からは、正確には鎖の伸長を開始できないであろう。 PoEVに特有の試験ポリヌクレオチド・シーケンスをハイブッリド形成研究に用いて、サンプル内におけるPoEV核酸の存在を検査する場合は、厳重な条件の下で、試験ポリヌクレオチドとサンプル・ポリヌクレオチドとを混成し残すことが好ましい。必要であれば、試験ポリヌクレオチドまたはサンプル・ポリヌクレオチドのいずれか一方を、固定する。一般に、試験ポリヌクレオチドの長さは、少なくとも１０ベース、または少なくとも５０ベースである。このポリヌクレオチドは、この分野では知られた適切な技術を用いて、標識化される。試験ポリヌクレオチド・シーケンスは、少なくとも２００ベースの長さを有することが好ましく、数キロベースの長さを有していてもよい。変性させたサンプル・ポリヌクレオチドまたは試験ポリヌクレオチドのいずれか一方が、まず担体に結びつけられる。ハイブッリド形成は、５０℃〜７０℃の温度において、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む２倍の強さのSSC（２×NaCl １７．５ｇ／ｌおよびクエン酸ナトリウム（SC）８．８ｇ／ｌ）緩衝含塩液の中で行われる。その後、担体は、同じ温度において、ただし、SSCの濃度を薄めた緩衝液で洗浄される。要求される厳格性の程度により、すなわち、要求されるシーケンスの相似度により、この薄められた緩衝液は、典型的に、０．１％のSDSを含む１倍の強さのSSCであり、０．１％のSDSを含む０．５倍の強さのSSCであり、０．１％のSDS を含む０．１倍の強さのSSCである。最も高い度合いの相似性を示すシーケンスは、そのハイブッリド形成における洗浄が、薄い濃度の緩衝液の中で行われ、洗浄による影響を最も受けていないシーケンスである。サンプルおよび研究用のシーケンスの場合、高度の相似性が必要であるため、０．１％のSDSを含む０．１倍の強さのクエン酸ナトリウムの中で洗浄し、または低温放置を行い、両者のハイブッリド形成が、これらによる影響を実質的に受けないようにすることが、最も好ましい。特に、PoEV核酸と混成することを意図して、PoEVオリゴヌクレオチドを特定することもできる。これらは、既知の技術により合成され、ポリメラーゼ鎖反応またはシーケンス反応におけるプライマーとて、あるいはサンプル内におけるPoEV 物質の存在を検出するプローブとして、用いられる。オリゴヌクレオチドは、たとえば、放射能標識、化学発光標識または蛍光発光標識等のような、この分野では既知の適切な標識を用いて標識化される。このように、本発明は、PoEVに特有なオリゴヌクレオチド・プローブおよびオリゴヌクレオチド・プライマーをも提供する。「オリゴヌクレオチド」という語は、シーケンスが何か特別な長さを有するということを意味するわけではなく、好ましくは少なくとも１０ベース（たとえば、１ベース〜１キロベース）の長さの、より好ましくは１２ベース〜５００ベースの長さの、最も好ましくは１５ベース〜１００ベースの長さのヌクレオチドを含む。 PoEVに特有のオリゴヌクレオチドは、図１に示すシーケンスから決定され、既知の技術によって操作される。これらは、そこに示されたストランドの一本またはこれに対応するRNA、あるいは該ストランドの部分と、実質的な同一性（たとえば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のシーケンスの同一性）を有する。こうした部分は、少なくとも１０ベース、少なくとも３０ベース、少なくとも５０ベースまたは少なくとも２００ベースの長さを有する。これは、ORF、またはその部分である。通常３０ベースよりも長いオリゴヌクレオチドは、上述した厳格な条件の一つ以上の下で、サンプル・ポリヌクレオチドと混成し残すことが好ましい。通常３０ベース未満の長さのオリゴヌクレオチドもまた、サンプル・ポリヌクレオチドと混成し残すことが好ましいが、この場合は、高度に厳格な異なった条件が必要となる。３０ベース未満のオリゴヌクレオチドの融解温度は、典型的に、次の公式により計算される；（おのおのおＡまたはＴに対して２℃＋おのおののＧまたはＣに対して４℃）−５℃。ハイブッリド形成は、どんなに特殊なオリゴヌクレオチドの場合でも、上記公式により計算された融解温度、またはこれに近い温度で、１％のSDSを含む６倍のSSCの中で行われる。その後、特に混成されないオリゴヌクレオチドは、厳格な洗浄によって取り除かれる。この洗浄は、たとえば、同じ温度において、０．１％のSDSを含む３倍のSSCの中で行われる。こうして、実質的に同様に一致したシーケンスだけが、すなわち、上述のオリゴヌクレオチドおよびこれに対応するPoEV核酸だけが、混成され残るのである。通常３０ベース未満の長さのオリゴヌクレオチドを、シーケンス研究および／またはポリメラーゼ鎖反応研究に用いる場合も、その融解温度は、上記と同様の方法で計算される。そして、オリゴヌクレオチドは、計算されたその融解温度に近い温度で、アニールされ、または混成される。ポリメラーゼ鎖反応研究の場合、アニール温度は、二つのプライマー・オリゴヌクレオチドについて計算された融解温度うちの低い方と、およそ同じ温度である。なお、ここに示した条件および融解温度は、単に一例として提示したものであり、これに限定する意図ではない。したがって、実験者の経験を通じて、ハイブッリド形成の条件を変更することは可能であり、上記の方法で計算された融解温度よりも高い温度で、オリゴヌクレオチドをアニール／混成することも可能である。実際、こうした変更が、いわゆる非特定ハイブッリド形成の発生を防ぐために、望ましい場合もある。ポリメラーゼ鎖反応研究において、二つ以上の適切なPoEVオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合に、得られるであろうポリメラーゼ鎖反応物のサイズは、予測可能である。この予測は、該オリゴヌクレオチドが、図１に示すシーケンスのどの位置で混成するかに基づいてなされる。こうしたポリメラーゼ鎖反応をPoEVのDNAで行った場合に、予測通りのサイズの断片が得られたならば、今度は、そのDNAはPoEVであるということが、予測される。また、本発明は、次のようなPoEV検出キットを提供する。すなわち、本発明は、PoEVに特有なオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ含み、また、上記に概説した試験形式用に必要とされる、あらゆる反応試剤、洗浄試剤、検出試剤、信号発生剤等を含むPoEV検出キットを提供する。また、本発明のもう一つ態様として、PoEV特有のポリヌクレオチドが、サンプル内のPoEVの検出に用いられる。本発明のさらに一つの態様として、PoEV特有のポリヌクレオチドが、ポリメラーセ鎖反応における、サンプル内のPoEVの検出に用いられる。当業者であれば、ポリヌクレオチド断片がどのように設計され、また、ポリメラーゼ鎖反応実験やサザン分析（すなわち、ハイブッリド形成研究）におけるプライマー／プローブとして、ブタの核酸内、またはブタから採取された細胞、組織または器官サンプル（たとえば、肝臓、腎臓、心臓のような潜在的移植器官）内に、PoEVポリヌクレオチドが存在するかどうか等を、調べるために、どのように用いられるかを理解するであろう。こうした細胞、組織または器官は、EP-A-0 493852に記載された手段により、または、この分野では既知のその他の手段により、作れ出された遺伝子移植動物から誘導され得る。したがって、これらの細胞、組織または器官は、ヒトの中に活動する同族補完制限因子の一つ以上と結びつき、補完活動を妨げ／減少させる可能性がある。