JPH04193895A - 新規ペプチド - Google Patents

新規ペプチド

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JPH04193895A
JPH04193895A JP2324763A JP32476390A JPH04193895A JP H04193895 A JPH04193895 A JP H04193895A JP 2324763 A JP2324763 A JP 2324763A JP 32476390 A JP32476390 A JP 32476390A JP H04193895 A JPH04193895 A JP H04193895A
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amino acid
acid sequence
ser
peptide
tyr
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Akira Yanai
昭 谷内
Kozo Imai
浩三 今井
Masayuki Tsujisaki
辻崎 正幸
Kumiko Hamada
久美子 濱田
Shinsuke Taki
滝 伸介
Junji Hamuro
淳爾 羽室
Toshiaki Shimamura
嶌村 俊朗
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト細胞間粘着分子■ (以下、ICAM−1
と称する)に結合することにより、ヒトIC^ト1とヒ
トリンパ球機能関連抗原−1(以下LFA−1と称する
)との結合を阻害する活性を有する新規ペプチドに関す
る。本ペプチドは、臓器移植時の拒絶反応の予防、アレ
ルギー性疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬
として利用しうる有用な免疫抑制剤である。
[従来の技術] 臓器移植の外科的技術が著しく向上した現在、臓器移植
手術の成否は術後の移植片拒絶反応をいかにして抑制で
きるかに換言されてきている。また、拒絶反応は、生体
が移植片を異物として認識し、それを排除するために一
連の免疫反応が惹起されることにより生じる。そこで、
従来より拒絶防止薬として、ステロイド剤、アザチオプ
リン、メトトレキセート、6−メルカプトプリンなどの
いわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬剤の投与が行われ
てきた。しかし、安全域が狭いこと、あるいは効果が弱
いことなどの理由で、移植した臓器の生着率は向上しな
かった。ところが、近年開発されたサイクロスポリンへ
の登場により、生着率は格段の向上をみるようになった
。しかしながら、サイクロスポリンAには重篤な腎毒性
があることが明らかとなり、その使用の制限を写像なく
されてきている。したがって、より安全で、かつ効果的
な免疫抑制剤の開発が望まれてきている。
ところで、移植片の拒絶のために惹起される免疫反応は
、細胞傷害性Tリンパ球が移植片を異物として認識し、
攻撃する反応がその主因の一つであると考えられている
。これらの反応は、まず宿主のTリンパ球が移植片を特
異的に認識し、両者が接着することにより開始する。従
って、これらの細胞同士の接着を阻害することができれ
ば、拒絶反応を抑制することができるものと推定される
細胞同士が接着するためには、それぞれの細胞表面上に
発現している接着分子と呼ばれている糖タンパク質同士
が結合することによる仲介が必須である。最近の研究に
より、接着分子として種々の分子が発見されてきており
、そのうち1組としてICAM−1とLF^−1が知ら
れている(Cel 1 、51巻、813頁。
1987年)。拒絶反応の場合には、細胞傷害性T細抱
土のLFA−1分子と移植片の細胞上のICAM−1分
子とが接着することが必要であると考えられている(E
uropean Journal of Immuno
logy+8巻、637頁。
1988年)。
一方、自己の抗原に対して免疫反応が生じることにより
自己の破壊が起こる自己免疫疾患や、外来抗原に対して
過剰な免疫反応が生じることにより自己に対しても傷害
を引き起こすアレルギー性疾患は、その多くが難治性の
慢性炎症性疾患である。その治療薬としては、ステロイ
ド性の抗炎症薬が現在量も有効であるが、強力な非特異
的免疫抑制作用を持ち合わしているために生じる重篤な
副作用がしばしば現れ、その使用を制限せざるを得ない
。また、非ステロイド性の抗炎症薬は、炎症反応を仲介
する化学的仲介因子の産生阻害剤、あるいはその拮抗物
質がほとんどを占めており、慢性の炎症には効果のない
ものが多く、これらの疾患の優れた治療薬の開発が望ま
れている。これらの疾患がいかにして慢性化するかは現
在まで不明であるが、炎症部位への好中球・マクロファ
ージの集束、それに引き続いて生じるリンパ球の集束が
、慢性化の一助となっている可能性が高い。
血液中を循環しているこれらの細胞が局所へと集束する
ためには、まず、炎症部位に近い血管の内皮にこれらの
細胞が接着し、血管の内皮細胞の接合部をすり抜け、更
に基底膜を破って、炎症部位へと遊走すると考えられて
いる。
したがって、この一連の反応の第一歩である炎症性細胞
