JPH04504501A - ホーミング配列およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ホーミング配列およびそれらの使用 芸街圀国 本発明の技術分野は、標的解剖学的部位にホーミング（ｈｏｍ−ｉｎｇ）する細 胞に関連する生理学的に活性なタンパク質に関する。

■ 免疫系は、１つの解剖学的位置において統合された大部分の器官の系と異なり、 生物体全体にわたって分散している。

それは血液中の循環要素として存在し、血液を通してほとんどすべての体の組織 へのアクセスを獲得し、そして体全体を通して多数のリンパの凝集体として存在 する。したがって、免疫系は過度の細胞−細胞の認識および相互作用の事象を置 換することによって管理される特別の拘束の下に配置されている。

特定の抗原反応性リンパ球を非常に低い頻度で含有する物理的に固定されない血 液に担持される免疫系により付与される拘束は、抗原の侵入口に無関係に抗原と の適当な相互作用を保証するために追加の機構を要求する。循環するリンパ系の 動態は、−緒になってリンパ系器官を構成するリンパ系要素、例えば胸腺、リン パ節、バイアー班および肺臓の分散した固形の集合体により助けられる。

リンパ系器官を通るリンパ球の不断の滲出は、これらの器官の各々を、抗原反応 性細胞の全体のレパートリ−により防衛し；リンパ球は血液からリンパ系器官へ 再循環しそして血液へ戻り、一般に遠心リンパ管およびそれらの収集管を通る。

血流から末梢リンパ系器官の中へのリンパ球の特別の侵入口は、異常に高い壁の 内皮を有する特殊化された毛管後の細静脈、引き続いて高い内皮細静脈（ｈｉｇ ｈ　ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ　ｖｅｎｕｌｅ）（ＲＥＶ）　と表示する、と同定 された。再循環するリンパ球は、他の血液により担持される細胞を除外して、管 腔の壁を特異的に認識しそしてそれに付着し、そしてこの高度に特殊化した内皮 を通してリンパ系器官の本来の実質の中に移動する。

再循環するリンパ球の血流からの特定のリンパ系部位へのこの移動は、「ホーミ ング」と呼ばれてきており、そしてリンパ系器官のＨＥＶの認識およびそれへの 付着を仲介する細胞表面の構造は「ホーミングレセプター」と呼ばれてきている 。

したがって、リンパ球のホーミングは２つの参加体、すなわち、再循環するリン パ球および特殊化されたリンパ様器官のＲＥＶ、の各々の上の相補的付着分子の 発現により調節されるように思われる。

ホーミングの現象は、宿主の利点および欠点の両者についての、多数の系の重要 な観点である。特定の器官への特異的細胞をホーミングすることができることは 、とくに細胞を問題の特定の器官に隣接して導入することができ、その結果特殊 化された細胞がその器官に住みつく場合、病気の防御において大きい利益をもつ 。対照的に、癌、とくにリンパ腫の場合において、ホーミングレセプターは転移 を増強して、免疫系全体にわたって新生物を広げる働きをすることができる。

ホーミングは、自己免疫疾患を生じうる炎症応答の１つの観点であろう。生来の 組織への炎症の応答または攻撃を減少することができないことは、慢性関節リウ マチのような病気の場合において、１つの治療として役立つであろう。したがっ て、ホーミングに参加する分子、ホーミングが起こる機構、およびホーミングの 応答を調節する手段を特定することは非常に興味あることである。

聚１を五文献 タンパク質のインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）族の概観は、ハイネス（Ｈｙｎ ｅｓ）　（１９８７）細胞（Ｃｅｌｌ）土８　：　５４９−５４４　；およびル オソラーチ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）およびピエルシュバヘル（Ｐｉｅｒｓｃｈ− ｂａｃｈｅｒ）　（１９８７）　サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３８　：　 ４９１　４９７の中に見いだすことができる。タンパク質のＶＬＡ族の記載は、 タカダら（１９８７）プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンクズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ）ＵＳＡ、８７　： 　３２３９−３２４３　ｉヘムシー（Ｈｅｍｌｅｒ）ら（１９８７）ジャーナル ・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２６２ 　：　３３００　３３０９　；ヘムシー（Ｈｅｍｌｅｒ）ら（１９８７）ジャー ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　 ２６２　：１１４７８−１１４８５　；およびヘムシー（Ｈｅｍｌｅｒ）ら（１ ９８８）　イムノロジー・ツデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｄａｙ）　９　：　１０ ９　１１３により提供される。

アルファおよびベータのサブユニットの構造は、キシモトら（１９８７）細胞（ Ｃｅｌｌ）土８　；６８１−６９０　；アルグレイゲス（Ａｒｇｒａｖｅｓ）ら （１９８７）ジャーナル・オブ・セル・バクテリオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ、）　１０５　：１１８３　１１９０　；フィツゲラルド（Ｆｉ　ｔｚｇｅ ｒａｌｄ）　（１９８７）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２６２　：３９３６−３９３７　ｉスズキら（１ ９８６）プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン クズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　）　ＵＳＡ、　８３　：　８６１４−８６１８　 ；ポンクズ（Ｐｎｃｚ）ら（１９８７）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２６２　：　８４７６　８４８２　 ；アルナオウト（Ａｒｎａｏｕｔ）ら（１９８８）ジャーナル・オブ・セル・バ クテリオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）　１０６　：　２１５３−２１５ ８；ピテラ（Ｐｙｔｅｌａ）　（１９８Ｂ）　Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｏジャーナル（Ｊ、 ）（Ｃｏｒｂｉ）ら（１９８８）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト リー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２６３　：　１２４０３　１２４１１に記 載されている。

ＭＥＬ−１４抗体およびそれが結合するリンパ節特異的ホーミングレセプターの 説明は、ガラチン（Ｇａｌｌａｔｉｎ）　ら（１９８３）ネイチャー（Ｎａｔｕ ｒｅ）　３０４：３０　３４；セイゲルマン（Ｓｅｉｇｅｌｍａｎ）　ら（１９ ８６）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３１　：８２３−８２９；セント・ジ ョン（Ｓｔ、Ｊｏｈ口）ら（１９８６）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３１： ８４５　８５０；　ジャルクネン（ｊａｌｋｎｅｎ）ら（１９８６）ヨーロピア ン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　１６ 　：１１９５　１２０２　；およびジャルクネン（ｊａｌｋｎｅｎ）ら（１９８ ７）ジャーナル・オブ・セル−バクテリオロジ−（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、） 　１０５　：　９８３−９９０に記載されている。

また、ダイレイ（Ｄａｉｌｅｙ）　ら（１９８２）プロシーディンゲス・オブ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンクズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ）　Ｕ　Ｓ　Ａ、　７９　：　５３８を参照のこと 。これはホーミングレセプターをもたない特定の細胞に対して特異的なＣＴＬが 活性の標的の排出物の中に存在しなくてはならないことを示唆している。

見更免翌對 ホーミングレセプターのコアタンパク質に対する抗体を使用する、末梢のリンパ 系器官、例えば、リンパ節および粘膜のリンパ系器官、例えば、バイアー塩への ホーミングを調節する方法、コアタンパク質の発現のための核酸組成物、細胞を トランスフェクションしてホーミング能力を与える方法、および診断および治療 における種々の組成物の使用が提供される。とくに、粘膜のリンパ系器官へのホ ーミングに使用するインテグリン族のマウスおよびヒトのアルファおよびベータ のサブユニットおよびリンパ節のホーミングレセプターを記載する。

の　の發゛■ 哺乳動物の宿主、とくにヒトの宿主における末梢リンパ系器官、例えば、リンパ 節および粘膜のリンパ系器官および／または膜部値、例えば、バイアー塩への細 胞のホーミングを調節する方法および組成物が提供される。ＶＬＡ−４はバイア ー塩に関連する高い内皮細静脈（ＨＥＶ）へのホーミングに関連するインテグリ ン族のメンバーであるが高度にグリシコシル化されたユビクイン化（ｕｂｉｑｕ ｉｎａｔｅｄ）タンパク質はリンパ節ホーミングレセプターに関連することが今 回水された。

本発明によれば、コアタンパク質またはその生理的に活性な断片をコードする核 酸、このような核酸配列を細胞のトランスフェクションに使用して特定の部位へ のホーミングを提供するか、あるいは拮抗剤として使用するペプチドを産生ずる こと、拮抗剤として使用するタンパク質およびその断片、タンパク質に対する抗 体、および抗イデオタイプ（ａｎｔｉｄｉｏ−ｔｙｐｅ）を記載する。

種々の組成物は種々の方法で使用することができる：診断において、ホーミング レセプターまたは相補的リガンドを含有するおよび／または発現する細胞、組織 または体液の存在または不存在を定めるために；治療において、表面上のホーミ ングレセプターの数を増強することによってホーミング現象を増強し、または拮 抗剤として競争タンパク質を使用するか、あるいはと（に炎症の応答に関して、 ホーミングレセプターとその相補的リガンドとの間の複合体の形成を阻害するこ とができる抗体を使用することによってホーミングの現象を阻害すること；研究 において、ホーミングレセプターの異なるドメインへのＨＥＶタンパク質の結合 および結合に対するドメインにおける突然変異の作用を同定すること。

さらに、主題のペプチド組成物を使用して、問題の部分をようにして、問題の部 分と高い内皮細静脈または他の細胞の標的との間の関連のより大きい特異性を達 成することができる。

核酸配列は、遺伝子技術に従い主題のペプチド、またはその断片の産生に使用す ることができるか、あるいは複製する種が関与する条件下に、他の核酸配列に接 合することができ、ここで、この条件は主題のペプチドを他の調製と一緒に発現 し、こうして複製する種を標的部位に向ける。

まず、インテグリン族に関連する、粘膜のリンパ系組織および器官、例えば、バ イアー塩のホーミングレセプターが考えられ、ここでマウスおよびヒトの両者の タンパク質を記載する。マウスおよびヒトの両者のタンパク質は、免疫学的に交 差反応性であることにおいて、互いに類似し、そして２つの種においてこれらの 配列は実質的に保存されていることが理解される。しかしながら、２つの種のタ ンパク質は異なる名前を与えられ、そして共通の名称が得られるまで、異なる名 前およびそれらの類似体が考えられるであろう。

記載するマウスのタンパク質はＬＰＡＭ−１および２と呼び、ここでＬＰＡＭは リンパ球バイアー班ＨＥＶ付着分子を意味するが、ＶＬＡは非常に後期の抗原（ Ｖｅｒｙ　Ｌｓｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ）（リンパ球の）を意味する。ＬＰＡ、Ｍ −１および−２はα４゜と呼ぶ共通のアルファユニットを共有し、α。は２つの 異なるベータサブユニットに結合し、ＬＰＡＭ−１のベータサブユニットはβ２ と呼び、βいはヒトのインテグリンＶＬＡタンパク質β３．β２およびβ、の前 に報告したベータサブユニットと類似性をもたない。ＬＰＡＭ−２のベータユニ ットはインテグリンβ１と類似性をもつ。ＬＰＡＭタンパク質は、ＬＰＡＭ−１ が、それぞれ、約１６０ｋｄおよび１３０ｋｄのＭ、のαおよびβｎｏサブユニ ットのへテロダイマーであること、会合がカルシウムイオンの存在を必要とする こと、およびＬＰＡＭ−１沈澱物中に存在する８４ｋｄのＭｌおよび６２ｋｄの Ｍ、のタンパク質がアルファ鎖のタンパク質分的プロセシングのタンパク質分解 的解免疫沈澱の産生物であると思われることにおいて、さらに、特徴づけられる 。ＬＰＡＭ−１の構造はヒトのインテグリンレセブターＶＬＡ−４のそれと事実 上同一であり、ＶＬＡ−４およびＬＰＡＭ−１タンパク質のアルファユニットの 間のモノ特異性の抗血清の交差反応性が観測される。

ＬＰＡＭ−１および一２タンパク質およびそれらのサブユニットは、精製された 形態で提供され、一般に、他のタンパク質の存在に関して、少なくとも５０重量 ％、通常少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９９重量％である。

組成物は、必要に応じて、凍結乾燥された形態で、溶液で、存在することができ るか、あるいは他の成分とともに配合することができる。

アルファおよびベータのサブユニットは、大きい細胞外ドメインおよび短い細胞 質ドメインをもつトランスメンブレン塘タンパク質である。アミノ酸配列におい て、これらの細胞外のドメインは５６のシスティン残基を含有し、それらのすべ ては保存される。インテグリンのアルファサブユニットは、２価のカチオンの結 合を行うことができる１連の部位を含有し、種々のアルファサブユニットの間の アミノ酸配列の類似性を示し、そしである場合において、２つのジサルファイド の連鎖ポリペプチドから成る。ベータサブユニットのシスティンは、８システイ ンのモチーフの４つの反復を含む。多数の異なるサブユニットに結合して異なる ホーミングレセプター分子を提供する単一のベータサブユニットを包含するサブ ユニットの従来観測された組み合わせよりむしろ、今回、単一のアルファサブユ ニットは異なるベータサブユニットに結合して、オーバーラッピングするホーミ ング能力を有する、異なるホーミングレセプターを提供することができることが 発見された。こうして、個々のアルファサブユニットを異なるベータサブユニッ トと組み合わせてオーバーラッピングするが、異なる結合のプロフィルを有する ホーミングレセプターを産生ずる。

リンパ節のホーミングレセプターは、またユビクイチンのエピトープを認識する ことができる抗ＭＥＬ−１４に結合する。リンパ節のタンパク質は高度にグリコ ジル化されたタンパク質であることを特徴とし、このタンパク質は、また、実験 の節に記載するように、ユビクイチン化されており、そしてコア構造を有する。

前駆体のタンパク質は異常に長いシグナル配列を有し、これは正常の疎水性領域 を有し、この領域に引き続いて親水性ドメインが存在する。グリコジル化タンパ ク質の分子量は約９０ｋＤであるが、ユビクイチン不合コアタンパク質は約３５ 〜４０ｋＤである。成熟タンパク質は約４〜４．５のｐＩを有する〔参照、シー ゲルマン（Ｓｉｅｇｅｌｍａｎ）およびワイズマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ）　、ユ ビクイチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、マーチン・レチステイナ−（Ｍａｒｔｉｎ 　Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ）　、プレナラ・パブリッシング・コーポレーション （Ｐｌｅｎｕｍ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｒｐ、）！、１９８８、第９章、ｐ ｐ、２３９−６９）。

ネズミおよびヒトのリンパ節のホーミングレセプターは、実験の節に記載するよ うに、核酸のコード配列およびフランキング配列並びに関係するアミノ酸配列を 有する。

実験の節に記載するネズミｃＤＮＡクローンは、５４ｂｐの５′非翻訳領域およ び引き続いて開始ＡＴＧコドンを有し、このコドンは１．１１６ｂｐの中断され ないオープンリーディングフレームを開始する。リーディングフレームは長さ３ ８アミノ酸の疎水性リーダー配列をもつタンパク質をコードし、その後成熟のタ ンパク質の最初のトリプトコア残基に到達する。リーダー配列はシグナル配列に ついて異常の長さを有する。

成熟タンパク質は、エンドグリコシダーゼＦ消化において広範なグリコジル化を 示すタンパク質の特性決定の研究と一致する、１０の潜在的アスパラギン連鎖グ リコジル化部位を有する。これらは同一の反復ユニットの構造内に含有される。

成熟タンパク質は２２システイン残基を含有し、ここでシスティンのうちで１２ は相補的調節反復構造の中に存在し、そして追加の９システインはＥＦＧ様ドメ インを包含する反復ユニットのちょうど前の６０アミノ酸の中に集中している。