さらに、本発明のポリヌクレオチド断片は、ブタの動物細胞ゲノムに位置する内生的PoEVの遺伝子構成を分析するためにも用いることができ、これにより、改変されたプロウィルスおよび／またはゲノム座（たとえば、発現しないプロウィルスの遺伝子座）を、ブタの群の中からスクリーニングすることが可能となる。このようなスクリーニング方法は、たとえば、発現したプロウィルスおよびゲノム座および／または伝染性のウィルス粒子を符号化しない遺伝子座を、生まれつき欠いている動物の群におけるスクリーニングを、容易にする。また、様々な試剤が、ヒトに感染可能な伝染性PoEVを発現しないブタを発育するための補助剤として、上述したポリヌクレオチド断片から開発されるであろう。こうしたブタであっても、なお、部分的に欠陥のあるゲノムを含む可能性があり、その結果、非伝染性粒子、ウィルス・プロテインまたはウィルス・メッセンジャーRNA（mRNA）の発現を招く可能性がある。これに代わる手段として、PoEV ポリヌクレオチド・シーケンスから誘導される構成を、生産的な伝染性PoEVをノックアウトする挿入型突然変異誘発体として作用させることも可能である。すなわち、上記のような突然変異誘発体を用いて、胚、胚の茎状細胞、または、生育する胚を形成可能な全潜在的核を有する細胞内の、生産的な伝染性PoEVをノックアウトするのである。こように、ギャグ遺伝子、ポリメラーゼ遺伝子および／またはエンベローブ遺伝子の「ノックアウト」が構成されれば、内生的なPoEVの発現を実質的に防止し、または減少させることを可能とする、ブタの発育プログラムの開発を促すことになろう。たとえば、試験管内で符号化シーケンスを削除し、これにより得られた構成を、組換え技術を用いて生来のPoEVシーケンスと置き換えることにより、PoEVのヌクレオチド・シーケンスを操作することが可能である。こうして、プロウィルスゲノムは、ブタの細胞内で不活性化される。ノックアウトを、胚および／または茎状細胞に導入することも可能であり、また、必要であれば、この分野では周知のマイクロ操作技術を用いて、処理済みの核を標的細胞から生殖細胞へと移し換えることもできる。本発明は、このような生殖細胞から誘導された動物にも及ぶ。こうして、ウィルス・プロテインの発現を抑制することが可能なアンチセンス構成および／またはリボザイム構成を含むよう、遺伝子移植されたブタが生み出されるであろうし、あるいは、PoEVプロテイン、またはプロテインの合成を妨げるその他のプロテイン、もしくはウィルスの集合に対して、有効に作用する免疫グロブリン分子の一本鎖を発現するよう、遺伝子移植されたブタも生み出されるであろう。同じような移植遺伝子、たとえば、PoEVの発現に否定的に作用する調節因子の移転優性遺伝質を符号化する移植遺伝子、または、競争的で欠陥のある「ゲノムＲＮＡ」を符号化する移植遺伝子も、伝染性ビリオンの発生を減少させ、または排除するために用いられるであろう。アンチセンス核酸（たとえば、アンチセンスmRNA）、リボザイム、またはその他の反ウィルス試剤を生成することにより、ブタの中の生来的PoEV遺伝子座の発現を抑える試剤の生成が研究されるであろう。ポリヌクレオチド断片は、標準的技術を用いて、原核細胞または真核細胞の発現ベクター内に分子的にクローン化され、宿主に施される。発現ベクターは、細胞および興味を示したポリヌクレオチド断片に受け取られ、プロテインを作り出す。細胞表面のプロテインの存在は、宿主の免疫システムを刺激し、防衛機構の一部として、該プロテインに対して免疫反応を示す抗体を作り出す。このように、発現したプロテインは、ワクチンとして使用できる。不活性化ワクチンは、PoEV細胞、またはPoEVを放出する細胞から作り出すことができる。こうしたPoEVに感染した細胞は、自然感染、またはPoEVプロウィルス・クローンのトランスフェクションによって生成される。プロウィルス・クローンは、少なくとも一つのPoEV抗原プロペプチド上に符号化する分子クローンであることが、理解されよう。ウィルスおよび／または感染細胞を採取した後、これらのウィルスまたは感染細胞を、たとえばホルムアルデヒト、グルテルアルデヒト、アセチレチレミン、またはその他の適切な薬剤もしくは工程で不活性化し、この分野で一般に使用されている方法（CVMP Working Party on Immunologi cal Veterinary Medicinal Products 1993年；獣医学用不活性哺乳類バクテリア／ウィルス・ワクチンの製造および管理に関する一般的要求）を用いて、不活性ワクチンを生成する。また、ギャグ遺伝子、ポリメラーゼ遺伝子およびエンベローブ遺伝子によって符号化された個々のプロテインから、サブユニット・ワクチンが準備される。典型的にワクチンは、エンベローブ遺伝子の生成物を、単独で含むか、あるいはギャグ遺伝子との組み合わせで含んでいる。なお、このギャグ遺伝子は、バクテリア、コウボまたは哺乳類の細胞系における発現により生成されたものである。ワクチン接種を用いる技術に適した、単サイクル、または反復型の欠陥ウィルスベクターを発達させるよう、プロウィルス・クローンを工作することもできる。この分野では知られたこうしたウィルスベクター（たとえば、「ネズミ白血病レトロウィルス、アデノウィルスおよびヘルペスウィルス」AndersonWF．1992年、「遺伝子療法」サイエンス256，P808-813）は、複製のために不可欠な遺伝子を一つ以上削除されており、この欠落した遺伝子機能を、構成上もしくは条件上、さらに異なる構成により（すなわち、プロウィルスPoEVクローンと相補的細胞系の染色体DNAの中に組み込まれた構成により）発現している。このような細胞系から放出されたPoEVビリオンは、ワクチン被接種者の第二の標的細胞に感染する可能性はあるが、さらにそれ以上の感染性ウィルス粒子を作り出すことはない。たとえば、ポリメラーゼの逆転写酵素ドメインを符号化するポリヌクレオチド・シーケンスを、プロウィルスPoEVクローン、および相補的細胞系に組み込まれたポリメラーゼの逆転写酵素ドメインから削除することができる。本発明に包含されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、PoEVを有さない細胞、組織および／または器官は、治療、診断および／または治療方法に用いることができる。また、本発明に包含されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、PoEVを有さない細胞、組織および／または器官は、治療または診断用の薬剤を調合するためにも用いることができる。さらに、PoEVの組換えポリヌクレオチド断片をクローニングし、発現することにより、反PoEV抗体およびその断片（特に、単一クローン抗体の断片）の生成が容易となり、また、PoEVの組換えポリメラーゼおよび／またはエンベローブ・ポリペプチドの生物学的な活動状態を、試験管内および生体内で評価することが容易となる。こうした抗体は、生来的PoEVウィルスに対する診断上の検査に用いられることになろう。ここで取り上げられている特殊なPoEVポリペプチドには、自然発生的な変形が存在するということが理解されよう。こうした変形は、各々の個体間に、あるいはSuidae種族（すなわち、ブタ科）の一員同士の間に、存在し得るが、これらは、シーケンス全体におけるアミノ酸の違いにより、または、該シーケンスにおけるアミノ酸の削除、置換、挿入、転換、または追加より説明できる。このようなすべての誘導体、すなわち、活発なポリメラーゼおよび／またはエンベローブ・ポリペプチドの生理学的および／または免役遺伝学的活動を示すすべての誘導体は、本発明の範囲に含まれる。たとえば、本発明の目的のために、以下に示すグループ内のアミノ酸の間で、保守的な置換がなされ得る。