の血管内皮細胞への接着を阻止すれば、炎症の抑制、更
には炎症の慢性化を抑制することができるものと考えら
れる。炎症性細胞の血管内皮細胞への接着の場合にも、
炎症性細胞の表面上に発現しているLFA−1分子と、
血管内皮細胞の表面上に発現しているICAM−1分子
の結合が必須であると考えられるようになってきている
(CI 1nicalResearch、 36巻、6
48八頁、 1988年〕。
すなわち、ICAM−1とLFA−1との結合を阻害す
ることができれば細胞同士の接着が阻害され、拒絶反応
を阻止したり、炎症を抑制することができるものと想定
される。しかし、現在までこの結合を選択的に阻害する
物質は、抗ICAに一1抗体あるいは抗LFA−1抗体
以外には知られていない。また、唯−知られているこれ
らの抗体も、ウサギやマウスなどの異種動物を免疫する
ことにより得られた異種タンパク質であり、そのままの
形でヒトに投与すると、抗体に対する免疫反応が生じて
アナフィラキシ−ショックや血清病などの重篤な副作用
が起こったり、抗体の効果が減弱してしまうことが想定
され、残念ながら直ちに臨床に応用することは不可能で
ある。
また、ICAM−1あるいはLFA−1の結合部位を明
らかにしてその情報を基にペプチドをデザインすれば、
結合阻害物質となりうる可能性もあるが、現在までのと
ころ、ICAM−1分子、LFA−1分子とも互いの結
合部位が同定されておらず、そのアプローチも不可能で
ある。
〔発明が解決しようとする課題〕
従って、本発明の目的はヒ目CAM−1に結合して、ヒ
トICAM−1とLFA−1との結合を選択的に阻害す
る物質を提供することである。この物質は、臓器移植時
の拒絶反応の予防、アレルギー性疾患や自己免疫疾患な
どの炎症性疾患の治療薬に有効な免疫抑制剤として期待
できる。
〔課題を解決するための手段〕
本発明らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた
結果、以下の新しい概念及び方法により、目的とするI
CAM−1とLFA−1との結合を選択的に阻害するペ
プチドを見いだし、本発明を完成した。
即ち、本発明はICAM−1とLFA−1との結合を阻
害するペプチドである。尚、ペプチド鎖を構成している
アミノ酸残基数により、ペプチドとポリペプチドを区別
して表現される場合もあるが、本発明においてはアミノ
酸残基数にこだわらず、全てペプチドという表現を用い
ることにする。従って厳密には、ポリペプチドに分類さ
れるものも本発明においては全てペプチドとして表記す
る。以下、本発明の詳細な説明する。
さて、ICAM−1分子を認識する抗体のうち、特にL
FA−1とICΔCエトの結合阻害活性を有しているも
のの中には、ICAM−1分子上のLFA−1分子との
結合部位そのものを認識しているものが含まれているも
のと考えられる。更に、ICAM−1分子上のLFA−
1分子との結合部位を認識している抗体の中には、LF
A−1分子がICAM−1分子と結合するがごとく、L
FΔ−1分子上のICAM−1分子結合部位と同じ様な
立体構造をもって、ICAM−1分子に結合するものも
含まれる可能性がある。従って、LFA−1とICAM
−1との結合阻害活性を有している抗IC,AM−1抗
体を産生ずるハイブリドーマを多数集め、それらのハイ
ブリドーマの産生ずる抗体の可変領域(以下V N域と
略する)のアミノ酸配列を決定すれば、LFA−1のI
CAM−1分子の結合部位のアミノ酸配列と同一あるい
は類似のアミノ酸配列が得られる可能性がある。そして
LFA−1分子のアミノ酸配列と、抗体の■領域のアミ
ノ酸配列との間に類似の配列が得られた場合には、その
部分に当たるペプチドを合成すればそのペプチドはLF
A−1とICAM−1の結合を阻害できるものと推定で
きる。このような概念に基づき、本研究者らはまずIC
AM−1に特異的でかつICAM−1とLFA−1の結
合を阻害する活性を有する7ウスモノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマクローンを作製した。マウス抗
ヒトICAM−1モノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマクローンは、以下のようにして得られる。まず
、γ−インターフェロンで刺激してICAM−1分子を
高発現させたヒト大腸癌細胞株BM314をマウスに免
疫する。
尚、この場合、ICAM−1分子を元来発現している細
胞、種々の刺激によりICAM−1分子の発現を誘導し
た細胞など、細胞表面にICAM−1分子を発現してい
るヒト由来の細胞であればどんな細胞を免疫原として用
いてもかまわない。次に、その免疫されたマウスの肺臓
細胞あるいはリンパ節細胞中に存在する抗体産生細胞と
、骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作製する。骨髄腫細
胞は、融合可能な限りいかなる動物種由来のものでもよ
いが、通常同一種の細胞を用いた方が良い結果が得られ
る。本発明で得たハイブリドーマは、生理食塩水に懸濁
したγ−インターフェロン刺激ヒト大腸癌細胞株BM3
14で免疫したBALB/cマウスの肺臓細胞とBAL
B/Cマウスの骨髄種細胞であるX63−Ag8−6.