これは１８０〜１９０アミノ酸の高度にシスティンに冨んだ前トランスメンブレ ン領域をもたらす。

推定された成熟タンパク質は３３４アミノ酸の長さであり、３７．６００の計算 された分子量を有する。約２９５〜３１７のアミノ酸を包含する疎水性トランス メンブレン領域が存在し、次いで正に帯電した残基の１群および１８アミノ酸の 親水性細胞質のテイルが存在する。ヒトロバシーのプロットは、さらに、アミノ 末端の１５０アミノ酸および膜に近接するほぼ２０アミノ酸の中に集中した、相 対的親水性の明確な領域を示す。介在する細胞質外のタンパク質は比較的電気的 に中性の伸長から構成されており、これは反復単位により特性決定され、ヌクレ オチドならびにタンパク質のレベルにおいて同一である。

レセプターの細胞質外部分は、３つの別々の細胞質外ドメインから作られており 、これらのドメインは３つの本質的に異なるタンパク質のモチーフにより定めら れる。１つは動物のレクチンの炭水化物結合ドメイン（位置７４−１１８）に対 する相同性を示す；連続する３７アミノ酸（位置１１９−１５５）はレクチンの ドメインと相補的反復単位との間の領域を占有し、そして表皮生長因子（ＥＧＦ ）のシスティンに特表千４−５０４５０１　（５） 冨んだ反復単位に対する類似性を示す；第３領域は補体調節および他のタンパク 質に存在する相同性の反復のコンセンサス配列に一致する２つの同一の反復単位 から構成されている（位置１５６−２１７）。

個々のドメインは、別々のかつ異なる実在物として、それらのそれぞれの目的の ために働くことができる。例えば、レクチンのドメインは相補的糖への結合のた めに、あるいは特定のドメインをもつ糖を同定するために使用することができる 。ＥＧＦドメインは、レセプターへの結合について天然ＥＧＦと競争し、ＥＧＦ レセプターへ結合するために使用することができる。補体調節反復単位は、補体 のカスケードのメンバーと組み合わせて、補体の形成および溶解を調唯すること によって、補体の調節において使用することができる。

ＥＦＧ様ドメインはＥＧＦ反復単位に特徴的なｃｙｓ−ｇｌｙ残基多数を保存し 、６つのコンセンサスが存在し、ならびにグリシンは１４７および１５０に、チ ロシンが１４８に存在する。これらの保存された残基の関係は、ヒトおよびウシ の血液凝固因子ＩＸおよびＸ、並びにドロソフィラ・ノツチ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ ｌａ　Ｎｏｔｃｈ）遺伝子産生物のそれと同一であり、そしてＥＦＧ様ドメイン を含有する他の分子に類似する。これらの領域は、神経および表皮の前駆体への 外胚葉の胚分化に必須の細胞−細胞の相互作用の機構に関係すると信じられる。

ＥＦＧ様ドメインは、さらに、ヒトにおけるインテグリンＬＡＭ−１β２−鎖の β−鎖のシスティンに冨んだ反復単位の１つの部分との相同性を共有する。

二重反復単位は、６２アミノ酸の長さを有し、そして位置１．５６−２１７およ び２１８〜２７９にまたがる。この配列に対して有意の相同性を示す既知のタン パク質は、ネズミの補体因子Ｈ１すなわち、補体調節活性をもつ血清タンパク質 である。同一の相同的反復のモチーフは、Ｃ３／Ｃ４と結合する多数の補体調節 タンパク質、および他のタンパク質、例えば１１−２レセプター、β２−糖タン パク質の血清タンパク質、および因子ＸＩＩＩの中に存在する。

リンパ節ホーミングレセプターは、種々の哺乳動物の種の間に実質的に保存され るであろう。こうして、レセプターはシグナル配列、レクチン様ドメイン、およ びＥＦＧ様ドメイン、並びに反復が補体調節タンパク質と相同性を有する、反復 配列を有するであろう。これらの種々のドメインは、個々の活性を提供する働き をすることができ、それらの特定の機能に関してアゴニストまたはアンタゴニス トである。配列はＨＥＶへのホーミングレセプターの結合を阻害するために使用 することができる。

配列を修飾することができ、ここで約８アミノ酸の配列を使用することができ、 この配列は種々のドメインの配列の１つ内に入る。配列は、アミノ酸の２０％ま で、通常約１０％以下を変異させることができ、ここで欠失および挿入は約１〜 １０、通常約１〜５アミノ酸を含むこができる。

種々のドメインに相当するＤＮＡ配列は、同様なドメインを有し、ホーミングレ セプターのドメインと機能の相同性を共有する他のタンパク質を発見するための プローブとして使用することができる。

使用する特定のタンパク質に依存して、ホーミングのための異なる部位を達成す ることができる。前述のＬＰＡＭまたはＶＬＡの場合において、ホーミングは主 として粘膜の組織に対してであり、この組織はバイアー塩、垂、扁桃、アデノイ ド、気管支粘膜、腸間膜のリンパ節などを包含する。末梢のリンパ系器官のホー ミングレセプターについて、すべての末梢リンパ節、および潜在的に肺臓は主な 標的であろう。

主題のタンパク質、該タンパク質をコードする核酸配列、あるいは化学的、生物 学的または生理学的に活性なまたは有用なその断片は種々の応用を見いだす。タ ンパク質またはその断片を使用して、主題のタンパク質の１または２以上のエピ トープに対して特異的な抗血清またはモノクローナル抗体を産生ずることができ る。引き続いて、抗体を使用して、抗イデイオタイプ抗体を産生ずることができ 、これらの抗体は相補的リガンドへの結合についてホーミングレセプターと直接 競争することができる。これらの抗体は、ホーミングレセプターとその相補的リ ガンドとの間の複合体の形成を阻害するための用途を見いだす。こうして、抗体 を使用して、粘膜の部位またはリンパ節への細胞のホーミングを防止することが できる。ホーミングの阻害は、炎症性の腸の病気、例えば、局所的回腸炎、潰瘍 性大腸炎、重いリンパ節炎、リンパ節のヒストサイト−シス疾患または他の炎症 性の状態の処置において使用することができる。抗体を使用して転移を阻害する ことができ、ここで新生物の状態は粘膜の部位またはリンパ節への輸送に関連す る。

相補的リガンドへ結合することができるタンパク質またはその断片はまた、複合 体の形成のアンタゴニストとして使用することができる。こうして、ホーミング レセプタータンパク質またはその断片を投与することによって、該タンパク質は 相補的リガンドにホーミングし、そして標的細胞に関連するホーミングレセプタ ーの結合を阻害する働きをすることができる。

リンパ球とＲＥＶとの間の複合体の形成を防止するための阻害因子として作用す るよりむしろ、タンパク質、その断片、または抗イデイオタイプ抗体は、広範な 種類の分子をホーミング部位へ向ける働きをすることができる。こうして、新生 物組織の場合において、療法剤に結合した１つの主題の化合物または組成物を投 与することによって、所望の部位における保持および濃縮のために、治療薬物を 所望の部位への結合のために向けることができる。生体内診断または像影、放射 線治療などのために、放射性同位元素を結合することができる。あるいは、細胞 障害性薬物を、リポソームのルーメンにおいて結合することができ、ここで主題 のタンパク質は細胞障害性薬物をホーミング部位へ向ける。

本発明のタンパク質をコードする核酸配列は、通常少な（とも１２ｎｔ、より通 常少なくとも１６ｎｔであり、そして５０ｎｔまたはそれ以上であることができ 、同一のまたは異なる種からの実質的に異なる標的プロフィルを有する、ホーミ ングレセプターのタンパク質のメンバーと異なる配列を提供する。ＤＮＡ配列は 哺乳動物の染色体以外のものとして、一般に５０　ｋ　ｎ、　ｔより小さいもの として、とくに操作、例えば、クローニングおよび構成の間に存在するであろう 。細胞の中に導入される場合、配列は染色体の中に組み込むことができるが、ゲ ノム中のその天然の部位以外の部位に存在することができる。配列は、構造遺伝 子のすべてまたは一部分を含んでなるゲノムの配列、あるいはコード配列のすべ てまたは一部分を含んでなるｃＤＮＡであることができる。

配列は、遺伝子の配列と同一であるか、あるいは異なり、トランジション、トラ ンスバージョン、欠失または挿入を包含することができる。類似の機能を有する タンパク質をコードする配列を検出するとき使用するために、関係する配列は３ ０％程度の少ない相同性、通常少なくとも４０％の相同性を有することができる 。変異または密接に関係するタンパク質について、少なくとも約９５％の野生型 配列との同一性、とくに保存的置換が存在するであろうが、アミノ酸の５％より 少ない、通常合計１０以下のアミノ酸、好ましくは約５以下のアミノ酸の変化を 生ずる置換が存在することができる。

核酸配列は検出可能なシグナルを提供することができる標識で、直接または間接 に、例えば、放射性同位元素、ビオチン、蛍光体などで標識することによって修 節することができる。

主題のタンパク質またはその断片をコードする核酸配列は、ペプチドの発現に使 用することができる。こうして、問題のペプチドを発現するベクターを調製する ことができ、次いでこれを前述したように使用するために回収することができる 。

多数の発現ベクターは商業的に入手可能であるか、あるいは種々の原核生物また は真核生物の宿主中の発現について文献に記載されてきている。問題の宿主は、 次のものを包含する：大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　、枯草蘭（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉ ｓ）　、酵母菌、例えば、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ）、ク ルイベロミセス（■亙胆皿町ｇ旦、糸状状菌類、例えば、アカパンカビ属（ヒ肛 匹り胆）、哺乳動物の細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯ３゜ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、 永久増殖能を与えられたＴ細胞またはＢ細胞、例えば、ＥＢＶで永久増殖能を与 えられたＢ細胞など。複製糸は、Ｃｏ１Ｅ１．サルウィルス４０、バクロウィル ス、ラムダ、２ｍμプラスミド、ウシ乳頭腫ウィルスなどを包含する。多数の転 写開始および停止調節領域は、分離され、そして種々の宿主中の異種タンパク質 の転写および翻訳において有効であることが示された。文献にはこれらの例、そ れらを分離する方法、およびそれらの操作方法が十分に記載されており、そして このような開示をここで反復しない。

クローニングまたは発現のための１または２以上の複製系、細胞宿主における選 択のための１または２以上のマーカー、例えば、抗生物質耐性、および主題のタ ンパク質の発現のための１または２以上の発現カセットを通常包含するベクター を調製することができる。望ましくは、標的部位へのホーミングのために使用す べき細胞中で主題のタンパク質を発現するとき、野生型転写開始領域以外の領域 を使用し、ここで開始は構成的または誘導可能であることができるが、野生型調 節を受けない。

コード配列を合成し、天然源から分離し、ハイブリッドなどとして調製すること ができる。コード配列を転写調節配列へ結合することは、制限酵素の反応、リガ ーゼの反応、アダプターまたはポリリンカーなどの使用により達成することがで きる。発現ベクターを調製し、ベクターを適当な宿主の中に導入し、宿主を増殖 させ、これにより主題のタンパク質を発現し、次いで主題のタンパク質を分離す る特定の方法は、本発明にとって臨界的ではなく、任意の便利な技術またはプロ トコールを使用することができる。

タンパク質を産生ずるために主題のコード配列を含んでなる発現カセットを導入 するほかに、多数の場合において、細胞を形質転換して、ホーミングするそれら の能力を増強するか、あるいは細胞にホーミング能力を付与することができる。

すなわち、通常同系または異型の幹細胞を形質転換し、そして幹細胞を培養して 、特定の系統またはサブセットの幹細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞、腫瘍 浸透リンパ球、細胞障害性Ｔリンパ球、Ｂ細胞などを産生ずることは興味深い。

次いで、これらの細胞を特定の１または２以上の部位にホーミングさせることが でき、ここでこれらの細胞は所望の機能を提供する。あるいは、前駆体の細胞、 例えば、ＣＤ４−　。

ＣＤ８−　、または成熟細胞、例えば、ＣＤ４”またはＣＤ８”を分離し、そし てそれらを類似の方法で形質転換することができる。次いで、細胞を適当な治療 のために宿主に戻すことができる。

宿主の選択に依存して、コアタンパク質（非ユビクイチン化）またはユビクイチ ン化タンパク質を得ることができる。

コアタンパク質をユビクイチン化するプロセシング能力をもたない微生物の宿主 または他の真核生物の宿主に依存して、コアタンパク質はプロセシングされない 生成物を生ずるであろう。対照的に、適当な宿主を使用することによって、ユビ クイチン化生成物が得られるであろう。

リンパ節のホーミングレセプターのシグナル配列を、使用して、広範な種類のタ ンパク質を細胞内トラフィッキング（ｔｒｆｆｉｃｋｉｎｇ）の特定の通路に沿 って輸送して、種々の細胞内の室の中にあるいは栄養培地の中に配置するための 特別の翻訳後修飾をもたらすことができる。こうして、主題のシグナル配列、あ る種のタンパク質を使用する好ましい応用を見いだすことができる、追加のシグ ナル配列を提供する。

α、１またはす、タンパク質を使用して、ゲノム遺伝子またはｃ　ＤＮＡとして 、α４ｍまたはｂ２タンパク質をコードする遺伝子を得ることができる。すべて の可能な変形の調製にコドンの冗長性を使用して、少なくとも６アミノ酸、好ま しくは少なくとも８アミノ酸のα４．またはｂ２タンパク質のアミノ酸配列に基 づくプローブを調製する二七によって、ｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡからなる ライブラリー中の配列を同定することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、普通 の方法に従い、ホーミングバイアー班ＲＥＶ結合性リンパ腫、例えば、ＴＫ＋か らの細胞質ＲＮＡ調製し、次いでバイアー班にホーミングしないＴ細胞のリンパ 腫でサブトラクション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）にすることができる。次いで 、サブトラクションしたライブラリーを上に示したプローブでブロービングする ことができる。次いで、陽性のクローンを配列決定して、正しいアミノ酸配列を コードする核酸配列の生成物を同定することができる。必要に応じて、完全な構 造遺伝子が得られない場合、端が欠けた配列をプローブとして使用して、完全な 配列を有するクローンを同定するか、あるいは、必要に応じて、端が欠けた配列 をもとの分離源からのｍＲＮＡの逆転写のためのプライマーとして使用すること ができる。いったん完全な配列が同定された場合、配列は前述したように種々の 方法で使用することができる。実質的に、リンパ節のホーミングレセプターｇ　 ｐ　９　Ｑ　ＭＩＬＬ−１４のための遺伝子の同定について記載するのと同一の 手順を、ＬＰＡＭサブユニットα４゜またはｂｐのために使用することができる 。

ＤＮＡを使用して、宿主細胞中の相補的配列に特異的に結合する接合体を形成す ることができる。このようにして、ホーミングレセプタータンパク質のためのｍ ＲＮＡを含んでなる細胞を同定することができる。さらに、このような配列を治 療剤として使用して、核酸配列を切断することができる因子、例えば、リポザイ ム、金属キレートなどにこのような配列を結合することによって、ホーミングレ セプターを発現する細胞中のホーミングレセプターの発現を破壊することができ る。

主題のタンパク質を使用して、エンベロープタンパク質をコードするウィルス中 の遺伝子の代わりに主題のタンパク質の遺伝情報を指定する配列を導入すること によって、ワクチンを調製することもできる。次いで、ウィルスが大きいリンパ 球集団を有する部位へ輸送され、ここでウィルスはエンドサイト−シスされて、 強い免疫応答が生ずる。

主題のタンパク質またはその断片は、標的部位へ特定の組成物へ向けるために、 種々の化合物、凝集物、細胞などへの接合体として使用することができる。ホー ミングレセプターのエピトープ結合部位を放射線標識して、診断または治療のた めの放射性同位元素をバイアー班の高い内皮細静脈または他の粘膜部位またはリ ンパ節−・特異的に向けることができる。

このようにして、放射線標識を、新生物の診断、異常細胞の処理などのために、 問題の部位に濃縮することができる。主題のエピトープ部位を使用して、細胞障 害性化合物例えば、天然の毒素、抗生物質、酵素阻害因子などを特異的部位に同 けることができる。主題の化合物は、リポソームを特定の部位へ向けるために、 普通の方法によりリポソームへ結合することができる。リポソームのルーメンは 問題の薬物または他の化合物を診断または治療のための部位へ運ぶ働きをするこ とができる。脂質へのタンパク質の結合は文献において広範に例示されている。