（Ｉ）アラニン、セリン、トレオニン；（II）グルタミン酸とアスパラギン酸；（III）アルギニンとロイシン；（IV）アスパラギンとグルタミン；（Ｖ）イソロイシン、ロイシンとバリン；（VI）フェニルアラニン、チロシンとトリプトファンさらに、組換えDNAテクノロジーは、上記に概説した様々な誘導体を符号化する核酸シーケンスを、準備するためにも用いられる。この分野ではよく知られたことだが、遺伝子暗号の縮退により、コドンにおける塩基の置換が可能となり、その結果、一つの同じアミノ酸を符号化することが可能な異なるコドンが併在することとなる。たとえば、アミノ酸グルタミン酸に対応するコドンには、GATとGAAの二つがある。したがって、次のことが明らかである。すなわち、図１のアミノ酸シーケンスにより示されたポリペプチドまたはその断片の発現は、図１に示した核酸シーケンスとは異なる上記のような代替コドンの組み合わせを用いた二次的核酸シーケンスによっても、作り出すことができる。さらに、本発明の範囲には、以下の断片も含まれる。すなわち、図３に示すPo EVコアポリペプチド、ポリメラーゼポリペプチドおよび／またはエンベローブポリペプチドから誘導された断片(この断片は、PoEVウィルスのコアポリペプチド、ポリメラーゼ・ポリペプチドおよび／またはエンベローブポリペプチドの特性を、なおも発揮する)、または、ウィルスのコアポリペプチド、ポリメラーゼポリペプチドおよび／またはエンベローブポリペプチドの特性を符号化する核酸シーケンスから誘導された、あるいは、上記ウィルスのコアポリペプチド、ポリメラーゼ・ポリペプチドおよび／またはエンベローブ・ポリペプチドの特性を符号化する図１、図２、図３および／または図４に示した核酸シーケンスから誘導された断片も、本発明の範囲に入る。当然、当業者であれば、上記断片は、 GAG、POLおよび／またはENVポリペプチドの生理学的および／または免疫学的特性を、実質的に保持しているということを、本発明の範囲の中に、理解するであろう。本発明のPoEVポリヌクレオチド断片は、調節制御シーケンスと好ましく結びつく。こうした制御シーケンスは、プロモーター、オペレーター、インデューサー、エンハンサー、リボソーム結合サイト、ターミネーター等を含む。所与の宿主に適した制御シーケンスは、この分野における通常の知識により選択される。本発明のポリヌクレオチド断片は、様々な発現制御シーケンスと結紮され、最終的には、いわゆる組換え核酸分子となる。したがって、本発明は、発現可能な PoEV核酸分子を有する発現ベクターをも含む。組換えPoEV核酸分子は、その後、適切な宿主の形質変換に用いられる。こうした混成分子は、ベクター分子と呼ばれるが、これらは、たとえば、プラスミドや、バクテリオファージまたはウィルス内に存在する核酸シーケンスから、好ましく得ることができる。本発明の核酸シーケンスをクローン化するために用いられる特定ベクターは、この分野では既知である(たとえば、Rodriguez，R.L.，Denhadt,D.T.，Edit.，V ectors：分子クローニング・ベクターおよびその用法に関する査察、Butterwort hs，1988年)。本発明の組換え核酸分子を作り出するため用いられる方法は、当業者には既知であり、なかんずくSambrookその他（分子クローニング：実験マニュアル、Cold Spring Harbour Labortory，1989年）に示されている。また、本発明は、PoEVポリヌクレオチド断片を発現可能な形態で含んだ形質変形細胞に関する。ここにいう「形質変形」とは、異種構造のポリヌクレオチド断片を、宿主に導入することを指す。これには、この分野で知られるどような方法を用いてもよい。たとえば、直接取り込み、トランスフェクション転換、電子ポレーション（分子生物学における新しいプロトコル、1995年）が挙げられる。導入された異種構造のポリヌクレオチド断片は、自己複製により保持され、または択一的に、宿主のゲノムに一体化される。組換え核酸分子は、好ましく、指定された宿主とうまく和合できる適切な制御シーケンスを与えられる。この制御シーケンスは、挿入されたポリヌクレオチド断片の発現を制御する役割を果たすが、これには、たとえば、テトラサイクリン反応プロモーター、チミジン・キナーゼ・プロモーター、SV-40プロモーター等がある。組換え核酸分子の発現には、原核細胞系または真核細胞系の宿主が適している。組換え核酸分子の発現に適した宿主は、バクテリア、コウボ、昆虫細胞および哺乳類細胞から選択される。組換えPoEVウィルスの核ポリペプチド、ポリメラーゼ・ポリペプチドおよび／またはエンベローブ・ポリペプチドの生物学的半減期およびグリコシル化の度合いは、生体内に用いる場合に重要であるため、コウボや棒状ウィルス・システム（これらは、進行およびグリコシル化の度合いが大きい）が好まれる。コウボの変種であるPichia Pastorisは、組換えプロテインの発現に高いレベルの潜在能力を示している(Clareその他、1991年)。また、棒状ウィルス・システムは、第１型インターフェロンの生成に用いられ、成功をおさめている(Smithその他、19 83年)。以下に、本発明の態様を具体例として記述するが、これらは単なる例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。実施態様実施例１（ウイルス性RNAの調整）指数関数的に成長するブタの腎臓細胞から誘導された上澄み液５００ｍｌ（PK -15、アメリカ型培養コレクションCCL33）が、約１１，０００ｘｇの遠心力で１０分にわたって澄まされた。約１１０，０００ｘｇの遠心力で６０分にわたって澄まされた上澄み液からウイルスがペレットにされた。上澄み液を捨てて、ウイルス性RNAのゲノムの調製のためにウイルスペレットが保持された。Dynabeads（商標）mRNA Directキットを使用して、製造業者のプロトコルに従い、ウイルスペレットからＲＮＡが調製された。５００μｌのTNE（１０ｍＭのTris HCl ｐＨ８．０、０．１Ｍ NaCl，１ｍＭ EDTA）にPoEVウイルスペレットを懸濁させて、２ｍｌの溶解(lysis)・結合（binding）緩衝液を追加して、ビリオンを崩壊させた。製造者の指示に従い、Dynabeads Oligo（dT）₂₅が調整されて、ウイルス崩壊の溶液に添加された。ウイルス性RNAが、１０分間Dynabeadを結合（binding）できるようにしてから、上澄み液が取り除かれ、結合されたRNAがLids（０．５ｍｌ）の洗浄液で３回洗浄され、緩衝液のみで２回洗浄された。該RNAが、２５μｌの溶離液で最終的に懸濁された。すべての操作が大気温度で行われた。RNaseの汚染は、手袋の着用、殺菌技術の観察、溶液、非使い捨てガラスおよびプラスチック容器のヂエチルピロカーーボネイト（DEPC）による処理で防止した。DEPC処理の殺菌水にＲＮＡが懸濁された。実施例２（cDNAの合成） cDNAは、製造者の指示に従い、Great Lengths（商標）cDNA増幅逆転写酵素試薬を使用して、純粋なゲノムRNAから合成した。RNAは、合成を極限化するために、オリゴ（dT）およびランダムhexamerでプライマー処理した。 Great Lengths（商標）cDNA合成プロトコルは、相補的DNAライブラリを作るための修正Gubler Hoffman（1983）に基づき、基本的には、第１ストランド合成、第２ストランド合成、アダプタ結紮、および細分化からなる。第１ストランド合成：ロックードック（lock-docking）プライマーのアニールを、プライマーの３’ 端のＡ、Ｃ、または残基の存在によりRNAのポリ−Ａ終端の開始までさせる。これにより、ポリ−Ａの長いストレッチの不必要な逆転写酵素を除いて、cDNA合成の効率が上がる。