5.3とをポリエチレングリコール存在下で融合して得
られたハイブリドーマである。骨髄種細胞としては、X
63−Ag8−6.5.3 ノほかに、P3−X63−
Ag8−U1+ P3−X63−Ag8. P3−NS
I/1−Ag4−1. MPCII−4,5,6,TG
、 1.7.SP2/V−Agll (以上マウス細胞
) 、210.RCY、八g1.2.3(ラット細胞)
 、5KO−(107,GH15(106TG−A12
 (以上ヒト細胞)等の8アザグアニン耐性の細胞株を
用いてもよい。マウスの肺臓中の抗体産生細胞と骨髄種
細胞とが融合したハイブリドーマの選択は、細胞融合後
ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地
(HAT培地)中で培養することにより行える。得られ
たハイブリドーマはすべて目的とする抗体を産生じてい
るわけではないので、得られたハイブリドーマクローン
の中からICAM−1に対する抗体を産生じているハイ
ブリドーマを選択し、その中から更にICAM−1とL
FA−1との結合阻害活性を有している抗体を産生じて
いるノ1イブリドーマを選択しなければならない。その
選択は例えば以下の様な方法を用いて行うことができる
ずなわち、ヒト調帯静脈内皮細胞をT−インタ一フェロ
ン存在下で37°Cで一晩培養して、プラスチックプレ
ート表面に張り付ける。この場合、張り付ける細胞は表
面にIcAM−1分子を発現しているヒト由来細胞であ
る限りどんな細胞を用いてもかまわない。この際、検体
であるハイブリドーマ培養上清をあらかじめ各穴に加え
ておく。2°7゛−ビス(カルボキシエチル)カルボキ
シフルオレセンテトラアセトキシメチルエステルにて標
識したHL−60細胞を各穴に加えて、調帯静脈内皮細
胞に結合したHL−60細胞数を蛍光強度として求め、
検体の培養上清による肛−60細胞の調帯静脈内皮細胞
への接着阻害能を測定し、目的とするICAM−1分子
とLFA−1分子の接着を阻害する活性を有するICA
M−1に対する抗体を産生ずるハイブリドーマを得る。
なお、スクリーニングのために調帯静脈内皮細胞へ接着
させる細胞は、It、−60以外にも表面にLF^−1
分子を発現しているヒト由来細胞である限りいかなる細
胞を用いてもかまわない。また、細胞の標識は、蛍光色
素以外にも、アイソトープ、酵素などを用いて行っても
よい。
こうして得られたハイブリドーマクローンより全RNA
を抽出し、モノクローナル抗体のV pM域をコードす
る遺伝子(cDNA)を取得する。本発明のためには、
期待する構造を有するV領域を見いだすため、多数のハ
イブリドーマより■領域cDNAを取得し、構造を決定
する必要がある。
そこで、本発明者らはより迅速な方法を鋭意工夫し、以
下の方法により遺伝子を取得した。すなわち、まず既に
知られているマウスIgGの重鎮(H鎖)及び軽鎖(L
鎖)の、それぞれのV領域をコードする遺伝子の5°端
に共通性の高い20〜30個の塩基配列(ブライマーD
NA)を考案する。
この塩基配列を有するDN^オリゴマー(5″側プライ
マーDNA)、及び抗体の定常領域mRNAに相補的な
配列を有するDNAオリゴマー(3’側プライマーDN
A)をDNA合成機を用いて合成する。得られたいくつ
かのハイブリドーマより、常法に従って全RNへを抽出
し、逆転写酵素と適当な3゛側プライマーDNAを用い
て一本鎖cDN^を作製し、5”側プライマーDNA及
び3゛側プライマーDNAを用い、Taqポリメララー
ゼによるポリメラーゼチェーンリアクシコン法(PCR
法) (Science、230巻: 1350頁、 
1985年)にて抗体のH鎖及びL鎖のV領域をコード
するDNA断片のみを選択的に増幅し取得する。その後
、得られたそれぞれのDNA断片を、T4ONAポリメ
ラーゼにより両端を平滑化し、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼにより5゛端をリン酸化する。このDNA断片を
、あらかじめクローニングサイトのSmaIザイトにて
切断し、アルカリフォスファターゼにて脱リン酸してお
し)たプラスミドベクターと、T4DN八リガーゼを用
いて連結してクローニングする。クローニングされたc
DNAの配列は、ダイデオキシ法(Science+ 
 214巻、 1205頁、 1981年)により決定
した。この決定されたH鎖及びL鎖のV領域の塩基配列
からアミノ酸配列を推定する。クローニング法は、ここ
に記した方法以外にも通常用いられているいかなる方法
を用いてもかまわない。
次に、得られた抗ヒトICAM−1抗体のH鎖及びI、
鎖の■領域の塩基配列より推定したアミノ酸配列と、L
FA−1分子のそれとのホモロジーの検索を行った。抗
ヒトICAM−1モノクローナル抗体産生ハイブリドー
マの作製、そのv領域のアミノ酸配列の決定、そしてヒ
トLFA−1分子とのホモロジー検索、という一連の行
程を多数のハイブリドーマについて繰り返し行った結果
、本発明の目的に沿う、ICAM−1とLFA−1との
結合を阻害する活性を有する6種類のペプチドを見い出
した。ペプチドのアミノ酸配列を具体的に示すと以下の
通りである。
即ち、下記のアミノ酸配列[I]〜[VI]で示される
構造を有するものである。