主題のタンパク質を使用して、特定の抗体を産生ずる抗体または細胞の特異的サ ブタイプを標的に向けて、標的部位において保護的抗体を産生ずることができる 。こうして、ＩｇＧ、ＩｇＡ、、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはｒｇＤを特定の用途に使 用することができる。さらに、抗体の可変領域をクローニングし、そして特定の エピトープへの結合において有効であることが示された。標的部位にホーミング することができるペプチドのＤ　、Ｎ　Ａ配列を、可変領域、または必要に応じ て、抗体の重鎮または軽鎖をコードする遺伝子と結合することによって、標的部 位に所望の結合能力を与える融合タンパク質生成物を産生ずることができる。

主題の核酸遺伝子配列を、使用して細胞を形質転換して、細胞を特定の標的部位 に向けることもできる。ＤＮＡ構成体は生体外で標的細胞の中に導入して、細胞 にホーミング能力を与えることができる。こうして、細胞、例えば、リンパ球を 、細胞中で機能的な転写および翻訳開始領域、１つまたは他のホーミングレセプ ターをコードする遺伝子またはホーミングレセプターのサブユニットの遺伝子、 および機能的翻訳および転写停止領域を含んでなる発現カセットで形質転換する ことができる。天然の調節を受けない開始領域を使用することによって、活性化 されたリンパ球は表面上のホーミングレセプターを有し、そして標的部位へ向け られるであろう。

種々の治療剤の投与において、はとんどの場合、実験的決定は治療剤のレベルに 含まれるであろう。投与されるタンパク質のレベルは、実質的な程度に、タンパ ク質の安定性、その大きさ、投与の方法、治療の目的などに依存する。したがっ て、特定の治療に適用されるべきレベルを示す簡単な範囲を与えることはできな い。多くの場合、タンパク質は適当な生理学的に許容されうる媒質、例えば、水 、生理的塩類溶液、リン酸塩緩衝液など中に溶解して投与される。投与は通常非 経口的であり、とくに静脈内である。前述の理由で、治療の道筋はまた変化する であろう。細胞の治療学的使用のために、細胞の数も、また、上に示したように 変化するであろう。

主題の組成物はタンパク質または核酸についての診断アッセイにおいて使用する ことができる。こうして、タンパク質は、標準として使用し、試薬として標識に 接合するなどの方法において、細胞上の主題のタンパク質の存在を決定すること ができる。次いで、細胞をそれらの標的に従い、ＦＡＣ３を使用して分離するこ とができ、特定の標的について細胞の数を個体の健康の指標などとして決定する ことができる。核酸をプローブとして使用して、主題のペプチドをコードする遺 伝子の転写を、細胞の状態、例えば、活性化または活性化されていない状態、イ ングランド性質などの指標として検出することができる。普通のアッセイ技術を 使用して、種々の事象を決定することができる。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定 しない。

叉猜 材料および方法 細胞系 これらの研究のために利用した主要なインデックスの細胞系は、ＥＬ−４／ＭＥ Ｌ−１４”、連続的Ｔ細胞リンパ腫細胞系、ＥＬ−４であり、ＭＥＬ−１４抗原 の高いレベルの発現、末梢節線静脈に結合する能力とともに同時に分離する性質 、についての蛍光フローサイトメトリーにより選択した。

ｇｐ９　Ｑ１４−Ｌ−１４の発現に関してＥｌ−４の追加の変異型もまた、蛍光 フローサイトメトリーにより選択し、これらの研究においてまた使用した。

推定上のリンパ球ホーミングレセプターｇｐ９　ＱＭ＠Ｌ−１４の免疫沈澱およ び５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 ＭＥＬ−４４抗体による試料表面の１２Ｊヨウ素化ＥＬ−４／ＭＥＬ−１４１′ ｉの免疫沈澱は次のようにして実施した。

２Ｘ１０’細胞をラクトペルオキシダーゼを使用して表面放射線ヨウ素化して、 次いでウィッチ（Ｗｉｔｔｅ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンクズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　 Ｕ　Ｓ　Ａ、　７５　：　２５８８　（１９８７）の方法に従い、１％のトリト ンＸ−１００，０，５％のデオキシコレート、０．１％のＳＤＳ、０．１モルの ＮａＣ１，０，０１モルのリン酸ナトリウム、ｐＨ７，５、および５ミリモルの ＰＭＳＦを含有する２ｊ！ｉ！０ＰＢＳ中で可溶化し、そして限外濾過（３０， ００Ｏｒｐｍにおいて３０分間）により清浄にした。リゼイトを１０〜２０ｕｇ のモノクローナル抗体に等しい２０Ｘ濃縮ＭＥＬ−１４ハイブリドーマの上澄み 液〔ガラチン（Ｇａｌｌａｔ−ｉｎ）　ら、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　３０ ４　：　３０−３４　（１９８３））とともに、４℃において３〜４時間インキ ュベーションし、次いで速い段階より４倍過剰のアフィニティー精製したヤギ抗 ラットＩｇＧを添加し、そして４°Ｃにおいてインキュベーションして固体の沈 澱を形成した。沈澱を３．００Ｏｒｐｍにおいて遠心し、そして０．０１１−リ ス−ＭＣＩ、ｐＨ７，４，０，１５モルのＮａＣｌ、０．２％のノニデット（Ｎ ｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ　４０中で３回洗浄した。残りの複合体をレムリ（Ｌａｅｍ ｍｌｉ）試料緩衝液中で９０°Ｃにおいて３分間加熱することによって可溶化し 、そして、クレン（Ｃｕｌｌｅｎ）　ら、ツランスプラント・リビュー（Ｔｒａ ｎｓｐｌａｎｔ　Ｒｅｖ、）　３０　：　２３６　（１９７６）により変更され たように、レムリの不連続ゲル系中の１０％のＳＤＳポリアクリルアミド管のゲ ルで分析した。１ｍｍの間隔でゲル濾過によりプロフィルを得、次いで計数した 。

３Ｈ−ロイシンで代謝的に標識したＥＬ４／ＭＥＬ−１４１″細胞のＭＥＬ−１ ４抗体による免疫沈澱を次のようにして実施した。２Ｘ１０１′細胞を１０ｍＣ ｉの３Ｈ−ロイシンで標識した。簡単に述べると、細胞を急速生長期において収 穫し、そして２００ｍＣ１／ｍｌでアイソトープとしてのみ添加したロイシンを 除外してすべてのアミノ酸を補充した、スピンナー（Ｓｐｉｎｎｅｒ）バランス ド生理的塩類溶液〔ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　）、１０％の胎児仔ウシ血清中の培 養物の中に１０’細胞／ｍｌで４〜６時間配置した。細胞を洗浄し、そして０． ５％のノニデントＰ４０，２０ミリモルのＰＭＳＦ中で４°Ｃにおいて１時間可 溶化した。核および破片を遠心により１５分間３．００Ｏｒｐｍで除去した。リ ゼイトを、０．０１モルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，０，１５モルのＮａＣ １，０，２５％のノ二デットＰ４０中で平衡化したセファローズ（Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅ）　４　Ｂに接合したレンズ・クリナリス（Ｌｅｎｓ　ｃｕｌｉｎａｒｉ ｓ）　レクチンのカラムに適用した。糖タンパク質が濃縮したプールを０．３モ ルのメチルＤ−マンノピラノシドで溶離した。５Ｘ１０６細胞相等の沈澱および ５ＤＳ−ＰＡＧＥの分析は、前節に記載されているようなものであった。ゲルの 分画を０．１％のＳＤＳ中で４°Ｃにおいて一夜インキユベーションして、放射 性物質を溶離した。放射能をバイオフロア−（Ｂｉｏｆ　１ｕｏｒ）シンチレー ション流体〔二ニー・イングランド・ニュークリアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）　）中のベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　Ｌ　Ｓカウンター（ ＬＳ−２３０型）により計数した。分子量マーカー：ホスホリラーゼｂ　、　９ ７，０００　；ウシ血清アルブミン、６８，０００　、オバルブミン、４３．０ ００゜ ｇ　ｐ　ｑ　Ｑ　Ｍ　＃　ｔ　−１４の二次元ポリアクリルアミドゲルの分析３ 、　ＯＯＯｃｐｍの３Ｈ−フェニルアラニンで標識したｇｐ９ＱＭＩし１４を蒸 留水に対して一夜透析し、凍結乾燥し、そして２０μｍの等電点電気泳動試料緩 衝液中で可溶化した。〔オウ゛ファレル（０’　Ｆａｒｒｅｌｌ）、細胞（Ｃｅ ｌｌ）、１２　：　１１３３（１９７７）〕。

第１次元の電荷の分離は非平衡のｐＨ勾配電気泳動（ＮＥＰＩ（ＧＥ）を使用し て達成し、この電気泳動は３．５〜１０の広いｐＨ範囲にわたるタンパク質の評 価を可能とする。第１次元のＮＥＰＨＧＥゲルをＳＤＳ試料緩衝液中で平衡化し 、そして第２次元は１０％のポリアクリルアミドＳＤＳスラブゲルの上部に埋め 込み、そして〔オウ”ファレル（０’　Ｆａｒｒｅｌｌ）、ジ中−ナル・オブ・ バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂ　ｉｏ　１　、　Ｃｈｅｍ、　）、２ ５０：４００７　（１９７５）　）に記載されているように展開した。スラブゲ ルを４０％のメタノール、１０％のアミノ酸中で固定し、そしてクーマツシーブ ルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）で染色し、フルオログラフの媒質のエン ハンス（Ｅｎｈａｎｃｅ）　にニー・イングランド・−ニークリアー（Ｎｅｗ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）］で処理し、乾燥し、そしてコダックＸＡＲ −５フィルムにオートラジオグラフィーのために１４時間露出した。

３Ｈ−アミノ酸生来的に標識したｇｐ９　ＱＭ＠Ｌ−１４のアミノ酸の自動化エ ドマン分解法 自動化配列分析は、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌ−ｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ）　４７０　Ａ型気体−液体相タンパク質配列決定装置（チアゾ リノン誘導体の転化のためにフラスコをバイパスするように変更された）で実施 した。各工程において２−アニリノチアゾリノン誘導体を含有する塩化ブチル抽 出液全体を、トルエン／ＰＰＯ中のシンチレーション計数のために、直接バイア ルの中に移した。各試料を二重反復試験において１０分間へツクマン（Ｂｅｃｋ ｍａｎ）　Ｌ　Ｓカウンター（ＬＳ−７５００型）で計数した。バンクグラウン ドより上の放射能を含有する位置は、その位置における特定の３Ｈ−アミノ酸の 存在を示す。

臭化シアンの分析 自動化アミノ末端配列の配列決定は前述したように実施した。ＣＮＢ　ｒの消化 は、基本的には記載されているように実施した。簡単に述べると、試料を含有す るガラス線維のフィルターを配列決定装置から取り出し、トリフルオロ酢酸無水 特表千４−５０４５０１　（９） 物でアシル化して遊離アミノ基をブロッキングし、そして閉じた容器内で２５μ ｍのＣＮＢ　ｒ溶液（６０％のトリフルオロ酢酸中の１００ｍｇ／ｍｌ）で室温 において２０時間湿潤することによって消化した。次いで、フィルターを気相配 列決定装置に配列決定分析を再開するために戻す。

細胞表面＋２５１ヨウ素化ｇｐ９０＋″＠Ｌ−＋４免疫沈澱のエンドグリコシダ ーゼＦ消化および５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析２Ｘ１０’のＥＬ４／ＭＥＬ−１４”細 胞を、２ｍＣｔの１２５１でラクトペルオキシダーゼ触媒の表面放射線ヨウ素化 を経て標識し、そして記載したように可溶化しそして清浄にした。リゼイトの１ ｍｌのアリコートを撹拌しながら一夜４°ＣにおいてＭＥＬ−１４抗体に接合し たセファローズ（Ｓｅｐｈａ−ｒｏｓｅ）　４Ｂ　（２ｍｇの抗タンパク質／ｍ ｌのゲル床；５０ｕｌの接合したビーズ／沈澱）とともに、あるいはＲ７Ｄ４　 。

３８１Ｃ１３細胞上の免疫グロブリンのイディオタイプを認識するアイソタイプ 合致ラットモノクローナル抗体の陰性対照、に接合したセファローズ（Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ）　４　Ｂ　（Ｒ，レビイ（ｌｅｖｙ）　、スタッフォード大学）と ともにインキュベーションした。溶菌緩衝液で４回洗浄した後、試料を１％のＳ ＤＳ、１％の２−メルカプトエタノールおよび１％のＮＰ４０を含有する緩衝液 で、９０°Ｃに３分間加熱することによって溶離した。エンドグリコシダーゼＦ （エンドＦ）消化をエルグ−（Ｅｌｄｅｒ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ。

７９　：　４　ｓ　５４０　（１９８１）に従い実施した。簡単に述べると、溶 離液を３つの等しい体積に分割し、そして反応緩衝液中でＱ、　２モルのリン酸 ナトリウム、ｐ）Ｉａｌ、０．０５モルのＥＤＴＡ、１％のＮＰ４０、および１ ％の２−メルカプトエタノールの最終濃度に希釈した。次いで、試料を１〜２２ 時間３７°Ｃにおいて、５μｍの精製したプロテアーゼ不含エンドグリコシダー ゼＦを添加するか、あるいは添加しないで、インキュベーションした。反応をＳ ＤＳを１％の濃度に添加して停止し、そして試料をレムリ＜Ｌａｅｍｍｌｉ＞の 方法により９％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析した。ゲルを乾燥し、 そしてコダックのＸＡＲ−５のフィルム上で７日間フルオログラフィーにかけた 。

細胞表面１２５−ヨウ素化ＥＬ４−ＭＥＬ−１４’・のモノクローナル抗ユビク イチン抗体を使用する免疫沈澱および５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 ｌＸｌ０’のＥＬ４／ＭＥＬ−１４”細胞を、４ｍＣ１の＋ｚｓ（でラクトペル オキシダーゼ触媒の放射線ヨウ素化を経て標識した。細胞の生存能力を９９％に おいて評価した。細胞を１×１０７細胞／ｍｌ緩衝液で溶菌し、前述したように 清浄化したが、ただし超遠心の前に、リゼイトを、免疫沈澱の前に、０．５　ｍ 　ｌのパンクボリウムの黄色ブドウ球菌（鉦肛−ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ ｅｕｓ）　（ＩｇＧｓｏｒｂ、ザ°エンザイム゛センター。

インコーポレーティド（Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｉｎｃ、）およ び０、５　ｍ　ｌのセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂとともに５　 ’Ｃにおいて４時間インキュベーションした。ＣＮＢｒ活性化セファローズ（Ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂ　Ｃファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　］をア フィニテー精製したヤギー抗マウスＩｇＧ［ベルブリーズ（Ｐｅｌｇｒｅｅｚｅ ）、２ｍｇの抗原／ｍｇのゲル床〕に接合し、次いでこの接合した物質を沈澱の ために使用すべき限外濾過濃縮した（５×）マウスハイブリドーマの調製物（５ −の上澄み液当量／２５μｌのセファローズ）とともに４°Ｃにおいて４時間イ ンキュベージジンした。よく洗浄した後、抗体コーティングしたセファローズ（ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を氷水浴中で標識した細胞リゼイト（２５μｌのセファロ ーズ／戚のリゼイト）とともに−夜インキユベーションした。試料を溶菌緩衝液 中で４回洗浄し、レムリ（Ｌａｅｎ＋ｍ１ｉ）試料緩衝液中で溶離し、そして還 元性条件下に９％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に かけた。

オリゴヌクレオチドの合成 単一トリチウム化アミノ酸代謝標識により決定した、成熟タンパク質のアミノ末 端の５アミノ酸に相当する３２倍の縮重した１５塩基のオリゴヌクレオチドを、 記載されているように、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ）ヌクレオチド合成装置で合成した〔ヘライック（ｔ（ｅｗｉ ｃｋ）　ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ 。