さらに、使用された逆転写酵素は、wild形のMMLVやAMVの逆転写酵素よりも安定して産出量の多いMMLV（RNase H）である。第２ストランド合成： RNase Ｈに対するDNAポリメラーゼＩの比率が最適化されることにより、第２ストランド合成の効率が増大し、ヘアピンループの形成によるプライム処理が最小にされた。第２ストランド合成の後に、ds cDNAがT4DNAポリメラーゼで処理されて、ブラント（blunt）端が形成される。アダプタ結紮（ligation）: cDNAは、前に存在したEcoRIの「粘性端」を有するように特殊に設計されたアダプタに結紮される。このアダプタの使用は、リンカ（linker）の代わりに、メチレートやEcoRIの必要性を排除し、cDNAを消化し、内部のEcoRI場を損じないで残す。アダプタは、ブラント（blunt）端を５’リン酸化し、ブラント（blunt）端を有するcDNAに有効な結紮を作る。細分化： ds cDNAは、EcoRIの場でリン酸化しており、細分化により、結紮されていないアダプタや組み込まれないヌクレオチドが除かれる。得られたcDNAは、適当なEc oRI消化のベクターにクローニングのため使用できる。実施例３（cDNAの分子クローニング）細分化された断片が、EcoR Ｉ−消化pZEro（商標）−１プラスミドベクターDN A（Invitrogen Corporation,米国サンジェゴ）で結紮された・結紮混合物が適当なTOP10F細胞を変成するために使用され、これらが、製造者の指示に従い (Zero Background（商標）クローニングキット−Invitrogen)、L-Agar含有ゼオシン（zeocin）の上に置かれた。得られたゼオシン抵抗コロニーの数個がL-Brot h含有ゼオシンの中で増幅され、プラスミドDNAがアルカライン・リシス（Maniat is等、1982年）で純化された。プラスミドDNAは、エンドヌクレアーゼEcoRIで、消化完成され、得られたDNA 断片は、１．０％アガローゼ・ゲル（Maniatis等、1982年）で電気泳動で分離され、所定のサイズの断片がクローニングされたことを検査した。pPoEVと識別されたクローンは、そのあとの実験に使われた。実施例４ pPoEVプラスミドDNAは、一般の技術（Sambrook等、1989年）で純化し、ABI自動シーケンサでシーケンス処理した。分子クローンの両ストランドからの重なるシーケンスプライマーが、ヌクレオチド・シーケンスの決定に使われた。図１に、得られた第１のシーケンスを示す。このシーケンスは、924（ヌクレオチド23-2793）および218（ヌクレオチド2642-3297）アミノ酸の２個のORF、それぞれpol、env遺伝子を符号化するものと、認められた。このシーケンスは、図２に示すように修正されて、第２シーケンスにアップデイトされている。この第２シーケンスは、516(ヌクレオチド576-2126)、1186（ヌクレオチド2143-5733）および656（ヌクレオチド5606-7576）アミノ酸の３個のORF、それぞれPoEV gag 、pol、env遺伝子を符号化するものと、認められた。この第２シーケンスは、図３に示すように修正されて、アップデイトされている。この第３シーケンスは、 524(ヌクレオチド588-2162)、1194（ヌクレオチド2163-5747）および656（ヌクレオチド5620-7590）アミノ酸の３個のORF、それぞれPoEV gag、pol、env遺伝子を符号化するものと、認められた。開示されたシーケンスの相違は、得られたシーケンスの実施と分析の改良で反映される。しかし、第１のシーケンスの21-2681位置と第３のシーケンスの2972- 5653位置との間の核酸レベルで１００％識別ができる。全体に、第１のシーケンスの3310 bp全体の位置と第３のシーケンスの対応の位置との間で７０．５％識別ができる。第２のシーケンスと第３のシーケンスの間には、ベースの変更は次のように３つのみである。ベース番号（図２から）変更 2121 「Ｇ」の挿入 2157 「Ｇ」の挿入 5902 「Ｒ」から「Ａ」に 7750 「Ｍ」から「Ａ」にベース番号5902と7700の変更は、対応のアミノ酸シーケンスに影響しない。しかし、ベース番号2121と2157の変更は、対応のアミノ酸シーケンスに、GAGの終端とPOLの開始で影響する。GAGに対し、最終のアミノ酸「Ｓ」は「VLALEEDKD」で置換されている。全体の製品寸法は、524のアミノ酸になっている。POLに対しては、最初の５つのアミノ酸「PLJET」が除去れ、「GRR」に置換されている。全体の製品寸法は、1194のアミノ酸になっている。 DNASTAR Inc.のLasergeneソフトウエア（DNASTAR）のアルゴリズムを使用して決定された大部分のレトロウイルス（retrovimses）とpPoEVとの類似性が観察された。類似性は、gibbon ape leukaemiaウイルス（GaLV）に、プローウイルス（ pro-virus）のポィメラーゼ（pol）領域で、６８．５％、ウイルスコア（gag）領域で、５９．２％、そしてエンベロープ（env）領域で、３９．３％と、非常に近かった。ヌクレオチド・シーケンスと、pPoEVインサートの主なORFを図３に示す。最大のORF（ヌクレオチド2163-5747）がポリメラーゼ・ポリペプチドを符号化し、最小のORF（ヌクレオチド588-2162、5620-7590）がコアとエンベロープのポリペプチドを符号化する。実施例５（培養された細胞、組織、血液からの細胞質ＤＮＡの純化）培養された細胞細胞は培養地に保持され、約５×１０⁷の細胞がDNA調製のために収穫された。細胞は、遠心力でペレットにして、リン酸塩緩衝液の食塩液に再懸濁され、１０００ｇで２分遠心力処理し、上澄み液が捨てられた。ブタの組織ブタの組織のサンプルが液体窒素の中で凍結され、モルタル中で、また金属フォイルの間で磨砕され、粉末化された。このサンプルが、０．０２５Ｍ EDTA(ｐＨ８．０)、０．０１Ｍ Tris.Cl ｐＨ８．０、０．５％SDS ２０μｇ／ｍｌ R NAseおよび１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（proteinase K，Maniatis等、19 82年）からなる抽出緩衝液５ｍｌ内に懸濁された。ブタの血液バッフィコート（buffy coat）が血液サンプルから用意された。２０ｍｌのサンプルが１０００ｇで１５分間遠心力処理された。バッフィコートは、緩衝液に懸濁され、サンプルが１０００ｇで１５分遠心力処理された。このプロセスがもう一度繰り返された。このサンプルが、抽出緩衝液（Maniatis等、1982年）５ｍｌ（３倍体積）と混合された。純化サンプル（すなわち、培養された細胞、ブタの組織、ブタの血液細胞）が、２０μｇ／ｍｌのRNAseと１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫとを含むプロテイナーゼＫ抽出緩衝液に入れられ、３７℃で約２４時間消化された。脱タンパク質化（deproteinised）されたDNAが、フェノールで２度、フェノールクロロフォルムで２度抽出処理され、最終的にアンモニュームアセテートの存在で、エタノールで沈殿処理された。このDNAが、３０００ｇで３０分の遠心力処理で回収され、上澄み液が捨てられた(Maniatis等、1982年)。ペレットは、７０％エタノールで洗浄され、約１時間空気乾燥された。このDNAが、TrisEDTA（TE）緩衝液に溶解され、spectrophotometry（Maniatis等、1982年）で純度と濃度が評価された。