アミノ酸配列[■] : Tyr−Ser−Thr−Ser−八5n−Leu−A
la−Ser−Gly−Val−Pro−Ala−八r
g アミノ酸配列[II]: His−Gln−Trp−Ser−Ser−Tyr−P
ro−Tyrアミノ酸配列配列] : Thr−Phe−Tyr−^5n−Gln−Lys−P
he−Lys−Glyアミノ酸配列配列]: Thr−Val−Val−Ala−^5p−Phe−八
5p−Tyrアミノ酸配列[V]ニ 1フ 八sp−IIe−Gln−Leu−Thr−Gln−S
er−Pro−Ala−Ile、Met−Ser−八1
a−Ser−Pro−Gly−Glu−Lys−Val
−Thr−Leu−Thr−Cys−Ser−八Ia−
Ser−Ser−Ser−νal−Ser−Ser−S
er−Tyr−Leu−Tyr−Trp−Tyr−GI
n−Gln−Lys−Pro−Gly−Ser−Ser
−Pro−Lys−Leu−Trp−Ile−Tyr−
Ser−Thr−Ser−^5n−Leu−八Ia−S
er−Gly−Val−Pro−八Ia−Arg−Ph
e−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−GIy
−Thr−Ser−Tyr−Ser−Leu−Thr−
Tle−Ser−Ser−Met−Glu−Ala−G
lu−Asp−へ1a−八1a−Ser−Tyr−Ph
e−Cys−H1s−G 1n−Trp−Ser−5e
t−Tyr−Pro−Tyr−Thr−Phe−GIy
−Gly−Gly−Thr−Lys−Leu−Glu−
1)e−Lys−Arg−AIa−へ5p−Ala−八
1a−Pro−Thr−Val−Ser−1)e−Ph
e−Pro−Pro−Ser アミノ酸配列[VI] : G Iu−Va 1−Lys−Leu−Gln −G 
Iu−Ser−G Iy−Pro−G l u−Leu
−Val−Lys−Pro−Gly−八la−Ser−
Val−Lys−Met−Ser−Cys−’Lys−
^1a−Ser−Gly−Ser−Thr−Phe−S
er−Asp−Tyr−Tyr−Met−Lys−Tr
p−シal−Lys−Gln−へrg−Pro−Trp
−Lys−Glu−Leu−Glu−Trp−1)e−
Gly−八sp−1)e−Ser−Pro−Asn−A
sn−c+y−^5p−Thr−Phe−Tyr−As
n−Gln−Lys−Phe−Lys−Gly−Lys
−^1a−71)r4.eu−Thr−シal−Asp
−Lys−Ser−Ser−Ser−Thr−Ala−
Tyr−Met−Gln−Lea−八5n−Ser−L
eu−Thr−Ser−Glu−^5p−Ser−Al
a−Val−Tyr−Tyr−Cys−Ala−Thr
−Thr−Va I −Va I−A Ia−Asp−
Phe−Asp−Tyr−Trp−G Iy−G In
−G1 y−Thr−Thr−Leu−Thr−Va 
l−Ser−Ser−A Ia−Lys−Thr−Th
r−pro−Pro−Ser−シal−Tyr−Pro
−Leu−Alaもちろん本発明のICAM−1とLF
A−1との結合を阻害するペプチドは上記[I]〜[V
I]に示した構造を有するペプチドにとどまらず、例え
ば上記[I]〜[VI]で示されるアミノ酸配列中の1
個若しくは複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され
た構造を有するもの、また、上記[I]〜[VI]で示
されるアミノ酸配列のN末端、及び/又はC末端に1個
若しくは複数個にアミノ酸が付加された構造を有するも
のもICAM−1とLFA−1との結合を阻害する活性
を有する限り本発明のペプチドに含まれる。
更に、上記[I]〜[VI]で示されるペプチドがアミ
ド化、アセチル化又はポリエチレングリコール付加され
た構造のものもICAM−1とLFA−1との結合を阻
害する活性を有する限り、本発明のベプチドに含まれる
さて、上記[I]〜[VI]で示される配列のうち、 式 [I]  、: ]Tyr−Ser−Thr−Se
rAsn−Leu−八la−Ser−Gly−Val−
Pro−Ala−Argで表される配列は特にICAM
−1とLFA−1との結合を強く阻害する。この配列抗
体の■領域中に存在し、LF^−1分子と非常にホモロ
ジーが高い部分である。
この配列は、抗体のV ’J域中で、いわゆる相補性決
定領域(CDR)と呼ばれ、抗原との結合に直接関与す
ることが知られている部分に当る。さて、上記[I]〜
[VI]で示される配列を有するペプチドは、化学的に
合成してもよいし、遺伝子工学の手法を用い゛て調製し
てもかまわない。化学的に合成する場合には、通常用い
られる固相法で、ペプチド結合の任意の位置で部分され
る2種類のフラグメントの一方に相当する反応性カルボ
キシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当ず
る反応性アミノ基を有する原料をジシクロへキシルカル
ボジイミド法を用いて縮合させ、生成する縮合物が保護
基を有する場合、その保護基を除去させることにより製
造し得る(InternationalJournal
 of Peptide Protein ReSer
ch、30巻、705頁、1987年)、また、遺伝子
工学の手法を用いる場合には、例えば、5”、3”両端
に適当な制限酵素サイト、更にその内部に5゛側から開