Ｃｈｅｍ、）、２５６　：　７９９０（１９８１））、合成は、各々次の配列に 相当する、８倍の縮重した４つのプールにおいて実施した：１）５’　ＴＧＧ　 ＡＣ（Ｔ／Ｃ）ＴＡ　（Ｔ／Ｃ）ＣＡ　（Ｔ／Ｃ）ＴＡＴ３’　；　２）５’　 ＴＧＧ　ＡＣ（ＴｉＣ）ＴＡ　（ＴｉＣ）ＣＡ　（ＴｉＣ）ＴＡＣ３’　１３） ５’　ＴＧＧ　ＡＣ（ＴｉＣ）ＴＡ　（ＴｉＣ）ＣＡ　（ＴｉＣ）ＴＡＴ３’　 ；　４）５’　ＴＧＧ　ＡＣ（ＴｉＣ）ＴＡ　（ＴｉＣ）ＣＡ　（ＴｉＣ）ＴＡ Ｃ３’。これらのプローブはＲＮＡコード（センス）ｖＡに相当するように表示 した。さらに、反対（アンチセンス）鎖に相当する同様なプローブも合成した。

ＲＮＡの単離 全ＲＮＡをグアニジン−チオシアネートＲＮＡ抽出手順により調製した。簡単に 述べると、細胞または組織をポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジナイザーで ８〜１６体積の５モルのグアニジン−チオシアネート中で均質化した。ホモジネ ートを１０分間１０．　ＯＯＯｒｐｍで遠心して、不溶性物質を除去した。上澄 み液を新しい管に取り出し、そして０．５体積の５．７モルのＣｓＣ１，１００ ミリモルのＥ　Ｄ　ＴＡ、　ｐＨ７，５を添加した。

次いで、Ｎ−ラウリルサルコシン［シグマ（Ｓｉｇｍａ）　］を４４％ｗ／　ｖ に添加した。次いで、この溶液を、ＳＷポリアロマド管内の５ｍｌの５．７モル のＣｓＣ１，１００ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ７，５のクッション上に注意して 重層した、３０〜４０ｍ１のホモジネート／管。次いで、遠心を２０および２４ 、０００ｒｐｍにおいて２０時間ＳＷ２５０−ター中で実施した。

生ずるペレットをＮＥＴＳ緩衝液（０，１モルのＮａＣ１、−ｏ、ｏｏｉモルの ＥＤＴＡ、０．０１モルのトリス−ＨＣｌ、ｐ’Ｈ７，５，０，２％の５ＤＳ） の中に再懸濁し、この溶液を等しい体積のフェノールで抽出し、次いでクロロホ ルムで２回抽出した。

あるいは、全細胞質ＲＮＡを前に記載したように調製した。

次に簡単に述べる。細胞または組織のホモジネートを１５０゜ｒｐｍおよび４° Ｃにおいて１０分間遠心し、そして２０ｍ１の水冷等張の高いｐＨの緩衝液（Ｉ ＨＢ）（１４０ミリモルのＮａＣ１，１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８， ４、および１．５ミリモルのＭｇＣ１□）の中に再懸濁した。追加の２０ｍ１の ＩＨＢ、１．０％のＮＰ、４０を添加し、そしてリゼイトを５分間放置した。核 を４３０Ｏｒｐｍにおいて１０分間遠心し、そして上澄み液を除去し、そして１ ／１０体積のブロティナーゼにで処理し、そしてＳＤＳを０．５％に添加した。

消化を室温において３０分間進行させた。ＥＤＴＡを５ミリモルの最終濃度に添 加し、この混合物をフェノール：クロロホルムで抽出し、次いで再クロロホルム で抽出し、そしてＥｔＯＨで沈澱させた。

ポリ−Ａを含有するｍＲＮＡを記載されているように、オリゴｄＴセルロースで 、次のようにして全体または全体の細胞質のＲＮＡから分離した。はぼ０．２５ 　ｇのオリゴ−ｄＴセルロースを無菌のカラムの中に入れ、１０カラム体積のＥ ＴＳ緩衝液（１ミリモルのＥＤＴＡ、１０ミリモルのトリス−ＨＣ１％ｐＨ７， ２，０，２５％の５ＤＳ）中のＯ，ｌ　ＮのＮａＯＨで洗浄し、そして高い塩の 緩衝液（ＨＳＢ）（０，５モルのＮａＣ１，１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ７，４，５０ミリモルのＭｇＣｌ２）中で平衡化した。全ＲＮＡを、６５°Ｃ に５分間加熱した後、カラムに適用し、ゆっくり展開し、そして溶離液を３×再 適用し、引き続いてカラムを他の１２〜２０ｍ１のＨＳＢで洗浄した。結合した 物質を４ｍｌのＥＴＡで洗浄し、カラムをＨＳＢで再平衡化し、溶離した物質を ：再び６５°Ｃに５分間加熱した後、カラムに再適用し、ＮａＣ１濃度を０．５ モルに調節し、次いで前述したように結合しそして溶離した。溶離したｍＲＮＡ を含有するポリ−Ａをエタノール沈澱させ、無菌の薫留水中に再懸濁し、そして −７０°Ｃにおいて貯蔵した。

ｃＤＮＡの合成 ポリーｄＴプライムドｃＤＮＡを、グブシー（Ｇｕｂｌｅｒ）およびホフマン（ Ｈｏｆｆｍａｎ）の基本的ＲＮアーゼＨ手順に従い、４μｇのＰ−Ａ選択したｍ ＲＮＡから合成した。二本鎖ｃＤＮＡをｃＤＮＡ種の末端にχｈｏｌアダプター を配置することによって修飾し、そしてｃＤＮＡ分子の集団をラムダＺＡＰｇｔ ｌＯベクター〔ストラタジー・インコーホレーテッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 　Ｉｎｃ、）　）のＸｈｏＩ部位の中に結合した。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングＥ、ｃｏｌｉ株ＬＥ３９２中のほぼ７． ５Ｘ１０ｓのファージのプラークを１５０ｍｍの寒天プレート上に抗体１５．０ ００プラーク／プレートで配置し、ニトロセルロースのフィルター上にリフトし 、塩基中で変性し、中和し、そして８０゛Ｃにおいて２時間ヘーキングした。合 成オリゴヌクレオチドを３２ｐのＡＴＰでポリヌクレオチドキナーゼを使用して 標識した。

ハイブリダイゼーションを５ＸＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤ Ｓ中で２５°Ｃにおいて１８時間実施した。

引き続いて、フィルターを５ＸＳＳＰＥ、０．２％で数回洗浄した。フィルター を１プールの３倍の縮重したオリゴヌクレオチドでブロービングし、構成し、そ して得られたタンパク質配列（５’　ＴＧＧ　ＡＣ（Ａ／Ｇ）ＴＡ　（ＴｉＣ） ＣＡ（ＴｉＣ）ＴＡＴ３’　）から推定し、５８の独立の分離物が同定され、そ してこれらの分離物はこの組のオリゴヌクレオチドと再現性をもってハイブリダ イゼーションした。これらの精製したクローンをヘルパーファージを使用して切 り出し、そして再環化して、引き続く分析のためにファージミド（ｐｈａｇｅｍ ｉｄ）ベクターｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔｓＫ（−）　（ストラタジー・インコー ホレーテッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｉｎｃ、）　）中でサブクローンを生 じさせた。

ＤＮＡ配列決定分析 クローンの断片または全クローンを、もとのラムダＺＡＰ分離物、Ｂｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔ　５Ｋ（−）から切除したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ（−）、また はファージＭ１３のバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）、ｍｐ１８およびｍｐ１９（ 便利な方向クローニングのためのＮｏｔＩ部位を含むように修飾した）中で配列 決定した。ジデオキシ−ＤＮＡ配列決定を利用し、操作したＴ７　ＤＮＡポリメ ラーシーークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）ｔｃｎ　［Ｕ、Ｓ、バイオケミカ ル・コーポレーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）］を使用した。

ｇ２９０′″″′−′４の放射線標識したアミノ酸の配列決定により予測された タンパク質をコードするクローンの同定後、別々の適当な制限断片をサブクロー ニングして内部の配列を誘導し、その後、オリゴヌクレオチドの配列決定プライ マーを合成して、全長のクローンの残りの配列を得、そして必要に応じて第２鎖 の配列を誘導した。

ｍＲＮＡのプロットハイブリダイゼーション分析ノザンプロット分析を、種々の 組織および細胞系の源からホルムアルデヒド法により分離した種々のポリーＡ選 択したＲＮＡ種について実施した。はぼ５μｇのＲＮＡを各ゲルのラインに適用 し、そして電気泳動後、ＲＮＡをゲネトラ（Ｇｎｅｔｒａｎ）ナイロンフィルタ ーに移した。分離し、３２Ｐ−ｄＣＴＰヘキサマーープライムド手順で標識した 、インサートＤＮＡへのハイブリダイゼーションを、４２°Ｃにおいて１８時間 、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５ＸＳＳＰＥ中で実施した。ナ イロンフィルターを高い厳格さで２ｘＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳで室温におい てすすぎ、次いでＱ、　ｌ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅで６５℃において３０分間２回 すすいだ。

オートラジオグラフィーをＸＡＲ−５フイルムへの露出後現像した。

猪果 ９０Ｍ５ｌ−１４のアミノ　「のタンパク　配１ＭＥＬ−１４陽性の細胞の抽出 物から精製した物質の自動特表千４−５０４５０１　（１１） 化配列分析を、ｍＬＨＲｃＤＮＡクローンによりコードされるタンパク質配列と 比較した。放射！ａ標識したアミノ酸で１’Ｊｊ的ニｍ識シタＥＬ　４／ＭＥＬ −１４”カラ（７）ｇ　Ｐ　９　ＱＭＥＬ−１４の精製は、記載されているよう に（２４）モノクローナルＭＥＬ−１４抗体を使用して実施した。２Ｘ１０”の 細胞を１０ｍＣ１の単一のゴＨ−または３５３−アミノ酸（８４）で１〜６時間 スピンナー均衡塩溶液（ギブコ）中で標識し、１０％の胎児仔ウシ血清を、２０ ０Ｃｉ／ｍｌで添加した放射線標識したものを除外した、すべてのアミノ酸で補 充した。細胞を０．５％のノニデットＰ４０．２０ミリモルのＰＭＳＦ中で１時 間４０°Ｃにおいて可溶化した。核および破片を遠心により１５分間３．００Ｏ ｒｐｍで除去した。リゼイトを、０．０１モルのトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，４， ０，１５モルのＮａＣｌ、０．２５％のノニデットＰ４０中で平衡化したセファ ローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂに接合したレンズ・クリナリス（Ｌｅｎｓ　 ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）　レクチンのカラムに適用した。カラムを洗浄し、そして 結合した物質を０．３モルのメチルＤ−マンノピラノシドで溶離した。

リゼイトを、１０〜２０ａｇのモノクローナル抗体に等しい、２０Ｘ濃縮ＭＥＬ −１４ハイブリドーマの上澄み液とともに４°Ｃにおいて３〜４時間インキュベ ーションし、次いで過剰の親和性精製したヤギ抗ラットを添加し、そして４　’ Ｃにおいて一夜インキユベーションした。沈澱を３，０００　ｒｐ＋ｗにおいて 遠心し、そして０．０１モルのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，４，０，１５モルの ＮａＣｌ、０．２５％のノニデッ）Ｐ２Ｏ中で３回洗浄した。複合体をレムリ（ Ｌａｅｍｍｌｉ）試料緩衝液中で３分間９０°Ｃに加熱し、そしてｇｐ９　ＱＭ ＥＬ−１４を１０％のＳ、Ｄ　Ｓポリアクリルアミド管ゲルでレムリ不連続ゲル 系（８５）を使用して、クレン（Ｃｕｌ　ｔｅｎ）　（８ｈ）により変更された ように、精製した。ゲルの分画を０．１％のＳＤＳ中で４°Ｃにおいて一夜イン キユベーションして、放射性物質を溶離した。放射線標識した分画をハイオフロ アー（Ｂｉｏｆ　１ｕｏｒ）　シンチレーションｉ体（−ニー・イングランド・ ニュークリアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）　）中のへツクマ ン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　Ｌ　Ｓカウンター（ＬＳ−２３０型）により計数した。

自動化配列分析は、記載されているように（”）　、アプライド−ハイオシステ ムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ’ｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）　４７０　Ａ型気体−液体相 タンパク質配列決定装置、チアゾリノン誘導体の転化のためにフラスコをバイパ スするように変更された、で実施した。各工程において２−アニリノチアゾリノ ン誘導体を含有する塩化ブチル抽出液全体を、トルエン／ＰＰＣ中のシンチレー ション計数のために、直接バイアルの中に移した。各試料を二重反復試験におい て１００分間ベックマンＢｅ−ｃｋｍａｎ）　Ｌ　Ｓカウンター（ＬＳ−７５０ ０型）で計数した。バックグラウンドより上の放射線を含有する位置は、特定の ３Ｈ−または３５３−アミノ酸の存在を示す。

明瞭なアミノ酸の帰属はアミノ末端の３２残基のうちの１５においてなすことが でき、そして追加の仮のチロシンの位置は残基３７においてなされた。

ＭＥＬ−１４および　の　および　二のｍＲＮＡこれらの研究のために利用した 主要なインデックスの細胞系は、ＥＬ−４／ＭＥＬ−１４”、連続的Ｔ細胞リン パ腫細胞系、ＥＬ−４であり、ＭＥＬ−１４抗原の高いレベルの発現、末梢節細 靜脈に結合する能力とともに同時に分離する性質、についての蛍光性活性化フロ ーサイトメトリーにより選択した。ｇ　ｐ　９　Ｑ　Ｎ　Ｅ　Ｌ　−１４の発現 に関して異なる、Ｅｌ−４の追加の変異型は、また、蛍光性活性化細胞ソーター （ＦＡＣＳ）分析に従い、種々の源から得、そしてこれらの研究において同様に よく使用された。Ｃ６Ｖ１およびＶＬ３の両者は輻射線誘発白血病ウィルス胸腺 腫のクローナル細胞系である。ノザンプロット分析は、記載されているように（ ８８）ホルムアルデヒドの手順により、種々の組織および細胞系について実施し た。はぼ５河のＲＮＡを各ゲルの線に適用し、電気泳動後、ＲＮＡをゲネトラン （Ｇｅｎ　ｔｅｒａｎ）ナイロンフィルターに移した。ランダムプライマー手順 （Ｂ９）により”Ｐ−ｄＣＴＰで標識したプローブへのハイブリダイゼーション は、４２゛Ｃにおいて５０ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×５ＳＰＥ中 で１８時間実施した。ナイロンフィルターを２×５ＳＰＥ、０．２％のＳＤＳで 室温において洗浄し、次いで０、　Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅで６５°Ｃにおいて ３０分間洗浄した。オートラジオグラフはＸＡＲ−５フイルムへＸ時間露出後現 像した。

ａ）”Ｐ標識したネズミリンパ節ホーミングレセプターのコアペプチド（ｍＬ　 ＨＲｃ　）　ＤＮＡ、レーンＡ、ＥＬ４／ＭＥＬ−１４”’；　レーンＢ、ｅ　 ｌ−４／ＭＥＬ−１４ｈｉ；　レーンＣ，ＢＤ　ＥＬ４／ＭＥＬ−１４’”；レ ーンＤ、ＥＬ４／ＭＥＬ−１４１ｏ；レーンＥ、ＢＤ　ＥＬ４／ＭＥＬ−１４１ ｏ；レーンＦ、ＶＬ３；レーンＧ、Ｃ６Ｖ１；レーンＨ１胸腺；レーン１．ＩＩ ＩＦＩ；レーンＪ、腸間膜のリンパ節；レーンＫ、肝臓；レーンし、腎臓；レー ンＭ、精巣；レーンＮ、脳；ｂ）ｚｚｐ標識したアクチンを使用するハイブリダ イゼーション。

検出可能なｎＲＮＡを発現するすべての細胞系および組織は、１．５　、２．５ および５．２　ｋ　ｂにバンドをもつ同一パターンを示した。ハイブリダイゼー ションの同一性は、ｇｐ９０ＭＡＬ−１４の細胞表面の発現と相関関係をもって いた。