実施例６（ブタの組織と血液のサザーンブロット（Southern blot）分析） PoEVからのインサートを有する分予状でクローニングされたDNAが、PK-15細胞線（アメリカ型培養コレクションCCL33）から誘導されたことを示すために、DNAが細胞状のDNAに対してハイブリッド形成され、そのプロウイルスDNA検出能力が検査された。 pPoEVから純化されたDNAが、放射線で標識化され、PK-15細胞から誘導されたエンドヌクレアーゼ消化のDNAのサザーンブロットをプローブするのに使用された。プローブされたDNAは次の通りである。ａ）EcoRIによる消化で線形にされたpPoEV DNAのコピー番号の制御。 haploid細胞ゲノム当たりの１コピーは６．８４ｐｇであると推定された。制御は、１コピー、５コピー、１０コピーのコピー数にておこなわれた。ｂ）PK-15 DNA。ｃ）ヒトの乳頭腫ウイルス型18DNAを宿すヒトの腺癌細胞から誘導された負制御HeLa（アメリカ型培養コレクション集積CCL2）DNA。ｄ）異種反応型MuLVレトロウイルスを宿すネズミの骨髄腫細胞から誘導された負制御SP20（動物細胞培養のヨーロッパコレクション85072401）DNA。 PK-15のブタのDNAのみから、ハイブリッド形成が観察された。負のヒトのおよびネズミのDNAからは、信号が検出されなかった。PK-15DNAは細胞当たり１０より多くのコピーを含有し、推定のコピー数は２０であった。３つの主なEcoRI− エンドヌクレアーゼ消化のDNA断片の寸法は、約３．８ｋｂ、１．８ｋｂ、０．６ｋｂであった。組み替えpPoEVに検出された主な断片の大きさが比較しうる。推定されたように、多数の断片がPK-15のゲノムDNAとpPoEVDNAに共通にある。またXhol、BamHI、およびHindIIIで消化したDNAに観察されたパターンが一致していた。しかし、多数のエンドヌクレアーゼに寄るpPoEV DNAの消化で得られた断片もあった。 pPoEVシーケンスも、ブタの精巣（アメリカ型培養コレクションCRL1746）および主なブタの腎臓細胞（Central Veterinary Laboratoryバッチco4495）に検出されたが、ハムスタCHOKI（アメリカ型培養コレクションCCL61）またはネズミの NSO骨髄腫（myeloma）細胞（動物細胞培養のヨーロッパコレクション 85110503）には検出されなかった。 pPoEVからのインサートを有する分子状のクローニングDNAが、PK-15に加えて、ブタの細胞や組織内のシーケンスを検出できることを示すために、pPoEVDNAが、ブタから誘導された組織から細胞DNAに対してハイブリッド形成されて、プロウイルスDNAを検出する能力が検査された(Maniatis等、1982年)。 pPoEVから純化されたDNAは、放射線で標識化され、ブタの肝臓、kidney、心臓、血液などの器官から誘導されたエンドヌクレアーゼ消化DNAのサザーンブロットをプローブするのにつかわれた。プローブされたDNAは次の通りである。ａ）EcoRIで消化されて線形化されたpPoEVのコピー数制御。ハップロイド細胞ゲノム当たり１コピーは６．３４ｐｇと推定された。推定コピー数５、１０、２０、５０に制御が存在した。ｂ）EcoRIで消化されたブタの組織から純化されたDNA。すべてのブタのDNAにハイブリッド形成信号が観察された。 DNAは、細胞当たり５コピー含有していた。各DNAに約８つの明瞭なバンドが存在した。エンドヌクレアーゼで消化された３つの主なDNA断片は約３．８ｋｂ、１．８ｋｂ、０．６ｋｂであった。実施例７（ポリメラーゼ鎖反応（PCR）の増幅）オリゴヌクレオチドはPoEVゲノムから選択された。上向プライマーは、5'-GGA AGT GGA CTT CAC TGAG-3'であった。下向プライマーは、5'-CTT TCC ACC CCG AAT CGG-3'であった。ポリメラーゼ鎖反応は、Saikiその他（1987年）の記載に基づいて行われた。１００ｎｇ／μｌのテンプレートDNA１μｌの１つが、２００μＭのdATP、DCTP 、dGTP、ｄTTP、３０ｐｍｏｌの上記一対の両プライマー、１ユニットの DNAポリメラーゼ、および５μｌの反応緩衝液を含む反応混合物に加えられた。反応緩衝液は、２００ｍＭのTris-HCl ｐＨ８．４、５００ｍＭの塩化カリウム、１５ｍＭの塩化マグネシウム、超純化水を含んだ。この溶液は、蒸発を防ぐため、２滴の鉱物油で表面を覆われた。Perkin Elmer Cetusの熱サイクラーを用いて、３５サイクルの増幅を行った。それぞれのサイクルは、次のように構成された。すなわち、９５℃で一分間DNAを変性させ、５３℃で一分間アニールしてプライマーをテンプレートにし、７２℃で一分間プライマーを伸張させた。最終サイクル終了後、さらに、７２℃における１０分間の低温放置が実行され、部分的完成物の伸張を可能とした。増幅完了後、１０μｌの反応混合物を、５％のアクリミドゲルを用いて電気泳動させた。DNAはエチジウムブロマイドで染色し、紫外線（３２０ｎｍ）に晒すことにより、視覚化された。このポリメラーゼ鎖反応（PCR）は、予想通り、pPoEVおよびブタ細胞からおよそ７８７ｂｐのシーケンスを増幅し、検出された分析物は、PoEVプロウィルスDN Aであることを示した。ブタではない起源の細胞には、何らシーケンスの増幅は観察されず、したがって、このポリメラーゼ鎖反応および組換えクローンは、Po EV検出用の効果的かつ高感度な診断手段として利用可能であることが判明した。二つのさらなるジゴヌクレオチドが、それぞれ、ポリメラーゼ（pol）遺伝子の３’端、およびギャグ（gag）遺伝子のｓ’端に対して設計された。３’ポリメラーゼ・オリゴヌクレオチドは、5'-GAT GGT TCT CCT GCC CTT TG- 3であった。５’ギャグ・オリゴヌクレオチドは、5'-CGA TGG AGG CGAAGC TTA AGG-3'であった。上記オリゴヌクレオチドも、上述した条件に従い、ポリメラーゼ鎖反応に用いられた。ただしこの場合、アニール温度は５８℃とされ、３０サイクルの反復が行われた。このポリメラーゼ鎖反応は、およそ４６８ｂｐのシーケンスを、pPoE Vおよびブタ細胞から増幅した。実施例８（大腸菌内におけるPoEVポリヌクレオチドの生成）ポリメラーゼ・ペプチドを符号化するオープン・リーディング・フレーム（OR F）を、PoEVクローンから隔離し、プラスミドpGEX-4T-1（Pharmacia社）の中にクローン化して発現させた。大腸菌の遺伝子を様々な発現構成で形質変化させ、その培養菌２ｍｌを３７℃ におけるシェーキングで、後期ログ段階（０．６のO.D．600rull）に成長させ、 IPTGを０．１ｍＭまで加えて誘導した。誘導された培養菌は、さらに２時間定温放置され、その後、遠心分離によりバクテリアが収集された。バクテリアのペレットは、SDS-PAGEのサンプル緩衝液の中で沸騰させることにより、溶解され、誘導されたバクテリアのプロテイン分析が、１２％のアクリミドゲル上で行われ、 (Laemmli、1970年)、その後バクテリアは、coomassieの光る青い染料で染色された。実施例９（Rajiクローンの隔離および部分的シーケンス）この研究の目的は、ヒトの細胞系「Raji」が、ブタの腎臓細胞（PK15）内に存在するPoEVの感染を、受けるか否かを確認することであった。ウィルスの異種反応能力を検査するため、２０回にわたって、PK15細胞を、Ｂリンパ胚細胞系（Ra ji）と共に培養した。培養システムとしては直接培養とトランスウェル（transwell）を用いた。このシステムでは、ヒトの細胞とブタの細胞は分離されてはいるが、ウィルスは両者を隔てている薄膜を通過することができる。５回の培養ごとに、ヒトの細胞系からの上澄み液にレトロウィルスが存在するかどうが、逆転写酵素分析物により検査された。細胞培養物ブタの腎臓（PK15）細胞（ATTCC CCL 33）が、PoEVの起源として用いられた。 