始コドン(ATG)、それに引き続き本ポリペプチドに
対応する塩基配列を含むように化学的に合成したDNA
 、あるいはPCR等を用いて調製したcDNAを、プ
ロモーター領域、SDwi域とターミネータ−領域を含
む適当な発現ベクタープラスミドに、組み込み、大腸菌
を形質転換し、大腸菌内に目的とするペプチドを産生さ
せればよい。発現させる宿主は大腸菌に限らず、酵母、
昆虫、動物細胞など可能な限りいかなるものを用いても
よい。本発明のペプチドは、通常の方法に従い精製され
る。具体的には、イオン交換クロマトグラフィー、逆相
液体クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラ
フィーなどを用いればよい。
さて、本発明のペプチドは、ICAM−1に結合してI
CAM−1とLFA−1との結合を選択的に阻害する活
性を有しており、臓器移植時の拒絶反応の予防などに対
して有効なものである。また、本発明に係る免疫抑制剤
は上記ペプチドを0.1重量%〜1(10重量Z、好ま
しくは0.5重量%〜70重量%の割合で含有すればよ
い。したがって、本発明のペプチドをそのまま投与して
もよいし、また通常製剤用担体と混合して調製した製剤
の形で投与しでもよい。製剤用担体としては、製剤分野
において常用され、かつ本発明のポリペプチドと反応し
ない物質が用いられる。注射剤の場合には、本発明のポ
リペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じ
て生理食塩水、ぶどう9IM溶液に溶解させてもよく、
また緩衝剤、保存剤、安定化剤あるいは賦形剤を含有さ
せてもよい。また、これらの製剤は治療上価値のある他
の成分を含有していてもよい。
本発明に係る免疫抑制剤の投与方法としては、経口、注
射、直腸内などいずれの方法を用いてもかまわないが、
注射による投与が好ましい。投与量は、投与方法、患者
の症状、年齢などにより異なるが、通常1回o、ooi
〜1(100■、好ましくは0.01〜10■を1日当
り1〜3回投与すればよい。
尚、本発明に係るペプチドは安全性が確認されている。
以下本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。
(実施例1、ICAM−1分子とLFA−1分子との結
合を阻害する活性を有するペプチドの作成)あらかじめ
250U/dの濃度のインターフェロン−T存在下で、
37°Cで3日間培養したヒト大腸癌細胞株BM314
を、生理食塩水に懸濁し、6〜8週令の雌のBALB/
cマウスに、1匹あたり1×IO7個腹腔内投与するこ
とにより免疫した。その10日後、同様の操作により追
加免疫し、更にその5日後、マウスの眼窩静脈より採血
して、8M314細胞に対する抗体価を、FAC3ca
n (ベクトンディッキンソン社製)を用いた蛍光染色
法により測定した。
すなわち、まず、1本あたり1×106個の8M314
細胞をチューブに入れ、遠心して上清を捨て、細胞をベ
レットとする。次に0.5%牛血清アルブミン(BSA
) 、0.1%NaN3及び0.15 M NaC1を
含む10mMリン酸塩緩衝液(pn7.5) (以下B
SA−PBS)にて種々の濃度に希釈したサンプル血清
を10μβずつ加え、4°Cで30分間反応させた。こ
の細胞をBSA−PBSにて3回遠心洗浄した後、細胞
ペレットにBSA−PBSにて1(100倍に希釈した
フルオレセンインチオシアネート(FITC)標識ヤギ
抗マウス免疫グロブリン抗体(Tago社製)を10μ
lずつ加えて、4°Cで30分間反応させた。更にBS
A−PBSにて3回遠心洗浄した後、FAC3canに
て細胞に結合した抗体量を蛍光強度として測定した。こ
のようにして抗体価を測定し、抗体価の高かったマウス
を更に同様の操作にて最終免疫した。その3日後、肺臓
を摘出して肺臓細胞とマウス骨髄腫細胞(×63−Ag
8−6.5.3)  とを、50%ポリエチレングリコ
ール#4(100 (ナカライテスク社製)存在下にて
細胞数で10:1の割合で混合し、細胞融合させた。融
合細胞を、10%牛脂児血清(ギブコ社製)を含むRP
M1)640培地(ギブコ社製)にて5×106個/m
!となるように懸濁し、1穴あたり5X10’個のマウ
ス胸腺細胞を含有する96穴平底プレート(コーニング
社製)に1(10μPずつ分注した。1日、2日、3日
、6日後に培地の半量をヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジンを含む培地(HAT培地)と交換し、以後
3日ごとに同様の操作を繰り返した。融合より約2週間
後、融合した細胞(ハイブリドーマ)の増殖してきた穴
の培養上清について、後述の方法にてICAM−1とL
FA−1との結合阻害活性を測定し、阻害活性を有して
いた穴に含まれるハイブリドーマを、限界希釈法にてク
ローン化した。更にそれぞれのハイブリドーマクローン
の培養上清中の阻害活性を測定して、抗をPBSにて洗
浄後、グアニジンチオシアネート、N−ラウリルサルコ
シン、EDT^を含むRNN油抽出用緩衝液ファルマシ
ア社製)を加えて懸濁した後、あらかじめ等容量のセシ
ウムクロライド溶液(ρ・1 、51 g / d 、
ファルマシア社製)を入れたチューブ重層し、125.