ｇｐｇ　□ＭＥＬ−１ａの発現レベルに関して異なるＥＬ−４の多数の変異型を 選択しそして蛍光フローサイトメトリーによりソーティングし、次いで急速に生 長させてｍＲＮＡをプロセシングした。ＥＬ４／ＭＥＬ−１４Ｘｈｉ　、ＥＬ４ ／ＭＥＬ−な転写パターンを示す。他の陽性の細胞系に関するＥＬ４／ＭＥＬ　 １４１ｏ細胞中の１．５　ｋ　ｂの転写体種の量の特定の減少は、細胞表面の発 現の決定においてこの種についての主な役割を示唆した。

ＥＬ−４に無関係の追加の細胞系、ＶＬ−３およびＣ６ＶＬ、生体外のＴ細胞リ ンパ腫系統を、また、この分析に含め、前者は相対的低いレベルの表面抗原を発 現し、そして後者は細胞表面の染色を示さなかった。転写のパターンは表面の発 現に匹敵し、ゲル上のｍＲＮＡの相対的負荷をおおざっばにコントロールし、フ ィルターをストリッピングし、そして比較的明瞭な転写体のベーターアクチン遺 伝子の配列と再ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションはレーン の間で合理的に均質であり、転写体について観測された差は存在量に関係づけら れた。

正常組織中の分布は、ＭＥＬ−１４についての組織の染色パターンに匹敵する、 主要なリンパ様分布を示す。胸腺、膵臓および腸間膜のリンパ節は細胞系の中に 存在する同一の大きさの転写体について陽性であるが、肝臓、腎臓および脳は検 出可能な転写体を示さない。

９　ＱＮＥＬ−１４の　に　して・　る　二の　２ソー　−ＦＡＣＳ 細胞をアイソタイプが合致する対照（ＡＩ、Ｂｌ、ＣＩ。

ＤＩ）またはＭＥＬ−１４ハイブリドーマの上澄み液（すべての他のもの）で染 色し、次いでマウス血清成分と交差反応性のためにＦＩＴＣ接合したヤギ抗ラッ ト免疫グロブリンを吸収した。Ａ）、１：ＥＬ　４ｈｉ；２：ＥＬ−４１ｏ；３ ：ＥＬ　４ｈｉ；　４　：　ＥＬ　４Ｘｈｉ　、Ｂ）、１：ＢＤ　ＥＬ−４１ｏ ；２　：ＢＤ　ＥＬ−４１ｏ、　Ｃ）　、１　：ＶＬ３　；２　：　Ｃ３Ｖｌ　 ｌ　：ＶＬ３゜Ｄ）　、１　：　ＢＤ　ＥＬ−４１ｏ、陽性のソート；　２　： 　ＢＤ　ＥＬ−４１１ｏ　、陰性のソート；３：ＢＤＥ　Ｌ　−４１ｏ、陽性の ソート。

細胞の発現の２つの明確な集団−生な陰性の集団および比較的小さい集団、ｇ　 ｐ　９０　ＨＥ　Ｌ−１４を発現する細胞の抗体５％−を含有する明確なＭＥＬ −１４染色パターン実証した、独立のＥＬ−４クローナル細胞系が同定された。

３％の最高および最低の強度の染色細胞をソーティングし、直ちに増殖させ、そ してｍＲＮＡを抽出した。ノザンプロットにおける転写の発現は高い集団で存在 し、そして陰性の集団中に存在せず、これにより、前述の変異型と組み合わせて 、同一のクローナル細胞系から誘導された変異型中の転写および細胞の表面抗原 の同時分離を示す。

ｍ　Ｌ　ＨＲｃのＤＮＡでトランスフェクションしたＣｏ５−７のＦＡＣＳ 全長のｃＤＮＡクローンを発現ベクターＣＤＭ８、すなわちテトラサイクリン／ アンピシリン抵抗性をもち、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）／ＨＩＶ（ヒト免 疫欠損性ウィルス）プロモーター、ＳＶ４０、Ｍ１３の複製起点、スプライス及 びボリアデニール化部位、並びにｃＤＮＡ種のポリリンカー領域を含有するプラ スミドに転移した〔ブリアン・シード（Ｂｒｉａｎ　５ｅｅｄ）　］。プラスミ ドＤＮＡをコンフルエントＣｏ５−７細胞に、記載されているように（”）ＤＥ ＡＥ−デキストラントランスフェクション法によりトランスフェクションした。

ＭＥＬ−１４陽性のトランスフエクタントの濃縮は、ＭＥＬ−１４で染色したト ランスフェクションした細胞をヤギ抗うントＩｇコーティングしたベトリ皿上に プレイティングすることによって達成した。非付着細胞を除去し、０．５〜１時 間後、付着性細胞を蛍光染色により再分析した。

トランスフェクションした細胞の分析の結果は、アイソタイプ合致の対照抗体に より染色と比較して、ＭＥＬ−１４で染色したとき陽性の集団の細胞の集団を示 す。偽トランスフェクションしたまたはＴｈｒ−１）ランスフェクションしたＣ ｏ５−７細胞をＭＥＬ−１４で染色して、同一のパックグラウンドが得られた。

２　したｍ　Ｌ　ＨＲｃ　）ランスフェクションしたＣｏ５−７胞からのＭＥＬ −１４心　の　゛　の　”盈 前述したように濃縮したｍＬＨＲｃｈランスフェクションしたＣｏ５−７細胞を 、ラクトペルオキシダーゼ（９０）を使用して＋ｚｓ■で標識した。免疫沈澱お よび電気泳動を、前述したようにして、スラブポリアクリルアミドゲルを使用し て、非還元性条件下および還元性条件下に実施した。非還元性ゲル：Ａ：トラン スフェクション体、アイソタイプ；Ｂ：トランスフエクタント、ＭＥＬ−１４抗 体；Ｃ：　ＥＬ４／ＭＥＬ−１４ｈ　ｉ、　ＭＥＬ−１４抗体。還元性ゲル：Ａ ：トランスフエクタント、ＭＥＬ−１４抗体；Ｂ　：　トランスフエクタント、 アイソタイプ；　Ｃ：　ＥＬ４／ＭＥＬ−１４ｈ　ｉ、ＭＥＬ−１４抗体。

結果が実証するように、非還元性条件下に２つのＭＥＬ−１４特異的種が存在し 、１つは７０ｋＤよりわずかに小さい分子量をもつＥＪ４／ＭＥＬ−１４ｈ　ｉ 　（レーアＣ）がらの成熟Ｇ　Ｐ　９０　”’−”よりわずかに小さく、および 他は約６０ｋＤなおいっそう小さい。これは、別々の形態への転写体のプロセシ ングが存在することがあることを示し、多分グリコジル化および／またはエビク イチン化を包含する、翻訳後の修飾の別の通路を反映する。分子の大きさはＥＬ ４／ＭＥＬ−１４ｈｉの形態とわずかに異るが、非還元性の形態が還元された形 態より速く移動する、ＧＰ９０Ｍ！Ｌ−”の典型的な還元性／非還元性の挙動は 保持される。

ｍ　Ｌ　ＨＲｃのｃＤＮＡの６　なヌクレオチドおよび　２　れ人ｌ詠ヱ寝江【 （剋 ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）およびコウルセン（ Ｃｏｕｌｓｅｎ）のジデオキシ鎖停止方法により、操作したＴ７ＤＮＡポリメラ ーゼセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）システム（Ｕ、Ｓ、バイオケミカル・ コーポレーション・コーポレーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、） ）を使用して決定した。一本積の鋳型ＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ 　（）（もとのラムダＺＡＰ分離物から切除した）　、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　 ＫＳ（）　、またはバクテリオファージＭ１３のバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ） 、便利な方向クローニングのためのＮｏｔＩ部位を含むように修飾したバクテリ オファージｍｐ１８およびｍｐ１９中から誘導した。

アミノ酸配列決定ｇｐ９　ＱＭＥＬ−１ｎにより推定されたアミノ末端をコード する配列がいったん同定された後、適当な制限断片をサブクローニングして内部 の配列を誘導した。引き続いて、オリゴヌクレオチドのプライマーを合成して、 全長のクローンの残りの配列を得、そして必要に応じて第２鎖の配列を得た。ヌ クレオチド位置５４の開始メチオニンから始まる予測されたタンパク質配列を下 に示す；右への番号はヌクレオチドおよびタンパク質の位置を示す。成熟タンパ ク質におけるシスティン残基は上の星印（＊）で印をし、そして標準のＮ一連結 炭水化物の認識部位（Ａｓ　ｎ−Ｘ−３ｅ　ｒ／Ｔｈ　ｒ）を矢印の棒で上方に 示す。アミノ末端の５アミノ酸をコードしそしてスクリーニングに使用したオリ ゴヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーシヨンする１５ヌクレオチドを、ボ ールドフェースで下線を引く。ポリ−Ａのスプライスおよび共通のポリアデニル 化認識配列に二重の下線を引いである。

２Ｅ　：ｉＭ　本：ヨ　Ｈコ葺　芝河　ミ目　コご　ニジ・５本　２谷　３ヨ　 ト　巨　伝ｃＤＮＡのクローンは５４ｂｐの５′非翻訳領域を有し、次いでイニ シェークーＡＴＣコドンを有し、これは１，１１６ｂｐの非中断のオープンリー ディングフレームを開始する。

位置は１１６９にＴＧＡ停止コドンが存在し、次いで３２７ｂｐの３′非翻訳領 域が存在する。

リーディングフレームは長さ３８アミノ酸の疎水性リーダー配列をもつタンパク 質をコードし、次いで成熟タンパク質の最初のトリプトファン残基に到達する。

ヒトロバシー分析は一般に疎水性のリーダー配列を確証し、ここで最初の１５残 基は中性ないしわずかに親水性である。シグナル配列は３つの正に帯電した残基 、４つのシスティン残基、および３つのヒスチジン残基を包含し、成熟タンパク 質に先行する１２残基中に集中している。

成熟タンパク質は１０の潜在的アスパラギン連結グリコジル化部位を有し、これ らのうちで６つは同一の反復ユニット構造内に含有される。成熟タンパク質は２ ２のシスティン残基を含有し、システィンの１２は相補的調節タンパク質の反復 構造の中に存在し、そして追加の９つのシスティンはＥＧＦ様ドメインを包含す る反復単位に先行する６０アミノ酸の中に含有され、１８０〜１９０アミノ酸の 高度にシスティンに冨んだプレートランスメンブレン領域を生ずる。

推定された成熟タンパク質は、３７，６００の計算分子量をもち長さが３３４ア ミノ酸である。約２９５〜３１７のアミノ酸を包含する疎水性トランスメンブレ ン領域が存在し、次いで正に帯電した残基のクラスターおよび１８アミノ酸の親 水性細胞質テイルが存在する。ヒトロバシイプロットは相対的に親水性の別個の 領域を示し、この領域はアミノ末端の１５０アミノ酸および膜の近位のほぼ２０ アミノ酸の中に集中している。介在する細胞質外部分は比較的に電気的に中性の 伸長であり、これはヌクレオチドおよびタンパク質のレベルの両者が同一である 、前述の反復単位の存在を包含する。

タンパク質の比較はリポータ−の細胞質外の部分が３つの別々の細胞質外ドメイ ンから作られていることを明らかにし、これらのドメインは３つの異なるタンパ ク質のモチーフに対するそれらの相同性により定められる。

アミノ末端のドメインは、動物レクチンの炭水化物結合性ドメイン（位置７４− １１８）に対する相同性を示す；連続する３７アミノ酸（位置１１９−１５５） はレクチンのドメインと補体調節反復単位の間のＮＪＩ！ｉを占め、表皮生長因 子（ＥＧＦ）のシスティンに冨んだ反復単位に対する類似性を示す；そして第３ 領域は補体調節および他のタンパク質の中に存在する相同性の反復のコンセンサ ス配列に一致する２つの同一の反復単位から構成されている（位置１ｌ５６−２ １７）　Ｌ　ＨＲｃは、動物レクチン中の結合ドメインの５０カルボキシ末端残 基に等しい４５アミノ酸にわたって相同性である。この領域はｍ　Ｌ　ＨＲｃ中 の９０，１０９、および１１６に３つの不変のシスティン、７５−’７６に−Ｗ 、特徴あるＥ−Ｔ−Ｎ　（８０−８２）、８８にＥ、９０−９１にＣ−Ｖ、およ び１０２−１０６に保存されたＧ−ＷＮＤを包含する。

コンセンサス配列中の位置および他の哺乳動物において存在する唯一の高度に保 存されたＧは、ｍＬＨＲｃ中の炭水化物結合ドメインに存在しない。保存された 残基Ｎ〜８２およびＥ−８８の間に、３つのりジン残基のクラスターおよびコン センサス配列のＣ−１７およびＧ−２４の間の５つの帯電したアミノ酸のコンセ ンサス配列に関するインサートが存在する。全体のドメインは１０の正に帯電し た残基、３Ｒおよび７Ｋを含有する。ｍＬＨＲｃ中のレクチンのドメインの存在 は、マンノース−６−ホスフェートおよびある類似体は、他の炭水化物を除外し て、末梢リンパ節ＲＥＶへの結合を阻害するが、バイアー班への結合を阻害しな いことを実証した研究と一致する。結合におけるレクチンのドメインの既知の役 割およびこのＭＥＬ−１４エピトープの既知の役割と本発明者らの理解を組み合 わせて、このドメインにおいて異常なＬｙｓの濃縮は、この領域がエビクイチン 化の部位を含有しうることを示唆する。ＨＥＶアトレシンはニニーラミニダーゼ で処理することによって不活性化されるが、アルカリ性ホスファターゼの処理に よっては不活性化されず、そしてまだ。　同定されない、非リン酸化シアル酸依 存性分子はｍＬＨＲｃのためのりガントとして示される。

ｍＬＨＲｃ中のＥＦＧ様ドメインはＥＧＦ反復単位の単一のコピーの相同体から 成り、この単位はこの構造に特徴あるＣ／Ｇ残基の多（を保存する。すべての６ つのコンセンサスＣが存在し、同様にｍＬＨＲｃの１４７および１５０にＧおよ び１４８にチロシンが存在する。これらの保存されたの関係は、ヒトおよびウシ の凝固因子ＩＸおよびＸおよびドロンフィラ・ノツチ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ　Ｎ ｏｔｃｈ）遺伝子産生物（およびこの遺伝子中の３６の反復のうちの４を除外し たすべて）のそれと同一であるが、配列を整列するために要求される挿入または 欠失をもたない、ＥＦＧ様ドメインを含有する他の分子と同一ではない。ＥＦＧ 様ドメインは、ヒトにおけるインテグリンＬＦＡ−１β２鎖のベーター鎖のシス ティンに冨んだ反復単位の１つの一部分との相同性を共有する（位置４４９−４ ８３）、ｍＬＨＲｃ　１４２−１５４からなる１２アミノ酸領域は、ＬＦＡ−１ β２サブユニツトの４８０−４９２と直接整列し、このサブユニットは７残基の 同一性をもつ３システインの保存された間隔を保持する。

次のドメインは、各ユニットが６２アミノ酸の長さであり、位置１５６−２１７ および２１Ｂ−２７９にまたがる、正確に二重反復の反復単位である。ネズミ補 体因子Ｈ１補体調節活性をもつ血清は有意の相同性を示す。因子Ｈにおいて、２ ０の隣接する相同性であるが、同一ではない、ｍＬＨＲｃレセプターとほぼ１０ 〜３０％の相同性を有する反復単位が存在する。同一の相同性の反復のモチーフ は、Ｃ３／Ｃ４と結合する、多数の補体調節タンパク質の中に、そして他のタン パク質、例えば、ＩＩ−レセプター、β２ｖ！！タンパク質血清タンパク質、お よび因子ＸｒＩＩＯ中に存在する。コンセンサス配列の位置はホーミングレセプ ターの反復単位配列Ｔ−４、Ｐ−７、Ｆ−３０、Ｃ−３２、Ｇ−３５、Ｃ−４６ 、Ｇ−５０、Ｗ−５２、Ｐ−５７、およびＣ−５９゜さらに、Ｃ−４およびＰ− ７の間の１残基の相対的欠失、コンセンサス配列およびＰ−７およびＦ−３０の 間の３残基の挿入を除外して、コンセンサス配列の残りの残基の相対的間隔はホ ーミングレセプター配列において完全に保存される。