PK15細胞との共培養に用いられたヒト細胞は、リンパ胚に似たBurkitts リンパR aji（ATCC CCL 86）細胞系であった。この細胞系は、本発明者たちが検査したところでは、内生的レトロウィルスを潜伏させておらず、逆転写酵素の活動を欠くものであった。共培養 Raji細胞は、２本の８０ｃｍ²のフラスコ内で、PK15細胞と直接的に共培養され、２０回の培養期間を通じて、PK15細胞に晒された。細胞は、一週間に２回づつ経過観測され、PK15細胞が、必要に応じて、ストック培養物から補充された。５回の経過観測ごとに、Raji細胞のサンプルを共培養物から取り出し、洗浄し、３〜４日間培養した。その後、上澄み液を採集し、逆転写酵素分析物により、レトロウィルスが存在するかどうかが検査された。結果検出細胞培養物から採取された上澄み液に、Ｍｎ²⁺陽イオンを好む逆転写酵素活動が存在すれば、このことは、ブタレトロウィルスによる感染を示唆していることになる。５回目の経過観察では、二重培養の試験培養物中に、Ｍｎ²⁺のテンプレートを好む逆転写酵素活動を、検出できなかったが、１０回、１５回および２０回目の経過観察では、検出した。逆転写酵素に兆候的な活動は、負制御の培養物には検出されなかった。正制御の培養物からは、５回目と２０回目の経過観察において、Ｍｎ²⁺のテンプレートを好む逆転写酵素活動が検出された。感染したraji培養物を、単細胞へと希釈化し、細胞を抜粋して別々に培養した。こうして、単一の細胞に起源を発する、それぞれの培養物を得て、これらを逆転写酵素分析物により検査した。ゲノムDNAが、実施例５に示した純化により、逆転写酵素陽性クローンから作られた。PoEVのエンベローブ領域が、下記に示すポリメラーゼ鎖反応（PCR）により増幅され、その生成物をpMOS blue T-vector（Amersham）に分子的にクローン化した。この分子クローンは、その後、シーケンス処理された(図４)。ポリメラーゼ鎖反応（PCR）オリゴヌクレオチドは、PoEVゲノムから選択された。上向プライマーは、5'-GAT GGC TCT CCT GCC CTTTG-3'であった。５’基の位置：5240 下向プライマーは、5'-CCA CAG TCG TAC ACC ACG-3'であった。５’基の位置：8144 予測される生成物のサイズ：２９０４ｂｐおよそ１μｇのゲノムrajiクローンDNAが、２００μＭのdATP、dCTP、dGTP、d TTP、上記一対のそれぞれのプライマーを３０ｐＭ、１μTaqのDNAポリメラーゼ、および５μｌの反応緩衝液を含む５０μｌの反応混合物に加えられた。反応緩衝液は、２００ｍＭのTris.Cl ｐＨ８．４、５００ｍＭの塩化カリウム、１５ｍＭの塩化マグネシウム、超純化水を含んだ。この溶液は、蒸発を防ぐため、２滴の鉱物油で表面を覆われた。３０サイクルの増幅が行われ、その後、伸長反応を７２℃で１時間延長した。サイクルは、以下のように構成された。９５℃ １分５６℃ １分７２℃ １分ポリメラーゼ鎖反応（PCR）生成物は、例７に記述した方法で視覚化された。予想される生成物のサイズ：−３Ｋｂクローニングポリメラーゼ鎖反応（PCR）生成物は、pMOS-Blue T-vector内に、製造者の指示にしたがって（pMOS-Blue T-vectorキット−Amersham）分子的にクローン化された。形質変形された２０のコロニー（クローン）が、取り出され、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌｓのＬ−ブロスに加えられた。この培養物を、３７℃で、一晩シェーキングして、成長させた。パーフェクト・プレップ・プラスミド隔離キットを用いて、製造者の指示に従い(5P rime-3 Prime Inc．Boulde r，CO,USA)、プラスミドDNAを、それぞれのクローンから隔離した。プラスミドDNAは、エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIIIで消化完成され、エチジウムでブロマイド染色した１％のアガローセゲル上に視覚化された。PoEV 細胞から誘導されたPK-15細胞系に予測される結合パターンと、同様の結合パターンを示すクローン（raji envクローン）がシーケンシング用に選ばれた。シーケンシング上記のように準備されたRajiエンベローブ遺伝子クローンのプラスミドDNAが、ABIの自動シーケンサー、および商業的に入手可能なＴ７シーケンシングプライマーを用いて、シーケンス処理された。「Raji」のエンベローブ遺伝子領域全体が、シーケンス処理されたが(図４参照)、核酸およびアミノ酸の両レベルにおいて、PK-15からのPoEVシーケンスと実質的な同一性（それぞれ９８．９％、９６．３％）を有していることが発見された。実施例１０系統発生学的分析系統発生学的分析が、PHYLIPパッケージを用いて行われた。シーケンスの隔たりが、PROTDISTプログラム（Dayhoff matrix）を用いて計算され、NIEGHBOURプログラムを用いて、近隣結合型の非ルーツ式系図を再現した。Bootstrappingが、SEQBOOTプログラムを用いて作成したポリメラーゼ遺伝子列２００コピーを用いて行われ、CONSENSEプログラムを用いて、同系の系統図（図５参照）を得た。 Bootstrapのパーセンテージが、分岐点に、１００％には満たない数値で示されている。このデータは、PoEVは、テナガザル、ネズミ、ネコの白血病ウィルスに代表されるＣ型腫瘍ウィルスと、密接な関係を有してはいるが、これとは区別されるということを示している。また、系統発生学的系図が、最大限可能性アルゴリスム（maximum likliehoo d algorithm；Dayhoff matrix）を用いて、ポリメラーゼ遺伝子列から、作成された。この系図は、上記ポリメラーゼ遺伝子の近隣結合型（NJ）系図と、他の哺乳類Ｃ型ウィルスとの関係におけるBaEV系の位置が異なるだけであり、BaEV分岐の下部のbootstrapについては、NJ系図における観察と一致いていた。実施例１１ LTR および近隣領域の分析ロング・ターミナル・リピート（LTR）は、プロウィルスのそれぞれの末端に、何度も長く繰り返されるシーケンスであり、RNAゲノムの逆転写や、プロウィルスDNAの統合に必要とされるシーケンスを含むばかりでなく、プロウィルスの転写を抑制するエンハンサーやプロモーターをも含んでいる。３つLTRドメインが認識されており、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５で表される。LTRは、Ｕ３とＵ５のそれぞれ５’端と３’端に、AATGAAAGGおよびCCTTTCATTが反対に繰り返して示されることにより、識別できる。LTR ドメイン PoEV ゲノムシーケンス長さｂｐ図３に従ってＵ３ 7638-8106 ４６９Ｒ^* 8107-8188,1-61 ８２Ｕ５ 62-143 ８２＊Ｒの位置は、ここでは、MuLV LTRの３’端との近似性により定めており、TA TAボックスのおよそ２４ｂｐ下流に観察されたキャップサイトの位置と適合している。図６に示されているように、Ｕ３領域は、多数の潜在的転写サイトを含んでいる。Ｕ３領域の大部分は、保存サイトまたは反復要素を示す他の哺乳類のＣ型レトロウィルスとは、殆ど、もしくは全く相同性を示さない。しかしながら、Ｕ３の３’端へ向かう領域、およびＲ、Ｕ５に入る領域には、他の哺乳類のＣ型ウィルスとの相同性が見られる。潜在的転写因子サイトの中から、以下にいくつかを示す： LyF-1は、リンパ細胞特有遺伝子用の新種のプロモーター（Loその他1991年）と相互に作用し合う転写調節因子である。 