(100xgにて16時間遠心した。
上清を吸い取ったのち、1mMEDTAを含む10mM
トリス塩酸塩緩衝液(pH7,5) (TE)を加えて
懸濁し、新しいチューブに入れ、65°Cで5分間イン
キユヘートした。更に、2M酢酸カリウム(pH5,0
) (ファルマシア社製)を1/10容量とエタノール
(ナカライテスク社製)を3倍容量加えて、−20°C
に一晩放置した。5,(100xgにて20分間遠心し
て、上滑を捨てた後、80%エタノールにて遠心洗浄し
、沈澱を乾燥させた。沈澱をTEにて熔解してRNA画
分とした。
次に、RNA溶液にデオキシNTP混合液、cDNA合
成用緩衝液(アマジャム社製) 、 RNaseインヒ
ビター(宝酒造社製)、及びリバーストランスクリプタ
ーゼ(宝酒造社製)を加えて42°Cにて1時間反応さ
せcDNAを合成した。更に、PCR用緩衝液(シータ
ス社製)、デオキシNTP混合液、マウス免疫グロブリ
ンH鎖V6Jf域cDNA増幅用ブライマー(5″、3
゛側それぞれ最終濃度1μM)あるいは、マウス免疫グ
ロブリンL鎖■領域cDNA増幅用プライマー(同濃度
)、及びTaqポリメラーゼ(全酒造社製)を加えDN
Aサーマルサイクラ−(シータス社製)にてPCRを行
った。反応は変性30秒(94°C)、アニール30秒
(55°C)、ブライマーイクステンション1分(72
°C)にて30サイクル行い、各サイクル毎にプライマ
ーイクステンションの時間を15秒ずつ延長させた。反
応後、1mMEDTAを含む40mM)リス酢酸緩衝液
(pl+8.0)にてアガロースゲル電気泳動を行い、
該当するcDN八フへグメントを切り出し、シーンクリ
ーンキット(バイ第101社製)を用いて抽出・精製し
た。
精製したフラグメントをT4 DN八へリメラーゼ(全
酒造社製)を用いて両端を平滑化した後、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ(全酒造社製)を用いて5゜端をリン
酸化し、あらかじめS…al (全酒造社製)にて切断
後アルカリフォスファターゼ(全酒造社製)にて脱リン
酸したpUc18ベクター(全酒造社製)と、T4 D
NAリガーゼ(全酒造社製)によりう2フ イゲーションした。大腸菌JMI09株(全酒造社製)
に形質転換後、クローンをχブロスに接種し37°Cに
て一晩培養して、アルカリSDS法によりプラスミドを
抽出精製した。
精製したプラスミドをシーフェンス用プライマーM4あ
るいはRV (全酒造社製)を用い、7−DEAZAシ
ークエンスキット(全酒造社製)にて以下の通り塩基配
列を決定した。
〈L鎖〉 GACATT  CAG  CTG  ACCCAG 
 TCT  CCA  GCA  ATCATGTCT
 GCA TCT CCT GGG GAG^^G G
TCACCTTG ACCTGCAGT  GCCAG
CTCA  AGT  GTA  AGT  TCCA
GCTACTTG  TACTGG  TACCAG 
 CAG  AAG  CCA  GGA  TCCT
CCCCCAAA  CTCTGG  ATT  TA
T  AGCACA  TCCAACCTGGCT T
CT GGA GTCCCT GCT CGCTTCA
GT GGCAGTGGG  TCT  GGG  A
CCTCT  TACTCT  CTCACA  AT
CAGCGCCATG  GAG  GCT  GAA
  GAT  GCT  GCCTCT  TAT  
TTCTGCCAT  CAG  TGG  AGT 
 AGT  TACCCA  TACACG  TTC
GGA  GGG  GGG  ACCAAG  CT
G  GAA  ATA  AAA  CGG  GC
Tcr  ccT GCA  CCA  ACT  G
TA  TCCATCTTCCCA  CC八へ8 TCC 〈H鎖〉 GAG  GTCAAG  CTG  CAG  GA
G  TCA  GGA  CCT  GAG  CT
GGTG  AAG  CCT  GGG  GCT 
 TCA  GTG  AAG  ATG  TCCT
GCAAG  GCT  TCT  GGA  TCC
ACCTTCAGT  GACTACTACATG  
AAG  TGG  GTG  AAG  CAG  
AGG  CCA  TGG  ^AA  GAGCT
T  GAG  TGG  ATT  GGA  GA
T  ATT  AGT  CCT  AACAATG
GT  GAT  ACT  TTCTACAACCA
G  AAG  TTCAAG  GGCAAG  G
CCACA  TTG  ACT  GTA  GAC
AAG  TCCTCCAGCACA GCCTACA
TG CAG CTCAACAGCCTG ACA T
CTGAG  GACTCT  GCA  GTCTA
T  TACTGT  GCA  ACT  ACGG
TA GTA GCT GACTTT GACTACT
GG GGCCAA GG’CACCACT  CTC
ACA  GTCTCCTCA  GCCAAA  A
CG  ACACCCCCA  TCT  GTCTA
T  ccA CTG  ccc得られた塩基配列より
、アミノ酸配列を推定し、以下に示す配列[Va  [
VI]を得た。
〈L鎖ニアミノ酸配列[Va〉 ^5p41e−Gin−Leu−Thr−Gln−Se