ｍ　Ｌ　ＨＲｃタンパク　配置の　に　いだされる　日　の＜＋ニス 相同性を有するタンパク質は下に示すように整列された。

各パネル中の上の線はアミノ酸残基を描写し、それらの位置は特定のモチーフに ついてのコンセンサス配列を定める。括弧内の残基はそのモチーフに一致する配 列の中に存在するか、あるいは存在しないことができる。ダッシュはアミノ酸に より占有されなくてはならない位置を示すが、スペースは可変長さの領域の境界 を定める。Ａ０ｍＬＨＲｃ残基７４−１１８は、動物のレクチンの炭水化物結合 ドメインのためのコンセンサスモチーフおよびそのモチーフを示す代表的なタン パク質に対して比較した。Ｂ、ｍＬＨＲｃ残基１２２−１５５は、システィンに 冨んだＥＧＦ様反復単位のためのコンセンサスモチーフおよびそのモチーフを示 す代表的なタンパク質に対して比較した。Ｃ，ｍＬＨＲｃ残基１５６−２１７は 、相補的調節反復単位のためのコンセンサスモチーフおよびそのモチーフを示す 代表的なタンパク質に対して比較した。Ｒ−ＭＢＰ−Ｃ、ラットのマンノース結 合性タンパク質ｃ　、　Ｒ−ＭＢＰ−Ａ、ラントのマンノース結合性タンパクｉ Ａ、Ｈ−ＭＢＰ−Ｈ、ヒトのマンノース結合性タンパク質Ｈ；ＣＰＳａ、イヌの 肺のサーファクタントａ　；ＲＡＳＧＰＲ、ラットのアシアログリコプロテイン （ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）レセプター；ＨＡＳＧＰＲ，ヒトの アシアログリコプロティンレセプター；ＨＦＣ，Ｒ，ヒトのＦｃニブシロンレセ プター、ＣＨＬ、ニワトリ肝炎レクチン、ＩＳＬ、サルコファガ・ペレグリナ・ ヘモリンフ（ｓａｒｃｏｐｈａ　ｐｅｒｅｇｒｉａ　ｈｅｍｏｌｙｈｐｈ）レク チン；Ｅｃｈ、エキノイジン、シーアーチン（ｓｅａ　ｕｒｃｈｉｎ）体腔流体 ；ＥＧＦ、表皮生長因子、ＴＧＦ、形質転換生長因子；ｔＰＡＨｕ、ヒトの組織 プラスミノゲン活性化因子、ＬＤＬ、低い密度のりボタンバク質、ＣＲＩ、補体 レセプター１；Ｈ１因子Ｈ；Ｃａ結合性タンパク質；Ｂａ、因子Ｂａ；βＯＰ　 Ｌβ−糖タンパク質！、１ｌ−２Ｒ、インターリューキン−２レセプター。

７、セ、サス　ｃ−−−・　・　・　・Ｃ−・　・　・　・Ｃ−・　・　・　− ・　−・　−・Ｃ・ｃ　−ａｖ−ａ　・　・Ｃ（＋２２．＋５５１　Ｃ０ＰＧＳ 　ＣＮＧＲＧＥＣＶεＴＩＮＮＨＴ　ＣＩＣＤＡＧＹＹＧＰＯＣＱＹＣ，ｓｌａ ｇ、Ｍ＋ｖ１２　ＣＬＥＮＰ　Ｃ３ＮＧＧＶＣＨＱＨＲＥＳＦＳ　ＣＤＣＰＰＧ ＦＹＧＮＧＣＥＱ）７クターｒＸヒ’　ＣＥＳＮＰ　ＣＬＮ（ＩＱＳＣＫＯＯＩ ＮＳＹＥ　ＣＷＣＰＦＧＦＥＧＫＫＣＥＬ前駆体 ７アクタ引χつ）　ＣＥＳＮＰ　ＣＬＮＧＧＩＪＣＫ００１Ｎ８ＹＥ　ＣＷＣＯ ＾ＧＦＥＧＴＮＣＥＬ７、り９−ｘヒト　ＣＥＴＳＰ　Ｃ０Ｎ０ＧＫＣＫＯＧＬ ＧＥＹＴ　ＣＴＣＬＬＧＦＥＧＫＮＣＥＬ７、り９４ｔ、）　ＣＥＱＨＰ　ＣＬ ＷＱＧＨＣＫＤＧ　ＩＧＤＹＴ　ＣＴＣ＾εＧＦＥＧＫＮＣＥＦＥＧＦ−７＋＞ ス　ＣＧＰＧＧ　ＣＧＳ）ＩＡＲｃＶｓＤＧＥＴＡＥ　Ｃ０ＣＬＫＧＦＡＡＧＮ ＬＣ５Ｉ）前駆体　Ｒｏ ＥＧＦ−ｉス　ｃ　ＰＳＳ　ＹＤＧＶＣＬ　ＮＧＧＶｃＭ）ｌ　Ｉ　ＥＳ　ＬＤ Ｓ　ＹＴＣＮＣＶ　Ｉ　ａｖｓａｏ　ＲＣＯＴＥＧＦ−ヒト　ＣＰＬＳＨＤＧＹ ＣＬＨＤＧＶＣＭＹＩ　ＥＡＬＯＫＹＡＣＮＣＶＶＧＹ　ＩＧＥＲｃＱＹＴＧＦ −５フト　ＣＰＤＳＨＴＯＹＣＦＨＧ丁　ＣＲＦＬＩ１０１″ＥｉＫＰＡＣＶＣ Ｈ８ＧＹＶＧＶＲＣＥＨブσティンＣウン　ＣＤＬＰ　ＣＣＧＲＧにＣＩＤＧＬ １３ＧＦＲＣＰＣＡＥＧＷＥＧＲＦＣＬＨｔＰＡ　ヒ）　Ｃ３ＥＰＲＣＦＮＧＧ ＴＣＱＯＡＬＹＦＳＤＦＶＣＯＣＰＥＧＦＡＧＫＣＣＥＩＬＤＬ　、）セブター 、ヒト　ＣＬＤＮＮＧＧ　Ｃ３ＨＶ　ＩｃＮＤＬＫＩＧＹＥ　ＣＬＣＰＤＧＱＬ ＱＲＲＣＥＯの 補体Ｃｇヒ）　ＣＨＴ　ＣＯＮＧＯＴＶＩＬＭＤＧＫＣＬ　ＣＡＣＰＦＫＦＥＧ ＩＡＣε１ヲクシニ７１９Ｘ　ＣＧＰＥＧＤＧＹＣＬＨＧＤ　ＣＩＨＡ日ＤＩＤ ＧＭＹＣＲＣ３ＨＧＹＴＧＩＲＣＯＨｃＤＮＡの八　およびヒトｃＤＮＡライブ −１−のスクリーニング ポリーｄＴプライムドｃＤＮＡを、４μｇのｐ−Ａ選択したｍＲＮＡから、グブ シー（Ｇｕｂｌｅｒ）およびホフマン（Ｈｏｆｆ−ｍａｎ）の基本的ＲＮアーゼ Ｈ手順に従い合成した。二本鎖ｃＤＮＡを合成し、そしてラムダｇｔｌｌのＥｃ ｏＲＩ部位の中に結合した。Ｅ、ｃｏｌｉ株ＬＥ３９２中のほぼ１．０Ｘ１０６ のファージプラークを、約２０．０００プラーク／プレートで１５０ｍｍの寒天 プレート上にプレイティングし、二重反復試験においてニトロセルロースのフィ ルター上にリフトし、塩基中で変性し、中和し、そして８０°Ｃにおいて２時間 ベーキングした。全長のマウスリンパ節ホーミングレセプターｃＤＮＡりｏ−７ （ｍＬＨＲｃ　）を、約１５００ｂｐのＮｏｔＩ／Ｎｏｔｌ制限断片として切除 するか、あるいは全長のクローンのすべてであるが５′の３００ｂｐ除外するも のを包含するＸｈｏｌで切除したほぼ１２００ｂｐ断片として切除した。

これらのインサートを精製し、そして標準のヘキサマーのプライミング方法によ り３２ＰアルフアーｄＣＴＰで標識した。

ハイブリダイゼーションは５ＸＳＳＰＥ、５ｘデンハルト溶液、０．５％のＳＤ Ｓ中で２５°Ｃにおいて１８時間実施し、二重反復試験のフィルターを使用し、 一方のプローブにおいて４５％のホルムアミドを使用し、そして他方において３ ５％のホルムアミドを使用した。Ｎ　ｏ　ｔ、　Ｉの全長のプローブを４５％の ホルムアミドのセットの中に配置し、そしてＸｈｏｌ切除したプローブを３５％ のセットの中に配置した。フィルターを１８時間ハイブリダイゼーションし、引 き続いて５×５ＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中の室温において、次いで５５゛Ｃに おいて数回洗浄した。フィルターのブロービングは８つの独立の分離物を同定し 、これらの分離物は両者のフィルターのセット中でハイブリダイゼーションし、 そしてプラーク精製に対する再スクリーニングのとき再現性をもってハイブリダ イゼーションした。

ラムダｇｐＨインサートを分離し、そして前述のジデオキシ配列決定方法による 配列の分析のためにＭ１３ｍ、ｐ１９のＥｃｏＲ１部位の中にサブクローニング した。

ヒトリンパ節ホーミングレセプター配列ＧＡＧＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＧＴＧＣＡ ＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＧＡＣＣＣ ＴＴＧＴＧＣＴＡＡＧＴＡＡＧＡＧＧＣＴＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＭ ＣＴＡＧＡＧＭＧＧＡＣＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＴＧ　ＡＴＡ　ＴＴＴ　ＣＣ Ａ　ＴＧＣ；　ＡＡＡ　ＴＧＴ　ＣＡＧ　ＡＧＣＡＣＣＣＡＧ　ＡＧＧＭｒＦＰ ＷＫＣＱＳＴＱＲ ＡＣＴ　’Ｉ’ＡＴ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　ＴＴＣＡＡＧ　ＴＴＧ　ＴＧＧ 　ＧＧＣＴＧＧ　ＡＣＡ　ＡＴＧ　ＣＴＣＴＬＧＴＳＦＫＬ　讐　Ｇ　讐　ｊＭ ＬＴＧＴ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＴＴＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　 ＡＣＣＧＡＣＴＧＣＴＧＧ　ＡＣＴＣＣＤＦＬＡＨＨＧＴＤＣＷＴ ＴＡ、ＣＣＡＴ　ＴＡＴ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＣＣＣＡＴＧ　ＡＡＣＴＧ ＧＹ）ＩＹＳＥＫＰＭＮＷ ＬＰＡＭ−１および−２を同定する実験手順を次に記載する。

抗体および細胞系 ＬＰＡＭ−１分子のα鎖を認識するラットのモノクローナル抗体Ｒ１−２（Ｉｇ Ｇ２ｂ）の調製は、次のようにして実施した。バイアー班ＨＥＶ結合性リンパ腫 系統ＴＫＩで３×腹腔内免疫化したフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ラットからの 牌細胞を、非分泌性マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３と、標準の手順〔ガ ルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）ら（１９７７）ネイチ’ｒ　（Ｎａｔｕｒｅ）２６６　 ：　５５０−５５２）を使用して融合した。免疫蛍光アッセイにおいてＴＫＩ細 胞と反応性であるが、ＲＥＶ結合性リンす腫ＴＫ５と反応性ではない抗体を生成 うるハイブリドーマを、制限希釈によりクローニングした。サブクローンの培養 した上澄み液を、末梢節またはバイアー塩のＨＥＶへ結合するリンパ球の阻害に ついてスクリーニングした。ＬＰＡＭ−１分子を認識するモノクローナル抗体Ｒ １−２（ＩｇＧ２ｂ、に）をそれ以上の分析のために選択した。

ネズミＭａｃ−１抗原のαサブミツト（スプリンガー（Ｓｐ−ｒｉｎｇｅｒ）　 ら（１９７８）イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）８　：　５３９５５１） と反応性のラットモノクローナル抗体Ｍｌ／７０　（Ｉ　ｇＧ２ａ）およびマウ スの白血球共通抗原Ｔ２Ｏ０（レッドヘタ−（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ）およびヘル ゼンバーグ（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）　（１９７９）、イムノロジカル・リビュ ー　（Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、）　４７　：　６３−９０）に対して特異的な ３０Ｇ１２　（ＩｇＧ２ａ）を、対照として使用した。ネズミＬＦＡ−１のαお よびβ鎖に対して特異的なラントモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ Ｍ１７／４．３およびＭ１８／２０は、Ｔ、　Ａ、スプリンガ−（Ｓｐｒｉｎｇ ｅｒ）博士、ダナーファーバー癌研究所（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　、ボストンから入手した。ニワトリインテグリンβ１ サブユニットのＣ０ＯＨ末端のドメインに相当する合成ペプチドに対してレイズ された多価のウサギ抗血清は、Ｅ、　Ｅ、マルカントニオ（Ｍａｒｃａｎｔｏｎ ｉｏ）博士およびＲ，Ｏ，ハイネス（Ｈｙｎｅｓ）博士、マサチュセッツ技術研 究所（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｉｎａｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ）　、ケンブリッジ、から入手した。この抗β１−ペプチド抗血清はイ ンテグリンβ、に対してモノ特異的であることが示され、そして種々のを推動物 からのβ鎖と反応する〔マルカントニオ（Ｍａｒ−ｃａｎｔｏｎｉｏ）およびハ イネス（Ｈｙｎｅｓ）　（１９８８）ジャーナル・オブ・セル・バクテリオロジ −（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）　１０６　：　１７６５−１７７２Ｌウサギ抗 ＶＬＡ−β抗血清は、Ｍ、Ｅ、ヘムラ−（Ｈｅｍｌｅｒ）博士、ダナーファーバ ー癌研究所（Ｄａｎａ　−ＦａｒｂｅｒＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　、 ボストンから入手した。血小板槽タンパク質ＩＴＩａに対して特異的な多価ウサ ギ抗血清〔レウング（Ｌｅｕｎｇ）ら（１９８１）ジャーナル・オブ・バイオロ ジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、（：ｈｅｍ、）　２５６　：　１９９４ −１９９７）は、Ｌ、Ｌ、に、レウング（Ｌｅｕｎｇ）、スタッフォード大学（ Ｓｔａｎ−ｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、メディカル・スクール、から入 手した。

Ｔ細胞リンパ腫ＴＫ２３、ＴＫ４０、およびＴＫ５０を１０’〜１０７細胞の同 系ＡＫＲ／ｃｕｍ受容体に皮下注射することによって継代培養した。すべての他 の細胞系は、組織培養で７％の胎児仔ウシ血清を含むＲＰＭ１１６４０を使用し て維持した。

生体外ＨＥＶ結合アッセイ この技術は、従来詳細に記載されている〔スタンパ−（Ｓｔａｎ＋ｐｅｒ）およ びウッドルフ（Ｗｏｏｄｒｕｆ　ｆ）　（１９７６）ジャーナル・オン・イクス ペリメンタル・メデイシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　１４４　：８２Ｂ−８３ ３，ブッチャ−（Ｂｕｔｃｈｅｒ）ら（１９７９）ジャーナル・オン・イムノロ ジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）　１２３　：　１９９６−２００３　）。