E47は、ネズミ白血病ウィルスのエンハンサーと結びつく新種の組織特有エンハンサープロテインの原型である。 ETS-1は、主として造血系統に発現される転写因子である。 LTRは、80006-8062および8045-8101に、直接反復を含むが、これらは、ともに３つの潜在的CCATTボックスを含む。潜在的TATAボックスは、8129-8144に位置する。Ｒ領域は、PADS（Poly A downstream element）および一致するアデニン重合信号（AATAAA）を含む。 PoEVのプライマー結合サイト（PBS）は、グリシリン（２）tRNAであるが、今のところ、グリシリン（２）tRNAが外因性レトロウィルスに見られたという報告はない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年６月２４日（１９９８．６．２４）【補正内容】請求の範囲１．図１、２、３または４に示される、次の各要素からなる隔離されたポリヌクレオチド断片、その派生物またはそれに対応するＲＮＡシーケンス：（ａ）少なくとも１つのブタのレトロウイルス（PoEV）発現体を符号化する、（ｂ）前記（ａ）の発現体の生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体と実質的に同様な生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体を示す発現体を符号化する、または、（ｃ）上記(ａ)、（ｂ）で定義されたポリヌクレオチドシーケンスに相補的なポリヌクレオチド断片。２．次の各要素からなる請求項１に記載の隔離されたポリヌクレオチド断片：（ａ）図３または図４に示されるアミノ酸シーケンスを有するポリペプチドを少なくとも１つ符号化する、（ｂ）前記（ａ）の発現体の生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体と実質的に同様な生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体を示す少なくとも１つのポリペプチドを符号化する、または、（ｃ）上記(ａ)、（ｂ）で定義されたポリヌクレオチドシーケンスに相補的なポリヌクレオチド断片。３．次の各要素からなる請求項１または２に記載の隔離されたポリヌクレオチド断片：（ａ）ポリメラーゼ（POL）ポリペプチドを符号化する、（ｂ）前記（ａ）のポリメラーゼ（POL）ポリペプチドの生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体と実質的に同様な生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体を示すポリペプチドを符号化する、または、（ｃ）上記(ａ)、（ｂ）で定義されたポリヌクレオチドシーケンスに相補的なポリヌクレオチド断片。４．次の各要素からなる請求項２に記載の隔離されたポリヌクレオチド断片：（ａ）ビリオンコアポリペプチド（GAG）および／またはエンベロープポリペプチド（ENV）を符号化する、（ｂ）前記（ａ）のビリオンコアポリペプチド（GAG）および／またはエンベロープポリペプチド（ENV）の生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体と実質的に同様な生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体を示すポリペプチドを符号化する、または、（ｃ）上記(ａ)、（ｂ）で定義されたポリヌクレオチドシーケンスに相補的なポリヌクレオチド断片。５．図２または図３に示されたシーケンスと少なくとも９０％のシーケンスの同一性を示す、次の各要素からなる隔離されたポリヌクレオチド断片：（ａ）ブタレトロウィルス（PoEV）のビリオンコアポリペプチド（GAG）、ポリメラーゼ（POL）およびエンベロープポリペプチド（ENV）を符号化する、（ｂ）前記（ａ）のGAG、POLおよびENVポリペプチドの生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体と実質的に同様な生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体を示すポリペプチドを符号化する、または、（ｃ）上記(ａ)、（ｂ）で定義されたポリヌクレオチドシーケンスに相補的なポリヌクレオチド断片。６．請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片を有する組換え核酸分子。７．組換え核酸分子が、ポリヌクレオチド断片の発現を制御するためにポリヌクレオチド断片に機能的に結合する制御シーケンスを有する請求項６に記載の組換え核酸分子。８．請求項６または７に記載の組換え核酸分子を有するベクター。９．ウイルスまたはプラスミドである請求項８に記載のベクター。１０．請求項１〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片、組換え核酸分子、またはベクターにより形質変成された原核生物型または真核生物型宿主細胞。１１．POL活性を有する図３に示すアミノ酸シーケンスを含む組換えPoEVポリペプチド。１２．図３に示すGAGアミノ酸シーケンスと少なくとも９５％のシーケンス同一性を有するアミノ酸シーケンスを含む組換えPoEVポリペプチドまたはその誘導体。１３．図３または図４に示すENVアミノ酸シーケンスと少なくとも７５％のシーケンス同一性を有するアミノ酸シーケンスを含む組換えPoEVポリペプチドまたはその誘導体。１４．図３または図４に示すシーケンスまたは該PoEVポリペプチドの生理化学的に活性なおよび／または免疫原的活性を含むポリペプチド誘導体組換えPoEVポリペプチドまたはその誘導体。１５．請求項１１〜１４のいずれかに記載の組換えPoEVポリペプチド、または不活性なPoEVウイルスおよび医学的に許容されるキャリアを有するワクチン。１６．請求項１１〜１４のいずれかに記載のポリペプチドまたは誘導体に対する反PoEV抗体または断片。１７．図１、２、３または４に示されるPoEVポリヌクレオチド断片と、特に混成することができ、かつ、鎖の伸張をプライマーの３’端から開始することができるが、PoEVではないシーケンスからは、正確には鎖の伸張を開始できないポリヌクレオチドプライマー。１８．厳格な条件下で、図１、２、３または４に示されるポリヌクレオチドシーケンスと特に混成することができるが、厳格な条件下でPoEVではないシーケンスとは混成しないポリヌクレオチドプローブ。１９．図１、２、３または４に示される分子のストランドと、またはその相補的なストランド、対応のRNA分子または該分子の一部を有する、と同一の実質的なヌクレオチドシーケンスを有する請求項１７または１８に記載のプローブまたはプライマー。２０．請求項１７〜１９のいずれかに記載のポリヌクレオチドプライマーまたはプローブを有するPoEV検出キット。２１．サンプル中のPoEVの検出における請求項１７〜１９のいずれかに記載のPo EV特性ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブの使用。２２．サンプル中のPoEVを検出するためのポリメラーゼ鎖反応における請求項１７または１９のいずれかに記載のPoEV特性ポリヌクレオチドプライマー１つまたは複数の使用。２３．図１、２、３または４に示したポリヌクレオチドシーケンスから誘導されるポリヌクレオチドシーケンスを用いることにより伝染性のPoEVを発現しないよう操作されたブタの胚、胚の茎状細胞、または生育する胚を形成可能な全潜在的核を有する細胞。２４．