r−Pro−^1a−1)e−Met−Ser−八Ia
−Set−Pro−Gly−Glu−Lys−Val−
Thr−Leu−Thr−Cys −Ser−A Ia
 −Ser−Ser−Ser−Va 1−Ser−Se
r−Ser−Tyr−Leu−Tyr−Trp−Tyr
−Gln−G In −Lys−Pro−G Iy−S
er−Ser−Pro−Lys−Leu−Trp−I 
1e−Tyr−Ser−Thr−Ser−Asn −L
eu−八Ia−Ser−GIy−VaI−Pro−AI
a−Arg−Phe−Ser−Gly−Ser−G l
 y−Ser−G 1y−Thr−Ser−Tyr−S
er−Leu−Thr−1)e−Ser−Ser−Me
t−Glu−へ1a−Glu−八sp−八1a−Ala
−Ser−Tyr−Phe−Cys −Hi s−G 
l n−Trp−Ser−Ser−Tyr−Pro−T
yr−Thr−Phe−GIy−Gly−Gly−Th
r−Lys−Leu−Glu−1)e−Lys−へrg
−Ala−Asp−へIa−へ1a−Pro−Thr−
Val−Ser−1)e−Phe−Pro−Pro−S
er 〈H鎖ニアミノ酸配列[VI]〉 Glu−Va 1− Lys −Leu−G In −
Glu−Ser−Gly−Pro−G 1u−Leu−
Va I−Lys−Pro−G 1y−A la−Se
r−Va 1− Lys−Met−Ser−Cys−L
ys−^1a−Ser−Gly−Ser−Thr−Ph
e−Ser−^sp−Tyr−Tyr−Met−Lys
−Trp−Val−Lys−Gln−八rg−Pro−
Trp−Lys−Glu−Leu−Glu−Trp−1
)e−Gly−Asp−1)e−Ser−Pro−^s
n−八5nへGly−Asp−Thr−Phe−Tyr
−Δ5n−Gln−Lys−Phe−Lys−Gly−
Lys−A 1a−Thr−Leu−Thr−Va I
−Asp−Lys −Ser−Ser−Ser−Thr
−A Ia−Tyr−Me t−Gln−Leu−As
n−Ser−Leu −Thr−Ser−Glu−As
p−Ser−八Ia−Val−Tyr−Tyr−Cys
−Ala−Thr−Thr−Val−シal−Ala−
Asp−Phe−Asp−Tyr−Trp−Gly−G
lr+−(ily−Thr−Thr−Leu−Thr−
Val−Ser−Ser−八Ia−Lys−Thr−T
hr−Pro−Pro−Ser−Val−Tyr−Pr
o−Leu−Δ1a本アミノ酸配列配有するペプチドの
調製は、まず、PCRにより増幅し精製したそれぞれの
cDNAフラグメントの両端に、Ncolリンカ−(フ
ァルマシア社製)をT4 DNAリガーゼ(宝酒造社製
)を用いてライゲーションしNcolにより切断したも
のと、Ncolにより切断したpKK233−2ベクタ
ー(ファルマシア社製)とを更にT4 DNAリガーゼ
を用いてライゲーションした。次に、大腸菌JM105
株(ファルマシア社製)に形質転換後、クローンをLブ
ロスに接種して一晩培養し、菌を超音波破砕後、C8結
合シリカカラム(資生堂社製)を用いた逆相液体クロマ
トグラフィーにより精製した。尚、N末端付近のアミノ
酸配列を調べた結果、上記アミノ酸配列V、及び■を有
するペプチドを得たことを確認した。
上記アミノ酸配列■、及び■とLFA−1のアミノ酸配
列とのホモロジー検索の結果、 IT] L鎖: 50Tyr−Ser−Thr−Ser
−Asn−Leu−ΔIa−Ser−Gly−Val−
Pro−へla−へrg[I]L鎖: 90H4s−G
ln−’Trp−Ser−Ser−Tyr−Pro−T
yr [I1)]H鎖: 5eThr−Phe−Tyr−As
n−Gln−Lys−Phe−Lys−Gly [TV] H鎖: 99Thr−Val−Val−Al
a−Asp−Phe−Asp−Tyr を得た。これらのペプチドの作成は以下の様にして行っ
た。ペプチド[I]の作成は、まずFmoc−Arg(
Mtr)樹脂(国産化学社製)をMerrif 1el
dの固相用反応装置(国産化学社)にとり、ジメチルホ
ルムアミド(DMF) (国産化学社製)に懸濁して振
盪し、樹脂を膨潤させた。樹脂をDMF中で振盪し、 
     □更に50%ピペリジン〜D肝熔液中で振盪
後、DMF。
イソプロパツールで洗浄してFmociを除去した。
再びDMFに懸濁して振盪し樹脂を膨潤させ、Fmoc
−Ala−OH(国産化学社製)のDMF m液を加え
て振盪した。更に、1Mジシクロへキシルカルボジイミ
ド塩化メチレン溶液を添加し振盪後、DMF、イソプロ
パツールで洗浄して縮合した。このようなFmoc基の
除去、Fmoc−アミノ酸縮合を繰り返して、Tyr−
Ser−Thr−Ser−Asn−Leu−八Ia−S
er−Gly−Val−Pro−Ala−Arg樹脂を
得た。樹脂からの脱離は、塩化メチレンで洗浄後、塩化
メチレン・アニソール・ヂオフェノール(15:3:1
)混合液に懸濁し、トリフルオロ酢酸・塩化メチレン(
8,6:1)を加え振盪した。
樹脂をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮して残渣にエー
テルを加え、更にろ過して得られた粉末を、C8結合シ
リカカラム(資生堂社製)による逆相液体クロマトグラ
フィーにより精製し、アミノ酸配列[I]を有するペプ