簡単に述べると、５％の仔ウシ血清および２０ミリモルのＨＥＰＥＳ　ｐＨ７， ４を含有するバンクの均衡塩溶液（ｔ（ＢＳＳ）中のリンパ球を、ネズミ末梢（ わきした、気管支、鼠径および頚部の）節またはバイアー班の新しく切断凍結し た切片上で７°Ｃにおいて３０分間おだやかに回転しながらインキュベーション した。インキュベーション後、付着性細胞を２％のホルムアルデヒドを含有する 冷１．２５　Ｘ　Ｐ　Ｂ　Ｓ中の組織の切片に固定した〔Ｊ、Ｔ、ベイカー・ケ ミカル・カンパニー　（Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　、ニュージ ャーシイ州フィリスバーグ〕。固定後、非付着性細胞をＰＢＳのおだやかな流れ ですすぎ、そして乾燥した切片を顕微鏡検査で検査した。定量的比較を促進する ために、２０ミリモルのＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　ｐＨ７，４を含有する血清不合ＨＢ ＳＳ中の４０μｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ，シグ マ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、ミゾリ ー州セントルイス〕とともに３７°Ｃにおいて１５分間インキュベージジンする ことによって、標識したマウス腸間膜節リンパ球の内部の標準の集団を、インキ ュベーション前に、各試料の集団と混合した。ＨＥＶに対して付着性のリンパ球 をまず暗野の照明下に選択し、次いで試料（非標識）または標準（蛍光性）の細 胞をＵＶエビ照明でスコアを付けた。少なくとも１２の切片／実験を分析した。

）ＴＥＶ上の試料対標準の細胞の比（ＲＨＥＶ）およびインキュベーション混合 物中の試料対標準の細胞の比（Ｒｏ）を決定し、そして特異的付着比、Ｒ）ｌ！ ｖ／Ｒ１、を各試料について（ＳＡＲｓ）および腸間膜節リンパ球について（Ｓ ＡＲ，）計算した。試料細胞の付着能力と非標準腸間膜節リンパ球のそれとの比 較は、相対的付着比（ＲＡＲ，＝ＳＡＲ，／ＳＡＲ，）　として与える。したが って、ＲＡＲは計算したＨＥＶに結合した試料細胞の数／同一条件下に結合した 参照腸間膜節リンパ球を表す。

細胞の標識化および免疫沈澱 細胞を＋ｚｓＩでグルコースーオキシダーゼーラルトベルオキシダーゼ方法に従 い標識した〔ピンク（ｐｉｎｋ）およびジ−グラ−（Ｚｉｅｇｌａｒ）　（１９ ７９）細胞表面分子の放射線標識つけおよび特性決定（Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌ ｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓｕｒｆ ａｃｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、レフコビツズ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｚ）およびペ ルニス（Ｐｅｒｎｉｓ）　（ｉ）　、免疫学において研究方法（Ｒｅｓｅａｒｃ ｈＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｉｎ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ｐｐ、１６９−１８０＼ ニューヨーク・アカデミツク・プレス・インコーホレーテッド（ＮＹＡｃａｄｅ ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋Ｉｎｃ、））　ａヨウ素化は２０ミリモルのＨＥ　ＰＢＳ 　ｐＨマ、４を含有するＨＢＳＳ中で実施した。細胞を、３ＸＩＯ’／ｍｌで３ ０分間４°Ｃにおいて、１％のトリトンＸ−１００，５０ミリモルのトリスｐＨ ７，４，１５０ミリモルのＮａＣｌ、および２ミリモルのＣａ　Ｃ１ｚから成る Ｃ　ａ　”−（オンを含有する免疫性′Ｒ緩衝液（Ｃ−ＩＰＢ）中で溶菌した。

１０μｇ　／　ｍ　ｔ　Ｔ：ロイペプチン、抗パパイン、ペプスタチンおよびキ モスタチン、２０μｇ　／　ｍ　ｌで大豆トリプシン阻害因子および１ミリモル のフェニルメチルスルホニルフルオライドをプロテアーゼ阻害因子として含めた 。リゼイトを１３，０００×ｇで１５分間遠心し、そしてパンソービン（Ｐａｎ ｓｏｒｂｉｎ）細胞〔ベーリンガー・ダイアグノスチクス（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ 　Ｄｉａｇｎｏ−ｓｔｉｃｓ）、カリフォルニア州うジョラ］またはプロティン Ａ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ　−４Ｂに結合した正常ウサギ 血清で予備清浄化した。ラットモノクローナル抗体をプロティンＡ−セファロー ズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ　−４Ｂに、ラットＩｇに対する多価ウサギ抗 血清〔ベル・フリーズ・バイオロジカルス（Ｐｅｌ　Ｆｒｅｅｚ　Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌｓ）、Ｒｏｇｅｒｓ、ＡＲ）を使用して結合した。免疫吸着剤をリゼイ トとともに４°Ｃにおいて３時間インキュベーションし、そして溶菌緩衝液中で 洗浄した。

免疫沈澱を６％または７％のポリアクリルアミドゲルの５ＤＳ−ＰＡＧＥにより 分析した。分子量標準はミオシン（Ｍ。

２００、０００）、β−ガタトシダーゼ（Ｍ、　１１６，０００）、ホスホリラ ーゼｂ　（Ｍ、　９７，０００）　、ウシ血清アルブミン（Ｍ、　６６．０００ ）およびアルブミン（Ｍ、　４３，０００）であった。ある実験のために、モノ クローナル抗体Ｒ１−２をヤギ抗ラット■ｇカラムで精製し、そして製造業者〔 バイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ、）カリフォルニア州 すッチモンド〕の指示に従いアフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）　１５に共有結合し た。

１次元のペプチドのマツピング ■８プロテアーゼ型黄色ブドウ球菌（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）　（シグマ・ケミカル ・カンパニー　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　、ミゾリー州セン トルイス〕によるタンパク質の消化を、ゲル電気泳動の間に実施した〔クレベラ ンド（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ）ら（１９７７）ジャーナル・オン・バイオロジカル ・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５２　：１１０２−１１０６） 。５ＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質の分離後、ゲルのスライスを切除し、そし て１ミリモルのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、１２５ミリモルのトリスＰＨ６， ８中で１５分間インキュベージジンした。次いで、ゲルのスライスを１２．５％ のポリアクリルアミドゲル上に負荷し、そして５００ｎｇの■８プロテアーゼで ブロモフェノールブルーを含有する１ミリモルのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、 １２５ミリモルのトリスｐＨ６，８，２０％のグリセロール中でオーバーレイし た。ゲル電気泳動は、色素の前面がタンパク質の酵素的消化を可能とするスコア キングゲルの終わりに近付いたとき、１時間中断した。

ＲＮＡの分離およびノザンプロット分析細胞を４モルのグアニジウムイソチアシ アネート溶液中で溶菌し、そしてＲＮＡを５．７モルのＣｓＣｌのクッションを 通して沈降させた〔チルブライン（Ｃｈ　ｉｒｇｗｉｎ）　ら（１９７９）バイ オケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１８　：　５２９４−５２９９ 　）　。

ポリ（Ａ”）ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース（ＩＩＩ型、コラボレティブ・ リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅａｓｅａｃｈ））のりロマトグラ フィーにより分離した。各細胞系について、４９ｇ（’）変性ポリ（Ａ゛）ＲＮ Ａを４０ミリ−ＩＬのＭＯＰＳ（ｐＨ７，５）で緩衝化した０、８％のアガロ− スゲ／２．２モルのホルムアルデヒドゲル上で分離し、そしてナイロン膜〔シュ レイヘル・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅＮ） 　）に移した。プローブを２〜４　Ｘ　１０”　ｃ　ｐｍ／ｕ　ｇのＤＮＡの比 活性にヘキサマーのプライマー標識っけ手順に従い標識した〔フェインバーグ（ Ｆｅｉｎｂｅｒｇ）およびポウゲルストゲイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｇｅｉｎ）　（ １９８３）アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、）　１３２　：　６−１３）、フィルターを４２°Ｃにおいて１６時間３ｘＳ ＳＰＥ、５０％のホルムアミド、１×デンハルト溶液、１％のＳＤＳおよび１０ ０μｇ／ｍｌのニシン精巣ＤＮＡ中でハイブリダイゼーションし、そして０、２ 　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ、０．１％のＳＤＳ中で６５°Ｃにおいて洗浄した。低い 厳格さ条件下に実施するハイブリダイゼーションのために、ハイブリダイゼーシ ョン溶液中のホルムアミドの濃度を３５％に減少し、そしてフィルターを２ＸＳ ＳＰＥ。

０．１％のＳＤＳ中の室温において洗浄した。ネズミインテグリンβ１のアミノ 酸１−３３３をエンコードするｃＤＮＡクローンｐＭＩＮＴβを、博士のり、　 Ｗ、デシモン（ＤｅＳｉｍｏｎｅ）、■、ベイチル（Ｐａｔｅｌ）およびＲ，Ｏ ，ハイネス（ｆ（ｙｎｅｓ）がら入手した。ヒトβ−アクチンを含有するｃＤＮ ＡクローンｐＨＦＢＡ−１（グニング（Ｇｕｎｎｉｎｇ）ら（１９８３）モレキ ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１Ｊ、Ｂｉｏｌ、）　 ３　：　７８７−７９５）は、Ｐ、グニング（Ｇｕｎｎｉｎｇ）博士およびり、 ケデス（Ｋｅｄｅｓ）、スタッフォード大学、メディカル・スクールから入手し た。ｐＨＦ８Ａ−１の９８０ｂｐの５ｃａｒ／５ａＩＩ断片をハイブリダイゼー ションのために使用した。

ネズミパイアー班ホーミングレセプター中の新規なインテグリンβ鎖の同定 ＬＰＡ、Ｍ−１のαサブユニット（以後α４１Ｔｈと呼ぶ）は、下に示すように 、ヒトインテグリン分子ＶＬＡ−４のα鎖に類似することが示された。Ｖ　Ｌ　 Ａ、−４のα鎖はインテグリンβ。

サブユニットと非共有結合的にアソシエーションする。

ＬＰＡＭ−１のβ鎖（以後β、と呼ぶ）がβ１に類似するかどうかを試験した。

β１に対して特異的な異なるウサギ抗血清はβ、または表面標識したＬＰＡＭ− １”ＴＫＩリンパ腫細胞のリゼイト中の他のタンパク質を認識しなかった。

ＬＰＡＭ−１のアルファサブユニット（以後α４．と呼ぶ）とヒトインテグリン 分子ＭＥＬ−１４のアルファ鎖との間の類似性は、次のようにして確立した。ヒ トＶＬＡ−４のアルファ鎖に対して特異的なウサギポリクローナル抗血清を、Ｌ ＰＡＭ−１のＰ１６０サブユニットを認識するその能力について試験した。免疫 沈澱したＳＤＳ変性ＬＰＡＭ−１を過剰のトリトンＸ−１００を含有する緩衝液 中で希釈し、そして異なるウサギポリクローナル抗血清で再分析した。モノ特異 的ウサギ抗ＶＬＡ−４アルファ鎖血清はＰ２Ｓ５およびその断片Ｐ８４を特異的 に認識したが、対照の血清はいずれも認識しなかった。ウサギ抗ＶＬＡ−４血清 は、精製したアルファ鎖を使用する免疫化により得られ、そして他のインテグリ ンアルファサブユニットと交差反応しなかった。こうして、免疫学的交差反応性 ならびに構造の類似性に基づいて、ＬＰＡ、Ｍ−１のＰ１６０サブユニットに、 ヒトＶＬＡ−４アルファ鎖に対して、相同性でないにしても、類似性であるよう に思われる。

抗ＶＬＡ−４抗体は、Ｍ、　１５０，０００および１３０，０００の細胞表面の へテロダイマー、ならびにＭ、　１５０，０００α鎖のタンパク質の断片である ことが示された、Ｍ、　８０，０００および７０，０００の２つのタンパク質を 免疫沈澱させる。これはＬＰＡＭ−１抗原のアルファ鎖と類似性であり、これは 還元性条件下に見掛けの分子量が１６０，０００（Ｐ２Ｓ５）　、１３０．００ ０（β１３０）　、８４，０００（β８４）　、および６２．０００　（β６２ ）の４つのタンパク質を産生する。

ＴＫＩリンパ譚細胞、３Ｔ３の線維芽またはネズミ血小板を細胞表面標識し、そ して免疫沈澱を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。免疫沈澱した物質を５０ミリ モルのトリスｐＨ７，４，１５０ミリモルのＮａＣ１，１％のトリトンＸ−１０ ０中の１０ミリモルのＥＤＴＡで処理し、そして溶離した物質をＬＰＡＭ−１へ テロ抗血清で分析した。すべての他の免疫沈澱を合計の細胞リゼイトから実施し た：Ｒ１−２　ＬＰＡＭ−１へテロ抗血清、抗ＬＦＡ−１アルファ鎖、抗ＬＦＡ 、−１ヘータ鎖、抗インテグリンβ１、抗ＶＬＡ−β、Ｍｌ／７０、正常ラット 血清および正常ウサギ血清。試料を還元性条件下に分析した。対照として、両者 のウサギ抗血清は、β１ならびにネズミ３Ｔ３線維芽からのＭ、　１３５，００ ０のα鎖を免疫沈澱した。

β２サブユニツトを特性決定するために、ＬＰＡＭ−１に対して特異的な多価の ラット抗血清は免疫親和性分離したタンパク質で免疫化することによって得られ た。ＬＰＡＭ−１αおよびβサブユニットの会合はＣａ”イオンの存在に依存す るので、βサブユニットはＥＤＴＡでβ４．特異的抗体Ｒ１−２に結合したＬＰ ＡＭ−１分子から選択的に溶離することができる。ＬＰＡＭ−１へテロ抗血清は 、ＥＤＴＡ溶離したβ２サブユニツトを免疫沈澱し、それがβ２を認識する抗体 を含有することを示す。この抗血清ならびに抗体Ｒ１−２を使用して、ＬＰＡＭ −１αまたはβ鎖は３Ｔ３線維芽上に検出されなかった。これらの結果が示すよ うに、β、はインテグリンβ、と区別される。

次に、β９が他のインテグリンβ鎖に関係するかどうかを研究した。ＬＦＡ、− １およびＬＰＡＭ−１の両者をＴＫＩ細胞から分離し、そしてそれらのサブユニ ットを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの元気泳動により比較した。ＬＦＡ−１ （インテグリンβ。）はそれらの分子量に基づいて明瞭に区別することができる ことが発見された。そのうえ、β２に対して特異的な抗体はβ、と交差反応する か、あるいはα４６サブユニツトと同時沈澱する。逆に、ＬＰＡＭ−１へテロ抗 血清はＬＦＡ−］サブユニットを再結合または同時沈澱しない。

β２サブユニットを、また、複タンパク質ＩＩＩａと同一であるインテグリンβ ３と比較した。

種々のβサブユニットをより詳細に比較するために、Ｖ８プロテアーゼを使用し て１次元のペプチドのマツピングを実施した。この手順は次の通りであった。放 射線標識したべ一タサブユニットを含有するゲルのスライスを、還元性条件下に ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後切除し、そして第２ポリアクリルアミドゲル 上に負荷した。タンパク質を５００ｎｇの■８プロテアーゼで第２電気泳動の間 に消化した。分析したタンパク質はＬＰＡＭ−１サブユニツトβ９、インテグリ ンβ１、インテグリンβ２、およびインテグリンβ３であった。種々のベータサ ブユニットの細胞源はＴＫ、１リンパ腫細胞、ＲＡＷ１１２リンパ腫細胞、３Ｔ ３線維芽およびネズミ血小板であった。マンピングにおいて、β、の消化は、β １．β２およびβ３のそれらと明瞭に区別されるペプチドのパターンを生ずるこ とを示した。同様に、β１．β２およびβ、の各々の消化は独特のペプチドのパ ターンを与えた。