胚、胚の茎状細胞、または生育する胚を形成可能な全潜在的核を有する細胞から得ることができるブタ。２５．請求項２４に記載のブタから得られる細胞、組織または器官。２６．ワクチンの調整に用いるための請求項１１〜１４に記載のいずれかの組換えPoEVポリペプチドまたはその機能的に活性な誘導体。２７．サンプルにおけるPoEV核酸の存在を検出することのできる検出キットの調製における請求項１７〜１９に記載のポリヌクレオチドプライマーまたはプローブの使用。２８．治療または診断に使用する薬剤の調製における請求項１〜５、１１〜１３、２５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、ポロペプチド、細胞、組織、または器官。２９．治療または診断における請求項１〜５、１１〜１３、２５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、ポロペプチド、細胞、組織、または器官の使用。３０．ここまでに実質的に記載された発明。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ハワース，クリスチーヌイギリス国、ジー11 ７ジェイイー、グラスゴー、ブルームヒル、マリボラフアヴェニュー 139番地 (72)発明者リース，ジリアン，マーガレットイギリス国、ジー77 ５エイチディー、グラスゴー、ニュートンミールンス、カークベールドライブ５番地 (72)発明者スミス，ケニス，トーマスイギリス国、ジー77 ５エイチディー、グラスゴー、ニュートンミールンス、カークベールドライブ５番地

Claims

【特許請求の範囲】１．次の各要素からなる隔離されたポリヌクレオチド断片：（ａ）少なくとも１つのブタのレトロウイルス（PoEV）発現体を符号化する、（ｂ）前記発現体の生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体を符号化する、または、（ｃ）上記(ａ)、（ｂ）で定義されたポリヌクレオチドシーケンスに相補的なポリヌクレオチド断片。２．次の各要素からなる請求項１に記載の隔離されたポリヌクレオチド断片：（ａ）ポリメラーゼ（POL）ポリペプチドを符号化する、（ｂ）上記(ａ)のポリペプチドを生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体を符号化する、または、（ｃ）上記(ａ)、（ｂ）で定義されたポリヌクレオチドシーケンスに相補的なポリヌクレオチド断片。３．次の各要素からなる請求項１に記載の隔離されたポリヌクレオチド断片：（ａ）ビリオンコアポリペプチド（GAG）および／またはエンベロープポリペプチド（ENV）を符号化する、（ｂ）上記（ａ）のポリペプチドを生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体を符号化する、または、（ｃ）上記(ａ)、（ｂ）で定義されたポリヌクレオチドシーケンスに相補的なポリヌクレオチド断片。４．次の各要素からなる請求項１に記載の隔離されたポリヌクレオチド断片：（ａ）ビリオンコアポリペプチド(GAG)、ポリメラーゼ（POL）およびエンベロープポリペプチド（ENV）を符号化する、（ｂ）上記（ａ）のポリペプチドを生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体を符号化する、または、（ｃ）上記(ａ)、（ｂ）で定義されたポリヌクレオチドシーケンスに相補的なポリヌクレオチド断片。５．ポリヌクレオチド断片が、デオキシリボース核酸（DNA）断片である請求項１〜４のいずれかに記載の隔離されたポリヌクレオチド断片。６．次の各要素からなる前記請求項のいずれかに記載の隔離されたポリヌクレオチド断片：（ａ）図３または４に示されるアミノ酸シーケンスを有する少なくとも１つのポリペプチドを符号化する、（ｂ）上記（ａ）に定義の少なくとも１つのポリペプチドの生理化学的に活性なおよび／または免疫原的な誘導体であるポリペプチドを符号化する、または、（ｃ）上記(ａ)、（ｂ）で定義されたポリヌクレオチドシーケンスに相補的なポリヌクレオチド断片。７．次の各要素からなる前記請求項のいずれかに記載の隔離されたポリヌクレオチド断片：（ａ）図１、２、３または４に示されるORFの少なくとも１つ、またはこれに対応のRNAシーケンスを有する、（ｂ）上記（ａ）に記載のシーケンスと同一の実質的なヌクレオチドシーケンスを有するシーケンスを有する、または、（ｃ）上記(ａ)、（ｂ）に記載されたシーケンスに相補的なシーケンスを有する。８．請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片を有する組換え核酸分子。９．組換え核酸分子が、ポリヌクレオチド断片の発現を制御するためにポリヌクレオチド断片に機能的に結合する制御シーケンスを有する請求項８に記載の組換え核酸分子。１０．請求項８または９に記載の組換え核酸分子を有するベクター。１１．ウイルスまたはプラスミドである請求項１０に記載のベクター。１２．請求項１〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド断片、組換え核酸分子、またはベクターにより形質変成された原核生物型または真核生物型宿主細胞。１３．POL PoEV生理化学的および／または免疫原的活性を示す組換えPoEVポリペプチドまたはその誘導体。１４．GAGおよび／またはENV PoEV生理化学的および／または免疫原的活性を示す組換えPoEVポリペプチドまたはその誘導体。１５．GAG、POLおよびENV PoEV生理化学的および／または免疫原的活性を示す組換えPoEVポリペプチドまたはその誘導体。１６．図３または４に示されるシーケンスを有する請求項１３〜１５に記載のいずれかの組換えPoEVポリペプチドまたはその機能的に活性な誘導体。１７．請求項１３〜１６のいずれかに記載の組換えPoEVポリペプチド、または不活性なPoEVウイルスおよび医学的に許容されるキャリアを有するワクチン。１８．請求項１３〜１６のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片に結合可能な抗体または断片。１９．PoEV特性であるポリヌクレオチドプライマー。２０．PoEVポリヌクレオチドシーケンスに対し具体的にハイブリッド形成できるポリヌクレオチドプローブ。２１．図１、２、３または４に示される分子のストランドと、またはその相補的なストランド、対応のRNA分子または該分子の一部を有する、と同一の実質的なヌクレオチドシーケンスを有する請求項１９または２０に記載のプローブまたはプライマー。２２．請求項１９〜２１のいずれかに記載のポリヌクレオチドプライマーまたはプローブを有するPoEV検出キット。２３．サンプル中のPoEVの検出におけるPoEV特性ポリヌクレオチドの使用。２４．サンプル中のPoEVの検出のPCRにおけるPoEV特性ポリヌクレオチドの使用。２５．ヒトに感染する感染性PoEVを出さないように変成したブタ。２６．請求項２５に記載のブタから得られる細胞、組織または器官。２７．ワクチンの調製における請求項１３〜１６に記載の組換えPoEVポリペプチドの使用。２８．サンプルにおけるPoEV核酸の存在を検出することのできる検出キットの調製における請求項１９〜２１に記載のポリヌクレオチドプライマーまたはプローブの使用。２９．治療または診断における請求項１〜７、１３〜１６、２６のいずれかに記載のポリヌクレオチド、ポロペプチド、細胞、組織、または器官の使用。３０．治療または診断に使用する薬剤の調製における請求項１〜７、１３〜１６、２６のいずれかに記載のポリヌクレオチド、ポロペプチド、細胞、組織、または器官。３１．ここまでに実質的に記載された発明。