チドを得た。
同様の方法により、以下のペプチド■、■、■を合成し
た。
(実施例2、ペプチド■によるICAM−1とLF^−
1を介した細胞接着阻害効果) ICAM−1分子を発現しているヒト請帯静脈内皮細胞
を最終濃度で10 U/dのIL−1(ゲンザイム社製
)を含む培地にて5X10’個/dの濃度に調製し、9
6穴平底プレートに1穴あたり1(10μ!(5×10
3個)ずつ、及び10μHの濃度に調製したペプチド■
あるいはコントロールペプチドを1(10μβずつ分注
して、37°Cで一晩培養した。
これとは別に10%FC3を含むRPM1)640培地
にて2XI07個/dの濃度に調製したl1l−60細
胞懸濁液に、最終濃度が10μHとなるように2”7゛
−ビス(カルボキシエチル)カルボキシフルオレセン 
テトラアセトキシメチルエステル(同位化学社製)を加
え、37°Cで1時間反応させ、3回培地にて洗浄した
後、培地にて2×106個/ mflの濃度に調製し、
細胞を標識した。−晩培養したl化−60細胞を培地に
て2回洗浄した後、標識したIIL−60細胞を1穴あ
たり1(10μn(2×105個)ずつ分注して、37
°Cで30分間インキュへ−I・した。培地にて4回洗
浄した後、細胞ペレットを1%NP−40にて可溶化し
、励起波長490nm、蛍光波長530 nmにて蛍光
リーダー(インターメッド社製)を用いて標識細胞の接
着量を測定した。その結果表Iに示す様に、本発明のペ
プチド添加時においてのみ、有意にICAM−1とLF
A−1分子を介した細胞接着が阻害された。
表−1 〈発明の効果〉 本発明のペプチドを用いれば、臓器移植時の拒絶反応の
予防、アレルギー性疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾
患の治療薬として有効な、従来の免疫抑制剤とは異なっ
た選択的作用のある、副作用の少ない免疫抑制剤として
利用できる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 (1)ヒト細胞間粘着分子−1(以下ICAM−1と称
    する)とヒトリンパ球機能関連抗原−1(以下LFA−
    1)との結合を阻害する活性を有するペプチド(2)ペ
    プチドが下記のアミノ酸配列[ I ]を有するものであ
    る請求項(1)項記載のペプチドアミノ酸配列[ I ]
    : Tyr−Ser−Thr−Ser−Asn−Leu−A
    la−Ser−Gly−Val−Pro−Ala−Ar
    g (3)ペプチドが下記のアミノ酸配列[II]を有するも
    のである請求項(1)項記載のペプチドアミノ酸配列[
    II]: His−Gln−Trp−Ser−Ser−Tyr−P
    ro−Tyr(4)ペプチドが下記のアミノ酸配列[I
    II]を有するものである請求項(1)項記載のペプチド
    アミノ酸配列[III]: Thr−Phe−Tyr−Asn−Gln−Lys−P
    he−Lys−Gly(5)ペプチドが下記のアミノ酸
    配列[IV]を有するものである請求項(1)項記載のペ
    プチドアミノ酸配列[IV]: Thr−Val−Val−Ala−Asp−Phe−A
    sp−Tyr(6)ペプチドが下記のアミノ酸配列[V
    ]を有するものである請求項(1)項記載のペプチドア
    ミノ酸配列[V]: 【遺伝子配列があります】 (7)ペプチドが下記のアミノ酸配列[VI]を有するも
    のである請求項(1)項記載のペプチドアミノ酸配列[
    VI]: 【遺伝子配列があります】 (8)アミノ酸配列[ I ]、[II]、[III]、[IV]
    、[V]または[VI]で示されるアミノ酸配列において
    、該アミノ酸配列中の1個または複数個のアミノ酸が他
    のアミノ酸で置換された構造を有する請求項(1)、(
    2)、(3)、(4)、(5)、(6)、または(7)
    記載のペプチド (9)アミノ酸配列[ I ]、[II]、[III]、[IV]
    、[V]または[VI]で示されるアミノ酸配列において
    、該アミノ酸配列のN末端、及び/またはC末端に1個
    もしくは複数個のアミノ酸が付加された構造を有する請
    求項(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)
    、または(7)記載のペプチド(10)アミノ酸配列[
    I ]、[II]、[III]、[IV]、[V]または[VI]
    で示されるアミノ酸配列において、該アミノ酸配列中の
    1個または複数個のアミノ酸がアセチル化、アミド化ま
    たはポリエチレングリコール付加させたものである請求
    項(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、
    または(7)記載のペプチド (10)請求項(1)、(2)、(3)、(4)、(5
    )、(6)、(7)、(8)、(9)、または(10)
    記載のペプチドを有効成分として含有する免疫抑制剤
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