したがって、これらの結果は、β２が独特のβサブユニットを表すという概念を 支持する。

ＬＰＡＭ　−１ｓ　ｓ　ｕ、　ｔβ２をさらにβ１とノザンプロット分析により 比較した。ＴＫ１細胞からのβ、タンパク質の不存在と一致して、ネズミβ１の Ｎ末端の断片の遺伝情報を指定するｃＤＮＡクローンはＴＫＩ細胞からのＲ，Ｎ 　Ａとハイブリダイゼーションしなかった。ポリ（Ａ”）ＲＮＡをβ２゛β１− ＴＫＩ細胞またはβ、−β１°ＲＡＷ１１２細胞から分離し、そしてネズミイン テグリンβ１サブユニットのアミノ酸１−３３３をエンコードするｃＤＮＡクロ ーンｐ　Ｍ　Ｉ　Ｎ　Ｔβとまたはβ−アクチンプローブとハイブリダイゼーシ ヨンすることによって、比較を実施した。フィルターを低いストリンジエンシー および高いストリンジエンシーの条件下にハイブリダイゼーシヨンしそして洗浄 した。ベーターアクチン特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、はぼ等 しい量のＴＫＩおよびＲＡＷ１１２ポリ（Ａ”　）ＲＮＡが分析されたことを明 らかにした。同一の結果は両者の低いストリンジエンシーおよび高いストリンジ エンシーの条件下に得られた。

対照的に、β１特異的ｃＤＮＡプローブはβＩ”ＲＡＷ１１２リンパ腫細胞の２ つのＲＮＡ腫ハイブリダイゼーシゴンした。

これらの結果が明瞭に実証するように、β２はインテグリンβ、と区別される。

ＶＬＡ−４様ＬＰＡＭ−１αは２つの異なるβ鎖の各々と会合することができる 。

リンパ腫細胞系のパネル上のα４１と会合したβサブユニットの性質を研究する ために、表面標識したリンパ腫細胞のリゼイトをβ４．特異的抗体Ｒ１−２を使 用して免疫沈澱し、そして非還元性条件下に５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

すべての細胞系は、同様な大きさのα鎖ならびに２つのＭ。

８４．０００および６２．０００のα鎖の断片を発現した。しかしながら、β２ 様サブユニツトは細胞系ＴＫＩ、’Ｔ”Ｋ２３およびＴＫ４０においてのみ検出 された。わずかにより高い見掛けの分子量（Ｍ、　１１５，０００非還元）のタ ンパク質を、β２を明らかに欠く細胞系（すなわち、ＴＫ５０、Ｌｌ−２、Ｔ６ ９、ＫＫＴ２）から同時沈澱させた。さらに、抗ＬＰＡＭ−１へテロ抗血清でこ れらの細胞系の大部分からβ、動物質同時沈澱しなかった。両者のβ、およびＭ 、　１１５，０００タンパク質は細胞系ＴＫ２３およびＴＫ４０において同時に 発現されることが分かった。インケグリンβ１サブユニットは、Ｍ、　１１５， ０００タンパク質と同時移動するが、β２とは同時移動しないＴＫ１以外の細胞 系からのモノ特異的ウサギ抗血清で分離された。

β、特異的抗血清を使用する免疫沈澱は、また、α４１と同時移動するタンパク 質を含有した。これらの結果の解釈は、α。をβ２またはインテグリンβ１と同 一であるＭ、　１１５．０００のタンパク質と会合することができるということ である。

この仮説を試験するために、β４゜と会合したサブユニットを、アフィゲル（Ａ ｆｆｉｇｅｌ）　１５に共有結合した抗体Ｒ１−２を使用して、リンパ腫細胞系 のパネルからの免疫沈澱に従い分析した。リンパ腫細胞系のパネルを細胞表面標 識し、そしてアフィゲル１５に共有結合したα４１特異的抗体Ｒ１−２を使用し て免疫沈澱させた。結合したタンパク質を１００ｍ１のグリシンｐＨ２，５，１ ％のトリトンＸ−１００で溶離し、そして溶離液を５０ミリモルのトリスｐＨ８ ，８，１５０ミリモルのＮａＣ１，１０ミリモルのＥＤＴＡ、１％のトリドアＸ −ＩＱＯで１：５に希釈した。溶離しそして会合したサブユニットをいくつかの アリコートに分割し、そして抗インテグリンβ７、抗ＶＬＡ−β、ＬＰＡＭ−１ へテロ抗血清、および白血球共通の抗原Ｔ２Ｏ０に対して向けられたモノクロー ナル抗体３０Ｇ１２で再分析した。試料を非還元性条件下に５ＤＳ−ＰＡＧＥに より分析した。結合したタンパク質を溶離し、そして会合したサブユニットをＬ ＰＡＭ−１へテロ抗血清またはβ、に対して向けられた２つの抗血清を使用して 再分析した。前述の結果と一致して、ＴＫＩ細胞中の発現されたβ２サブユニツ トを抗ＬＰＡＭ−１へテロ抗血清と反応したが、β、特異的抗血清と反応しなか づた。対照的に、β。

陰性細胞系ＴＫ５０、Ｌｌ−２、Ｔ６９、およびＫＫＴ２からの抗体Ｒ１−２に より同時沈澱したＭ、　１１５．０００のタンパク質は両者のβ１特異的抗血清 により認識されたが、Ｌ　Ｐ　ＡＭ−１へテロ抗血清により認識されなかった。

両者のβ、およびＭ、　１１５，０００タンパク質は細胞系ＴＫ２３およびＴＫ ４０から分離した。したがって、両者の抗β１抗血清はＭ。

１１５．０００タンパク質と特異的に反応したが、β２はＬＰＡＭ−１へテロ抗 血清によってのみ検出された。これらの結果が直接示すように、β２及び別個の Ｍ、　１１５．０００タンパク質（インテグリンβｌ）はα４ｍに対して特異的 である抗体により同時に精製される。

放射線標識α４．を含有するゲルのスライスを、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（非還元性 ）分離から切出し、そして第２ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動の間に５０ ０ｎｇのＶ８プロテアーゼで消化した。α４１サブユニツトを細胞系ＴＫＩ、Ｔ Ｋ２３ＴＫ４０およびＴＫ５０から分離した。抗体Ｒ１−２により認識されたα サブユニットの同一性は、１次元のペプチドのマツピングによりさらに評価した 。Ｖ８プロテアーゼで４つのＤＮＡ断片細胞系から分離したα鎖の消化は、β２ またはβ１との会合に無関係に同一のペプチドのパターンを生じ、抗体Ｒ１−２ が異なる細胞系上の同一のαを認識したことが示された。したがって、ＶＬＡ− ４様ＬＰＡＭ−１α鎖は２つの明確な細胞表面のへテロダイマーの共通のサブユ ニットである：ＬＰＡＭ−１はＲ２とアソシエーションしたα４．、ｌから構成 されている、そしてＬＰＡＭ−２はα４．、ｌおよびインテグリンβ１から成る 。

ＬＰＡＭ−１およびＬＰＡＭ−２の両者は、バイアー塩ＨＥ■の相互作用に関係 する。

ＬＰＡＭ−１およびＬＰＡＭ−２ヘテロダイマーの両者の細胞分布および機能を 研究した。ＬＰＡＭ−１およびＬＰＡＭ−２の存在は、α４１特異的抗体Ｒ１− ２および引き続くＬＰＡＭ−１へテロ抗血清またはβ、特異的抗血清（前述の） を使用するβサブユニットの分析により決定された。バイアー塩または末梢リン パ節中のＲＥＶについての細胞の結合能力を、変更したスタンバ−（ＳｔａｒＲ ｐｅｒ）およびウソドララフ（Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）の生体外アッセイにおいて試 験した。結果は、すべてのバイアー班ＨＥＶ結合性細胞ならびに非結合性リンパ 腫は抗体Ｒ１−２と反応したことが示された。免疫沈澱により分析したとき、バ イアー班ＨＥＶ結合性リンパ腫はＬＰＡＭ−１およびＬＰＡＭ−２の異種発現を 示した。両者のへテロシマーは細胞系ＴＫ２３およびＴＫ４０中で発現されたが 、他の細胞系はＬＰＡＭ−１（細胞系ＴＫＩ）またはＬＰＡＭ−２（細胞系ＴＫ ５０）について単一に陽性であった。

正常の腸間膜節リンパ球において、両者のヘテロダイマーが検出された。バイア ー塩）（ＥＶ結合性細胞系と対照的に、すべてのＲ１−２反応性非結合性リンパ 腫はＬＰＡＭ−２を発現したが、ＬＰＡＭ−１を発現しなかった。抗体Ｒ１−２ はバイアー塩ＨＥ　Ｖへの試験したすべてのリンパ腫細胞系の結合を阻害したが 、末梢リンパ節ＨＥ　Ｖへの結合を阻害せず、従来の結果と一致し、それがネズ ミパイアー班ホーミングレセプターを認識することを示した。抗体Ｒ１−２は、 また、ＬＰＡＭ−１またはＬＰＡＭ−２の単一の陽性リンパ腫ＴＫ１およびＴＫ ５０バイアー班ＨＥＶの付着をブロッキングしたので、これらの結果が示唆する ように、ＬＰＡＭ−１に加えて、ＬＰＡＭ−２もまた、リンパ球−パイア−班Ｈ Ｅ　Ｖの相互作用に関係する。

上の結果が実証するように、新規なタンパク質は特定の解剖学的部位への特異的 結合に使用することができる。異なるタンパク質を種々の方法において使用して 、細胞の結合を防止するか、あるいは組成物を所望の部位へ向けることができる 。このようにして、免疫系は特異的部位においてリンパ球の個体数を増加または 減少することによって変調することができる。特定の部位におけるリンパ球の個 体数をコントロールする能力を使用して、自己免疫疾患に対して保護し、炎症の 応答を減少し、新生物の状態についての診断または治療のために特異的細胞また は薬物を局在化し、そしてＴ細胞のプレゼンテーションについてリンパ球または 単球によりエンドサイト−シスされうるウィルスを修飾することによって免疫応 答を増強することができる。

この明細書に引用したすべての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物ま たは特許出願が詳しくかつ個々にここに引用によって加えられているように、こ こに引用によって加える。

当業者は、ここに記載した発明の特定の実施Ｍ様と同等の多くの実施態様を認識 するか、あるいは日常の実験を越えない実験を使用して確証することができるで あろう。このような同等の実施態様は次の請求の範囲により包含されることを意 図する。

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Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の染色体の−部分であるもの以外の、α４ｍ、ｂｐ、またはユビク イチン不含のコアタンパク質ｇｐ９０Ｍｅｌ−１４、あるいはそれらの個々のド メインから成る群より選択されるホーミングレセプターユニットをコードするＤ ＮＡ配列。
2. ２．前記ＤＮＡはＣＤＮＡである、上記第１項記載のＤＮＡ配列。
3. ３．前記ユニットはａ４ｍまたはｂｐである、上記第１項記載のＤＮＡ配列。
4. ４．前記ユニットはコアタンパク質ｇＰ９０Ｍｅｌ−１４またはシグナル配列を 含んで成るドメイン、レクチン様ドメイン、ＥＦＧ様ドメインもしくは相補的調 節タンパク質様ドメインである、上記第２項記載のＤＮＡ配列。
5. ５．ホーミングレセプターユニットをコードするＤＮＡ配列を含んでなり、前記 レセプターユニットは、哺乳動物の染色体の−部分であるもの以外の、βｐまた はｇｐ９０Ｍｅｌ−１４またはそのドメインから成る群より選択され、野生型以 外の転写開始領域、マーカーまたは細胞の宿主中の安定な複製のための複製系に 接合されている、ＤＮＡ配列。
6. ６．哺乳動物の宿主に、ホーミング調節量のＬＰＡＭ−１、−２またはＶＬＡ− ４に対する抗体、粘膜のリンパ様器官または組織のリガンドまたはリンパ節に結 合することができる、ＬＰＡＭ−１、−２、ＶＬＡ−４のペプチド、またはコア タンパク質ｇｐ９０Ｍｅｌ−１４またはそのドメイン、それらと免疫学的に交差 反応性のペプチド、またはその接合体からなる組成物を投与して、粘膜のリンパ 様器官または組織のリガンドヘの結合を調節することからなり、 ここで前記組成物は前記リガンドヘの結合を調節する、ことからなる、哺乳動物 宿主の粘膜のリンパ様器官または組織に関連する高い内皮細静脈のホーミングリ ガンドヘの問題の成分のホーミングを調節し、前記リガンドヘの結合を提供する か、あるいはそれを阻害する方法。
7. ７．前記組成物は、ＬＰＡＭ−１、−２またはＶＬＡ−４に対する抗体、前記粘 膜のリンパ様器官または組織のリガンドに結合することができる、ＬＰＡＭ−１ 、−２、ＶＬＡ−４のペプチド、またはコアタンパク質ｇｐ９０Ｍｅｌ−１４ま たはその細胞質外ドメインからなる、上記第６項記載の方法。
8. ８．前記組成物は、前記粘膜のリンパ様器官または組織のリガンドに結合するこ とができるＶＬＡ−４またはその断片からなる、上記第７項記載の方法。
9. ９．前記組成物はＬＰＡＭ−１または−２からなる、上記第８項記載の方法。
10. １０．少なくとも５０重量％のＬＰＡＭ−１および／または−２を含んでなる組 成物。
11. １１．少なくとも５０重量％のα４ｍまたはｂｐを含んでなる組成物。
12. １２．粘膜の高い内皮細静脈に結合することができるＬＰＡＭ−１または−２の 断片を含んでなる組成物。
13. １３．少なくとも約８アミノ酸の哺乳動物のα４ｍまたはｂｐの断片を含んでな る組成物。
14. １４．α４ｍまたはｂｐをコードする遺伝子の配列と少なくとも９５％の同一性 を有し、そしてコード配列において終わるか、あるいは天然の隣接するＤＮＡ以 外に接合する少なくとも約１２ｎｔのＤＮＡ配列。
15. １５．ＣＤＮＡを含んでなる、上記第１４項記載のＤＮＡ配列。
16. １６．α４ｍをコードするＤＮＡ配列。
17. １７．ｂｐをコードするＤＮＡ配列。
18. １８．ｇｐ９０Ｍｅｌ−１４をコードする遺伝子の配列と少なくとも９５％の同 一性を有し、そしてコード配列において終わるか、あるいは天然の隣接するＤＮ Ａ以外に接合する少なくとも約１２ｎｔのＤＮＡ配列。
19. １９．ＣＤＮＡを含んでなる、上記第１８項記載のＤＮＡ配列。
20. ２０．シグナル配列、レクチン様ドメイン、ＥＦＧ様ドメインまたは補体調節タ ンパク質ドメインを含んでなる、上記第１８項記載のＤＮＡ配列。
21. ２１．高い内皮細静脈への結合をブロッキングすることができる。ｇｐ９０Ｍｅ ｌ−１４のコアタンパク質に対する抗体。
22. ２２．高い内皮細静脈への結合をブロッキングすることができるａ４ｍまたはｂ ｐに対する抗体。
23. ２３．細胞において機能的な調節領域の転写および翻訳の調節下の上記第１４ま たは１８項記載の構成体を含んでなり、前記構成体は、前記細胞中への前記構成 体の導入の結果として、前記細胞の中に存在する、細胞。
24. ２４．哺乳動物の宿主に、結合阻害量のＬＰＡＭ−１、−２またはＶＬＡ−４に 対する抗体、粘膜のリンパ様器官または組織のリガンドまたはリンパ節に結合す ることができる、ＬＰＡＭ−１、−２、ＶＬＡ−４のべブチド、またはｇｐ９０ Ｍｅｌ−１４のコアタンパク質、それらと免疫学的に交差反応性のペプチド、ま たはその接合体からなる組成物を投与する、ことからなる、高い内皮細静脈部位 への転移を阻害する方法。
25. ２５．細胞またはウイルスのゲノムの中に、上記第５項記載のＤＮＡ配列または 前記ユニットまたはその機能的断片の発現のためのその機能的断片からなる発現 カセットを導入し、これにより発現産生物は前記細胞またはウイルスの表面上に 発生しそして高い内皮細静脈のリガンドへ結合して、前記高い内皮細静脈へホー ミングする細胞またはウイルスを産生することができる、ことからなる、哺乳動 物ヒトにおける粘膜のリンパ様器官または組織またはリンパ節に細胞またはウイ ルスを向ける方法。